Aportaciones del laboratorio en el diagnóstico y el tratamiento del paciente intoxicado.

Transcripción

1 Aportaciones del laboratorio en el diagnóstico y el tratamiento del paciente intoxicado. Dpto. Toxicología y Legislación Sanitaria, Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid Dra. Ana María López Parra

2 Esquema Introducción. Muestras. Envasado, conservación y almacenamiento. Análisis químico-toxicológico. Métodos de extracción. Detección e identificación del tóxico: técnicas espectrofotométricas técnicas cromatográficas técnicas inmunoquímicas

3 La investigación toxicológica es el conjunto de procesos analíticos que tienen por objeto el aislamiento, identificación y determinación cuantitativa de los tóxicos, tanto en el vivo como en el cadáver, con el fin de permitir el diagnóstico de la intoxicación. Introducción

4 Contenido gástrico Sangre Orina Pelo Saliva Meconio Muestras

5 Muestras Contenido gástrico -Vómito, aspirado gástrico y lavados estomacales. -En el caso de los lavados estomacales, primer lavado. -Un volumen de aproximadamente 20 ml. -Puede ser necesario procedimientos de homogenización, filtración y/o centrifugación. -No representa grado de intoxicación.

6 Muestras Sangre -Es una de las muestras más útiles para la identificación y especialmente para el análisis cuantitativo. -La sangre total y el plasma son las muestras más representativas. -Recoger la muestra en tubos con heparina o EDTA como anticoagulante. -Si se sospecha de intoxicación con etanol, utilizar fluoruro sódico como conservante. Y la extracción deberá efectuarse desinfectando la zona con cloruro mercúrico.

7 Muestras Orina -Ensayos preliminares en el screening de tóxicos. -Para drogas de abuso. -La concentración de un tóxico puede llegar a ser 100 veces mayor que en la sangre. -Se debe de tomar antes del tratamiento. -Como mínimo 50 ml.

8 Muestras Pelo -Tóxicos minerales -Detección de drogas de abuso. -Refleja el estado promedio de los elementos minerales del organismo durante su crecimiento.

9 Muestras Saliva. -Correlación de los análisis séricos con drogas de abuso y psicofármacos. Meconio. Drager DrugCheck Kit -Meconio: líquido amniótico, moco, lanugo, bilis y células que se han desprendido de la piel y del tracto intestinal. -Identificación de drogas durante la gestación.

10 Muestras Hígado -Niveles de tóxicos superiores a los de la sangre. -Especialmente útil cuando no se puede disponer de sangre. -Evitar contaminación por bilis. -Evitar añadir conservantes.

11 Envasado y conservación Tapones PTFE (polytetrafluoroethylene) Conservantes: Azida sódica (0,1%, p/v) Fluoruro sódico (1%, p/v) Anticoagulante: - Heparina -EDTA - Oxalato potásico (0,5%, p/v).

12 Almacenamiento Factores que intervienen: Luz Temperatura Hidrólisis Oxidación Descomposición biológica

13 Análisis químico mico-toxicológico 1. Separación o extracción del tóxico de la muestra. 2. Detección e identificación del tóxico. 3. Cuantificación.

14 Métodos de extracción Finalidad: Aislamiento y purificación del tóxico Concentración del tóxico en el extracto obtenido Parte de la muestra se reserva íntegra Desde el punto de vista analítico los tóxicos se dividen en: Tóxicos volátiles Tóxicos gaseosos Tóxicos orgánicos fijos o extraíbles Tóxicos inorgánicos o minerales

15 Métodos de extracción n de tóxicos volátiles Aquellos que se volatilizan por debajo de los 100ºC, por lo cual son arrastrados por el vapor de agua cuando ésta destila (alcohol etílico, alcohol metílico, benceno, fenoles,...).

