Gonzalez, Héctor Horacio Lucas

Transcripción

1 Tesis de Posgrado Estudio de la distribución de la microflora contaminante de maíz recién cosechado : Riesgo potencial de aparición de microtoxinas en la Región Maicera Argentina Gonzalez, Héctor Horacio Lucas 1995 Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias Químicas de la Universidad de Buenos Aires Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente. This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source. Cita tipo APA: Gonzalez, Héctor Horacio Lucas. (1995). Estudio de la distribución de la microflora contaminante de maíz recién cosechado : Riesgo potencial de aparición de microtoxinas en la Región Maicera Argentina. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Cita tipo Chicago: Gonzalez, Héctor Horacio Lucas. "Estudio de la distribución de la microflora contaminante de maíz recién cosechado : Riesgo potencial de aparición de microtoxinas en la Región Maicera Argentina". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes C1428EGA - Tel. ( ) Conta cto : digital@bl.fcen.uba.ar

2 UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES DEPARTAMENTO DE INDUSTRIAS "Estudio de la distribución de la micoflora contaminante de maíz recién cosechado. Riesgo potencial de aparición de micotoxinas en la Región Maícera Argentina" HECTOR HORACIO LUCAS GONZALEZ Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires Directora: Dra. Silvia L. Resnik 1995

3 A Florencia y Carolina

4 AGRADECIMIENTOS A la Dra. SilviaL. Resnikpor su guía científica, constantepresencia y dedicación volcada en la elaboración de esta tesis. A la Sra. María Elena Modena por su apoyo, estímulo y amistad. A la Lic. Elena J. Martínez por su valioso y cálido aporte en el análisis estadístico de los datos. Al Ing. Agrón. Eduardo Teyssandier, a la Dra. Marta S. de Huergo, a la Dra. Helga Heineken, al Prof Dr. Walter F. 0. Marasas, a la Ing. Agrón. Rosa T. Boca, a la Ing. Agrón. Ruth Friedman, a la Lic. Carmen Peralta Sanhueza, al Dr. Eric W. Sydenham, al Lic. Gustavo Moltó, a la Dra. Sofia Chulze, a la Dra. Miriam Etcheverry, a la Lic. Marta Viora, al Dr. Eduardo Gras, al Dr. Guillermo Caballero y a la Sra. Gabriela Cano por su colaboración en la concreción de este trabajo. A la Srta. Leticia Scocciapor sus sugerencias y la dedicación puesta en la edición de esta tesis. A los Departamentos de Industrias y Quimica Orgánica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y a la Cátedra de Microbiología Industrial del Departamento de Ingenien'a Química de la Facultad de Ingeniería de la Universidadde BuenosAires, donde realicé la mayorparte del trabajo experimental. Al Centro de Investigación en Micotoxinas de la Universidad Nacional de Luján, al Medical Research Council en Ciudad del Cabo, Sudáfi'ica, al Departamento de Microbiologia e Inmunología, Orientación Micología, de la Facultad de Ciencias Exactas y Fisico-Quimicas de la Universidad Nacional de Rio Cuarto y al Laboratorio Nacional de Investigaciones y Servicios de Espectrometria de Masa de Alta Resolución, donde complete el análisis de algunas micotoxinas. Por el apoyo económico recibido, a la Universidad de Buenos Aires, a la Fundación Cargill, al Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Técnicas, a la Comisión de Investigaciones Cientificas de la Provincia de Buenos Aires y a Merck Quimica Argentina. Héctor Horacio Lucas González.

