Espectrofotómetro de absorción atómica SHIMADZU AA-700 Generador de vapor frio SHIMADZU Baño María

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1 VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIONES, INNOVACIÓN Y EXTENSION INFORME DE VALIDACION DE MERCURIO EN AGUA TRATADA Y CRUDA Página 112 de Método de Ensayo Determinación de Mercurio por Espectrofotometría de Absorción Atómica- Vapor Frio para Aguas (Tratada y Cruda) (Tratamiento de las muestras mediante digestión con ácido nítrico, sulfúrico y permanganato de potasio (si se tiene materia orgánica a 100 C)) Código del Instructivo: (123-LAA-INT-51). 2. Responsable (s) Ariel Felipe Arcila Z. 3. Materiales y Reactivos MATERIALES REACTIVOS Descripción Cantidad Descripción Cantidad Beaker de 200 ml 4 Solución patrón de 1000mg/l de Hg 20 ml Bureta de 25 ml 1 Agua destilada ml Matraz de 200 ml 16 Acido Nítrico 65% 1240 ml Matraz de 100 ml 2 Acido Sulfúrico 98% 1600 ml Matraz de 250 ml 1 Permanganato de Potasio 500 g Pipeta Graduada de1 ml 2 Sulfato de Hidroxilamina 480 g Pipeta Graduada de 15 ml 1 Cloruro Estañoso 400 g Pipeta volumétrica de10 ml 5 Winklers Equipos Espectrofotómetro de absorción atómica SHIMADZU AA-700 Generador de vapor frio SHIMADZU Baño María 4. Preparación de la Curva de Calibración 112

2 VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIONES, INNOVACIÓN Y EXTENSION INFORME DE VALIDACION DE MERCURIO EN AGUA TRATADA Y CRUDA 4.1. Solución madre de Mercurio (10 mg/l) Página 113 de 14 Tomar 1mL de solución estándar PANREAC de 1000 ppm Aforar a 100 ml Solución estándar de Mercurio (0,02 mg/l) Tomar 1mL de solución madre de mercurio (10 mg/l) Aforar hasta 500mL Patrones curva de calibración Mercurio Tomar el volumen en bureta necesario de la solución estándar de Mercurio (0,02 mg / L) para preparar cada uno de los patrones de acuerdo a la siguiente tabla Volumen de Patrón Concentración Solución estándar a tomar (µg/l) (ml) Blanco 0,0 0,0 1 0, ,75 7, Aforar cada uno de los patrones a 200 ml con agua desionizada Pasar los patrones antes preparados a 6 winklers previamente lavados con ácido nítrico al 10% y realizar el proceso de digestión de muestras sin materia orgánica. 113

3 VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIONES, INNOVACIÓN Y EXTENSION INFORME DE VALIDACION DE MERCURIO EN AGUA TRATADA Y CRUDA 4.2. Soluciones para la verificación Página 114 de 14 übk: Blanco de reactivos. (Agua desionizada) übb: Estándar de concentración baja. (0,8 µg/l para Hg) üba: Estándar de concentración alta. Aproximadamente el 90% del rango. (2,5 µg/l para Hg) übkat: Blanco agua tratada üm1at: Muestra natural para ver efectos en la matriz real. (Agua Cruda + 0,8 µg/l Hg) üm2at: Muestra natural para ver efectos en la matriz real. (Agua Cruda + 2,5 µg/l Hg) übkac: Blanco agua cruda üm1ac: Muestra natural para ver efectos en la matriz real. (Agua Tratada 0,8 µg/l Hg) üm2ac: Muestra natural para ver efectos en la matriz real. (Agua Tratada 2,5 µg/l Hg) Preparación de soluciones para la verificación Tomar el volumen en bureta necesario de la solución estándar de Mercurio (0,02 mg / L) para preparar cada uno de las soluciones de verificación. Volumen de Patrón Concentración Solución estándar a tomar (µg/l) (ml) übk 0,0 0,0 übb 0,8 8 üba 2,5 25 Aforar cada uno de los patrones a 200 ml con agua desionizada Pasar los patrones antes preparados a 6 winklers previamente lavados con ácido nítrico al 10% y realizar el proceso de digestión de muestras sin materia orgánica. 114

4 VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIONES, INNOVACIÓN Y EXTENSION INFORME DE VALIDACION DE MERCURIO EN AGUA TRATADA Y CRUDA Preparación de muestras adicionadas Página 115 de 14 Tomar el volumen en bureta necesario de la solución estándar de Mercurio (0,02 mg / L) para preparar cada uno de los patrones de acuerdo a la siguiente tabla Patrón Concentración (µg/l) Volumen de Solución estándar a tomar (ml) übk AT 0,0 0,0 üm 1AT 0,8 8 üm 2AT 2,5 25 übk AC 0 0 üm 1AC 0,8 8 üm 2AC 2,5 25 Aforar cada uno de los patrones a 200 ml con agua Según la matriz de análisis. Pasar los patrones antes preparados a 6 winklers previamente lavados con ácido nítrico al 10% Nota: La muestra queda lista para determinar su concentración por espectrofotometría de absorción atómica-vapor frio. La determinación de mercurio en el equipo de absorción atómica SHIMADZU AA debe ser programada a través del software WizAArd, instalado en su PC. Se recomienda atender recomendaciones del instructivo 123-LAA-INT

