Investigando los genes FRAUDE CANINO

Transcripción

1 FRAUDE CANINO Ahora vamos a actuar como policías científicos. No se trata de un caso humano, sino de perros. El protocolo seguido es similar al de la Huella Genética o Huella de ADN, es decir, vamos a diferenciar individuos de una misma especie utilizando muestras de ADN. La huella genética La técnica se basa en que los individuos de la misma especie comparten una gran parte de su secuencia de ADN, pero existen determinadas regiones que son propias de cada individuo. Estas zonas del genoma se llaman polimorfismos o marcadores genéticos. Es muy poco probable que dos individuos de la misma especie que no tengan relación de parentesco, tengan en común los mismos marcadores genéticos. Este conjunto de polimorfismos de un individuo se llama perfil genético. Aplicaciones prácticas de la huella genética Esta técnica fue utilizada por primera vez en un caso de inmigración en el Reino Unido. A un chico que volvía al Reino Unido tras un viaje a su país de origen, Ghana, se le negó la residencia en el país al considerar que su documentación era falsa. Las pruebas de ADN demostraron con un 99,997% de fiabilidad que era hermano de los demás hijos de su madre, de nacionalidad británica. Así se pudo quedar en el Reino Unido. Otro caso de gran repercusión fue el de Josef Mengele, criminal de guerra nazi. En 1985 se descubrieron unos restos óseos, en un cementerio de Brasil, que se creía correspondían a este asesino. En 1992 se comparó el ADN que se extrajo de un hueso con el de la esposa y el del hijo de Mengele. Con un 99,94% de fiabilidad, se determinó que los restos encontrados pertenecían a Mengele. En la actualidad, la huella genética tiene muchas aplicaciones: Identificar a los sospechosos de un crimen con muestras de sangre, cabello, saliva o semen. También para exonerar a condenados y para identificar a las víctimas. Identificar restos humanos por comparación con muestras de familiares. Pruebas de Paternidad Estudiar la compatibilidad en donaciones de órganos. Estudiar la evolución de poblaciones animales salvajes. Generar hipótesis sobre las migraciones humanas. I n m a c u l a d a E s p á r r a g o Página 1

2 Identificar inmigrantes. Situación El Sr. Cánido compró un perro de raza muy apreciada a un criador, quien le aseguró que el cachorro era hijo de un perro campeón en multitud de exposiciones. El Sr. Cánido comprobó, cuando su cachorro, Milú, se hizo adulto, que no tenía porte ni características de campeón. Regresó para hablar con el criador que se lo vendió, quien le aseguró que el padre era el campeón. Sin embargo, al Sr. Cánido le pareció que había sido engañado ya que su perro se parecía más a otro ejemplar de la perrera que para nada tenía porte de campeón. Recogió muestras de pelo de la madre, de los dos supuestos padres y de su cachorro y llevó los pelos a un laboratorio de genética molecular para que, mediante marcadores genéticos, pudiera averiguar cuál de los dos era el padre de su perro. En el laboratorio los técnicos han extraído el ADN de cada animal y han amplificado, mediante la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa), un fragmento específico de cada perro (polimorfismo) que puede dar lugar a dos alelos diferentes (heterocigótico) o iguales (homocigótico) en cada uno de los individuos. Los productos de estas amplificaciones están ahora en tus manos para que, mediante electroforesis en gel de agarosa, determines la posible paternidad y hagas saber al Sr. Cánido si ha sido engañado o no. Protocolo de actuación Material biológico ADN de la madre (tubo rosa) ADN del posible padre 1 (tubo azul) ADN del posible padre 2 (tubo amarillo) ADN del perro Milú (tubo verde) Marcador (tubo transparente) Nota: El ADN ya viene con búfer de aplicación (azul) por lo que sólo necesitas aplicar las muestras en el gel desde los tubos anteriores. Procedimiento 1. Preparar una electroforesis en gel agarosa I n m a c u l a d a E s p á r r a g o Página 2