5 INDICE GENERAL Introducción Objetivos Materiales y Métodos Resultados 121 Conclusiones 231 Bibliografía 236 Tablas de Datos 272

6 INDICE DEL CAPITULO l. Introducción La. I.b. I.c. Importancia del maíz en la Argentina Caracterización edáñca, orográfica y climática de la región pampeana argentina I.b.l. Características de la zona núcleo de producción de maíz en la Argentina Micoflora asociada al cultivo de maíz Lc. l. Enfermedades de origen fúngico I.c.2. Micoflora contaminante del maíz previa al almacenamiento l.d. Hongos toxicogénicos y micotoxinas en maíz I.d.l. Ocurrencia natural de micotoxinas en maíz I.d.2. Alternaria I.d.2.]. Alternariol y alternariol monometil éter I.d.3. I.d.4. I.d.S. Aspergillus I.d.3.l. Aflatoxinas I.d.3.2. Acido ciclopiazónico Penicillium I.d.4.]. Citrinina Fusarium I.d.5. l. Características morfológicas I.d.5.2. Taxonomía I.d.5.3. Zearalenona I.d.5.4. Tricotecenos I.d.5.5. Moniliformina I.d.5.6. Fumonisinas

7 I. Introducción El maíz (Zea mays (L.)) es el cereal americano por excelencia, de ahí que cumpliera el papel que tuvo el arroz en Oriente y el trigo y la cebada en Occidente, es decir, fue el cultivo básico que permitió el desarrollo de las grandes civilizaciones precolombinas (Tocagni, 1982). La palabra maíz significaba "causa de vida" para los nahuas, quienes creían que los hombres fueron creados con granos de maíces molidos y amasados con la sangre de los dioses. En el libro sagrado de los mayas el "Popol Vuh" se encuentra otra relación entre el origen del ser humano y el maíz. Como el maíz tenía muchos colores (blanco, gris, azul, amarillo, rosa, rojo, morado) los hombres creados a partir del maíz tenían distintos colores de piel (Emoke Ijjász, 1992). El cultivo de maíz es probablemente originario del Valle de Teohuacán (México). Algunos investigadores creen que el maíz apareció en estado silvestre hace años y que hace 8.000, los hombres comenzaron a cultivarlo e hibridarlo. Después del descubrimiento de América el maíz es conocido en España en el año de 1492 y de allí pasó al mundo entero. En la actualidad se siembran híbridos originados de maíces tipo flint o colorado (Zea mays L. var. Indurata (Sturtevant) Bailey) y de maíces tipo dentado (Zea mays L. var. Indentata (Sturtevant) Bailey). Los principales productores son: Estados Unidos de América, China, ex Unión Soviética, Brasil, México, Francia, ex Yugoslavia, Rumania, Italia, Sudáfrica y Argentina. La. Importancia del maíz en la Argentina En la República Argentina el cultivo del maíz representa una de sus más importantes fuentes de ingresos proveniente del sector agrícola, pues es el principal cereal que exporta la Nación. Argentina vende maíz a 27 países entre los que podemos Introducción - 2

8 mencionar los de la Comunidad Europea, Cuba, Japón, Irán, Brasil y Perú (Bolsa de Cereales de Buenos Aires, 1994). Como en los principales países productores, en la Argentina el maíz es industrializado en una mayor proporción. Este cereal se procesa según dos modos: molienda húmeda y molienda seca. En la primera, el objetivo principal es la separación del almidón, producto que se usa con fines alimentarios o como materia prima en industrias no alimentarias. La molienda seca, en cierta forma similar a la del trigo, tiene como finalidad obtener molinados de distinto tamaño de partícula, siendo los más conocidos la harina de maíz y los cereales de desayuno (copos de maíz o "corn flakes"). Por ambas vías de industrialización se puede obtener aceite, el cual tiene valor competitivo, respecto a los provenientes de oleaginosas, ya que la extracción del mismo está facilitada por estar contenido en el germen, el cual puede separarse del grano entero. Es creciente, también, el consumo de maíz en forma de grano entero enlatado al estilo de las legumbres, mientras que comienza a verse una forma alternativa de consumo de maíz en grano entero congelado individualmente (IQF: individually quick frozen). En maíz, la mayoría de lo industrializado se consume en el pais, siendo las exportaciones predominantemente de grano entero, aceite y derivados proteínicos de la molienda húmeda ("gluten feed" y "gluten meal"). En la Tabla I.l se observa la evolución de la producción, industrialización y exportaciones de maíz en el último quinquenio. En Argentina, el maíz se cultiva mayoritariamente en las provincias de Buenos Aires (40%), Córdoba (20%) y Santa Fe (20%). Según datos de la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca de la Nación en las campañas maiceras de 1992/93 y 1993/94, la superficie sembrada fue de ha y ha, respectivamente (disminuyó un 7% de una campaña a otra). Se cosecharon ha en 1993 y ha en 1994 (disminuyó un 3.3%).