5 VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIONES, INNOVACIÓN Y EXTENSION INFORME DE VALIDACION DE MERCURIO EN AGUA TRATADA Y CRUDA 5 RESULTADOS Página 116 de RANGO DE TRABAJO 0,50 3,00 µg Hg/L 5.2 MEDICIONES REALIZADAS Se realizaron 15 curvas de calibración de Mercurio y la posterior lectura de 6 réplicas de cada solución durante 2 días diferentes para evaluar la repetibilidad y reproducibilidad. 116

6 VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIONES, INNOVACIÓN Y EXTENSION INFORME DE VALIDACION DE MERCURIO EN AGUA TRATADA Y CRUDA Página 117 de

7 VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIONES, INNOVACIÓN Y EXTENSION INFORME DE VALIDACION DE MERCURIO EN AGUA TRATADA Y CRUDA Página 118 de

8 VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIONES, INNOVACIÓN Y EXTENSION INFORME DE VALIDACION DE MERCURIO EN AGUA TRATADA Y CRUDA REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD Página 119 de 14 Fecha üm1at üm2at Fecha üm1ac üm2ac 0,9026 2,6409 0,8061 2,5698 0,8339 2,7686 0,8594 2, /09/2012 0,8732 2,6311 0,7279 2, /11/2012 0,8732 2,7407 0,8011 2,6648 0,8666 2,6736 0,8195 2,6748 0,6997 2,5623 0,7945 2,6365 Media 0,8415 2,6695 0,8014 2,6800 Desviación estándar 0,0729 0,0757 0,0428 0,1266 Coeficiente de variación 8,6586 2,8373 5,3443 4,7224 Varianza de la muestra 0,0053 0,0057 0,0018 0,0160 Mínimo 0,6997 2,5623 0,7279 2,5698 Máximo 0,9026 2,7686 0,8594 2,9263 Datos del porcentaje de error y porcentaje de Recuperación. Agua Tratada Tipo Concentración (ppb) % de Error % Recuperación H2O Tratada + 0,8 ppb Hg (1) 0, , ,825 H2O Tratada + 0,8 ppb Hg (2) 0,8339 4, ,2375 H2O Tratada + 0,8 ppb Hg (3) 0,8732 9, ,15 H2O Tratada + 0,8 ppb Hg (4) 0,8732 9, ,15 H2O Tratada + 0,8 ppb Hg (5) 0,8666 8, ,325 H2O Tratada + 0,8 ppb Hg (6) 0, , ,45 Media 0,8415 9, ,1896 H2O Tratada + 2,5 ppb Hg (1) 2,6409 5, ,636 H2O Tratada + 2,5 ppb Hg (2) 2, , ,744 H2O Tratada + 2,5 ppb Hg (3) 2,6311 5, ,244 H2O Tratada + 2,5 ppb Hg (4) 2,7407 9, ,628 H2O Tratada + 2,5 ppb Hg (5) 2,6736 6, ,944 H2O Tratada + 2,5 ppb Hg (6) 2,5623 2, ,492 Media 2,6695 6, ,

9 VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIONES, INNOVACIÓN Y EXTENSION INFORME DE VALIDACION DE MERCURIO EN AGUA TRATADA Y CRUDA Página 120 de 14 Agua Tratada Tipo Concentración (ppb) % de Error % Recuperación H2O Cruda + 0,8 ppb Hg (1) 0,8061 0, , H2O Cruda + 0,8 ppb Hg (2) 0,8594 7, , H2O Cruda + 0,8 ppb Hg (3) 0,7279 9, , H2O Cruda + 0,8 ppb Hg (4) 0,8011 0, , H2O Cruda + 0,8 ppb Hg (5) 0,8195 2, , H2O Cruda + 0,8 ppb Hg (6) 0,7945 0, , Media 0,8014 3, ,1779 H2O Cruda + 2,5 ppb Hg (1) 2,5698 2, , H2O Cruda + 2,5 ppb Hg (2) 2,6082 4, , H2O Cruda + 2,5 ppb Hg (3) 2, , , H2O Cruda + 2,5 ppb Hg (4) 2,6648 6, , H2O Cruda + 2,5 ppb Hg (5) 2,6748 6, , H2O Cruda + 2,5 ppb Hg (6) 2,6365 5, , Media 2,6800 7, , ANÁLISIS DE RESULTADOS 6.1 PRUEBA DE LINEALIDAD (Prueba de Fisher) Se realiza un promedio de los valores obtenidos de la concentración y la respectiva absorbancia de las ultimas siete curvas de calibración y se grafican dichos valores promedio. 120

10 Absorbancia Promedio VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIONES, INNOVACIÓN Y EXTENSION INFORME DE VALIDACION DE MERCURIO EN AGUA TRATADA Y CRUDA Curva de Calibracion Promedio 0,1000 0,0900 0,0800 0,0700 0,0600 0,0500 0,0400 0,0300 0,0200 0,0100 0,0000 0,0000 0,5000 1,0000 1,5000 2,0000 2,5000 3,0000 3,5000 y = 0,0292x + 0,0014 Concentracion de Hg (ppb) R² = 0,9986 Página 121 de 14 Planteamiento de la Hipótesis: Ho: No existe correlación entre los valores de X y Y Hi: Existe correlación ente los valores de X y Y Coeficiente de correlación (r 2 ) 0,9986 Datos prueba de linealidad. Prueba de linealidad T cal T tabla 2 r ( n 2) t 53,37 2,36 2 (1 r ) Criterio de rechazo de Ho: T cal >T tabla Existe correlación entre XyY 121

