VARIABILIDAD GENÉTICA EN POBLACIONES CULTIVADAS DE LENGUADO SENEGALÉS (Solea senegalensis KAUP) EN BASE A MARCADORES MOLECULARES MITOCONDRIALES

Transcripción

1 VARIABILIDAD GENÉTICA EN POBLACIONES CULTIVADAS DE LENGUADO SENEGALÉS (Solea senegalensis KAUP) EN BASE A MARCADORES MOLECULARES MITOCONDRIALES Manchado, M.; Catanese, G.; Funes, V.; Perez, L.; Infante, C. LABORATORIO DE IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES PESQUERAS Y ACUÍCOLAS CICEM EL TORUÑO. EL PUERTO SANTA MARÍA CONSEJERÍA DE AGRICULTURA Y PESCA. JUNTA DE ANDALUCIA

2 IMPORTANCIA EN ACUICULTURA CARACTERÍSTICAS PRODUCTIVAS COMERCIALIZACIÓN DEMANDA DE CONOCIMIENTOS REPRODUCCIÓN PATOLOGÍA GENÉTICA Larvas de Solea senegalensis

3 PRODUCCIÓN EN CAUTIVIDAD CICEM El Toruño comenzó su cultivo en los 90. Desde entonces, se han obtenido, de forma sistemática, puestas periódicas en condiciones naturales de termoperíodo y fotoperíodo. Actualmente, se dispone de un colectivo de reproductores en cautividad de más de 100 ejemplares. La producción anual de este colectivo se sitúa entre millones de huevos Distribución a empresas para su cultivo en intensivo Programas de repoblación Larva de Solea senegalensis tras la metamorfosis POCA INFORMACIÓN GENÉTICA

4 MARCADORES MOLECULARES Existen 2 aplicaciones importantes de marcadores moleculares al cultivo de lenguado senegalés Información de pedigrí: Cultivo conjunto de machos y hembras Dificultad para establecer: Capacidad reproductiva--> Número efectivo de reproductores Endogamia--> Grado de parentesco Trazabilidad de características productivas Programas de repoblación: La conservación de la diversidad genética en poblaciones naturales es un reto. Diferentes marcadores moleculares se han usado para evaluar la estructura genética de las poblaciones naturales y cultivadas, realizar marcaje genético para establecer el origen de los stocks cultivados y su integración con las poblaciones nativas Instalaciones CICEM El Toruño

5 OBJETIVOS Aportar nuevos marcadores moleculares para determinar la variabilidad genética y estructura poblacional del colectivo de reproductores en cautividad Para ello, se ha aislado, por primera vez, el ADN mitocondrial de esta especie. Su estructura, contenido y principales características serán discutidas. Además, se ha analizado la región de control o D-loop (>1000 pb) en 82 reproductores para estudiar la diversidad y estructura genética de nuestro stock. Adultos Solea senegalensis

6 ADN mitocondrial Molécula circular de pequeño tamaño (~16Kb) Alto número de copias por célula Generalmente, homoplásmico Tasa evolutiva mayor que el genoma nuclear (5-10 veces) Muy compacto (no intrones con pequeños espaciadores intergénicos). HERENCIA MATERNAL: Muy sensible a deriva genética, efectos fundacionales y cuellos de botella Solea senegalensis alevin Estructura general del ADN mitocondrial

7 METODOLOGÍA 16S 1 F V L IM W leu 1 D K G R HSL T atp8 atp6 coiii nd3 nd4l 12S 16S nd1 nd2 coi coii nd4 nd5 cytb CR nd6 Q ANCY S E P 16S 2 leu 2

8 ESTRUCTURA DEL MITOGENOMA El ORDEN y CONTENIDO del mitogenoma de lenguado senegalés coincide con el modelo general de vertebrados 13 genes codificantes 3 subunidades del complejo de la citocromo c oxidasa 1 subunidad del complejo de la ubiquinol citocromo c oxidorreductasa 7 subunidades de la NADH ubiquinona oxidorreductasa 2 subunidades de la ATP sintasa 2 genes de ARN ribosómicos (12S y 16S) 22 genes de ARN transferentes 2 regiones no codificantes (D-loop y oril)

9 CARACTERÍSITICAS GENES Longitud total: 16,659 pb. CODIFICANTES Todos los genes codificantes poseen ATG como codón de inicio excepto la COI y ND1 que comienzan por GTG y la ND3 con ATA. 3 de los 13 genes codificantes (COII, ND4 y cytb) terminan en un codón truncado (T). Se cree que la terminación de estos genes se transforma en TAA tras una poliadenilación del mensajero Existen 4 regiones de solapamiento entre genes codificantes en la misma cadena. ATP8 y ATP6 comparten 10 bases, ATP6 y COIII 1 base, ND4L y ND4 7 bases mientras que ND5 and ND6 8 bases.