9 Tabla I.1. Producción y exportación de maíz en la República Argentina ( ). Campaña Producción Exportación Exportación (toneladas) (toneladas) (dólares-fob) 1989/ / / / / Ref. C.T.I. (1993); INDEC (1995). El rendimiento de estas campañas fue de 43,6 qq/ha en 1993 y de 42,3 qq/ha en 1994 (se redujo un 3% de un año a otro) y la producción pasó de a toneladas (bajó un 6%). En la campaña 1994/95 se han cubierto a nivel nacional ha, que corresponden al 99,8% de la expectativa de siembra, que se tiene en ha, superior en un 4% a la superficie del ciclo 1993/94. Según las estimaciones publicadas por la SAGyP (1995) hasta el 12 de mayo de 1955, se había recolectado en todo el país el 74,5% ( ha) de la superficie cosechable ( ha). El rinde nacional hasta esa fecha fue de 47,2 qq/ha (6.8% superior al obtenido el año pasado) y la producción de toneladas, es superior en un 18,5% a la campaña pasada hasta esa altura del ciclo. En la campaña 1989/90 la producción de maíz en la República Argentina fue de toneladas, lo cual representó un 50% de la producción media del quinquenio El rendimiento para la campaña 1989/90 fue de 32,7 qq/ha, observándose una disminución en el área sembrada del 42,3% (Bolsa de Cereales, 1990). Introducción - 4

10 I.b. Caracterización edáfica, orográfica y climática de la Región Pampeana Argentina La Argentina produce un espectro amplio de granos, tanto de cereales como de oleaginosas, ya que las caracteristicas climáticas del pais y especialmente las de la llanura pampeana, permiten producir granos de tipo termófilo como el maíz, sorgo, arroz, soja y girasol, y del tipo criófilo, como el trigo, avena, cebada y centeno. En los últimos años la producción fluctuó entre los 28 y 45 millones de toneladas anuales, dependiendo de los aspectos meteorológicos como así también de las condiciones socioeconómicas nacionales e internacionales. Geográficamente (Damario y Pascale, 1988), la región pampeana se ubica entre los 30 y 39 de latitud sur abarcando tres países: La mitad austral del estado de Rio Grande Do Sul en Brasil, toda la R.O. del Uruguay y gran parte de la región centro oriental de la Argentina. La parte argentina de esta región, donde se produce la casi totalidad de los granos del país, es una dilatada llanura de aproximadamente medio millón de kilómetros cuadrados, casi plana o ligeramente ondulada, solamente interrumpida por las serram as del sur de la provincia de Buenos Aires con alturas máximas cercanas a los 1200 m. Comprende la mayon'a de la provincia de Buenos Aires, salvo el apéndice sur, una parte on'ental de la provincia de La Pampa, parte del sur de Córdoba, sur de la provincia de Santa Fe y la parte sudoriental de la provincia de Entre Ríos. El suelo está formado por una capa de loes de origen eólico, constituido por elementos finos, compacto y con elevada retención hídrica en la porción nororiental, más suelto y permeable en la occidental. El subsuelo es arcilloso y a profundidad variable suele tener elementos de tosca, aislados o formando capas impermeables que obligan a las aguas a escurrir hacia lugares bajos donde forman lagunas y cañadones. El tipo de vegetación natural dominante, resultado de las caracteristicas climáticas y del suelo es de tipo estepario o seudoestepario de gramineas, que forman Introducción - 5

