RIDASCREEN. Clostridium difficile Toxin A/B. Art. n.: C0801

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1 RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B Art. n.: C0801 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D Darmstadt, Germany Tel.: +49 (0) / Fax: +49 (0) C

2 1. Área de aplicación Para el diagnóstico in vitro. El test RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B es un enzimoinmunoensayo para la identificación cualitativa de las toxinas A y B de Clostridium difficile en muestras de heces y en cultivos de cepas productoras de toxinas de Clostridium difficile obtenidas previamente de muestras de heces. 2. Resumen y explicación del test Las enfermedades diarreicas son efectos adversos relativamente frecuentes en las antibioticoterapias. Especialmente después de la introducción de la clindamicina a principios de la década del 70 aparecieron cada vez con mayor frecuencia formas graves de la enfermedad (colitis asociada a antibióticos, AAC por sus siglas en inglés) que se extendieron hasta llegar al cuadro de afección masiva que produce la colitis seudomembranosa (PMC por sus siglas en inglés). La Clostridium difficile es el agente patógeno de la colitis seudomembranosa (PMC) y también una de las causas de la AAC y la AAD (Diarrea Asociada a Antibióticos, según siglas en inglés). En el cuadro de manifestaciones de la enfermedad se destaca por su importancia etiológica la producción de las toxinas A y B por cepas toxígenas de Clostridium difficile. Estas dos proteínas de masa molecular por encima de 200 kda son diferenciables inmunológica y funcionalmente. En el caso de la toxina A se trata de una enterotoxina, pero la toxina B es una citotoxina; ambas gustan de actuar in vivo de forma sinérgica. Debido a que no todas las cepas de Clostridium difficile son generadoras de toxinas y que aprox. del 2-8% de la población adulta sana y hasta 50% de los niños menores de 2 años pueden estar colonizados por Clostridium difficile, resulta de esta situación que la identificación de las toxinas A y B en la práctica diagnóstica es mucho más significativo que el reconocimiento del germen. El test RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B EIA es un enzimoinmunoensayo en el cual se emplean anticuerpos monoclonales específicos para identificar simultáneamente las toxinas A y B en las muestras de heces de pacientes. Un resultado fiable en la investigación se obtiene ya a las 2 horas, de manera que se posibilita de forma temprana la toma de medidas terapéuticas efectivas. 3. Fundamento del test En el test RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B se emplean anticuerpos monoclonales en un procedimiento sándwich. La superficie de la cavidad de la microplaca de titulación está recubierta con anticuerpos monoclonales contra las toxinas A y B de Clostridium difficile. Se pipetea a temperatura ambiente (20 25 C) en el pocillo de la microplaca una suspensión de la muestra de heces a analizar, así como de los controles junto con anticuerpos monoclonales anti-toxinas A y B biotinilados (conjugado 1) para iniciar la incubación. Después de un paso de lavado se adiciona un conjugado de poliestreptavidina con peroxidasa (conjugado 2) y se incuba nuevamente a temperatura ambiente (20 25 C). En caso de RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B

