Valores Séricos de Marcadores Hepáticos en Ratas. Aporte de un Patrón de Referencia N Porras 1, Q Zeidán 1, M Strauss 1 y G Anselmi 1. 1.
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- Adrián Coronel Ortíz
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1 Valores Séricos de Marcadores Hepáticos en Ratas. Aporte de un Patrón de Referencia N Porras 1, Q Zeidán 1, M Strauss 1 y G Anselmi Sección de Biología Celular. Instituto de Medicina Tropical. Facultad de Medicina. Universidad Central de Venezuela. RESUMEN La cepa Sprague Dawley representa un modelo animal usado para evaluar el potencial terapéutico y tóxico de drogas y permite la elaboración de diseños experimentales para estudiar órgano toxicidad, siendo el hígado uno de los órganos mas estudiados. Una manera indirecta de evaluar la condición del individuo y el órgano afectado, es la determinación sérica de metabolitos específicos, lo cual exige el establecimiento de rangos de referencia de marcadores universales para la detección de daño orgánico. Aplicando un diseño no experimental, se determinaron los valores séricos normales de -GT, TGP, Bt, Bd y Tg, en ratas hembras Sprague Dawley, de g de peso corporal (p.c), empleando métodos optimizados para humanos. Se extrajeron 3 cc de sangre, mediante punción directa de la arteria aorta a 40 ratas, posterior a su sacrificio con vapores de cloroformo. Las muestras fueron centrifugadas 15 min. separando el suero para la determinación de los parámetros químicos establecidos, con el uso de estuches comerciales de técnica manual. Se calculó el promedio y la desviación estándar de las valores, obtenidos arrojando los siguientes rangos de valores de referencia: -GT (16.0 UI/L =72), TGP (32.5 UI/L± 9.5), Bt (0.36 mg/dl ±0.18), Bd (0.08 mg/dl ±0.04) y Tg (88 mg/dl ±30) y un promedio de p.c de 203 g±21. Las similitudes y diferencias entre los valores obtenidos y los reportados por otros investigadores, sugieren que cambios ambientales, alimenticios y de cautiverio pudieran modificar los niveles de metabolitos séricas en estos animales experimentales. Palabras Clave: Química sanguínea, Sprague Dawley, Marcadores hepáticos. ABSTRACT Sprague Dawley is an experimental rat model used in the evaluation of new drugs and their toxic effects. Through the use of this animal model we are able to generate organ toxicity designs, especially of the liver which is one of the most studied organs. As the serum determination of the specific chemical parameters is an indirect way of evaluating the condition oí the individual and the organ affected, it is necessary to obtain the range of reference values of universal markers of hepatic damage detection. Using a non-experimental design, this study examined the normal serum values of -GT, TGP, Bt, Bd and Tg in adult female Sprague Dawley rats ( g body wt), using optimized human methods. 3 cc of blood was extracted by direct aortic puncture from forty rats after had been killed by chloroform. The samples were centrifuged (15 min), with the serum being separated to determine the established chemical parameters, using commercial manual technique kits. The mean and the standard deviation of the values were calculated, giving the following range of reference values: -GT (16.0 UI/L±7.2), TGP (32.5 UI/L ± 9.5), Bt (0.36 mg/dl ± 0.18), Bd (0.08 mg/dl ± 0.04) and Tg (88 mg/dl ± 30) and a mean per body wt of 203 g ± 21. The similarities and differences between the values obtained in this study and those reported by other researchers suggest that changes in enviroment diet and captivity may modify serum metabolite levels in experimental animals. Key Word: Blood chemistry, Sprague-Dawley, Hepatic markers INTRODUCCIÓN Cuando en los mamíferos ocurre la pérdida de la homeóstasis como resultado de estados patológicos (daño celular, estados inflamatorios o necrosis) y fisiológicos se generan cambios en el ám0bito bioquímico que pueden ser fácilmente detectados en la circulación sanguínea. La evaluación de tales cambios exige del conocimiento de los valores de referencia de los metabolitos químicos que la sangre contiene (5): catalizadores enzimáticos y/o componentes de las diferentes rutas metabólicas celulares. Debido a que en los tejidos se encuentran enzimas características que solo se detectan en la sangre cuando se lesionan o destruyen las células que las albergan, la presencia de tales enzimas específicas en el torrente sanguíneo, en cantidades significativas, sugiere el entorno celular probable del daño tisular (1). En tal sentido, se han descrito perfiles bioquímicos órgano específico, orientados a la determinación sérica de metabolitos propios de un órgano en la sangre,