10 Región oril El origen de replicación de la cadena ligera (oril) se localizó dentro de un grupo de genes de ARNt (región WANCY) entre el ARNt Asn y ARNt Cys. Su tamaño fue de 51 nucleótidos. Este formaba una estructura secundaria típica consistente en un brazo de 14 nucleótidos apareados y un lazo de 11 bases ricas en timinas. La secuencia conservada 5'-GCCCG-3' se localizo en la base de este lazo dentro de trna Cys Estructura secundaria de oril

11 Región D-loop La region D-loop tuvo 1018 pb de longitud. Su contenido promedio de bases fue: 33.7 % A, 31.8% T, 21.1% C, y sólo 14.0% G para la cadena ligera. Domain I ETAS Domain II Conserved Domain III variable Presentó distintas regiones conservadas. La termination-associated sequence (TAS) se situo en la región de control cercano al ARNt Pro como un grupo de 3 repeticiones repetidas en tándem. Una secuencia homóloga a la región CSB-D se ubicó en en área central Adyacente al ARNt Phe, se identificaron los 3 bloques conservados CSB-1, CSB- 2 y CSB-3. TAS ACATATATGTATT CSB-D ATTCCTGGCATTTGGCTCT CSB-1 ATATCATGAGCATAA CSB-2 GTTAAACCCCCCCTACCCCCCC CSB-3 CTGCAAACCCCCCGGAAACA

12 HETEROPLASMIA La región D-loop de 10 individuos se amplificó por PCR usando cebadores específicos y los productos obtenidos se clonaron en células DH5α. Se secuenciaron 10 clones por individuo. Un total de 100 secuencias de a aproximadamente 1018 pb se analizaron. NO HUBO EVIDENCIA de heteroplasmia de longitud o secuencia en los individuos estudiados

13 ESTUDIO DE VARIABILIDA GENÉTICA Reserva 2 T5 GRUPO CONTROL T1 T2 AÑO 1999 T3 T4 Reserva 1 AÑO 2001 Río S. Pedro Reserva 1 muy influencia por el agua del Río S. Pedro Reserva 2, muy aislada y se supone que sólo contiene animales salvajes

14 DATOS HAPLOTÍPICOS Todos los animales se creen inicialmente de origen salvaje La región D-loop se secuenció en un total de 82 individuos Individuos Haplotipos Diversidad haplotípica Diversidad nucleotídica T % Reserva 1 T2 T % 0.3 % T % Reserva 2 T %

15 FRECUENCIA DE HAPLOTIPOS nº individuos Se hallaron un total de 39 haplotipos El haplotipo 1 se detectó 37 veces, aproximadamente el 45% de los individuos analizados El haplotipo 2 y 3 se presentaron 3 veces mientras que los haplotipos 7, 11 y 26 sólo dos. El resto de haplotipos eran únicos

16 Distribución haplotipo 1 El haplotipo 1 se observó en todos los tanques Sin embargo, no estaba uniformemente distribuido entre ellos Este haplotipo fue más frecuente en los tanques de la reserva 1 (T1-T4). Estos valores oscilaban entre el 47% al 62 %. En el tanque control este valor fue de tan solo el 13%

17 Haplotipo 1. Ratio H/M Si consideramos la relación H/M para los individuos del haplotipo 1, encontramos que los animales de la misma reserva y año tenían valores semejantes. Tanques 1 y 2 poseían un ratio de 4.3 y 6 respectivamente. Los tanques 3 y4 tenían valores de 0.4 y 0.6 respectivamente mientras que el tanque control no poseía hembras de este haplotipo. Estos datos son muy importantes porque un total de 10 y 6 hembras en los T1 y T2 comparten este mismo haplotipo. Esto dificultaría el uso de este marcador molecular para la trazabilidad de las puestas en las hembras para estos dos tanques

18 MINIMUN SPANNING TREES Tank 1 Estos árboles representan la variabilidad haplotípica encontrada en los 5 grupos estudiados. Los haplotipos encontrados en cada lote se indican mediante círculos negros. Su tamaño es propocional a la frecuencia de este haplotipo en cada tanque. El haplotipo 1 se observó en ambos tanques y fue el más frecuente. Tank 2 La distribución de haplotipos fue muy similar en ambos tanques.

19 MINIMUN SPANNING TREES Tank 3 Tank 4 Tank 5 Los tanques 3 y 4 presentaron una frecuencia y un patrón de distribución similar a lo observado en los tanques anteriores Por el contrario, el tanque 5 presenta una baja frecuencia del haplotipo 1 aunque con un patrón de distribución muy similar.

20 RESULTADOS AMOVA JERÁRQUICA* 3 Groups definidos: T1 y T2 T3 y T4 T5 *Basada en frecuencias haplotípicas Source of variation d.f. Variance components Percentage of variation Fixation indices P value Among groups Among populations within groups ns * Within populations * AMOVA mostraron que la mayor variación se encuentra dentro de las poblaciones (>96%). Los grupos definidos no mostraron diferenciación mientras las poblaciones dentro de grupo mostraron diferencias significativas Al calcular la probabilidad asociada a los valores de Fst entre poblaciones, el grupo control se diferenció significativamente de los tanques T1, T3 y T4

21 CONCLUSIONES El contenido y orden de los genes del mitogenoma del lenguado senegalés era similar a otros teleósteos La ausencia de heteroplasmia observada en tamaño y secuencia posibilita la secuenciación directa de los fragmentos de PCR sin clonación previa como método rápido y fiable para asignar el parentesco y estudios de estructura genética La región de control ha demostrado su utilidad para estudios de variabilidad genética en el banco de reproductores. De forma genérica, se pude decir que se ha detectado una alta diversidad haplotípica. Esto posibilita que este marcador sea usado para monitorizar la conducta reproductiva de las hembras (a excepción de aquellas de los tanques 1 y 2)

22 CONCLUSIONES Sobre estructura genética, no hubo diferenciación en los grupos de animales observados. La alta presencia del haplotipo 1 en los grupos de animales de la reserva 1 indica que estas poblaciones salvajes están expuestas a un proceso importante de deriva genética en el que descendencia de nuestro banco de reproductores han sido englobados en las poblaciones naturales.