3 presencia en la muestra de las toxinas se forma un complejo sándwich entre anticuerpos inmovilizados, toxinas y anticuerpos conjugados. La fracción no enlazada del conjugado de estreptavidina-peroxidasa se elimina en un paso posterior de lavado. Después de añadir el sustrato, si la muestra es positiva, la enzima enlazada transforma el color de la solución en las cavidades de la microplaca de incolora hacia el azul. Mediante la adición de reactivo de parada se lleva a cabo un cambio de color del azul al amarillo. La absorbancia es proporcional a la concentración de toxinas A y B de Clostridium difficile presentes en la muestra. 4. Contenido del envase Los reactivos de un envase alcanzan para 96 determinaciones Plate 96 determ. Microplaca de titulación, 12 tiras de microtitulación (separables) en marco de soporte; recubiertas con anticuerpos monoclonales (ratón) contra Clostridium difficile Toxinas A y B Diluent ml Buffer de dilución de muestras, solución de NaCl tamponada con buffer de proteína; listo para el uso; teñido de azul Wash 100 ml Buffer de lavado, solución de NaCl tamponada con buffer de fosfato (conc.10 veces); contiene Timerosal al 0,1% Control + 1,8 ml Toxina parcialmente desnaturalizada; lista para el uso Conjugate 1 Conjugate 2 10 ml 10 ml Anticuerpos conjugados con peroxidasa contra Clostridium difficile toxinas A y B en solución estabilizada de proteína; contiene Kathon al 0,1 %; listo para el uso; teñido de azul Conjugado de poliestreptavidina-peroxidasa en solución estabilizada de proteína; listo para el uso, teñido de anaranjado Substrate 10 ml Peróxido de hidrógeno / TMB; listo para el uso Stop 6 ml Reactivo de parada,ácido sulfúrico 1N ; listo para el uso 5. Reactivos y su almacenamiento Todos los reactivos se deben guardar entre 2 8 C y pueden usarse hasta la fecha de vencimiento impresa en las etiquetas. El buffer de lavado diluido se puede usar hasta 4 semanas si se conserva entre 2 8 C. La contaminación microbiana se debe evitar. Después de la fecha de vencimiento no se asumen garantías de calidad. RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B

4 La bolsa de aluminio se debe cortar con una tijera de manera que el cierre no sea eliminado. Las tiras de microtitulación no usadas se deben guardar inmediatamente en la bolsa de aluminio cerrada y conservar entre 2 8 C. Se debe evitar la incidencia directa de la luz sobre el sustrato incoloro para prevenir la descomposición o su coloración de azul debido a la autooxidación. Si el sustrato presenta una coloración azul no se deberá utilizar. 6. Reactivos adicionales necesarios accesorios requeridos 6.1. Reactivos - Agua destilada o desionizada 6.2. Accesorios - Tubos de ensayo - Pipetas desechables (Art. n.: Z0001) - Agitador Vortex (opcional, véase 9.3.) - Micropipetas de µl y de 1 ml de volumen - Probeta (1000 ml) - Cronómetro - Instrumento de lavado para las microplacas de titulación o pipetas multicanal (300 µl) - Fotómetro lector de microplacas de titulación (450 nm, eventualmente filtro de referencia 600 nm) - Papel de filtro (paños de laboratorio) - Recipiente de desechos con una solución de hipoclorito al 0,5 % 7. Medidas de seguridad Sólo para el diagnóstico in vitro. Este test debe ser realizado solamente por personal cualificado de laboratorio. Se deben observar las directrices de trabajo para laboratorios médicos. Las instrucciones para el uso del test deben cumplirse estrictamente. El control positivo que se encuentra en el kit contiene C. difficile toxina parcialmente desnaturalizada, la cual reacciona positiva en el test de citotoxicidad. Esta toxina debe ser manejada, al igual que las muestras de los pacientes, como potencialmente infecciosa de acuerdo a las reglamentaciones nacionales de seguridad. No se deben pipetear las muestras o reactivos con la boca, así como también evitar el contacto con la piel lesionada o las mucosas. Durante el trabajo con las muestras deben usarse guantes desechables y lavar las manos después del test. En los locales donde se trabaje con las muestras o reactivos de prueba no está permitido fumar, comer o beber. RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B