11 VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIONES, INNOVACIÓN Y EXTENSION INFORME DE VALIDACION DE MERCURIO EN AGUA TRATADA Y CRUDA Página 122 de CARACTERÍSTICAS DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN Pendiente Ordenada Denominación 0,0292 0,0014 Yb Desviación Estándar de la pendiente Sb R 2 0,9986 Sy/x R 0,9992 Limite de detección de la señal 6.3 REPETIBILIDAD (Precisión) Limite de detección en mg/l Para este atributo del método de ensayo se considera el coeficiente de variación obtenido de las lecturas de las muestras adicionadas en agua cruda y agua tratada. El criterio de aceptación es que el coeficiente de variación debe ser menor a 10%: Coeficiente de variación Muestra adicionada (Agua Cruda + 0,8 µg/l Hg): 5,3443% Coeficiente de variación Muestra adicionada (Agua Cruda + 2,5 µg/l Hg): 4,7224% Coeficiente de variación Muestra adicionada (Agua Tratada 0,8 µg/l Hg): 8,6586% Coeficiente de variación Muestra adicionada (Agua Tratada 2,5 µg/l Hg): 2,8373% 6.4 EXACTITUD El porcentaje de Exactitud se determina a partir las muestras adicionadas en agua cruda y agua tratada. El criterio de aceptación es que el % de error debe ser menor a 10%: Para la muestra adicionada de (Agua Cruda + 0,8 µg/l Hg): % Error = 3,4133%. Para la muestra adicionada de (Agua Cruda + 2,5 µg/l Hg): % Error = 7,2180%. Para la muestra adicionada de (Agua Tratada + 0,8 µg/l Hg): % Error = 9,3729%. 122

12 VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIONES, INNOVACIÓN Y EXTENSION INFORME DE VALIDACION DE MERCURIO EN AGUA TRATADA Y CRUDA Para la muestra adicionada de (Agua Tratada + 2,5 µg/l Hg): % Error = 6,7813%. 6.5 PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN Página 123 de 14 El porcentaje de recuperación para el Mercurio en aguas tratada y cruda se determina a partir las muestras adicionadas en agua cruda y agua tratada. El criterio de aceptación es que el % de recuperación debe estar entre 75 y 125%: Para la muestra adicionada de (Agua Cruda + 0,8 µg/l Hg): % de Recuperación = 100,1779%. Para la muestra adicionada de (Agua Cruda + 2,5 µg/l Hg): % de Recuperación = 107,2018%. Para la muestra adicionada de (Agua Tratada + 0,8 µg/l Hg): % de Recuperación = 105,1896%. Para la muestra adicionada de (Agua Tratada + 2,5 µg/l Hg): % de Recuperación = 106,7813%. 6.6 LIMITE DE DETECCIÓN El límite de detección se calcula teniendo en cuenta 3 veces la desviación de la muestra adicionada de (Agua Cruda + 0,8 µg/l Hg) para agua cruda y 10 veces la desviación estándar de la muestra adicionada de (Agua Tratada + 0,8 µg/l Hg) para agua tratada: L.D Agua Cruda = 0,1284 µg de Hg/L L.D Agua Tratada = 0,2187 µg de Hg/L 6.7 LIMITE DE CUANTIFICACIÓN El límite de cuantificación se calcula teniendo en cuenta 10 veces la desviación de la muestra adicionada de (Agua Cruda + 0,8 µg/l Hg) para agua cruda y 10 veces la desviación estándar de la muestra adicionada de (Agua Tratada + 0,8 µg/l Hg) para agua tratada: 123

13 VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIONES, INNOVACIÓN Y EXTENSION INFORME DE VALIDACION DE MERCURIO EN AGUA TRATADA Y CRUDA L.C Agua Cruda = 0,428 µg de Hg/L L.C Agua Tratada = 0,729 µg de Hg/L 7 CONCLUSIONES Página 124 de 14 Para las condiciones de trabajo establecidas en el proceso de verificación para la determinación de Mercurio en muestras de Agua cruda y tratada (µg Hg/L) por el método de espectrofotometría de absorción atómica-vapor frio (Tratamiento de las muestras mediante digestión con ácido nítrico, ácido sulfúrico y permanganato de potasio a 100 C) del Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos se establecieron las siguientes conclusiones: El rango de trabajo para el método está entre 0,5 y 3,0 mg/l utilizando estádar de 1000 mg/l de Mercurio. El límite de detección del método es de: L.D Agua Cruda = 0,1284 µg de Hg/L L.D Agua Tratada = 0,2187 µg de Hg/L El límite de cuantificación del método es de: L.C Agua Cruda = 0,428 µg de Hg/L L.C Agua Tratada = 0,729 µg de Hg/L Características Expresada en Muestra Datos obtenidos Agua cruda + 0,8 ppb Hg 5,3443 Precisión % coeficiente de variación Agua cruda + 2,5 ppb Hg 4,7224 Agua Tratada + 0,8 ppb Hg 8,8568 Agua Tratada + 2,5 ppb Hg 2,8373 Agua cruda + 0,8 ppb Hg 3,4133 Exactitud % error Agua cruda + 2,5 ppb Hg 7,2180 Agua Tratada + 0,8 ppb Hg 9,3729 Agua Tratada + 2,5 ppb Hg 6,7813 Linealidad Coeficiente de correlación 0,9986 Agua cruda + 0,8 ppb Hg % de recuperación Porcentaje Agua cruda + 2,5 ppb Hg Agua Tratada + 0,8 ppb Hg Agua Tratada + 2,5 ppb Hg