11 matas de hasta l m de altura con doble reposo: en invierno, por las bajas temperaturas y heladas, en verano por la deficiencia hídrica del suelo; en ambas situaciones la pradera aparece seca y amarillenta. No obstante, la elevada variabilidad del clima argentino hace posible la ocurrencia ocasional de inviernos benignos que no interrumpen el crecimiento vegetal o de veranos anormalmente provistos de lluvias abundantes que mantienen el verdor de la pradera. Sin embargo, esta vegetación natural ha sido casi totalmente alterada por la agricultura y la ganaderia. Las características térmicas propias resultan de la acción conjunta de varios factores entre los que debe mencionarse la oceanidad que, atenuando la variación anual de la temperatura, genera veranos frescos e inviernos suaves. En la llanura pampeana, la suavidad del verano térmico se encuentra compensada por su dilatada duración, lo que permite disponer del calor necesario para el desarrollo y maduración de especies termófilas como el maíz, el girasol, el sorgo y la soja. El invierno, muy poco intenso en comparación con iguales latitudes del hemisferio norte, está provisto sin embargo de la cuota de frío suficiente para satisfacer las necesidades de los cereales invernales como el trigo, la cebada, el centeno y la avena. Dentro de la pradera pampeana, la duración de la estación de cultivo o período medio libre de heladas varía desde 180 días (principios de octubre a mediados de abril) en la parte sudoccidental hasta 330 días (mediados de agosto a mediados de junio) en la parte nororiental. Pocas llanuras agrícolas cuentan con una estación de cultivo tan extensa (entre 6 y ll meses), condición excepcional sólo en parte desmerecida por la variabilidad de las heladas. La estación de cultivo es el pen'odo donde pueden desarrollarse los cultivos de verano, cuya siembra se realiza en primavera después de pasado el peligro de las heladas, completando la acumulación de calor requerida para madurar sus frutos y granos antes del comienzo efectivo del invierno siguiente. Las temperaturas máximas promedio de enero, para la mayor parte de la pradera, varían enre 28 y 32 C con valores de 26 C en la costa atlántica y de 33 C en la parte centro-occidental y nororiental. Las amplitudes térmicas medias (diferencias Introducción - 6

12 entre temperaturas máximas y mínimas) son menores en las regiones costeras por la influencia oceánica (unos 10 C). A medida que se ingresa en continente, se van haciendo mayores, pudiendo llegar a cerca de 17 C en el sur de Córdoba. Las temperaturas mínimas promedio de julio, varían entre 1 y 7 C, lo cual da idea de la relativa suavidad del invierno. Los valores menores se hallan en región sudoccidental y los valores más altos en la nor-oriental. Las amplitudes térmicas siguen una tendencia similar a la del verano con alrededor de 6-7 C en zonas costeras marítimas y 9-12 C en la zona mediterránea (sur de Córdoba). Las precipitaciones anuales van an, en promedio, entre 1100 mm en la región noron ental de la pradera a mm en la zona sud-occidental. Las lluvias no están uniformemente repartidas en el curso del año, siendo el invierno la estación menos lluviosa seguida en orden creciente, aunque con gran diferencia, por el verano, el otoño y la primavera. En casi toda la región los valores mensuales más elevados de precipitación se registran en marzo y octubre. Al comparar regionalmente los valores totales de lluvias con las necesidades estimadas por la evapotranspiración potencial que es justamente mínima en el invierno, se encuentra que, en términos medios, una gran extensión de la pradera pampeana presenta balances hidrológicos equilibrados. Sin embargo, la variabilidad climática existente produce, en algunas campañas, lluvias excesivas en otoño-inviemo, lo que atrasa la preparación del suelo y las siembras de los granos criófilos. Más aún, cada 15años, aproximadamente, las lluvias invernales excesivas producen acumulaciones de agua superficial las cuales, por el reducido declive e insuficiente desagüe de la llanura, inundan los campos y provocan pérdidas de las cosechas y del ganado. En el caso de los cultivos termófilos, el período de siembra es muy dilatado porque las exigencias térmicas iniciales de crecimiento son diferentes según el cultivo. Se realizan primero las siembras de girasol y maíz, y más tarde las de sorgo y soja. Las variaciones regionales introducen diferencias en las fechas normales de siembra de cada cultivo. Los trabajos preparatorios del suelo para las siembras se realizan al final del invierno Introducción - 7