5 El buffer de dilución de muestras y el conjugado contienen Kathon y azida de sodio al 0,1 % como agentes conservantes. Se debe evitar, por tanto, el contacto con la piel o mucosas. El buffer de lavado contiene Timerosal al 0,1% como agente conservante. Se debe evitar por tanto el contacto con la piel o mucosas. El peróxido de hidrógeno puede producir a efectos cáusticos sobre la piel. Manéjese con cuidado! El reactivo de parada contiene una solución 1 N de ácido sulfúrico Evítese el contacto con la piel o ropas! Si se produce contacto con la piel, debe enjuagarse con agua. Todos los materiales y reactivos que entren en contacto con muestras potencialmente infecciosas se requiere que sean tratados con agentes desinfectantes adecuados o se sometan a autoclave por lo menos una hora a 121 C. ATENCIÓN: Para evitar la formación de gases venenosos deben neutralizarse los residuos líquidos que contengan reactivo de parada antes de echarlos en la solución de hipoclorito. 8. Recolección y conservación de las muestras El material de examen se debe guardar entre 2 8 C hasta el momento de su elaboración. Si el material no puede ser usado en el espacio de 3 días, se recomienda almacenarlo a -20 C o temperatura inferior. Evite congelar y descongelar las muestras varias veces. Las muestras de heces o frotis rectales no se deben recolectar en recipientes que contengan medios de transporte, agentes conservantes, sueros animales, iones metálicos, agentes oxidantes o detergentes debido a posibles interferencias con el test RIDASCREEN Clostridium difficile Toxina A/B. Si se van a utilizar frotis rectales se debe prestar atención a que haya suficiente material de heces (aprox. 100 mg) para la realización del test. En los estudios de contactos se deben incluir también muestras de heces de personas sin signos clínicos aparentes para identificar también a los portadores asintomáticos. 9. Realización del test 9.1. Generalidades Antes de su uso se deben llevar todos los reactivos y la microplaca de titulación Plate a la temperatura ambiente (20 25 C). Las tiras de microtitulación no se deben sacar de la bolsa de aluminio hasta que no hayan alcanzado la temperatura del ambiente. Los reactivos se deben mezclar bien inmediatamente antes de su empleo. Posterior a su uso se deben conservar las tiras de microtitulación (cerradas en su bolsa) y los reactivos otra vez a temperaturas entre 2 8 C. Las tiras de microtitulación que se hayan usado una vez no RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B

6 pueden volverse a utilizar. Los reactivos y las tiras de microtitulación no se deben usar cuando el envase esté dañado o los recipientes hayan perdido su hermeticidad. Se debe evitar el contacto directo de las muestras con los componentes del kit para prevenir la contaminación cruzada. Se debe evitar la incidencia directa de la luz solar durante la realización del test. Se recomienda tapar la microplaca o cubrirla con cinta adhesiva para evitar pérdidas por evaporación Preparación del buffer de lavado Se mezcla 1 parte del buffer de lavado concentrado Wash con 9 partes de agua destilada. Los cristales que pudieran encontrarse en el buffer concentrado se deben solubilizar previamente con calor (baño María a 37 C) Preparación de las muestras En un tubo de ensayo rotulado se vierte 1 ml de buffer de dilución de muestras de RIDASCREEN Diluent 1. Las heces líquidas se aspiran (aprox. 100 µl) con una pipeta desechable (Art. n Z 0001) hasta ligeramente por encima del segundo espesamiento y se suspenden en el buffer preparado. En el caso de heces sólidas se toma una cantidad equivalente (100 mg) con una espátula o con un asa de siembra desechable y se suspenden igualmente. La homogeneización de la suspensión de heces se efectúa mediante aspiración y expulsión con la pipeta desechable o alternativamente por agitación en un vibrador Vortex. Después de dejar reposar un corto tiempo, para lograr la sedimentación de partículas grandes de heces, se emplea directamente el sobrenadante claro obtenido de esta manera. En caso de usar para la determinación analítica un equipo ELISA automático el sobrenadante tiene que estar libre de partículas. En este caso se recomienda una centrifugación a 2500 G durante 5 minutos Análisis de las toxinas de los cultivos de C.difficile Para el examen de las colonias procedentes de los medios de cultivo sólidos (CCFA o agar Schaedler) se extraen las mismas de la placa de agar con un asa de siembra, y se suspenden y mezclan bien en 1 ml de buffer de dilución de muestras Diluent 1. Seguidamente se centrifuga la suspensión (5 minutos a 2500 G). El sobrenadante claro está apto para ser utilizado directamente en el ensayo. Para el examen de cultivos líquidos se toman 100 µl y se suspenden y mezclan bien en 1 ml de buffer de dilución de muestras Diluent 1. Seguidamente se centrifuga la suspensión (5 minutos a 2500 G). El sobrenadante claro está apto para ser utilizado directamente en el test Primera incubación Después de introducir una cantidad suficiente de cavidades en el marco de soporte se pipetean en cada una 2 gotas (100 µl) del control positivo Control +, del buffer de dilución de muestras RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B