2 Entre los marcadores universales de daño hepático (MDH) se incluyen la gamma-glutamil transpeptidasa (-GT) y las transaminasas, específicamente la transaminasa glutámico pirúvica (TGP). Lo anterior se fundamenta en el contenido elevado de estas enzimas en el hígado. Además de los MDH señalados, se incorporan como posibles marcadores de función hepática la bilirrubina total (Bt), bilirrubina directa (Bd) y triacilglicéridos (Tg) por ser productos de rutas metabólicas propias del hígado. Dada la similitud entre los valores de referencia de los metabolitos mencionados determinados en humanos y los de rata, los métodos optimizados para determinaciones séricas en humanos pueden emplearse en el análisis de metabolitos séricos en animales experimentales (2). Del mismo modo que ocurre en humanos, con relación a distintos grupos étnicos, etáreos, etc., en ratas gran número de crías, linajes, sublinajes y cepas inter-especies podrían estar vinculado a variaciones fisiológicas. En tal sentido, la complejidad en el establecimiento de los valores de referencia en especies de laboratorio como las ratas, exige del conocimiento de los parámetros séricos específicos de los modelos animales experimentales y su relación con el contexto ambiental donde se desenvuelven. La generación de patrones de valores séricos específicos en un modelo animal particular facilita la utilización del mismo con mayor rigurosidad científica. Debido a la inexistencia de información sobre rangos normales de referencia de parámetros químicos en el modelo animal Sprague Dawley, en este trabajo, mediante la aplicación de un diseño no experimental, se determinaron los valores séricos de referencia de -GT, TGP, Bt, Bd y Tg como parte de un perfil químico de evaluación hepática en ratas Sprague Dawley. MATERIALES Y MÉTODOS Se emplearon 40 ratas hembras Sprague Dawley ( g p.c), de apariencia normal, provenientes del Bioterio del Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel". Los animales fueron pesados y durante tres días, en el mismo horario, fueron sacrificados con vapores de cloroformo (dos grupos de 15 y uno de 10). Posterior al sacrificio, se extrajeron 3cc de sangre, mediante punción limpia directa de la arteria aorta. Luego de la retracción del coágulo, las muestras fueron centrifugadas a 3500 r.p.m. por 15 min. separando el suero del paquete globular para su posterior análisis bioquímico. El procesamiento de los sueros se llevó a cabo el mismo día de su extracción. Las determinaciones séricas realizadas fueron -GT, TGP, Bt, Bd y Tg. Se usaron estuches comerciales con metodología manual, específicamente métodos cinéticos INVELAB S.A., para la determinación de -GT y TGP, y métodos colorimétricos CHEMROY para la determinación de Bt, Bd y Tg. Una vez obtenidos los 40 registros para cada uno de los metabolitos estudiados, se les aplicó el programa estadístico "Statistix for Windows" (Figura 1). Figura 1: Esquema de metodología de trabajo empleada para la determinación sérica de metabolitos químicos relacionados con tejido hepático, en ratas Sprague Dawley.
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4 RESULTADOS Los datos para cada metabolito, incluyendo el peso, se analizaron estadísticamente con el programa "Statistix for Windows'. la que arrojó una serie de datos estadísticos que facilitaron el establecimiento del rango de referencia de los parámetros sérícos (Tabla 1). Se elaboraron gráficos de distribución de todos los registros tomando en cuenta el valor promedio y la DS (Figura 2A, 28, 2C, 2D, 2E, 2F), lo que permitió observar la tendencia de todos los valores, para cada caso, con su respectiva media aritmética y desviación estándar. En la tabla 2 se presentan los rangos de referencia de -GT, TGP, Bt, Bd y Tg en ratas hembras Sprague Dawley. Tabla 1 : Análisis Estadístico Metabolito g-gt (UI/L) TGP (UI/L) Bt (mg/dl) Bd (mg/dl) Tg (mg/dl) Peso (g) N DS Media Aritmética C.V Mínimo Máximo Datos estadísticos resultantes de la aplicación del programa Statistix for windows a los 40 valores de cada parámetro analizado con un intervalo de 95% de confianza ( Tabla 2: Patrón de valores de metabolitos séricos hepáticos Metabolito Rango de Referencia g-gt (UI/L) ( ) TGP(UI/L) (23-42) Bt (mg/dl) ( ) Bd (mg/dl) ( ) Tg (mg/d1) (58-118)
