ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD DE ADN DE CLOROPLASTOS EN Quercus ilex L., Q. suber L. Y Q. coccifera L..

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1 ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD DE ADN DE CLOROPLASTOS EN Quercus ilex L., Q. suber L. Y Q. coccifera L.. C. COLLADA 1, P. JIMÉNEZ 2 Y L. GIL 2 1 Departamento de Biotecnología, ETSI Montes, Ciudad Universitaria s/n, Madrid, Spain 2 Unidad de Anatomía, Fisiología y Genética, ETSI Montes, Ciudad Universitaria s/n Madrid, Spain RESUMEN Se ha analizado mediante PCR-RFLP la variación del ADN de cloroplasto (cp) y mitocondria (mt) en 14 sistemas forestales (13 con Q. suber, 12 con Q. ilex y 6 con Q. coccifera) situadas a lo largo del área de distribución natural de dichas especies. Se han utilizado 5 pares de cebadores para ADNcp y uno para ADNmt, cada uno en combinación con un enzima de restricción. El número de haplotipos diferentes detectados es de 29; uno de ellos, es característico de Q. suber y muy divergente de los restantes. En las poblaciones en las que hay varias especies, generalmente no comparten haplotipos. La distribución de los haplotipos apunta una estructuración geográfica. Los niveles de diversidad son similares a los obtenidos para los robles. Q. ilex muestra el mayor valor de diversidad intrapoblacional (h S =0,262) Los coeficientes de diferenciación (Gst) son similares en las tres especies e indican una alta estructuración típica de marcadores maternos. P.C.: ADN de cloroplasto, variabilidad, Quercus, haplotipos, distribución geográfica, filogenia SUMMARY Chloroplast (Cp) and mitochondrial (mt) DNA variation have been studied by PCR-RFLP in 14 location (13 with Q. suber, 12 with Q. ilex and 6 with Q. coccifera) along the natural distribution area of these species in the Iberian Peninsula. Five chloroplast DNA primers pairs and one mitochondrial DNA primer pair have been used, each one in combination with a restriction enzyme. 29 different haplotypes have been detected, In the case of Q. suber a characteristic haplotype, very divergent of the remaining ones has been described. Usually, species don t share haplotypes within the same populations. The distribution of haplotypes suggests a geographical structuring. The levels of genetic differentiation are similar to those obtained in oaks.h S is significantly higher in Q. ilex (h S =0,262). Differentiation coefficients (Gst) are similar in the three species and indicate a high typical structuring of maternal markers. K.W.: chloroplast DNA, differentiation, Quercus, haplotypes, geographic distribution, phylogeny INTRODUCCIÓN El análisis de la variabilidad del ADN de cloroplasto constituye una poderosa herramienta en estudios de filogenia y su relación con la distribución geográfica de los haplotipos El ADN de cloroplasto, al igual que el de mitocondrias es una molécula cuya secuencia esta muy conservada en plantas (Wolfe et al. 1987), lo que supone una limitación para su utilización en estudios de variabilidad intraespecífica; a pesar de ello en algunas especies se ha podido detectar variabilidad suficiente para realizar estudios de filogenia (Soltis et al. 1989, Byrne & Moran 1994, Demesure et al. 1996). Este es el caso de los robles, donde el cloroplasto, de transmisión materna exclusivamente (Dumolin et al. 1995), muestra una alta diversidad interpoblacional y escasa intrapoblacional. Este hecho ha permitido la caracterización de los niveles de diversidad de la especie, así como el establecimiento de linajes y de rutas de migración para los mismos. Estudios llevados a cabo con robles caducifolios de la Península Ibérica (Dumolin-Lapègue et al. 1997, Herrán et al. 1999) han establecido la existencia de un flujo genético entre las distintas especies, de forma que no existe un haplotipo característico de cada una de las estirpes. De igual modo, se ha comprobado la existencia de diversos refugios glaciares dentro de la Península.