7 Diluent 1 (= control negativo) o de la muestra de heces en suspensión (o, dado el caso, del sobrenadante de la colonia en suspensión). A continuación se adicionan 2 gotas (100 µl) del anticuerpo conjugado con biotina Conjugate 1, se mezcla bien (con ligeros golpes en los bordes de la placa) y se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente (20 25 C) Lavado Un lavado cuidadoso es importante para lograr resultados correctos por lo cual éste debe llevarse a cabo estrictamente según las instrucciones. Las muestras incubadas en las cavidades se deben vaciar primeramente en un recipiente de desechos con hipoclorito para la desinfección. Posteriormente se sacude la placa sobre un papel absorbente para eliminar los restos de humedad. Seguidamente se lava 5 veces con 300 µl de buffer de lavado en cada caso. Después de cada enjuague se debe prestar atención a vaciar completamente la placa sacudiéndola sobre partes secas y no usadas del papel. Cuando se usen lavadores automáticos se debe velar por el ajuste correcto del instrumento al tipo de placa microtitulación utilizado. Además es preciso que si se tiene una suspensión de heces no totalmente libre de partículas, que éstas sean eliminadas manualmente de las cavidades antes del primer lavado para evitar obstrucciones en las agujas de lavado. Igualmente se debe velar en los diferentes pasos de lavado por una aspiración completa del líquido. Después del último paso de lavado se debe sacudir la placa cuidadosamente sobre papel absorbente limpio o paños de laboratorio para eliminar la humedad residual. Para obtener resultados óptimos en el proceso de lavado se recomienda utilizar el modo de rebose con al menos 600 μl de buffer de lavado por cavidad y paso de enjuague. Es posible aumentar a más de 5 los pasos de enjuague y en casos particulares esto conduce a mejores resultados en la limpieza Segunda incubación Se adicionan en las cavidades 2 gotas (100 µl) del conjugado poliestreptavidina-peroxidasa Conjugate 2 y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente (20 25 C) Lavado Lavar según el punto Tercera incubación Añadir 2 gotas de sustrato (100 µl) Substrate a cada uno de los pocillos. A continuación se incuba la placa durante 15 minutos a temperatura ambiente (20-25 C) en la oscuridad. Después se adiciona 1 gota (50 µl) de reactivo de parada Stop en cada una de las cavidades para detener la reacción. Se mezcla cuidadosamente (mediante ligeros golpes en los bordes de la placa) y se mide la absorbancia a 450 nm (opcional: Longitud de onda de referencia 600 nm) La compensación del valor cero se debe realizar contra aire, o sea, sin la microplaca. RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B

8 Observación: Muestras de pacientes con altos valores positivos pueden dar lugar a precipitados negruzcos del sustrato Protocolo abreviado de ensayo Los tiempos de incubación indicados en los puntos 9.5, 9.7 y 9.9 se pueden reducir significativamente si se incuba la placa a 37 C y con una frecuencia de agitación de Hz. Los tiempos de incubación quedan modificados entonces de la siguiente manera: 1 a Incubación: 30 min 2 da Incubación: 15 min 3 ra Incubación: 15 min 10. Control de calidad Indicios de reactivos caducados Como control de calidad en cada determinación se debe añadir un control positivo y otro negativo para asegurar la estabilidad de los reactivos y un correcto desarrollo del test. El test ha transcurrido correctamente si el valor de absorbancia (D.O.) del control negativo a 450 nm es menor que 0,2 y el valor medido para el control positivo a 450 nm es mayor de 0,8. Si el valor del control negativo es mayor de 0,2 esto puede ser un indicio de que no se ha enjuagado suficientemente. Una desviación de los valores requeridos, lo mismo que una turbidez o coloración azul del sustrato incoloro antes de ser transferido a las cavidades, puede ser un indicio de vencimiento de los reactivos. Si los valores predefinidos no se cumplen, se deben verificar los siguientes puntos antes de repetir el análisis: Durabilidad de los reactivos empleados - Funcionamiento correcto de los instrumentos utilizados (p. ej. la calibración) - Ejecución correcta del test - Control visual de los componentes del kit con respecto a contaminación o pérdida de hermeticidad; una solución de sustrato de coloración azulada no se debe volver a usar. Si al repetir la determinación se obtienen nuevamente valores incorrectos usted debe dirigirse al fabricante o a su distribuidor local de R-Biopharm. 11. Evaluación e interpretación Cálculo del valor límite Para establecer el valor límite se le suma 0,15 al valor de absorbancia obtenido para el control negativo. cut-off (Valor límite) = Valor de absorbancia del control negativo + 0,15 RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B

