Otras marcas comerciales de proteinsuccinilato férrico serían Ferplex y Ferrocur.

Transcripción

1 1. INTRODUCCIÓN Para empezar hemos considerado oportuno explicar brevemente la composición del objeto de estudio así como sus aplicaciones en el mercado. Lactoferrina, de laboratorios Chiesi, es el nombre de la marca comercial de este. Su principio activo es el proteinsuccinilato férrico, es decir, es un compuesto orgánico donde el hierro ( Fe3 + ) está unido a proteínas succiniladas de la leche ( caseína ). En el ámbito de la medicina, Lactoferrina es prescrito para tratar los estados de deficiencia del hierro y curar la anemia, aportando hierro a los glóbulos rojos sanguíneos, tratando los estados de deficiencia del hierro y curando la anemia. Imagen 1: Medicamento Lactoferrina Otras marcas comerciales de proteinsuccinilato férrico serían Ferplex y Ferrocur. 2. OBJETIVOS El objetivo fundamental de esta práctica será determinar la concentración de Fe 3+ en el citado para posteriormente poder comparar el resultado obtenido con el específicado en su prospecto, mediante análisis espectrofotométrico. 3. FUNDAMENTO TEÓRICO Los métodos espectroscópicos de análisis están basados en la medida de la radiación electromagnética que es absorbida o emitida por una sustancia. En función de ello se clasifican fundamentalmente en: Métodos de absorción: Se basan en la disminución de la potencia de un haz de radiación electromagnética al interaccionar con una sustancia. Métodos de emisión: Se basan en la radiación que emite una sustancia cuando es excitada previamente por medio de otro tipo de energía (térmica, eléctrica ). Métodos de fluorescencia: Se basan en la radiación que emite la sustancia cuando es excitada 1

2 previamente por un haz de radiación electromagnética. Otras clasificaciones de los métodos espectroscópicos se establecen en función de la región del espectro electromagnético que interviene en la técnica. Así, pueden utilizarse regiones como rayos X, ultravioleta, visible, infrarrojo, microondas, etc. En la imagen 2 pueden verse las regiones del espectro electromagnético, en función de los valores de la longitud de onda (λ) de cada radiación: Imagen 2: Regiones del espectro electromagnético En esta figura puede también observarse como la luz visible para el ojo humano constituye únicamente una pequeña parte del espectro electromagnético. Dado que los primeros métodos espectroscópicos desarrollados corresponden a la región del visible recibieron la denominación de métodos ópticos, la cual se utiliza todavía con frecuencia. A continuación, se ofrece una breve información sobre la ley de Lambert-Beer y la espectrofotometría de absorción en la región visible del espectro. Si se considera que se dispone de una fuente de radiación que hace llegar a la muestra un haz de radiación, de longitud de onda previamente seleccionada, cuya potencia es P 0, la muestra de espesor b absorbe una parte de esa radiación incidente, de forma que la potencia del haz disminuye después de atravesar la muestra siendo su nueva potencia P. El cociente entre la potencia de la radiación que sale de la muestra y la de la que incidió sobre ella, se define como transmitancia: T = P / P 0 La transmitancia también puede expresarse en tanto por ciento, multiplicando el cociente anterior por 100. Es más frecuente utilizar el concepto de absorbancia, o densidad óptica, que se define como el logaritmo de la transmitancia cambiado de signo: 2