2 Las especies esclerófilas del género Quercus (Q. ilex, Q. suber y Q. coccifera) comparten gran parte del área de distribución a lo largo de la Península Ibérica, con unos requisitos ecológicos que se solapan y por tanto con abundancia de masas mixtas. La encina y el alcornoque están sometidos a manejos similares lo que determina unos problemas comunes a la hora de su conservación. Se ha descrito la existencia de híbridos a pesar de su pertenencia a distintos subgéneros, [Q.suber-subgénero Cerris y Q. ilex subgénero Sclerophyllodris (Amaral Franco, 1990)], lo que conlleva un intercambio genético entre ellos. En el caso de la coscoja la situación es diferente, se trata de una especie de carácter arbustivo y escaso interés económico aunque no hay que olvidar su importante papel ecológico en el área mediterránea. La cercanía filogenética de la encina y la coscoja, pertenecientes al mismo subgénero, y la existencia de híbridos nos han impulsado a incluir a la última en los estudios de variación genética, pues probablemente ambas compartirá parte del genoma, de modo similar a lo que ocurre en las especies del subgénero Quercus (Zanetto et al. 1994, Dumolin-Lapègue et al. 1999). En este trabajo se estudia la variabilidad de ADNcp de los Quercus esclerófilos, las relaciones filogenéticas maternas entre las distintas especies y su estructura geográfica en la Península Ibérica, usando la técnica de PCR-RFLP. MATERIAL Y MÉTODOS Material vegetal. Se ha realizado un muestreo de 13 poblaciones de alcornoque, 12 de encina y 6 de coscoja, situadas en 14 localidades del área natural de distribución de estas especies en la Península Ibérica (Fig.1).En las zonas muestreadas coexisten al menos dos de las tres especies. De cada población se eligieron por lo general 10 árboles separados 50 metros. Figura 1. Mapa de la Península Ibérica en el que se localizan las poblaciones muestreadas. Abreviaturas: S (Q. suber), I (Q. ilex) y C (Q. coccifera). PCR-RFLP. La extracción de ADN se realizó a partir de hoja siguiendo el método descrito por Dumolin et al. (1995). Se usaron 5 pares de cebadores específicos de cloroplasto y uno de mitocondria para la amplificación del ADN (Tabla 1). Las amplificaciones se llevaron a cabo según el protocolo descrito por Demesure et al. (1995). Los productos resultantes de la amplificación se digirieron con un único enzima de restricción como se indica en la Tabla 1. Los fragmentos de restricción se separaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 8%, usando un tampón Tris-Bórico-EDTA (1x). Los geles se tiñeron con nitrato de plata. Se uso como patrón para calcular el tamaño de los fragmentos el marcador de 1kb de Gibco BRL. Tabla 1. Lista de cedadores utilizados en el estudio Cebador 1 Cebador 2 Abr Cloroplasto Peso Molecular del fragmento Enzima de Restricción trnc [trna-cys(gca)] trnd [trna-asp(guc)] a 3860 tipo ilex CD TaqI 3290 tipo suber trnd [trna-asp(guc)] trnt [trna-thr(ggu)] a 1730 TaqI DT trnt [trna-thr(gug)] trnf [trna-phe(ugu)] b TF 1840 HinfI

3 psaa[psi (P700 apoproteina A1)] trns[trna-ser(gga)] a AS 3510 HinfI trns[trna-ser(gcu)] trnr[trna-arg(ucu)] c SR 2050 HinfI Mitocondria nad7exon 2 nad7 exon3 a nad7/ HinfI a Demesure et al. (1995); b Taberlet et al. (1991); c Grivet, sin publicar Los polimorfismos detectados con este método corresponden a mutaciones puntuales que afectan a un punto de corte del enzima de restricción, inserciones o deleciones. Los fragmentos polimórficos se numeraron por orden decreciente de tamaño. Los haplotipos se definen como diferentes combinaciones de variantes de longitud en los distintos fragmentos polimórficos. Análisis de los datos. Los parámetros de diversidad para cada especie (h S, h T y G ST ) se calcularon de acuerdo a Pons y Petit (1995) usando el programa HAPLODIV (Petit, 1995). Las relaciones filogenéticas entre haplotipos se establecieron mediante el metodo de Fitch-Margoliash, usando la opción Fitch del PHYLIP 3.5 (Felsenstein 1993). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Después de la digestión de los fragmentos de amplificación de ADNcp con los enzimas de restricción que se indican en la Tabla 1 se obtuvieron 26 fragmentos polimórficos, que dieron lugar a 29 haplotipos. La amplificación del ADNmt y posterior digestión da lugar a un único fragmento polimórfico con dos variantes; la de mayor movilidad está asociada únicamente al haplotipo 1, presente sólo en alcornoque. A esta variante de ADNmt la denominamos tipo suber y la consideramos característica de Q. suber. La de menor movilidad, aparece en el resto de los haplotipos, ya sean de encina, coscoja o alcornoque; la consideramos como la propia de Q. ilex y Q. coccifera y la designamos como variante tipo ilex. La composición genética de las poblaciones analizadas se muestra en la Tabla 2. Las poblaciones fueron monomórficas en el caso de la coscoja, mientras que en el caso de Q. suber solo se observan polimorfismos en 2 de las 13 poblaciones analizadas. Para la encina 8 de 12 poblaciones fueron polimórficas. De los 139 ejemplares de Q. suber analizados 39 presentaron haplotipos tipo ilex ; en el caso de Q. ilex, sólo se encontró un individuo con haplotipo tipo suber y en el caso de la coscoja ninguno. De los 8 haplotipos de tipo ilex presentes en Q. suber sólo tres están presentes en encina y/o coscoja, si bien los otros 5 muestran una cercanía filogenética con los haplotipos presentes en encina. Todas las muestras de Q. coccifera mostraron únicamente haplotipos de tipo ilex y en tres de las cuatro localidades en que aparecen juntas comparten la misma variante (Tabla 2). No se observa una agrupación de haplotipos propios de Q. coccifera frente a Q. ilex, por lo que debemos considerar a ambas especies como un único grupo ilex-coccifera desde el punto de vista del genoma citoplasmático. Esto se suma a las escasas diferencias existentes también a nivel polínico o a nivel de ARN ribosómico (Manos et al. 1999) y que han hecho que taxónomicamente se agrupen juntas dentro del subgénero Cerris (Nixon 1993). Tabla 2. Composición genética de las trece poblaciones analizadas. Haplotipos Población sp Nt Q.c Aracena Q.s Azaruja Q.i Q.c Coín Q.i Constantina El Pardo Q.i Q.s Q.i Gabriel y Q.i 10 10

4 Galán Q.s Guetaria Liébana Mata dos Medos Puebla de Alcocer Sª Arrábida Sª Espadán Selladores Montseny Q.i 5 5 Q.s 6 6 Q.i Q.s Q.c 5 5 Q.c 9 9 Q.i Q.s Q.c 5 5 Q.i Q.i Q.c 4 4 Q.i 5 5 Q.s Q.i Q.c (Q. coccifera),q.i (Q. ilex) y Q.s (Q. suber) Las relaciones filogenéticas entre los haplotipos se analizaron mediante la construcción de una matriz de distancias a partir del número de diferencias en los patrones de restricción. Mediante el programa Fitch se generó el árbol filogenético que se muestra en la Figura 2. Los resultados muestran cómo H1 (tipo suber ) está muy alejado del resto de haplotipos. Dentro de los haplotipos de tipo ilex, puede apreciarse la existencia de 2 linajes. El primero incluye las poblaciones del este y norte así como una andaluza y otra extremeña. El segundo se extiende prácticamente por todo el territorio estudiado, siendo de destacar la existencia de una mezcla de ambos linajes en Cataluña y Castellón. Figura 2. Relaciones filogenéticas de los 29 haplotipos descritos, obtenidas mediante el método de Fitch a partir de la matriz de distancias. Los haplotipos se corresponden con los de la Tabla 2.