13 5-- - \y o principio de primavera, generalmente con adecuada humedad. I.b.1. Caracterización de la zona núcleo de producción del maíz en Argentina Las limitantes para el cultivo del maíz son la disponibilidad de humedad y la temperatura. Este cereal se cultiva desde la latitud de 50 Norte, que es el limite septentrional de las áreas de cultivo en Europa y Asia, hasta la latitud de 40 Sur en América del Sur, que corresponde en nuestro país a la zona de Patagones. A partir de esta zona hacia el norte y cuando la disponibilidad de agua lo permite, se cultiva maíz con diversos rendimientos y resultados. Teniendo en cuenta factores climáticos, edáficos y socioeconómicos, se ha subdividido la región maicera de acuerdo a los rendimientos promedio que se alcanzan. La zona de producción más importante es la Región Núcleo o Principal (Figura l. l), de donde provienen las muestras con las que se realizó este trabajo. La misma comprende el norte de la provincia de Buenos Aires, sur de la provincia de Santa Fe y los departamentos de Unión y Marcos Juárez en la provincia de Córdoba (INTA, 1980). \ \ Pergaman x N Hoias O O o Salto General Arenales l I O Chacabuco x Figura [.1. Zona Núcleo de la región maicera típica de la República Argentina. Introducción - 8

14 Esta zona núcleo tuvo un rendimiento promedio de 5280 kg/ha en la campaña 94/95 (SAGyP, 1995). Las condiciones en esa zona se presentan favorables para el cultivo, ya que hay un período importante libre de heladas y con temperaturas y humedad óptimas durante el período crítico de la floración. Si bien la subregión núcleo tiene un promedio de temperaturas medias anuales de 17 C (1941/1960), el promedio de las temperaturas medias del mes de diciembre fue de 23 C. La subregión está comprendida entre las isohietas de 950 a 800 mm anuales (aproximadamente 110 mm en diciembre, en el período 1941/1960). Ante la imposibilidad de contar los datos meteorológicos de toda la zona núcleo para el último decenio se muestran en la tabla 1.2, a modo indicativo las temperaturas medias mensuales y precipitaciones de la localidad de Pergamino. En esta localidad en el pen'odo 1941/1960 el promedio de las temperaturas medias anuales fue de 16,1 C y en el período 1988/1993 fue de 17 C. En el mes de diciembre el promedio de las temperaturas medias mensuales es ligeramente inferior en los dos períodos que el promedio en toda la zona. El factor menos favorable en la región es el edáfico. A esta región corresponden suelos tipo brunizen con un horizonte Bt bien definido en el este de la zona y que va perdiéndose hasta desaparecer en el oeste. El horizonte humífero A tiene buena estructura, siendo limitado en su profundidad (entre los 15 y 35 cm, alcanzando en algunos puntos los 50 cm de profundidad). Este horizonte es franco con un contenido en materia orgánica variable (del 2-5 %), según el manejo recibido. El horizonte Bl característico, es compacto cuando está seco y plástico y adherente cuando está húmedo y actúa como limitante a la función de las raíces porque su alto contenido en arcilla deja poco oxígeno disponible para la respiración radicular. Introducción - 9