3 A = log (P 0/ P)=-log T De acuerdo con estas expresiones, si la muestra no absorbe radiación, P y P 0 coinciden, por lo tanto A=0, y se transmite toda la radiación T=1 (100% de transmitancia). Si, en otro caso, se transmite solo un 1% de radiación (T=0.01), P=P 0 /100 la absorción de radiación que ha tenido lugar corresponde a A=2. Al incidir radiación electromagnética visible sobre la materia puede ser totalmente absorbida o totalmente reflejada. En el primer caso el objeto aparecerá de color negro y en el segundo de color blanco. Puesto que nosotros percibimos los objetos por medio de la luz reflejada, si hacemos incidir un haz de luz blanca (que contiene todas las longitudes de onda) sobre un objeto, éste absorberá ciertas longitudes de onda y reflejará otras, siendo éstas últimas las responsables del color. Se dice que este color (observado) es complementario del que se percibiría si la luz absorbida se pudiera detectar. Dado que en la parte experimental de esta práctica las medidas van a realizarse con espectrofotometría visible, es conveniente conocer para qué longitud de onda tiene cada color su máxima absorción, lo que se muestra en la tabla siguiente: Para medir los valores de absorbancia y transmitancia de una disolución se utilizan espectrofotómetros UV-Vis, que, como puede verse en la imagen 3, se componen de cinco elementos principales: Una fuente de radiación que suele ser una lámpara de filamento de wolframio. Un monocromador que permite seleccionar una longitud de onda determinada originando un haz monocromático. 3

4 Un recipiente para contener la muestra denominado cubeta fabricado con un material que permite el paso de la radiación en la región del espectro de interés. Suelen ser de vidrio, plástico o cuarzo. El espesor de la cubeta más habitual es 1 cm. Un detector que convierte la energía radiante en una señal eléctrica. Una pantalla de visualización. Imagen 3:Espectrofotómetro UV-vis La absorbancia está relacionada con la concentración de la sustancia, c, por la ley de Lambert-Beer, que se resume con la ecuación: A = ε b c, donde c se expresa en mol/l, b es la longitud del camino óptico (anchura de la célula que contiene la disolución de la sustancia) y se expresa en cm, y ε es la absortividad molar, propiedad característica de cada sustancia correspondiente a la cantidad de radiación que absorbe a una longitud de onda determinada por unidad de concentración, siendo sus unidades L mol -1 cm -1. Para poder aplicar la ley de Lambert-Beer es necesario seleccionar previamente una longitud de onda puesto que tanto A como ε varían con ella. Para ello se obtiene previamente el espectro de absorción de la sustancia, que consiste en una representación de los valores de absorbancia frente a la longitud de onda expresada en nanometros (nm). Del espectro de absorción puede seleccionarse el valor de longitud de onda para el cual la absorbancia es máxima. La imagen 4 muestra dos ejemplos de espectro de absorción. 4

5 Imagen 4: Ejemplos de espectros de absorción Si bien la ley de Lambert-Beer indica que a una representación gráfica de la absorbancia frente a la concentración le correspondería una línea recta, esto sólo tiene lugar para disoluciones diluidas, por ello, no es conveniente utilizar la expresión matemática directamente, sino construir en cada caso la recta de calibrado que confirme que la ecuación de Lambert-Beer se cumple en el intervalo de concentraciones en el que se trabaja. Esta recta se construye midiendo la absorbancia de una serie de disoluciones de concentración perfectamente conocida. En la práctica que realizaremos a continuación se determinará la concentración de Fe 3+ presente en una determinada muestra por espectrofotometría. Para ello se formará previamente el complejo con sulfocianuro de potasio, es decir, Fe(SCN) 3. Por otro lado, se medirá la absorbancia de una serie de disoluciones cuya concentración de Fe(SCN) 3, representándose el valor de absorbancia obtenida frente a la concentración (recta de calibrado). Por último, a partir del valor de absorbancia medido para la disolución problema y utilizando la recta de calibrado se determinará la cantidad de hierro presente en la muestra problema. 4. CAMPO DE APLICACIÓN La espectrofotometría UV/vis se utiliza habitualmente en la determinación cuantitativa de soluciones de iones metálicos de transición y compuestos orgánicos muy conjugados. Soluciones de iones metálicos de transición: las soluciones de iones metálicos de transición pueden ser coloreadas ( es decir, absorben la luz visible ) debido a que los electrones en los átomos de metal se pueden exitar desde un estado electrónico otro. El color de las soluciones de iones metálicos se ve muy afectado por la presencia de otras especies, como 5