14 VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIONES, INNOVACIÓN Y EXTENSION INFORME DE VALIDACION DE MERCURIO EN AGUA TRATADA Y CRUDA Página 125 de

15 Pagina 88 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN AGUAS LABORATORIO DE ANÁLISIS DE AGUAS Y ALIMENTOS Establecer el procedimiento para determinar la concentración de Mercurio en aguas por el método de absorción atómica-vapor frio en el Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira 1. CONTENIDO La espectrofotometría de absorción atómica está fundamentada en la capacidad que tienen los elementos, en su estado atómico basal, de absorber radiación electromagnética a longitudes de onda específicas para cada elemento. La cantidad de energía absorbida es directamente proporcional a la concentración de los átomos del metal analizado, de acuerdo con la Ley de Lambert-Beer. los límites de detección logrados son del orden de ppm (partes por millón). En esta técnica, los metales disueltos son llevados a su forma atómica elemental mediante calentamiento por una llama generada por una mezcla de gases combustibles. Las mezclas más empleadas son: aire-acetileno y óxido nitroso-acetileno. Las temperaturas de la llama van de 1900 C a 2800 C. Los átomos en forma de nube gaseosa, son irradiados por un haz de luz de una longitud de onda específica, de acuerdo con el metal analizado; esto se logra mediante el empleo de lámparas con cátodo del metal de interés o con lámparas de descarga sin electrodo. Los átomos absorben una fracción de la radiación proveniente de la lámpara y la fracción restante es captada por un fotodetector y un dispositivo transductor, que la convierten en una señal eléctrica, que posteriormente es registrada por un software. Como se mencionó anteriormente, el valor de señal obtenido es proporcional a la concentración de los átomos presentes en la nube de gases; de este modo es posible construir una curva de calibración analizando soluciones patrón de concentración conocida y midiendo la magnitud de la absorción de cada una de ellas. 88

16 Pagina 89 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN AGUAS Un caso particular en la técnica de absorción atómica, lo constituye el mercurio, ya que gracias a su volatilidad, no requiere el uso de llama para atomizarse y puede determinarse en forma de vapor frío. Mediante esta técnica se alcanzan límites de detección del orden de 1 ppb. La determinación se realiza adicionando un agente reductor (cloruro estañoso o borohidruro de sodio), al digerido. La reacción del mercurio en solución con el agente reductor produce mercurio atómico muy volátil. El vapor de mercurio es conducido hacia una celda colocada en el paso del haz de luz, donde ocurre la interacción entre los átomos de mercurio y la radiación, produciéndose la absorción. Para la determinación de mercurio en agua se utiliza el espectrómetrofotometro de absorción atómica SHIMADZU AA-7000 y un generador de vapor frio SHIMADZU #### ubicado en la zona de análisis instrumental del laboratorio de Aguas y Alimentos. 2. INFORMACION ANTES DE INICIAR EL PROCESO 2.1 Interferencias Interferencia es el efecto de un concomitante presente en la muestra sobre la señal generada por el analito. La presencia de un interferente conduce en todos los casos a un error sistemático. Las interferencias más comunes para la determinación de mercurio en muestras de agua cruda y tratada por espectroscopia de absorción atómica son: Las interferencias por materia orgánica, las cuales se reducen por medio de digestiones con ácido nítrico concentrado, ácido sulfúrico concentrado, permanganato de potasio y calor durante 1.5 horas, posteriormente se elimina el color con cloruro de hidroxilamina y se procede a realizar la medición. Las interferencias por coloración en los vapores generados a la hora de la medición. 88

17 Pagina 90 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN AGUAS 2.2. Recolección y Preservación de Muestras Recolección de la Muestra Lavar los recipientes para la recolección de muestras antes de usarlos con jabón y enjuagarlos muy bien para quitar impurezas, luego enjuagarlos con agua desionizada. Limpiar los recipientes para la recolección muestras con suficiente ácido nítrico al 10% para eliminar rastros de analitos que puedan interferir con la determinación y enjuagar con agua desionizada Preservación de la muestra A la muestra recolectada se le debe adicionar ácido nítrico concentrado hasta obtener un ph de 1, monitorear el ph en este valor y guardar la muestra refrigerada para ayudar con su conservación, pero se debe tener en cuenta que las muestras deben ser analizadas antes de dos meses, para mejores resultados Características del método Límite de Detección: Para las muestras cuya concentración sea inferior al límite de detección del método de acuerdo a 123-INT-LAA-017, reportar el mercurio como menor a dicho valor Incertidumbre: Se debe seguir el procedimiento descrito en 123-INT-LAA-05 Instructivo para el cálculo de la Incertidumbre Robustez: Se realizara mediante pruebas F de acuerdo a 123-INT-LAA Precisión: De acuerdo a resultados obtenidos para coeficientes de variación de acuerdo a 123-INT-LAA