16 Métodos de extracción n de tóxicos volátiles Las técnicas son: -Destilación simple. -Destilación fraccionada. -Destilación directa al vacío. -Destilación por arrastre en corriente de vapor. -Microdifusión. -Técnica de espacio de cabeza ("head space" ).

17 Destilación n simple Muestra problema Tóxico volátil extraído

18 Destilación n fraccionada Separación según puntos de ebullición

19 Microdifusión Camara de Conway Análisis Muestra Agente liberador Compartimento interior Tiempo de difusión Acetaldehído 3 ml de sangre 3-4 gotas de 3,3 ml de 3 horas 5 ml de tejido SO 4 H 2 al 10% SO 3 HNa 0,15M Acetona 3 ml de sangre 3-4 gotas de 3,3 ml de 3 horas 5 ml de tejido SO 4 H 2 al 10% SO 3 HNa 0,15M Monóxido de 1 ml de sangre 1 ml de SO 4 H 2 al 2 ml de cloruro 1 hora carbono 10% de paladio Cianuro 2-4 ml de sangre 3-4 gotas de 3,3 ml de NaOH 3 horas 5 ml de tejido SO 4 H 2 al 10% 0,1N Etanol 0,8 ml de sangre 1 ml de CO 3 K 2 al 2 ml de 3 horas 4 ml de tejido 10% dicromato potásico Formaldehído 3 ml de sangre 3-4 gotas de 3,3 ml de 3 horas 5 ml de tejido SO 4 H 2 al 10% SO 3 HNa 0,15M Hidrocarburos 1-4 ml de sangre - 1 ml de tolueno 3 horas halogenados 1-4 ml de tejido Isopropanol 2 ml de sangre 1 ml de CO 3 K 2 3,3 ml de SO 4 H 2 3 horas 5 ml de tejido al 10% Metanol 2 ml de sangre 1 ml de CO 3 K 2 3,3 ml de 3 horas 5 ml de tejido SO 3 HNa 0,15M Fenoles 2-4 ml de sangre 3-4 gotas de 3,3 ml de NaOH 3 horas 5 ml de tejido SO 4 H 2 al 10% 0,1N Sulfuro 2-4 ml de sangre 5 ml de tejido 3-4 gotas de SO 4 H 2 al 10% 3,3 ml de NaOH 0,1N 3 horas

20 Técnica de espacio de cabeza 1. La muestra se deposita en un vial cerrado con tapón perforable, en el que se deja una cámara de aire. 2. Se calienta a 60ºC durante 30 min. 3. Se extrae con una jeringa para gases una muestra de la parte superior del frasco para inyectarla en un cromatógrafo de gases.

21 Métodos de extracción n de tóxicos gaseosos Se denominan tóxicos gaseosos a todas aquellas sustancias que a temperatura ambiente se encuentran en estado gaseoso. Por ejemplo: CO, HCN, SH 2,AsH 3,SbH 3, NH 3, Cl 2, Br 2.

22 Métodos de extracción n de tóxicos gaseosos Las técnicas son: -La extracción de gases en sangre se basa en leyes físicas, según las cuales su solubilidad disminuye elevando la temperatura o disminuyendo la presión. -Mediante las mismas técnicas que para los tóxicos volátiles. -Cromatografía de gases

23 Técnicas cromatográficas Volatilización Cromatografía de gases (GC) Técnica de separación. Se basa en la diferente velocidad con que se mueven los solutos a través de un medio poroso arrastrados por un disolvente en movimiento.

24 Cromatografía a de gases *Line Base *Pico Cromatográfico *Base del Pico *Área del Pico *Altura del Pico *Anchura del Pico *Anchura del Pico a la mitad de la altura

25 Cromatografía a de gases Ventajas e inconvenientes Costoso. Personal especializado. Técnica muy sensible, fiable y rentable para determinaciones cualitativas (casi la totalidad de los tóxicos) y cuantitativas (límite de sensibilidad 1-5 µg/ml.). Posibilidad de derivación (obtener un compuesto intermedio a partir de una sustancia no volátil) hace su aplicación prácticamente universal.