9 11.2. Resultado del test Se evalúan como positivas las muestras cuyo valor de absorbancia se encuentra más de 10% por encima del valor límite calculado. Se denominan como muestras de valores límites y que deben repetirse, aquellas cuyo valor de absorbancia está en el rango de 10% por encima o por debajo del valor límite. Si una repetición del análisis con una muestra de heces fresca posee de nuevo valores que corresponden a la zona gris, entonces se debe evaluar la muestra como negativa. La muestras cuyos valores se encuentren en más de 10% por debajo del valor límite calculado se evalúan como negativas. 12. Limitaciones del método El test RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B identifica las toxinas A y B de Clostridium difficile en muestras de heces. No es posible a partir de este test deducir una relación entre la magnitud de un valor de absorbancia obtenido y la manifestación o gravedad de síntomas clínicos. Los resultados obtenidos siempre deben interpretarse de conjunto con el cuadro clínico. Un resultado positivo no excluye la presencia de otros agentes infecciosos. Un resultado negativo no excluye una posible infección con Clostridium difficile. Es posible, por ej. que hubiera ocurrido una degradación proteolítica de las toxinas por una conservación inadecuada de la muestra. Si existe la sospecha anamnésica fundada de una infección con Clostridium difficile se debe repetir el análisis con otra muestra de heces. Un resultado con valores límites puede ser ocasionado también por una distribución no homogénea de las toxinas en la muestra de heces. Por este motivo se debe examinar en tales casos una segunda suspensión de la misma muestra o solicitar otra muestra de heces para repetir el análisis. El cultivo de C. difficile en casos de resultados negativos de toxinas en las heces podría ser un indicio de la presencia de cepas no toxígenas de C. difficile. Para el esclarecimiento de este evento se deben investigar colonias sospechosas en el ELISA en busca de formación de toxinas. 13. Características de rendimiento Calidad del test En un estudio prospectivo en una clínica importante de Alemania se analizaron 502 muestras de heces de pacientes con sospecha de ADCD (diarrea asociada a C. difficile) con el RIDASCREEN ELISA y otros ELISA comerciales y se compararon los resultados con el ensayo de citotoxicidad como patrón de oro (método de referencia). El ensayo RIDASCREEN RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B

10 ELISA mostró la mejor coincidencia con el patrón de oro. Los resultados de este estudio se resumen en la Tabla 1. Tabla 1: Comparación del RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B con el patrón de oro (ensayo de citotoxicidad con neutralización) RIDASCREEN C. difficile Toxin A/B pos. neg. Patrón de oro pos neg Sensibilidad: 89,7 % Especificidad: 96,8 % Valor predictivo positivo: 81,3 % Valor predictivo negativo: 98,4 % Reactividad cruzada Diferentes gérmenes patógenos del tracto intestinal fueron analizados con el test RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B y no presentaron reactividad cruzada. Los análisis se realizaron con suspensiones de bacterias (10 6 hasta 10 9 UFC/ml), con cultivos de parásitos (10 7 hasta 10 9 microorganismos/ml) y con sobrenadantes de cultivos celulares de células infectadas con virus. Los resultados se resumen en la tabla 2. Tabla 2: Reacciones cruzadas con gérmenes patógenos del tracto intestinal Germen de prueba Resultado [DO 450] Adenovirus 0,060 Aeromonas hydrophila 0,057 Astrovirus 0,055 Bacillus cereus 0,053 Bacteroides fragilis 0,058 Campylobacter coli 0,061 Campylobacter jejuni 0,059 Candida albicans 0,066 Citrobacter freundii 0,055 Cryptosporidium muris 0,061 Cryptosporidium parvum 0,054 RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B