18 Pagina 91 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN AGUAS 3. DESCRIPCIÓN DE MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS 3.1 Reactivos Nombre Permanganato de Potasio Cloruro de Hidroxilamina Ácido Sulfúrico Concentrado Ácido nítrico concentrado Cloruro Estañoso Estándar PANREAC de Mercurio 1000 mg/l Agua Desionizada Tipo I Almacén P D R S CAS O,X n / C Blanco C X n 36/37/38 X n 20/21/ /38 36/37/ X n 20/ / D: Desactivación R: Información de riesgo S: Información de seguridad P: Pictograma de seguridad Residuos Generados Código de Riesgos Consejos de Nombre colector específicos prudencia Solución ácida D Solución de sales de metales pesados E Residuos de sales H metálicas regenerables 35 36/37/

19 Pagina 92 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN AGUAS 3.2 Materiales Balones aforados de: 100 ml, 200 ml, 250 ml y 500 ml Pipetas aforadas de 1 ml, 5 ml, 25 ml, 50 ml y 100 ml. Pipetas graduadas de 2 ml, 5 ml, 10 ml Bureta de: 25 ml Beakers de: 50 ml, 100 ml Winklers Frasco lavador 3.3 Equipos Espectrofotómetro de absorción atómica. Lámpara de cátodo hueco de mercurio. Balanza analítica de precisión. Baño María. Generador de vapor frio. 4. NORMAS DE SEGURIDAD Y PRECAUCIONES Lavar todo el material de vidrio con ácido nítrico al 10% para evitar contaminación de la muestra, también se debe lavar los recipientes que se utilizaran en la toma de la muestra con ácido nítrico al 10%. (Llevar el residuo generado al Colector D Se debe tener en cuenta el uso de guantes y gafas de seguridad para evitar accidentes. Se debe trabajar en la cabina de extracción de gases por los vapores generados durante la conservación de la muestra, ya que estos pueden ser tóxicos. 88

20 Pagina 93 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN AGUAS 5. PROCEDIMIENTO 5.1 Preparación soluciones curva de calibración Solución madre de Mercurio (10 mg/l) Tomar 1mL de solución estándar PANREAC de 1000 ppm Aforar a 100 ml Solución estándar de Mercurio (0,02 mg/l) Tomar 1mL de solución madre de mercurio (10 mg/l) Aforar hasta 500mL Patrones curva de calibración Mercurio Tomar el volumen en bureta necesario de la solución estándar de Mercurio (0,02 mg / L) para preparar cada uno de los patrones de acuerdo a la siguiente tabla Volumen de Patrón Concentración Solución estándar a tomar (µg/l) (ml) Blanco 0,0 0,0 1 0, ,75 7,

21 Pagina 94 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN AGUAS Tomar el volumen correspondiente y aforar cada uno de los patrones a 200 ml con agua Desionizada Pasar los patrones antes preparados a 6 winklers previamente lavados con ácido nítrico al 10% Agregar 4 ml de Ácido Nítrico Concentrado y 4 ml de Ácido Sulfúrico concentrado. Rótulos para las soluciones estándar LABORATORIO DE ANÁLISIS DE AGUAS Y ALIMENTOS Metal, unidades Fecha de preparación: Fecha de expiración : 5.2 Preparación de las muestras Preparación de solución de Permanganato de Potasio (0,05 g/ml) Pesar 10 g de KMnO 4 puro Diluir en 20 ml de agua desionisada. Aforar hasta 200mL 88

22 Pagina 95 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN AGUAS Preparación de solución de Cloruro de Hidroxilamina Pesar 24 g de cloruro de Hidroxilamina puro Diluir en 20 ml de agua desionisada. Aforar hasta 100mL Digestión de las muestras de agua tratada. Adicionar 200 ml de agua en un winkler. Agregar 4 ml de Ácido Nítrico Concentrado y 4 ml de ácido sulfúrico concentrado Dejar reposar por 1 hora Digestión de las muestras de agua cruda. Adicionar 200 ml de agua en un winkler. Agregar 2 ml de Ácido Nítrico Concentrado y 4 ml de ácido sulfúrico concentrado Calentar en baño maria a temperatura de 90 C durante 2 horas Agregar 15 ml de solución de KMnO 4 (0,05 g/ml). Dejar enfriar y agregar 4 ml de la solución de cloruro de Hidroxilamina 88

23 Pagina 96 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN AGUAS Preparación de la muestra Preparación de solución de Cloruro Estañoso (0,1 g/ml) Pesar 20 g de cloruro Estañoso puro Diluir en 20 ml de Ácido Clorhídrico Concentrado. Aforar hasta 200mL Preparación de la muestra para la medición. Agregar 200 ml de la solución patrón acidificada o del agua tratada acidificada o del agua cruda digerirá en un vial del generador de vapor frio. Agregar 10 ml de solución de cloruro estañoso preparada Proceder a medir en el equipo de absorción atómica. Nota1: La determinación de Mercurio se realizara en el equipo de absorción atómica SHIMADZU AA-7000 debe ser programada a través del software WizAArd, instalado en su PC. Se recomienda atender recomendaciones del instructivo 123-LAA-INT-23. El software WizAArd permite realizar automáticamente controles para garantizar la calidad de los datos, tales como coeficientes de correlación, verificación inicial de calibración, verificación continúa de calibración en el transcurso de las lecturas de concentración de las de las muestras, valores del blanco menores al límite de detección, entre otras. Para la implementación de esta configuración en las condiciones de análisis de Mercurio se expone a continuación cuáles serán las condiciones de calidad analítica adoptadas por el laboratorio de Aguas y Alimentos para la aceptación de los datos entregados mediante el software wizaard. 88