26 Métodos de microextracción en fase sólidas

27 Métodos de extracción n de tóxicos orgánicos fijos Sustancias orgánicas y no volátiles. Se incluyen: *Tóxicos de origen vegetal (glucósidos, aceites esenciales, alcaloides, etc) *Productos de síntesis (medicamentos).

28 Métodos de extracción n de tóxicos orgánicos fijos Las técnicas son: -Con disolvente polar (etanol): técnica de Stas-Otto. - Con disolventes apolar: los más frecuentes son: éter etílico, cloroformo y diclorometano. Puede ser: *Directa: sólo aplicable a muestras biológicas limpias como la orina *Previa purificación de la muestra (eliminación de proteínas). Fraccionamiento del extracto antes de su análisis: Debido a la gran variedad de tóxicos orgánicos conocidos es necesario un fraccionamiento del extracto.

29 Métodos de extracción n de tóxicos orgánicos fijos Clasificación de tóxicos orgánicos en: 1. Ácidos: débiles (por ejemplo barbitúricos) o fuertes (por ejemplo salicilatos), unos y otros extraíbles con disolventes orgánicos en medio ácido. 2. Básicos: extraíbles con disolventes orgánicos en medio básico (alcaloides, antidepresivos tricíclicos, etc.) 3. Neutros: extraíbles con disolventes orgánicos en medio ácido o básico.

30 Métodos de extracción n de tóxicos orgánicos fijos Las técnicas son: -Método de electrodiálisis: se basa en la propiedad que tiene la corriente eléctrica de descomponer las sales de los tóxicos orgánicos, yendo la base hacia el polo negativo y el resto al polo positivo. -Columnas con rellenos de resinas: las drogas orgánicas son absorbidas por la resina y luego son eluidos con solventes apropiados.

31 Métodos de extracción n de tóxicos orgánicos fijos Extracción en fase sólida

32 Métodos de extracción n de tóxicos minerales o inorgánicos nicos Estos tóxicos se encuentran en el organismo firmemente unidos a albúmina, lípidos o glúcidos, siendo requisito la destrucción de la materia orgánica para poder realizar su análisis.

33 Métodos de extracción n de tóxicos t minerales o inorgánicos nicos 1. Mineralización: proceso por el cual se produce la destrucción de la materia orgánica y la consiguiente liberación del tóxico. a) Destrucción oxidativa por vía húmeda de la materia orgánica empleando ácido nítrico o mezclas de ác. nítrico-agua oxigenada, etc. b) Destrucción de materia orgánica por vía seca (calcinación). c) Formación de complejos y posteriormente se separa con disolventes orgánicos. Se pueden efectuarse combinaciones entre los distintos métodos, para obtener una muestra más apropiada.

34 Métodos de extracción n de tóxicos t minerales o inorgánicos nicos Existen métodos que no precisan la destrucción de la materia orgánica como: *Diálisis. *Ultrafiltración. *Electrodiálisis. *Desproteinización. 2. Marcha posterior de extracción

35 Detección n e identificación del tóxicot Dos etapas: 1. Rastreo o detección rápida: -Técnicas de inmunoensayo -Cromatografía en capa fina 2. Técnicas de confirmación: -Técnicas espectrofotométricas. -Técnicas cromatográficas.

36 Técnicas inmunoensayo Fundamento: Reacciones antígeno-anticuerpo. Se aplica especialmente para drogas de abuso y psicofármacos. Tóxico libre + AC Tóxico libre-ac Tóxico marcado Tóxico marcado

37 Técnicas inmunoensayo 1. Radioinmunoensayo (RIA): isótopo radioactivo. 2. Enzimoinmunoensayo: enzima. -ELISA: ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas -EMIT: inmunoensayo multiplicado por enzimas 3. Fluorescencia polarizada (FPIA): fluoróforo. 4. Inmunoanálisis por interacción cinética de partículas (KIMS): competencia por unirse al Ab y evitar formar agregados de micropartículas.