6 algunos iones o ligandos. Por ejemplo, el color de una solución diluída de sulfato de cobre es muy azul; agregando amoníaco se intensifica el color y cambia la longitud de onda de absorción máxima. Compuestos orgánicos: los compuestos orgánicos, especialmente aquellos con un alto grado de conjugación, tambien absorben luz en las regiones del espectro electromagnético visible o ultravioleta. Los disolventes para estas determinaciones son a menudo el agua para compuestos solubles, o el etanol para compuestos orgánicos solubles. Los disolventes orgánicos pueden tener una significativa absorción de UV, por lo que no todos los disolventes son adecuados para su uso en espectrofotometría UV. El etanol absorbe muy débilmente en la mayoría de longitudes de onda. La polaridad y el ph del disolvente pueden afectar la absorción del espectro de un compuesto orgánico. La tirosina, por ejemplo, aumenta su máximo de absorción y su coeficiente de extinción molar cuando aumenta el ph de 6 a 13, o cuando disminuye la polaridad de los disolventes. Aunque los complejos de transferencia de carga también dan lugar a colores, éstos son a menudo demasiado intensos para ser usados en mediciones cuantitativas. 5. DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO 5.1 MEDIOS NECESARIOS MATERIAL Matraces aforados de 100 ml Matraz aforado de 500 ml Pipeta graduada de 50 ml ( o matraz aforado en caso de no tener una pipeta de esta capacidad ) Pipeta de doble aforo de 5 ml Pipeta de doble aforo de 10 ml Pipeta de doble aforo de 25 ml Pipeta graduada de 5 ml Vasos de precipitados Embudo Cuentagotas Cubetas de cuarzo REACTIVOS Disolución KSCN 3M 6

7 Disolución HCl 1M Acetona Disolución patrón de Fe ± 50 ppm EQUIPO Espectrofotómetro ultravioleta-visible MUESTRA Medicamento con Fe 3+ ( Cada vial de Lactoferrina contiene 800 mg de hierro proteinsuccinilato, equivalente a 40 mg de Fe 3+ ) 5.2 PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS Preparación de 500 ml KSCN 3M a partir de KSCN extrapuro 0,5 L 3mol 1L 97,18 g =145,77 g de KSCN 1mol Preparación de 1L de HCl 1M a partir de HCl con una pureza del 37% y una densidad de 1,19 g/ml 1L 1mol 1L 36,5 g disolución 1mL 100g =82,89 ml HCl mol HCl 37g HCl 1,19 g disolución Preparación de la disolución patrón de Fe 3+, 500 ml con una concentración de 50 ppm Para preparar la disolución del patrón se utiliza FeCl 3 6H 2 O ( es una sal que presenta una elevada solubilidad, en caso de no tener este reactivo es posible utilizar otro que también contenga Fe 3+ siempre y cuando éste sea altamente soluble ). 0,05g Fe +3 1L 1mol Fe+3 FeCl 6H O 55,9 g Fe +3 1mol ,20 g 1mol Fe 1 molfecl 3 6H 2 O = 0,145 g FeCl 6H O 3 2 L 5.3 PREPARACIÓN DE LAS DISOLUCIONES Una vez preparados los reactivos se preparan seis disoluciones, de acuerdo con la tabla que figura a continuación ( tabla 1 ) y aforando a 100mL. El orden en que se añaden los reactivos es muy 7

