Int. Cl.: 74 Agente: Carpintero López, Francisco

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl.: C12M 1/36 ( ) C12M 3/02 ( ) 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Dispositivo y procedimiento para expansión en serie de semillas de células de mamífero. 30 Prioridad: US Titular/es: Bayer Pharmaceuticals Corporation 400 Morgan Lane West Haven, Connecticut 06516, US 45 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Heidmann, Rudiger; Mered, Mokhtar; Michaels, James, D. y Konstantinov, Konstantin 45 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Carpintero López, Francisco ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Dispositivo y procedimiento para expansión en serie de semillas de células de mamífero. 5 Antecedentes de la invención Campo Ésta invención se refiere a la fabricación de tecnología de cultivo de células de mamífero a escala y específicamente a un nuevo procedimiento de expansión en serie de semillas para células de mamífero. Se usan células crioconservadas para inocular directamente en un biorreactor de diseño reciente, que sirve como fuente de semillas para la producción a escala. Antecedentes El comienzo de una nueva expansión en serie de semillas para una campaña de producción para la expresión de un sistema de cultivo de células de mamífero es una etapa crítica del procedimiento. Las contradicciones y errores de funcionamiento a menudo ponen en peligro el procedimiento, conduciendo a retrasos significativos y a variabilidad del inóculo. En los protocolos de producción típicos, una nueva expansión en serie de semillas comienza a partir de un criovial de 1-2 ml (master working cell bank, MWCB). La concentración de células de este recipiente normalmente está en el intervalo de 5-10 millones de células/ml. Las células se descongelan, se lavan para retirar el crioprotector y se cultivan (siembran) en pequeños matraces de cultivo celular. Es una práctica convencional con cultivos celulares de mamífero usar densidades de inoculación de 0,5 a 1 x 10 6 células/ml. La siembra de células a concentraciones de células inferiores después de la crioconservación puede dar como resultado una fase de retraso prolongada antes de entrar en la fase de cultivo, mal desarrollo celular o incluso muerte celular. Esto se acentúa especialmente en los medios de cultivo sin suero o incluso sin proteínas que se ha convertido en el modus operandi para la preparación actual de cultivo celular. Las células se sub-cultivan de acuerdo con su tasa específica de crecimiento (densidad celular), y normalmente se dividen en múltiples matraces de cultivo celular cada 2-3 días. Una vez que se produce suficiente biomasa, las células se expanden en frascos de cultivo mayores tales como frascos rotativos, matraces de agitación o rotativos. Después de que se ha acumulado suficiente masa celular, se inocula en un biorreactor, que se convierte en el cultivo de semillas para el recipiente de producción a escala. Esta expansión en serie de semillas descrita es una práctica general para varias líneas celulares de mamífero y se usa ampliamente en la producción comercial y en el mundo académico. Una revisión de una expansión en serie de semillas comercial usando matraces T y matraces rotativos se da también por Whitaker y col., Journal of the American Chemical Society, páginas 28-43, Los protocolos típicos de aumento a escala que necesitan aproximadamente de cuatro a seis semanas para completarse en condiciones óptimas, son de trabajo intensivo y susceptibles a contaminación y variabilidad. Las condiciones de pequeña escala no están bien definidas - normalmente no existe punto fijado para ph y DO durante el periodo de matraz T, frasco rotativo o matraz de agitación, lo que puede conducir a más variabilidad durante todo el procedimiento y puede poner en peligro la calidad del inóculo y del producto. Sumario de la invención Se ha desarrollado un nuevo biorreactor y un procedimiento para la expansión en serie de semillas de células de mamífero. Esta tecnología elimina el uso de matraces de cultivo celular, frascos rotativos o matraces de agitación. El nuevo biorreactor de inoculación está diseñado para facilitar un procedimiento mejorado de expansión en serie de semillas de células de mamífero, y se distingue por la presencia de un pocillo de inoculación que comunica con el interior del biorreactor y que facilita el crecimiento de células de mamífero para expansión en serie comercial de semillas. El procedimiento para expansión en serie de semillas de células crioconservadas comprende el uso de un biorreactor dedicado a la inoculación que tiene un pocillo de inoculación para expandir las células antes de su transferencia a un biorreactor de producción. Más específicamente, el procedimiento comprende añadir las células crioconservadas a medios dentro del pocillo de inoculación del biorreactor de inoculación, permitiendo a las células crecer hasta una concentración predeterminada dentro del pocillo de inoculación controlando y ajustando las condiciones de los medios y el entorno, y, en lo sucesivo, aumentando gradualmente el volumen de los medios dentro del reactor de modo que se mantenga el crecimiento celular óptimo. Una vez que se han alcanzado la densidad y volumen celulares deseados, las células se transfieren a un biorreactor de producción. En una realización preferida, el biorreactor de inoculación incluye un pocillo de inoculación situado en la base de la cámara del reactor. Este pocillo de inoculación está provisto de sensores de fermentación (ph, oxígeno disuelto, temperatura, densidad óptica, etc.) para ayudar a asegurar las condiciones óptimas de cultivo. Más preferiblemente, este pocillo de inoculación se adapta para incluir un rotor impulsor mediante un dispositivo de agitación de líquidos en un tanque reactor continuamente agitado (CSTR). 2