3 2. Aplicar una muestra (10μL) de cada uno de los materiales biológicos proporcionados (madre, padre 1, hijo, padre 2) en diferentes pozos y una muestra del marcador en un pozo adyacente. 3. Separar los fragmentos por electroforesis 4. Colorear el gel 5. Contabilizar las bandas. 6. Análisis de los resultados 1. Electroforesis en gel agarosa Material necesario Para electroforesis Cubeta de electroforesis (con tapa) Bandeja Peine Electrodos (cordón rojo y negro) Transformador Cinta adhesiva Para gel de agarosa TBE búfer (x 10) Agarosa Agua destilada Para las muestras Búfer de aplicación Jeringa Puntas amarillas ADN de perros Procedimiento Preparación de las disoluciones El gel de agarosa debe estar preparado en búfer TBE 0,5 x. El búfer suministrado viene concentrado x 10, por lo tanto, tienes que diluirlo 1:20 en agua destilada. Necesitamos unos 200 ml para cubrir el gel en la cubeta de electroforesis por tanto necesitaremos: TBE búfer de 10 x Agua destilada Volumen final 10 ml 190 ml 200 ml Pon todos los volúmenes en un frasco hermético y agita invirtiéndolo varias veces. Agarosa I n m a c u l a d a E s p á r r a g o Página 3

4 La solución de agarosa debe prepararse también en búfer TBE x 0,5. Preparamos 100 ml de este búfer: TBE búfer de 10 x 5 ml Agua destilada Volumen final 95 ml 100 ml La agarosa debe prepararse a la concentración de 1%. Para ello pesamos 1 g de agarosa y derretimos en matraz o frasco hermético en 100 ml de búfer TBE de 0,5 x. Para derretir: -agitar para diluir un poco. -Ponemos en el microondas durante períodos cortos (15 segundos cada vez) -Agitar de nuevo -Repetir la operación (15 s en microondas + remover hasta que la solución se vuelva completamente transparente). Figura 1: Solución de agarosa (1%) fundida en microondas (Nota: si todavía hay gel de agarosa en gránulos no disuelto, la solidificación no será uniforme y dañará la separación de los fragmentos de ADN) Preparación de tinte gel (Azul Nilo) Disolver el contenido del tubo tinte (40mg) en 200ml de agua destilada. Agitar hasta que esté bien disuelto. La disolución se debe hacer en un matraz envuelto en papel de aluminio ya que se debe mantener en oscuridad. Si lo tenemos que almacenar lo haremos en un armario con puerta. Preparación del gel -Sellar con cinta-adhesiva ambos lados abiertos de la bandeja para el gel. -Colocar la bandeja en un lugar plano. I n m a c u l a d a E s p á r r a g o Página 4

5 Figura 2: Bandeja sellada con cinta-adhesiva y con el peine colocado en la posición correcta -Transferir cuidadosamente a la bandeja (con lentitud y sin dejar burbujas) alrededor de 40 ml de agarosa fundida y enfriada a aproximadamente C (cuando se pueda mantener la botella agarosa en las manos sin quemarnos). Figura 3: Verter agarosa en bandeja (la agarosa debe dejarse enfriar hasta unos 45 C) -Poner inmediatamente el peine aproximadamente a 1 cm de distancia desde la parte inferior de la bandeja y completamente paralela al sello del fondo (ver la figura 2). Los dientes del peine deben permanecer sumergidos en gel alrededor de 3 mm. Si al colocar el peine observa que los dientes permanecen fuera o ligeramente en contacto con el gel, vierte unos pocos ml más de gel en la bandeja. Figura 4: Bandeja de agarosa y peine colocado en la posición correcta I n m a c u l a d a E s p á r r a g o Página 5

6 -Espera aproximadamente 30 minutos, hasta que el gel se solidifique completamente. -Retira el peine perpendicularmente, con cuidado de no destruir los pozos. Figura 5: Retirar el peine del gel después de solidificación (con una mano se sujeta la cubeta y con la otra se extrae el peine perpendicularmente al gel). -Remover cuidadosamente la cinta-adhesiva, manteniendo la cubeta horizontalmente, y depositar el gel con la bandeja dentro de la cubeta de electroforesis con los pozos al lado del electrodo negro. -Verter, cuidadosamente, búfer TBE 0,5 x dentro de la cubeta para cubrir el gel por completo de búfer y el nivel de este alcance aproximadamente 1 mm por encima del gel. Nota: todos los pozos del gel deben llenarse de búfer. Figura 12: verter suavemente el búfer en la cubeta Figura 13: Gel totalmente cubierto con búfer TBE I n m a c u l a d a E s p á r r a g o Página 6