8 importante para la posterior medida de las muestras, ya que para que estas medidas de absorbancia sean fiables, todas las disoluciones deben estar, en la medida de lo posible, el mismo tiempo en contacto con el KSCN. Así pues, el orden a seguir será: I. Se añade la acetona II. Se añade el HCl III. Se añade el patrón IV. Una vez tenemos las seis disoluciones con esos reactivos, se comienza a añadir el KSCN,empezando por la disolución de concentración más baja a la más alta, haciendo una pausa de dos minutos entre disolución y disolución. ( Rotular cada matraz aforado de manera que cada disolución quede identificada, siendo la disolución 1 la correspondiente al blanco ) Disolución Disolución patrón Fe 3+ ( ml ) * (1) Disolución KSCN 3M ( ml ) Disolución HCl 1M ( ml ) Disolución acetona ( ml ) Tabla I: Prepación de las disoluciones *(1) Estos ml de la disolución patrón de Fe +3 coincidirán con la concentración en ppm. 5.4 DETERMINACIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA MÁXIMA Como ya se ha dicho en otro punto de esta práctica, para poder aplicar la ley de Lambert Beer es necesario seleccionar previamente una longitud de onda máxima. Así pues, una vez realizadas las seis disoluciones se procede a determinar ésta ( λmax ), tomando el blanco ( disolución 1 ) como referencia. Para realizar estas mediciones se utilizarán cubetas de cuarzo, puesto que la acetona dañaría las cubetas de plástico. 8

9 Las longitudes de onda a las que se medirá la absorbancia de la disolución elegida son las siguientes ( tabla II ): Los pasos a seguir para determinar λmax son: λ 1 λ Tabla II: Longitudes de onda I. Encender el espectrofotómetro al menos 30 minutos antes de su uso. El interruptor se encuentra en el lateral izquierdo del equipo. II. Lavar las dos cubetas que se van utilizar con agua destilada y secarlas completamente. III. Enjuagar una de las cubetas con el blanco una vez, y a continuación llenarla de nuevo, asegurándonos de que los laterales de la misma por donde va a pasar la luz quedan completamente limpios, sin restos de líquido ni de huellas. Abrir la tapa del espectrofotómetro e introducir la cubeta en el primer hueco que nos encontramos más próximo a nosotros. Situándonos en frente del equipo, introducimos la cubeta, de manera que las caras transparentes de la misma queden perpendiculares a nosotros y las caras opacas queden paralelas a nosotros, ya que la luz pasa horizontalemente y debe atravesar las caras transparentes de la cubeta. IV. Coger otra disolución de las preparadas y seguir el mismo procedimiento que en el paso anterior, con la única diferencia de que esta vez la cubeta se va a meter en el huevo contiguo al de la cubeta que contiene el blanco. Aunque la disolución utilizada en este caso para 9

10 determinar la longitud de onda máxima es opcional se recomienda utilizar la disolución 4, ya que es la que contiene una concentración intermedia de Fe 3+ frente a las demás disoluciones preparadas. V. Cerrar la tapa del espectrofotómetro. VI. Pulsar GO TO WL para seleccionar la λ deseada, utilizando el teclado numérico, y a continuación pulsar ENTER ( pulsar CLEAR para en caso de equivocación para corregir ). VII. Pulsar CELL o CELL para poder seleccionar el hueco donde se ha situado la cubeta con el blanco. Una vez éste ha sido seleccionado poner la absorbancia a 0, pulsando AUTOZERO. VIII. Ahora pulsa CELL para ascender al siguiente hueco ( que será el hueco donde se ha puesto la disolución 4 ) y anotar la absorvancia ( A ) que aparece en la pantalla. Repetir estos pasos con cada λ. Con los datos obtenidos se construirá un gráfico donde se representará la Absorbancia ( A ) frente a la λ, y se observará el punto en el que la longitud de onda produce un máximo de absorción. Ésta será la λmax. 5.5 OBTENCIÓN DE LA CURVA DE CALIBRADO Una vez se conoce el valor de la longitud de onda máxima, se procede a determinar la absorbancia de todas las disoluciones preparadas para esa λmax, tal y como se ha hecho anteriormente, con la única diferencia que, ahora ya no es necesario realizar AUTOZERO, puesto que se está midiendo con la misma longitud de onda. Para medir, es necesario seguir ESTRICTAMENTE el mismo orden de concentración ( de más baja a más alta ) que se siguió para añadir el reactivo KSCN. Con los datos obtenidos se construye la recta de calibrado representando A ( absorbancia ) de cada disolución patrón respecto a su concentración en ppm ( recordar que la concentración en ppm coincide con el volumen de la disolución patrón de Fe 3+ que se ha añadido a cada disolución ) 5.6 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Partimos de un vial muy concentrado en Fe +3 ( 40 mg/ 15 ml ), equivalente a 2666,66 ppm de Fe +3. Por tanto tendremos que preparar una muestra de 50 ppm próxima a los patrones utilizados en la recta de calibrado; sabiendo que el volumen de muestra que se quiere preparar es de 500 ml, mediante una operación sencilla se puede determinar qué volumen ( ml ) de muestra será necesario para que tanto la concentración del patrón como la de la muestra sean lo más semejantes posibles: V muestra =