3 Breve descripción de las figuras La Figura 1 muestra la técnica anterior del procedimiento de expansión en serie de semillas. 5 La Figura 2 muestra el procedimiento preferido de esta invención. La Figura 3 muestra el concepto del biorreactor de inoculación con pocillo de inoculación La Figura 4 muestra un cultivo de perfusión continua realizado en el biorreactor de 5 l que contiene pocillo de inoculación, comenzado con células BHK crioconservadas en la bolsa de 50 ml. Se muestran la densidad celular viable (VCD [ ]) y el perfil de viabilidad [ ]. La viabilidad celular permaneció alta durante todo el cultivo. La densidad celular diana de 20 millones de células/ml a escala de 5 l, se alcanzó en 12 días. La Figura 5 ilustra la influencia de una etapa de lavado de DMSO durante la expansión en serie de semillas de células BHK. En el cultivo de 12 l (símbolos huecos) se realizó una etapa de lavado de DMSO donde el segundo cultivo de 5 l (símbolos rellenos) se inoculó directamente sin lavar las células. Como se indica, no se observó ningún efecto negativo, la viabilidad celular así como el crecimiento celular no mostraron ninguna diferencia. La Figura 6 muestra un cultivo continuo en biorreactor de 12 l, que comienza con células BHK crioconservadas en la bolsa de 50 ml, no se realizó lavado de DMSO antes de la inoculación. Se muestran la densidad celular viable (VCD [ ]) y el perfil de viabilidad [ ]. La densidad celular diana de 20 millones de células/ml a escala de 12 l, se alcanzó en 14 días. La Figura 7 ilustra un cultivo de 5 l de células CHO recombinantes, que comienza con células CHO crioconservadas en una bolsa de 50 ml, no se realizó lavado de DMSO antes de la inoculación. Se muestran la densidad celular viable (VCD [ ]) y el perfil de viabilidad [ ]. La densidad celular diana se alcanzó en 6 días. La Figura 8a ilustra dos cultivos de 5 l que comienzan con células rbhk crioconservadas en una bolsa de 50 ml, un segundo cultivo en una bolsa de 100 ml, no se realizó lavado de DMSO antes de la inoculación. Se muestran la densidad celular viable (VCD [ ]) y el perfil de viabilidad [ ]. Las densidades celulares diana de 20 millones de células/ml a escala de 5 l se alcanzó en 10 días en los dos cultivos. La Figura 8b ilustra dos cultivos de 12 l que comienzan con células CHO recombinantes crioconservadas en bolsas de 50 ml y 100 ml, no se realizó lavado de DMSO antes de la inoculación. Se muestran la densidad celular viable (VCD [ ]) y el perfil de viabilidad [ ]. No se apreciaron efectos negativos en los dos cultivos. Realizaciones específicas Materiales y Procedimientos Este procedimiento de expansión en serie de semillas se desarrolló inicialmente a partir de una línea celular recombinante de riñón de cría de hámster (BHK) y una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) que expresaban proteínas humanas. Las células usadas para esta invención se tomaron de un biorreactor de perfusión de 12 l que contenía 20 x 10 6 células/ml. Las células se cultivaron y congelaron en medio de cultivo de células de mamífero basado en una formulación disponible en el mercado de DMEM/Ham F12 (1:1) fabricada por JRH (Lenexa, KS) o Life Technologies (Grand Island, NY), y se suplementaron con hierro, Pluronic F68 (BASF, Pardipanny, NJ), insulina humana recombinante (Humulin, Eli Lilly, Indianapolis, IN), y esencialmente libre de otras proteínas. El medio de congelación contenía dimetilsulfóxido al 7,5% (Sigma St. Louis, MO) como crioprotector. Las bolsas de crioconservación (Cryocite TM 250 ml o 500 ml, Nexell Therapeutics Inc. Irvine, CA) usadas para almacenamiento contenían ml de suspensión celular y se congelaron en un congelador a -40ºC (Revco, Asheville, NC) antes de transferirlas a un congelador de N 2 líquido (Forma Scientific, OH). Las células se concentraron a aproximadamente 40 x 10 6 células/ml en 50 ml, o a 20 x 10 6 células/ml en 100 ml para asegurar una densidad celular inicial en el biorreactor de 1 millón de células/ml en 2 l de volumen. Comúnmente se usan densidades celulares de 0,5-1 x 10 6 células/ml para iniciar un nuevo procedimiento de expansión en serie de semillas. Las células BHK en la bolsa de crioconservación se descongelaron usando un baño de agua a 37ºC. La suspensión celular se transfirió a un tubo de centrífuga, se diluyó con medio recién preparado (1:1) y se centrifugó suavemente a rpm. El sobrenadante se descarto, el precipitado celular se resuspendió en medio recién preparado y se transfirió a un frasco estéril para inocular el biorreactor con pocillo de inoculación. Esta etapa de lavado se usa para retirar la mayoría del DMSO y es práctica común en el cultivo de células de mamífero. Más adelante, esta etapa de lavado de DMSO se eliminó y las células se transfirieron directamente al biorreactor desde la bolsa. (La eliminación de la etapa de lavado de DMSO permite el manejo y mantenimiento de un sistema cerrado, reduciendo de este modo la oportunidad de contaminación del sistema. Véase el Ejemplo 2). La misma tecnología se usó también para células CHO recombinantes. 3