5 Peso (g) ( ) Rangos de referencia de marcadores hepáticos: g-gt TGP, Bt, Bd y Tg en ratas hembras Sprague Dawley, como resultado de la correlación entre las DS y sus Medias Aritméticas obtenidas de la aplicación del programa estadístico "Statistix lor Windows" (95% de confianza). DISCUSIÓN Entre especies de animales existen variaciones en los valores normales séricos que están relacionadas con diferencias de edad, sexo, hábitos alimenticios, climáticos, de cautiverio e incluso con la técnica empleada para su determinación. Lo anterior pudiera explicar las semejanzas y diferencias observadas entre los rangos de valores reportados en este trabajo y los descritos por otros autores. Nomura y col. (1975) reportan en ratas hembras Wistar valores de Bt 0.24 ± 0.07 ( ) y de TGP 22.5 ± 2.5 ( ). Czerwek, (1981), Berlanga y col (1998), por su parte, reportan TGP en ratas hembras Sprague Dawley de 16.5 ± 2.8 (3) y 23 ± 9, respectivamente (2). Tales variaciones pueden evaluarse si se establece el rango de referencia de metabolitos para una determinada población en estudio. Por otra parte, los parámetros sanguíneos pueden verse afectados tanto por el tiempo que dure la recolección como por la condición del animal cuando se está recolectando la muestra, por lo que se hace necesario recurrir a la utilización de sustancias anestésicas. En tal sentido, se ha reportado que anestésicos como el éter y el pentobarbital sódico no tienen efecto sobre el balance ácido básico, las proteínas plasmáticas, el calcio y el magnesio en ratas; en contraste a la manipulación de la rata que incrementa la acidez de la sangre, las proteínas plasmáticas, el calcio y el magnesio pero disminuye la glucosa sanguínea (5). Mas aún, otros investigadores, también han reportado respuestas fisiológicas similares refiriéndose a los métodos de toma de muestra sanguínea en ratas(5). Debido al trauma y estrés que puede ocasionar la excesiva manipulación del animal de trabajo y la posible alteración de los parámetros sanguíneos en estudio, este trabajo, se usaron los vapores de cloroformo como estrategia de sacrificio, en vez de la extracción sanguínea por la vena caudal o la técnica de sangrado orbital. Sin embargo las posibles modificaciones que los vapores de cloroformo puedan generar sobre los valores normales de los parámetros séricos estudiados se minimizan silos investigadores que vana usar esta herramienta como patrón de referencia siguen el mismo diseño experimental aquí realizado. Poder establecer un rango de referencia de marcadores séricos específicos para hígado representa una guía o pauta adicional, que junto con otros parámetros del tipo histológico, ultraestructural y bioquímico permite una evaluación confiable de la función hepática.
6 Figura 2: Distribución de los valores de peso corporal (2A), -GT (2B), TGP (2C), Bt (2D), Bd (2E) y Tg (2F) obtenidos de las 40 ratas hembras Sprague Dawley en función a su Media Aritmética y DS (-----: Media Aritmética y : ± DS). El eje de la X representa el número de individuos y el eje de la Y representa el valor de cada parámetro en su respectiva unidad de medida, en cada una de las gráficas presentadas. CONCLUSIÓN En este trabajo se aporta un patrón de referencia de valores séricos de marcadores hepáticos normales: -GT, TGP, Bt, Bd y Tg, en ratas hembras Sprague Dawley necesario para la evaluación directa de estos indicadores así como para la evaluación indirecta de diversas situaciones, tales como: alteraciones en tejido hepático, efectos colaterales de un tóxico y evaluaciones terapéuticas. AGRADECIMIENTO Los autores agradecen al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad Central de Venezuela, por su apoyo a través del Proyecto Individual N
7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Alarcón O, Ramirez M, Bastardo G, Silva T y Alarcón A. Alteraciones enzimáticas séricas en ratas tratadas con bisulfito de sodio. Acta Cient. Venez. 2000; 51: Berlanga J, Caballero ME, Ramirez D, Torres A. Valenzuela C, Lodos J and Playford R. Epidermal growth factor protects against carbon tetrachloride induced hepatic injury. Clinical Science. 1998; 94: Czerwek H and Bietel H. Normal values of alkaline phosphatase, glutamic oxaloacetic transaminase and glutamic pyruvic transaminase in the serum of experimental animals using optimized methods, and the effect of haemolysis on these values. Exp. Path. 1981; 19: Guzman F. Hepatoxicidad y cardiotoxidad de derivado antimonial pentavalente en ratas albinas. Revista de la Facultad de Medicina 1996; 19: Mitruka B,Rawns Iey H andvadehra B.Clinical biochemical and hematological reference values in normal experimental animals. Hematological Values in Experimental Animals / Clinical Chemistry. Masson publishing, USA, 1977; pp
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