24 Pagina 97 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN AGUAS Se da clic en el botón [calibration curve setup] en la ventana de preparación de soluciones estándar [preparation parameter], luego da click en la opción QC blank/ QCStandar Setup 5.3 Condiciones para el análisis mediante el software WizAArd 4 [CORR] (Correlation ) 5 [%TV] (Selfdetermined true value) 6[ [ICV]initial calibration validation Se determinara el valor 0.99 y las opciones retry y pause Se determinara el valor entre 90% y 110% seleccionando la opción de retry y mark & continue Se tomara para esta verificación del estandar de la carta de control con un valor de 1,2 mg/l de calcio Los límites de tolerancia para este valor fueron estipulados entre el 90% y 110 % de la solución preparada 7 [ICB] (Initial Calibration blank 8CCV]continuing calibration verification 9 CCB] (Continuing CALIB Se adoptara el valor recomendado por la EPA es cual es de 0,5 mg/l Se tomara como valor de calibración el valor de 1,2 mg/l de Mercurio dando la opción de detener el análisis si no se cumplen los criterios de aceptación. Se adoptara el valor recomendado por la EPA es cual es de 0,5 mg/l 10 ICV/CCV Se asignara la posición de la solución en el automuestreador. 88

25 Pagina 98 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN AGUAS 5.4 CARTAS DE CONTROL En cada lectura realizada de mercurio a cualquier muestra se registrara el valor reportado por el estándar de 1,2 µg/ L de Hg. Tomar 12 ml de solución estándar de Mercurio de 20 ppb Aforar a 200 ml con agua desionizada. Realizar la medición como se describe en el numeral Realizar procedimiento digestión descrito en el numeral Nota: El valor obtenido de la concentración se registra y se grafica en el formato (123-LAA-F07). 6.0 CALCULOS Y RESULTADOS En caso de que se haga dilución de la muestra, calcular la concentración de mercurio a partir de la ecuación de la curva guardada en el equipo o graficada durante la realización de la curva de calibración. Si hubo dilución de la muestra aplicar la siguiente relación: ( g Metal / L) Volumen g Metal / L Alícuota ( ml) final ( ml) Reportar el valor promedio de la concentración de mercurio en µg / L 88

26 Pagina 99 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN AGUAS 7.0 DOCUMENTO DE REFERENCIA NTC-ISO 9000:2000 Sistema de gestión de calidad. Fundamentos y vocabulario. Standard Methods For The Examination of Water And Wastewater. American Public Health Association. 21st Edition. Washington, EATON, Andrew D. CLESCERI, Lenore S. GREENBERG, Arnold E. Sección 3111 D. Método Directo llama Acetileno Oxido Nitroso Página Instructivo de operación de Espectrómetro de Absorción Atómica. 123-LAA-INT-23 Cook book. Equipo Absorción Atómica. Marca Shimadzu. Elaborado por: Revisado por: Aprobado por: Personal UTP Jefe de Calidad Director del Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos 88

27 Pagina 100 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN PESCADOS LABORATORIO DE ANÁLISIS DE AGUAS Y ALIMENTOS Establecer el procedimiento para determinar la concentración de Mercurio en pescados por el método de absorción atómica-vapor frio en el Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira 1. CONTENIDO La espectrofotometría de absorción atómica está fundamentada en la capacidad que tienen los elementos, en su estado atómico basal, de absorber radiación electromagnética a longitudes de onda específicas para cada elemento. La cantidad de energía absorbida es directamente proporcional a la concentración de los átomos del metal analizado, de acuerdo con la Ley de Lambert-Beer. Los límites de detección logrados son del orden de ppm (partes por millón). En esta técnica, los metales disueltos son llevados a su forma atómica elemental mediante calentamiento por una llama generada por una mezcla de gases combustibles. Las mezclas más empleadas son: aire-acetileno y óxido nitroso-acetileno. Las temperaturas de la llama van de 1900 C a 2800 C. Los átomos en forma de nube gaseosa, son irradiados por un haz de luz de una longitud de onda específica, de acuerdo con el metal analizado; esto se logra mediante el empleo de lámparas con cátodo del metal de interés o con lámparas de descarga sin electrodo. Los átomos absorben una fracción de la radiación proveniente de la lámpara y la fracción restante es captada por un fotodetector y un dispositivo transductor, que la convierten en una señal eléctrica, que posteriormente es registrada por un software. Como se mencionó anteriormente, el valor de señal obtenido es proporcional a la concentración de los átomos presentes en la nube de gases; de este modo es posible construir una curva de calibración analizando soluciones patrón de concentración conocida y midiendo la magnitud de la absorción de cada una de ellas. 100