7 2. Aplicación de las muestras Antes de aplicar las muestras colocar el tanque con gel en el lugar donde se va a hacer la electroforesis. Después de la aplicación de las muestras la cubeta no se debe tocar o mover. De cada una de las cuatro muestras de ADN retirar una fracción de aproximadamente 10 μl a un nuevo tubo y agregar alrededor de 5 μl de aplicación de búfer (líquido azul) para dar la densidad y permitir su visualización, tras la electroforesis en gel de agarosa. El volumen de muestras no excederá de 10 μl por ventana, ya con el búfer (azul) incluido. Coloca las muestras de ADN de forma secuencial en los pozos anotando qué muestra colocaste en cada uno Evita utilizar los pozos de los extremos ya que ahí las muestras migran de forma menos homogénea. Puedes dejar pozos sin muestras entre pozos con muestra. Figura 15: Aplicación de muestra en un pozo de gel 3. Separar los fragmentos por electroforesis Después de la preparación del gel y la colocación de muestras: -Coloca la tapa en la tina -Conectar los electrodos (negro al Polo negativo de las baterías; red de polo positivo) I n m a c u l a d a E s p á r r a g o Página 7

8 Figura 16: Sistema de electroforesis montado. -Verificar el paso de corriente (en los electrodos deben comenzar a liberarse pequeñas burbujas de gas, más en el lado de los pozos que en el contrario) En la figura 17: Curso de la electroforesis. Vista de burbujas de gas liberandose de electrodo. -Dejar correr la electroforesis, hasta que la banda más alejada de tinte azul oscuro alcance aproximadamente 1 cm del final del gel (alrededor del 2-3 horas) - Desconecta los electrodos -Quitar el gel cuidadosamente -Colocar el gel en un contenedor adecuado tras la electroforesis. Preferiblemente, el contenedor debe ser una bandeja de vidrio, poco más grande que el gel, pero con una profundidad suficiente para cubrir el gel con tinte. Nota: Durante la electroforesis es normal el depósito de cristales de sal sobre el electrodo, dentro del tanque, formando una pasta que envuelve el electrodo. Esta sustancia no interfiere con la separación de los fragmentos y puede eliminarse al final de la electroforesis retirando el búfer del tanque y frotando el electrodo con el dedo o un estropajo, suavemente, bajo agua corriente. I n m a c u l a d a E s p á r r a g o Página 8

9 4. Coloración del gel -Cubrir el gel totalmente con tinte (Nilo Azul) preparado como se ha descrito anteriormente. -Dejar teñir durante toda la noche. -Quitar el tinte y verterlo en la botella ya que se puede reutilizar. -Colocar el gel sobre un sobre una superficie blanca iluminada por debajo. Figura El resultado debe ser parecido a este 5. Contabilizar las bandas Cuenta el número de bandas que aparecen en cada muestra. 6. Análisis de resultados PREGUNTAS 1.- De los cuatro, cuáles son homocigóticos y cuáles heterocigóticos? Razona la respuesta Respuesta 2.- Cuál de los dos padres puede eliminarse? Por qué? Respuesta 3.- Podemos asegurar al 100% que el perro eliminado no es el padre de Milú? Respuesta I n m a c u l a d a E s p á r r a g o Página 9

10 4.- En relación con el animal que se ha eliminado, podemos decir, con una certeza absoluta, que no es el padre? Respuesta 5.- Ha sido engañado el Sr. Cánido por el criador de perros? Respuesta NOTA: Para la realización de esta práctica de biotecnología se ha empleado el KIT BIOGENIUS I n m a c u l a d a E s p á r r a g o Página 10