4 Se usaron dos biorreactores diferentes. Sin embargo, los dos tenían la característica común de ser capaces de inocular en un pocillo de inoculación de 2 l de volumen Se realizaron cultivos de 5 l en biorreactores Applikon de 7 l (Schiedam, Países Bajos) equipados con una frita de acero inoxidable sinterizado (Mott Metallurgical, Farmington CT) para aireación. Se usó un dispositivo de separación celular para retener a las células dentro del recipiente y para permitir el funcionamiento en modo de perfusión continua. El sistema reactor es capaz de soportar al menos 20 millones de células/ml en 5 l de volumen. Se midieron el ph, el oxígeno disuelto, la temperatura, y la densidad óptica mediante sondas que se sumergieron en el cultivo cuando se usaba un volumen de al menos 2 l. El reactor se diseña con un pocillo de inoculación de acero inoxidable de 2 l de volumen. 2. Se realizaron cultivos de 12 l en un biorreactor de diseño personalizado de 15 l. El pocillo de inoculación de acero inoxidable era el mismo (2 l de volumen) que en el recipiente de 7 l. Sin embargo, se usó un reborde cónico para prolongar el diámetro y el volumen de la parte superior (figura 3). Se proporcionó aireación a través de una frita de acero inoxidable sinterizado (Mott Metallurgical, Farmington CT). Se usó un dispositivo de separación celular para tecnología de perfusión continua. Este sistema de reactor es capaz de soportar al menos 20 millones de células/ml en un volumen de trabajo de 12 l. Los dos sistemas de biorreactor se controlaron usando una DCU B. Braun (Unidad de Control Digital, B. Braun International, Melsungen, Alemania) en condiciones de funcionamiento como se ha indicado en otra parte. Las relaciones entre el tamaño y la densidad celular del crio-recipiente usado y el pocillo de inoculación (V RI min ) del reactor de inoculación puede determinarse mediante la siguiente fórmula: V RI min = X bolsa V bolsa X RI de partida donde X bolsa es la densidad celular en el crio-recipiente y V bolsa el volumen. X RI de partida es la densidad celular de partida deseada en el pocillo de inoculación del reactor de inoculación, normalmente 1 x 10 6 células/ml. El volumen final del reactor de inoculación (V RI max ) depende del volumen del reactor de producción que se usará y puede determinarse mediante la fórmula: V RI max = X RP V RP x RI Donde X RP es la densidad celular de partida diana en el biorreactor de producción (normalmente 1 x 10 6 células/ml), V RP el volumen del reactor de producción, y X RI la densidad celular final en el biorreactor de inoculación. El pocillo de inoculación del biorreactor normalmente será pequeño (en los presentes ejemplos se usó un pocillo de inoculación de 2 l) y el volumen puede aumentar aumentando el diámetro y la altura del biorreactor. Puesto que V RI max no es limitante, puede aplicarse el mismo concepto de pocillo de inoculación al diseño de biorreactores más grandes (véase la figura 3). Los cultivos realizados en los sistemas de 7 y 12 l tenían un volumen inicial de 2 l. Este es el volumen mínimo necesario para sumergir los electrodos de ph, oxígeno disuelto del biorreactor, así como el sensor de temperatura. La aireación se realiza usando aireación de la parte superior justo después de la inoculación. El volumen aumenta por etapas para mantener la densidad celular entre 0,8 y 1,2 x 10 6 células/ml. Se usa oxigenación mediante dispersión de gas una vez que el volumen alcanza los cuatro litros. La tasa de perfusión específica de células se mantuvo a 0,5-0,7 nl/célula/día en todo momento. Se realizó un muestreo fuera de línea diariamente para determinar las concentraciones celulares y de metabolitos. Se determinaron los recuentos y la viabilidad celulares usando un hematocitómetro y el procedimiento de exclusión por azul de tripano. Se usó un analizador YSI (Yellow Spring Instruments) para medir las concentraciones de glucosa, lactosa, glutamato y glutamina de las muestras. La LDH y el amoniaco se midieron usando un Bioanalizador Kodak (Kodak Instruments, NY). Se usó un analizador de gas en sangre NOVA (Nova Biomedical, Walthman, Mass.) para medir el nivel de CO 2 disuelto y para comprobar los valores de ph y oxígeno disuelto. Se analizó la actividad rfviii en las muestras mediante el procedimiento de coagulación en una etapa. La calidad del producto se determinó mediante un ensayo de transferencia de Western de desarrollo propio. Ejemplo 1 La Figura 4 muestra un cultivo de perfusión de 12 l. Se usaron 50 ml de suspensión celular crioconservada en una bolsa EVA para inoculación. Las células se lavaron con medio recién preparado para retirar el DMSO antes de la inoculación. El cultivo estaba a un volumen inicial de 2 l con aireación de la parte superior. La viabilidad celular superaba el 95% durante todo el procedimiento y el volumen aumentaba por etapas en base a la densidad celular. Se usó dispersión de gas una vez que el volumen estaba en 4 l. la perfusión continua de medio se inició un día después de que el volumen alcanzó 12 l. La tasa de perfusión se mantuvo a 0,5-0,7 nl/célula/día. La densidad celular diana 4