28 Pagina 101 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN PESCADOS Un caso particular en la técnica de absorción atómica, lo constituye el mercurio, ya que gracias a su volatilidad, no requiere el uso de llama para atomizarse y puede determinarse en forma de vapor frío. Mediante esta técnica se alcanzan límites de detección del orden de 1 ppb. La determinación se realiza adicionando un agente reductor (cloruro estañoso o borohidruro de sodio), al digerido. La reacción del mercurio en solución con el agente reductor produce mercurio atómico muy volátil. El vapor de mercurio es conducido hacia una celda colocada en el paso del haz de luz, donde ocurre la interacción entre los átomos de mercurio y la radiación, produciéndose la absorción. Para la determinación de mercurio en pescados se utiliza el espectrómetrofotometro de absorción atómica SHIMADZU AA-7000 y un generador de vapor frio SHIMADZU #### ubicado en la zona de análisis instrumental del laboratorio de Aguas y Alimentos. 2. INFORMACION ANTES DE INICIAR EL PROCESO 2.1 Interferencias Interferencia es el efecto de un concomitante presente en la muestra sobre la señal generada por el analito. La presencia de un interferente conduce en todos los casos a un error sistemático. Las interferencias más comunes para la determinación de mercurio en muestras de pescados por espectroscopia de absorción atómica son: Las interferencias por materia orgánica, las cuales se reducen por medio de digestiones con ácido nítrico concentrado, ácido sulfúrico concentrado, permanganato de potasio y calor durante 2 horas, posteriormente se elimina el color con cloruro de hidroxilamina y se procede a realizar la medición. Las interferencias por coloración en los vapores generados a la hora de la medición. 101

29 Pagina 102 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN PESCADOS 2.2. Recolección y Preservación de Muestras Recolección de la Muestra Lavar las nevera para la recolección de muestras antes de usarlos con jabón y enjuagarlos muy bien para quitar impurezas, luego enjuagarlos con agua desionizada. Limpiar las neveras para la recolección muestras con suficiente ácido nítrico al 10% para eliminar rastros de analitos que puedan interferir con la determinación y enjuagar con agua desionizada Preservación de la muestra A la muestra recolectada se debe congelar y tener en cuenta que las muestras deben ser analizadas antes de seis meses, para mejores resultados Características del método Límite de Detección: Para las muestras cuya concentración sea inferior al límite de detección del método de acuerdo a 123-INT-LAA-017, reportar el mercurio como menor a dicho valor Incertidumbre: Se debe seguir el procedimiento descrito en 123-INT-LAA-05 Instructivo para el cálculo de la Incertidumbre Robustez: Se realizara mediante pruebas F de acuerdo a 123-INT-LAA Precisión: De acuerdo a resultados obtenidos para coeficientes de variación de acuerdo a 123-INT-LAA

30 Pagina 103 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN PESCADOS 3. DESCRIPCIÓN DE MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS 3.1 Reactivos Nombre Permanganato de Potasio Cloruro de Hidroxilamina Ácido Sulfúrico Concentrado Ácido nítrico concentrado Cloruro Estañoso Estándar PANREAC de Mercurio 1000 mg/l Agua Desionizada Tipo I Almacén P D R S CAS O,X n / C Blanco C X n 36/37/38 X n 20/21/ /38 36/37/ X n 20/ / D: Desactivación R: Información de riesgo S: Información de seguridad P: Pictograma de seguridad Residuos Generados Nombre Código de Riesgos Consejos de colector específicos prudencia Solución ácida D Solución de sales de metales pesados E Residuos de sales

31 Pagina 104 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN PESCADOS metálicas regenerables H 35 36/37/ Materiales Balones aforados de: 100 ml, 200 ml, 250 ml y 500 ml Pipetas aforadas de 1 ml, 5 ml, 25 ml, 50 ml y 100 ml. Pipetas graduadas de 2 ml, 5 ml, 10 ml Bureta de: 25 ml Beakers de: 50 ml, 100 ml Soxleth de 250 ml Condensador Balón de digestión de 200 ml Soporte universal Pinzas Nueces Frasco lavador 3.3 Equipos Espectrofotómetro de absorción atómica. Lámpara de cátodo hueco de mercurio. Balanza analítica de precisión. Estufa Generador de vapor frio. 4. NORMAS DE SEGURIDAD Y PRECAUCIONES Lavar todo el material de vidrio con ácido nítrico al 10% para evitar contaminación de la muestra, también se debe lavar los recipientes que se utilizaran en la toma de la muestra con ácido nítrico al 10%. (Llevar el residuo generado al Colector D). Se debe tener en cuenta el uso de guantes y gafas de seguridad para evitar accidentes. Se debe trabajar en la cabina de extracción de gases por los vapores generados durante la conservación de la muestra, ya que estos pueden ser tóxicos. 104

32 Pagina 105 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN PESCADOS 5. PROCEDIMIENTO 5.1 Preparación soluciones curva de calibración Solución madre de Mercurio (10 mg/l) Tomar 1mL de solución estándar PANREAC de 1000 ppm Aforar a 100 ml Solución estándar de Mercurio (0,02 mg/l) Tomar 1mL de solución madre de mercurio (10 mg/l) Aforar hasta 500mL Patrones curva de calibración Mercurio Tomar el volumen en bureta necesario de la solución estándar de Mercurio (0,02 mg / L) para preparar cada uno de los patrones de acuerdo a la siguiente tabla Volumen de Patrón Concentración Solución estándar a tomar (µg/l) (ml) Blanco 0,0 0,0 1 0, ,75 7,

33 Pagina 106 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN PESCADOS Tomar el volumen correspondiente y aforar cada uno de los patrones a 200 ml con agua Desionizada Pasar los patrones antes preparados a 6 winklers previamente lavados con ácido nítrico al 10% Agregar 4 ml de Ácido Nítrico Concentrado y 4 ml de Ácido Sulfúrico concentrado. Rótulos para las soluciones estándar LABORATORIO DE ANÁLISIS DE AGUAS Y ALIMENTOS Metal, unidades Fecha de preparación: Fecha de expiración : 5.2 Preparación de las muestras Preparación de solución de Cloruro de Hidroxilamina Pesar 24 g de cloruro de Hidroxilamina puro Diluir en 20 ml de agua desionizada.. Aforar hasta 100mL 106