11 V muestra =9,37 ml Se toman por tanto 10 ml de muestra y se enrasan a 500 ml. Ésta será nuestra muestra, y sabemos que va a tener una concentración muy semejante a la de la disolución patrón. 5.7 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA Para determinar la concentración de la muestra ha de conocerse previamente su absorbancia. Para ello, se prepara una nueva disolución, siguiendo las mismas pautas y con los mismos reactivos que las disoluciones anteriores ( tabla III ), siendo la única diferencia que esta vez, en vez de un patrón de Fe 3+ se utilizará la muestra propiamente. Disolución Muestra ( ml ) Disolución KSCN 3M ( ml ) Disolución HCl 1M ( ml ) Disolución acetona ( ml ) Muestra Tabla III: Preparación de la disolución muestra. A continuación y del mismo modo que se ha hecho anteriormente, se mide la absorbancia de la muestra a la longitud de onda máxima ya obtenida. Si el valor obtenido se encuentra dentro de los valores de la curva de calibrado realizada, ya se puede determinar la concentración de Fe 3+ en el. 5.8 PRESCRIPCIONES Y CONDICIONES DE ENSAYO I. El espectrofotómetro ha de encenderse al menos 30 minutos antes de su uso. II. El reactivo KSCN ha de echarse siguiendo las pautas establecidas. III. Se ha de ser lo más riguroso posible a la hora de preparar las disoluciones. IV. Las mediciones de las disoluciones para determinar la longitud de onda máxima han de realizarse ESTRICTAMENTE siguiendo el mismo orden de concentración ( de más baja a más alta ) que se siguió para añadir el reactivo KSCN. V. Las disoluciones y la muestra han de prepararse el mismo día en que se va a medir su absorbancia y éstas han de medirse lo más rápido posible, puesto que el color no es muy estable, y en 30 minutos la intensidad de reduce en un 2-3%. VI. Homogenizar las disoluciones y la muestra antes de medir su absorbancia. VII. Enjuagar cuidadosamente la cubeta con la disolución que va a ser medida, antes de llenarla definitivamente. VIII. Asegurarse de no dejar huellas en las cubetas y colocarlas en la posición correcta en el espectrofotómetro 11

12 5.9 DIAGRAMA DE FLUJO HCl 1M KSCN 3M FeCl 3 6H 2 O Acetona Cubeta1--->D1 Cubeta2--->D4 Medir λ >530nm Anotarlas λ obtenidas λmax ENCENDER EL EQUIPO PREPARAR LOS REACTIVOS PREPARAR LAS DISOLUCIONES ( aforar a 100 ml ) DETERMINAR λmax MEDIR ABSORBANCIA DISOLUCIONES D1 D2 D3 D4 D5 D6 Acetona 50mL 50mL 50mL 50mL 50mL 50mL HCl Patrón KSCN Curva de calibrado 0mL 2mL 4mL 6mL 8mL Pipetear 10 ml del y aforar a 500 ml PREPARAR LA MUESTRA DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA 2mL Muestra 50mL Acetona Hcl Patrón kscn (Aforar a 100mL) MEDIR ABSORBANCIA DE LA MUESTRA RETIRAR CUBETAS APAGAR EL EQUIPO 12