5 5 10 de 20 x 10 6 células/ml se alcanzó después de 11 días. El experimento de expansión en serie de semillas demuestra claramente la elegancia de esta tecnología de multiplicación. No se usaron matraces de cultivo celular intermedios, se redujo de manera drástica el riesgo de posible contaminación, los medios y el entorno se controlaron externamente, y como resultado el tiempo para poner en marcha un biorreactor de producción se redujo en al menos el 70%. Ejemplo 2 Se evaluó la necesidad de la etapa de retirada de DMSO (lavado/dilución) antes de la inoculación. En esta evaluación, se pusieron en marcha dos biorreactores de forma paralela a partir del mismo lote de bolsas congeladas de 50 ml. Reactor de 12 l donde se realizó una etapa de lavado de DMSO Reactor de 5 l donde se omitió una etapa de lavado de DMSO. Los dos cultivos se realizaron en las mismas condiciones (etapas de aumento de volumen, aireación de la parte superior y tasas de dispersión, etc.). El cultivo de 5 l alcanzó la densidad celular diana de 20 x 10 6 células/ml en 11 días, el cultivo de 12 l un día después. La Figura 5 muestra una comparación entre estos dos cultivos. No se apreciaron diferencias en crecimiento o viabilidad celulares. La eliminación de la etapa de lavado de DMSO hace más eficiente aún el procedimiento de expansión en serie de semillas (a partir de la descongelación de células) y permite el cierre del sistema durante todo el procedimiento. Ejemplo La Figura 6 muestra el perfil temporal de un cultivo realizado en el reactor con pocillo de inoculación de 12 l. Se usaron 50 ml de suspensión celular, crioconservados en una bolsa, para inoculación sin un lavado de DMSO. La densidad celular diana de 20 x 10 6 células/ml se alcanzó después de 16 días. Ejemplo 4 La Figura 7 muestra el perfil temporal de un cultivo de CHO realizado en el biorreactor de 5 l. Se usaron 50 ml de células crioconservados en una bolsa para inoculación. No se realizó etapa de lavado de DMSO. La densidad celular diana - aquí 10 x 10 6 células/ml, se alcanzó en 6 días. Ejemplo 5 La Figura 8a y 8b muestran los perfiles temporales de dos cultivos de BHK y dos de CHO realizados en los biorreactores de inoculación. Se usaron criobolsas de 50 y 100 ml, no se realizó etapa de lavado de DMSO en ninguno de los cuatro cultivos. No se apreció efecto negativo usando criobolsas de 50 ml o 100 mm. Resumen En general, los procedimientos existentes de expansión en serie de semillas son de trabajo intensivo y susceptibles a la contaminación microbiana debida al uso de múltiples recipientes de cultivo tales como matraces T, frascos rotativos y matraces rotativos. Se desarrolló un nuevo procedimiento de expansión en serie de semillas usando bolsas de crioconservación EVA de 50 ml o 100 ml que se usan para inocular directamente en un pocillo de inoculación hecho a medida en un biorreactor. Este reactor sirve como la fuente de inoculación para un sistema de producción a escala. Esta metodología elimina completamente el uso de matraces T, frascos rotativos o matraces rotativos cualesquiera durante el aumento a escala. Se propone un procedimiento para clasificar por tamaño y diseñar el pocillo de inoculación. Siguiendo este procedimiento, puede aplicarse el procedimiento para la inoculación directa de cualquier reactor de producción a escala. En estos ejemplos se usaron células crioconservadas, pero la crioconservación no es un requisito de esta tecnología. Las células crioconservadas pueden sustituirse por células de mamífero a temperaturas convencionales y la eficacia y utilidad del sistema seguirían siendo las mismas. Análogamente, puede ajustarse el tamaño del biorreactor, siempre que se mantengan los conceptos de un pocillo de inoculación y el procedimiento de uso