38 Técnicas inmunoensayo Su aplicación es cualitativa y cuantitativa (con patrones de concentración). Técnicas rápidas, y sensibles. Posibilidad de reacciones cruzadas.

39 Técnicas cromatográficas Cromatografía en capa fina (CCF) Fase movil Fase estacionaria Aplicaciones Cloroformo/acetona Silica gel G activada a 120ºC/30 min Todos los tipos 80:20 Desarrollo: 30 min/10 cm Isopropanol/cloroformo Silica gel G activada a 120ºC/30 min Barbitúricos Desarrollo: 30 min/10 cm Cloroformo/acetona 90:10 Silica gel G activada a 120ºC/30 min Desarrollo: min Anticonvulsionantes Sedantes no babitúricos

40 Detección n e identificación del tóxicot 2. Técnicas de confirmación: -Técnicas espectrofotométricas. -Técnicas cromatográficas.

41 Técnicas espectrofotométricas tricas Fundamento: capacidad que tienen las moléculas y los átomos de absorber radiaciones de diferente longitud de onda utilizando la energía de dichas radiaciones para producir cambios energéticos en su estructura (en los átomos transiciones electrónicas y en las moléculas movimientos electrónicos) Técnicas Aplicaciones Compuestos Análisis Espectrofotometría UV visible Orgánicos Cuali/cuantitativo Espectrofluorimetría Orgánicos Cuali/cuantitativo Espectrofotometría infrarroja Orgánicos Cualitativo Espectrofotometría de absorción atómica Metales Cuali/cuantitativo Espectrometría de masas Orgánicos Cualitativo

42 Espectrofotometría a de absorción atómica (EAA) E* Luz incidente Fluorescencia emitida E

43 Espectrofotometría a de absorción n atómica Lámpara de cátodo hueco Sistema atomizador Sistema monocromador Sistema detector La emisión de una energía electromagnética de longitud de onda determinada, se hace incidir sobre un átomo libre en estado fundamental, este átomo absorbe la energía y con lo que pasa a un estado excitado.

44 Espectrofotometría a de absorción atómica Ventajas e inconvenientes Costoso. En la interpretación de resultados considerar: contaminación en la toma y mantenimiento de las muestras, etc. Personal especializado. Técnica muy sensible, fiable y rentable. Su sensibilidad permite identificar y cuantificar metales en niveles de traza.

45 Espectrofotometría a de emsión atómica (EEA) E* Luz emitida E

46 Volatilización Ionización Espectrofotometría de masas (EM) 2.Aceleración iones 3. Separación 4. Detección Técnica cualitativa y cuantitativa. Separa partículas moleculares o atómicas según su masa.

47 Espectrofotometría a de masas Técnica cualitativa y cuantitativa. Análisis de fragmentos moleculares. Determinación de la estructura molecular. Su principal aplicación es la identificación de sustancias desconocidas

48 Espectrofotometría a de masas Ventajas e inconvenientes Costoso. Personal especializado. Acoplamiento a GC (o HPLC): método más efectivo para la identificación de tóxicos y sus metabolitos. ICP-MASAS

49 ICP-Masas ICP: Plasma de acoplamiento inducido

50 Técnicas cromatográficas Cromatografía de líquidos Cromatografía de gases

51 Técnicas cromatográficas Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

52 Cromatografía a líquida l de alta resolución n (HPLC) Ventajas e inconvenientes Costoso. Personal especializado. No destruye la muestra, lo que permite la detección por distintos sistemas en serie. Requiere mínima preparación y pequeñas cantidades. Mayor precisión que GC. En general se aplica a compuestos de alto peso molecular y polar mientras que GLC se aplica a gases permanentes y sustancias volátiles. Mejor resolución y menor tiempo de análisis.

53 Gracias por su atención