13 6. RESULTADOS Y GRÁFICOS 6.1 DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS PARA LA DETERMINACIÓN DE λmax En la tabla que se muestra a continuación ( tabla IV ) se muestran los valores de absorbancia obtenidos para la disolución 4. λ 1 A 1 λ 2 A Tabla IV: Resultados experimentales de absorbancia obtenidos para la disolución 4. Nota: por falta de tiempo no se han realizado las medidas de absorbancia en todas las longitudes de onda que se reflejan en la tabla IV, puesto que se ha considerado que midiendo las absorbancias en el resto de longitudes de onda era suficiente para determina λmax. No obstante se recomienda realizar la medida de la absorbancia en todas las λ. Con estos datos se construye un gráfico ( gráfico 1 ) donde se representa la absorbancia frente la longitud de onda. El punto de absorbancia más alto se correponde con la longitud de onda máxima. 13

14 Gráfico 1. Absorbancia frente Longitud de onda 6.2 DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS PARA LA ABSORBANCIA DE CADA DISOLUCIÓN. CURVA DE CALIBRADO Una vez se ha obtenido la λmax, se han medido las absorbancias del resto de disoluciones preparadas. Los valores obtenidos se reflejan en la tabla V: λmax = 490 nm Disolución A ( absorbancia ) A m 1 0,084 A m 2 0,229 A m 3 0,312 A m 4 0,426 A m 5 0,530 Tabla V: Resultados experimentales de absorbancia para cada disolución. Con los datos de esta tabla se construye la curva de calibrado ( gráfico 2 ), que nos servirá posteriormente para poder determinar la concentración de nuestro ( muestra ). 14

15 Gráfico 2: Curva de calibrado 6.3 DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS EN LA MEDICIÓN DE LA ABSORBANCIA DE LA MUESTRA. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DEL MEDICAMENTO. El valor de absorbancia que se ha obtenido para la muestra se refleja en la tabla VI. λmax = 490 nm Disolución A ( absorbancia ) Muestra 0,522 Tabla VI: Resultado experimental de absorbancia para la muestra Como se puede ver en el gráfico 2, el valor de la absorbancia que se ha obtenido se encuentra dentro del valor más bajo y más alto de la curva de calibrado, con lo cual, teniendo en cuenta también que el valor del coeficiente de determinación de la recta de regresión obtenido en dicha curva de calibración es próximo a uno, lo que nos indica que el ajuste es casi perfecto e y depende funcionalmente de x, podemos determinar la concentración de la muestra, es decir, podremos determinar la concentración de Fe +3 en el. Ecuación de la recta de regresión: Y sustituyendo en la ecuación: 15

16 y= 0,522 Se obtiene que el valor de x, que será el valor de la concentración es de 9,39 ppm. Pero estos ppm están presentes en los 2mL de muestra diluída. Realizando los cálculos correspondientes se obtiene que en la muestra hay un total de 704,55 ppm de Fe CONCLUSIONES El contenido en Fe +3 obtenido para esta práctica, ha sido de 704,55 ppm por cada 15 ml de muestra, frente a los 2666,66 ppm por cada 15 ml de muestra que contiene este, por tanto el resultado no es el correcto y todo para indicar que en el desarrollo de esta práctica se ha cometido algún error que ha llevado a esta diferencia entre el valor obtenido experimentalmente y el valor real. Por tanto se recuerda la importancia de prestar especial atención a las pautas indicadas en el punto 5.8 de esta práctica PRESCRIPCIONES Y CONDICIONES DE ENSAYO. En nuestro caso el único punto que no se ha cumplido ha sido que el tiempo transcurrido desde que se prepararon las disoluciones y hasta que se realizaron las mediciones en el espectrofotómetro ha sido superior a 30 minutos, con la pérdida de intensidad en el color que esto conlleva. 8. BIBLIOGRAFÍA ambert_beer.pdf