6 REIVINDICACIONES 5 1. Un procedimiento de expansión en serie de semillas de células de mamífero que comprende: a) proporcionar un biorreactor que tiene un pocillo de inoculación, b) suministrar una suspensión de células de mamífero a medios dentro del pocillo de inoculación, c) controlar las condiciones ambientales y la composición de dichos medios de modo que se optimice el crecimiento celular dentro del pocillo de inoculación, d) cultivar las células de mamífero hasta que se alcanza una densidad celular predeterminada dentro de dicho pocillo, y e) aumentar gradualmente el volumen de los medios mientras se mantienen condiciones ambientales y condiciones de cultivo ambientales óptimas hasta que el biorreactor se llena a un volumen y densidad celular predeterminados. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células de mamífero son células crioconservadas. 3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células de mamífero se seleccionan entre el grupo constituido por células de ovario de hámster chino y células de riñón de cría de hámster. 4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células se obtienen de una criobolsa. 5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células se obtienen de un criovial. 6. Un biorreactor de fermentación que comprende: a) un biorreactor, definiendo dicho biorreactor una cámara, b) teniendo dicha cámara lados exterior e interior, un miembro superior, miembro de pared, y miembro base, teniendo dicho miembro base un orificio, c) un pocillo de inoculación, definiendo dicho pocillo una cámara que tiene lados exterior e interior, miembros superior y de base, un miembro de pared, y d) incluyendo además dicho pocillo un orificio en dicho miembro superior unido a dicho orificio del biorreactor, de modo que se forma un canal entre la cámara del pocillo y la cámara del biorreactor para permitir el movimiento sin restricción entre ellas. e) estando dicha cámara del pocillo provista de un sensor óptico Un biorreactor de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la cámara del pocillo de inoculación está provista de sensores seleccionados entre el grupo constituido por: sensor de ph, sensor de oxígeno, sensor de temperatura. 8. Un biorreactor de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el pocillo de inoculación está provisto de un orificio de comunicación a través de la pared de dicho pocillo para permitir la introducción de medios y agentes en la cámara del pocillo. 9. Un biorreactor de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el pocillo de inoculación está provisto de un brazo mecánico para permitir la agitación de los contenidos de dicho pocillo