11 E. coli (EPEC) 0,060 E. coli (ETEC) 0,054 E. coli (STEC) 0,053 Enterobacter cloacae 0,059 Enterococcus faecalis 0,054 Giardia lamblia 0,056 Klebsiella oxytoca 0,054 Proteus vulgaris 0,055 Pseudomonas aeruginosa 0,055 Rotavirus 0,056 Salmonella enteritidis 0,063 Salmonella typhimurium 0,062 Serratia liquefaciens 0,053 Shigella flexneri 0,067 Staphylococcus aureus 0,065 Staphylococcus epidermidis 0,055 Vibrio parahaemolyticus 0,054 Yersinia enterocolitica 0, Especificidad de la cepa: Las siguientes cepas de Clostridium fueron negativas en el test RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B ELISA: C. bifermentans, C. butyricum, C. difficile no toxigénicas (3 cepas), C. perfringens, C. sordellii, C. sporogenes y C. tetani Precisión La reproducibilidad del test RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B ELISA se realizó con seis patrones de referencia, los cuales abarcan todo el rango de medición desde los valores negativos hasta los valores positivos altos. Para la determinación de la reproducibilidad intraensayos se midieron 40 repeticiones de estas soluciones de referencia. Se obtuvieron los valores promedio y los coeficientes de variación (VK) para 3 lotes de kits de ensayo. Para la determinación de la reproducibilidad interensayos se midieron los patrones de referencia en 10 días de trabajo consecutivos con 2 análisis por duplicado diarios. Las mediciones se realizaron con 3 lotes de kits de ensayo y por parte de 3 técnicos de laboratorio. La reproducibilidad interlotes se determinó con los 3 lotes de kits de ensayo. RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B

12 Valor medio de la referencia/v K Kit lote 1 1,181 / 5,09% 0,867 / 6,25% 0,659/ 6,01% 0,428 / 9,64% 0,320 / 8,42% 0,046 / 5,60% Intraensayos Interensayos Internotes: Kit lote 2 1,307 / 6,13% 0,895 / 4,59% 0,665 / 5,16% 0,461 / 4,74% 0,337 / 5,69% 0,049 / 6,91% Kit lote 3 1,175 / 4,28% 0,879 / 4,81% 0,616 / 7,61% 0,462 / 3,30% 0,300 / 4,71% 0,053 / 15,40% Kit lote 1 Kit lote 2 Kit lote 3 Kits lotes 1-3 1,256 / 13,93% 0,947 / 15,51% 0,620 / 17,87% 0,471 / 20,13% 0,319 / 24,51% 0,058 / 24,16% 1,218 / 12,86% 0,900 / 14,41% 0,596 / 16,85% 0,445 / 18,24% 0,293 / 19,98% 0,058 / 20,54% 1,211 / 11,33% 0,897 / 12,47% 0,601 / 12,45% 0,482 / 18,32% 0,319 / 14,19% 0,059 / 15,37% 1,228 / 12,78% 0,915 / 14,24% 0,605 / 15,94% 0,466 / 18,98% 0,310 / 20,14% 0,058 / 20,33% 14. Interferencia de otras sustancias Las sustancias que se relacionan a continuación no mostraron efecto sobre los resultados del análisis cuando se adicionaron a las muestras de heces positivas y negativas de toxina A/B Clostridium difficile en las concentraciones indicadas: Sulfato de bario (5% p/p), Loperamida (antidiarreico; 5% p/p), Pepto-Bismol (antidiarreico; 5% v/p), mucina (5% p/p), ciclamato (edulcorante sintético 5% v/p), sangre humana (5% v/p), ácido esteárico/ácido palmítico (mezcla 1:1, 40% p/p), Metronidazol (0,5) (antibiótico 5% v/p), Diclofenaco ( % v/p). RIDASCREEN Clostridium difficile Toxin A/B

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