34 Pagina 107 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN PESCADOS Digestión de las muestras de Pescados Adicionar 1 g del pescado al balón de digestión y lavar con 20 ml de agua desionizada. Agregar al embudo de separación 20 ml de HNO 3 y 10 ml de H 2 SO 4 Calentar durante una hora adicionando porciones de agua desionizada por el condensador Dejar enfría y agregar 1 g de KMnO 4 Calentar durante una hora adicionando porciones de agua desionizada por el condensador. Dejar enfriar y agregar 12 ml de Hidroxilamina Filtrar la solución por gravedad Aforar el filtrado a 200 ml y proceder a medir Preparación de la muestra Preparación de solución de Cloruro Estañoso (0,1 g/ml) Pesar 20 g de cloruro Estañoso puro. Diluir en 20 ml de Ácido Clorhídrico Concentrado. Aforar hasta 200mL 107

35 Pagina 108 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN PESCADOS Preparación de la muestra para la medición. Agregar 200 ml de la solución patrón acidificada o de la solución resultante de la digestin del pescado un vial del generador de vapor frio. Agregar 10 ml de solución de cloruro estañoso preparada. Proceder a medir en el equipo de absorción atómica. Nota1: La determinación de Mercurio se realizara en el equipo de absorción atómica SHIMADZU AA-7000 debe ser programada a través del software WizAArd, instalado en su PC. Se recomienda atender recomendaciones del instructivo 123-LAA-INT-23. El software WizAArd permite realizar automáticamente controles para garantizar la calidad de los datos, tales como coeficientes de correlación, verificación inicial de calibración, verificación continúa de calibración en el transcurso de las lecturas de concentración de las de las muestras, valores del blanco menores al límite de detección, entre otras. Para la implementación de esta configuración en las condiciones de análisis de Mercurio se expone a continuación cuáles serán las condiciones de calidad analítica adoptadas por el laboratorio de Aguas y Alimentos para la aceptación de los datos entregados mediante el software wizaard. Se da clic en el botón [calibration curve setup] en la ventana de preparación de soluciones estándar [preparation parameter], luego da click en la opción QC blank/ QCStandar Setup 108

36 Pagina 109 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN PESCADOS 5.3 Condiciones para el análisis mediante el software WizAArd 4 [CORR] (Correlation ) 5 [%TV] (Selfdetermined true value) 6[ [ICV]initial calibration validation Se determinara el valor 0.99 y las opciones retry y pause Se determinara el valor entre 90% y 110% seleccionando la opción de retry y mark & continue Se tomara para esta verificación del estandar de la carta de control con un valor de 1,2 mg/l de calcio Los límites de tolerancia para este valor fueron estipulados entre el 90% y 110 % de la solución preparada 7 [ICB] (Initial Calibration blank 8CCV]continuing calibration verification 9 CCB] (Continuing CALIB Se adoptara el valor recomendado por la EPA es cual es de 0,5 mg/l Se tomara como valor de calibración el valor de 1,2 mg/l de Mercurio dando la opción de detener el análisis si no se cumplen los criterios de aceptación. Se adoptara el valor recomendado por la EPA es cual es de 0,5 mg/l 10 ICV/CCV Se asignara la posición de la solución en el automuestreador. 109

37 Pagina 110 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN PESCADOS 5.4 CARTAS DE CONTROL En cada lectura realizada de mercurio a cualquier muestra se registrara el valor reportado por el estándar de 1,2 µg/ L de Hg. Tomar 12 ml de solución estándar de Mercurio de 20 ppb. Aforar a 200 ml con agua desionizada. Realizar la medición como se describe en el numeral Realizar procedimiento digestión descrito en el numeral Nota: El valor obtenido de la concentración se registra y se grafica en el formato (123-LAA-F07). 6.0 CALCULOS Y RESULTADOS En caso de que se haga dilución de la muestra, calcular la concentración de mercurio a partir de la ecuación de la curva guardada en el equipo o graficada durante la realización de la curva de calibración. Si hubo dilución de la muestra aplicar la siguiente relación: ( g de Hg / L) Volumen Aforo( L) mg Metal /100g( pescado) *10 Masa de Pescado usada( g) Reportar el valor promedio de la concentración de mercurio en mg / 100 g de pescado 110

38 Pagina 111 de 12 INSTRUCTIVO PARA LA DETERMINACIÓN DE MERCURIO EN PESCADOS 7.0 DOCUMENTO DE REFERENCIA NTC-ISO 9000:2000 Sistema de gestión de calidad. Fundamentos y vocabulario. Standard Methods For The Examination of Water And Wastewater. American Public Health Association. 21st Edition. Washington, EATON, Andrew D. CLESCERI, Lenore S. GREENBERG, Arnold E. Sección 3111 D. Método Directo llama Acetileno Oxido Nitroso Página Instructivo de operación de Espectrómetro de Absorción Atómica. 123-LAA-INT-23 Cook book. Equipo Absorción Atómica. Marca Shimadzu. Elaborado por: Revisado por: Aprobado por: Personal UTP Jefe de Calidad Director del Laboratorio de Análisis de Aguas y Alimentos 111