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11 Número de publicación: 2 256 996. 51 Int. Cl. 7 : B31B 19/74 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: 2 26 996 1 Int. Cl. 7 : B31B 19/74 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: 99120740.8 86 Fecha de presentación

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11 Número de publicación: 2 224 244. 51 Int. Cl. 7 : E21B 4/14. 72 Inventor/es: Beccu, Rainer. 74 Agente: Díez de Rivera de Elzaburu, Alfonso

11 Número de publicación: 2 224 244. 51 Int. Cl. 7 : E21B 4/14. 72 Inventor/es: Beccu, Rainer. 74 Agente: Díez de Rivera de Elzaburu, Alfonso 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: 2 224 244 1 Int. Cl. 7 : E21B 4/14 B2D 17/06 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: 97922273.4 86

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11 Número de publicación: 2 294 085. 51 Int. Cl.: 72 Inventor/es: Sasaki, Yoshiyuki. 74 Agente: Sugrañes Moliné, Pedro

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11 knúmero de publicación: 2 190 546. 51 kint. Cl. 7 : A46B 11/00

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11 Número de publicación: 2 208 222. 51 Int. Cl. 7 : B21J 15/04. 74 Agente: Isern Jara, Jorge

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11 Número de publicación: 2 210 058. 51 Int. Cl. 7 : F16D 48/06. 74 Agente: Isern Jara, Jorge

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11 knúmero de publicación: 2 137 992. 51 kint. Cl. 6 : A61B 17/16

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11 Número de publicación: 2 275 622. 51 Int. Cl.: 72 Inventor/es: Fast, Peder. 74 Agente: Isern Jara, Jorge

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