5 Los niveles de diversidad para las distintas especies se establecieron a partir de las frecuencias haplotípicas en cada población, mediante la estimación de la diversidad intrapoblacional h S, diversidad total h T y el coeficiente de diferenciación entre poblaciones G ST (Tabla 3). Los mayores niveles de diversidad corresponden a Q. ilex y Q. coccifera, la primera presenta también los menores niveles de diferenciación interpoblacional. En el caso Tabla 3. Análisis de diversidad Q. suber Q. ilex Q. coccifera h S 0,099 0,262 0,092 h T 0,568 1,000 1,000 G ST 0,825 0,737 0,907 de Q. suber se ha encontrado en las poblaciones analizadas un único haplotipo característico de esta especie que coincide con el que se encuentra mayoritariamente en Marruecos (Belahbib et al. env). Frente a esta uniformidad, se han encontrado 28 haplotipo de ADNcp tipo ilex ( 19 en Q. ilex 6 en Q. coccifera y 8 en Q. suber), prácticamente cada población de encina o coscoja es diferente, lo que se refleja en los altos valores de G ST. La alta variabilidad de encina hace pensar en la validez de estos marcadores como herramientas para la identificación del origen del material forestal de reproducción de la especie, si bien es necesario contar con información procedente de un mayor número de poblaciones. AGRADECIMIENTOS Esta investigación ha sido financiada por la DGCN a través del convenio Evaluación y conservación de los recursos genéticos de los Quercus esclerófilos mediterráneos en España establecido con la UPM y por el proyecto REN GLO del Ministerio de Ciencia y Tecnología. BIBLIOGRAFIA AMARAL FRANCO, J; (1990). Quercus L. En: Castroviejo, S et al. (eds). Flora Ibérica. Vol II. Real Jardín Botánico, CSIC, Madrid 897 pp. BELAHBIB, N; PEMONGE, MH; OUASSOU, A; KREMER, A & PETIT, RJ; (2001). Chloroplast and mitochondrial DNA exchange between Quercus suber and Q. ilex (Fagaceae) in Morocco. BYRE, M & MORAN, GF;(1994). Population divergence in the chloroplast genome of Eucalyptus nitens. Heredity, 73, DEMESURE, B; SODZI, N & PETIT, RJ; (1995). A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants. Mol Ecol. 4, DEMESURE, B; COMPS, B & PETIT, RJ; (1996). Chloroplast DNA phylogeography of the common beech (Fagus sylvatica L.) in Europe. Evolution, 50, DUMOLIN, S; DEMESURE, B & PETIT, RJ; (1995) Inheritance of chloroplast and mitochondrial genomes in pedunculate oak investigated with an efficient PCR method. TAG, 92, DUMOLIN-LAPÈGUE, S; DEMESURE, B; FINESCHI, S & PETIT, RJ; (1997). Phylogeographic structure of white oaks throughout the European continent. Genetics. 146, DUMOLIN-LAPÈGUE, S; KREMER, A & PETIT, RJ; (1999). Are chloroplast and mitochondrial DNA variation species independent in oaks?. Evolution. 53, FELSENSTEIN, J; (1993). PHYLIP. Phylogeny inference package, version Department of Genetics, University of Washington, Seattle, Washington. HERRÁN, A; ESPINEL, S & GOICOECHEA, PG; (1999). Utilización del polimorfismo del ADN de cloroplastos para definir regiones de procedencia materna en robles blancos de la Península Ibérica. Investigación agraria, Sistemas y Recursos Forestales. 8(1), MANOS, PS; DOYLE, JJ & NIXON, KC; (1999).Phylogeny, biogeography, and proceses of molecular differentiation in Quercus subgenus Quercus (Fagaceae). Mol Phylog Evol. 12,

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