15 Introduce/ Tabla 1.2. Temperaturas medias mensuales y precipitaciones en Pergamino (promedios de los períodos indicados). Elementos climáticos Período Mses del año AS Temperatura media ( C) 1941/ ,4 13,0 15,9 22,6 1988/ ,8 13,7 16,8 20,1 22,4 Precipitacio nes (mm) 1941/ ,0 62,0 39,0 54,0 92,0 95,0 86,0 109,0 82,0 1988/ ,6 56,7 48,1 40,9 98,3 116,3 149,6 111,6 49,7

16 I.c. Micoflora asociada al cultivo de maíz I.c.1. Enfermedades de origen fúngico Entre los factores bióticos que afectan la producción de maíz se encuentran las enfermedades de origen fúngico (Sarasola y de Sarasola, 1981; Krüger, 1989; Rheeder y col., 1990), las cuales se pueden dividir en: 1 Aquellas que ocasionan daños durante la primer etapa del cultivo, inmediatamente después de la siembra y durante el estado juvenil de la planta. 2 Aquellos que ocasionan daños durante el desarrollo del cultivo. En el pn'mer grupo las principales son la podredumbre de la semilla y el tizón de las plántulas. Los hongos más importantes que causan estas enfermedades son especies del género Pythium, como por ejemplo P. ultímum Trow. Otros mohos que atacan semillas y plántulas son los siguientes: Fusarium monilzfonne Sheldon, F. graminearum Schwabe, Diplodía maydis (Berk.) Sacc., Helminthosporium maydis Nisik. & Miy., H. pedicellatum Henry, Collerotrichum graminicolum (Ces.) G.W. Wills y Penícíllium oxalicum Currie & Thom. También están relacionados con los tizones de las plántulas Aspergillus spp., Nigrospora oryzae (Berk. & Br.) Petch, Rhizoctom'azeae Voorhees, Macrophomina phaseoli (Maubl.) Ashby y Cephalosporium maya'is Semra, Sabet et Hingorani. El segundo tipo de enfermedades se agrupan según los órganos de la planta que ataquen:

17 A. Tallos y hojas * Podredumbre del pie: causado por un complejo de especies fúngicas entre los que sobresalen Díplodía maydis (Berk.) Sacc., Macrophomina phaseoli (Mubl.) Ashby (sinónimo: Sclerotium bataticola Taub), Gibberella zeae (Schw.) Petch, Fusaríum moníliforme Sheldon, F. subglutinans (Wollenw. & Reinking) Nelson, Toussoun & Marasas, Phytium aphamidermatum (Eds.) Fitz. Tizón de la hoja: provocado por Helmínthosporium turcicum Pass, H. maya'ís Nisik & Miy. y H. carbonum Ullstr. Otro tizón, el amarillo, es causado por Phyllosticta maydis Arny & Nelson. * * Mancha en ojo: ocasionada por Kabatiella zeae Narita & I-liratsuka. Roya: producida por Puccinia sorghí Schw. B. Inflorescencias * Carbón de la espiga (inflorescencia femenina): ocasionado por Ustilago maydis (DC) Cda. Carbón de la panoja (inflorescencia masculina): producido por Sphacelotheca reiliana (Kühn) Clint. Crazy top provocado por Sclerospora macrospora Sacc. Podredumbre de la espiga ocasionada por un grupo de hongos entre los que se encuentran Diplodia maydis (Berk.) Sacc., Gibberella zeae (Schw.) Petch, Fusaríum monilíforme Sheldon, F. subglutinans (Wollenw. & Reinking) Nelson, Toussoun & Marasas, Nigrospora oryzae (Berk. & Br.), Physalospora zeae Stout, Penicillíum oxalicum Currie & Thom, Cladosporium herbarum (Pers.) Link, Aspergillus flavus Link.

18 De las especies mencionadas anteriormente, Puccinia sorghi, Ustilago maydis y Sphacelotheca reiliana son parásitos vegetales absolutos, el resto pueden actuar como patógenos, con distinto nivel de virulencia, o como saprobios colonizando y creciendo en los restos del cultivo de un año a otro. Entre los hongos saprobios que afectan al cultivo de maíz, patógenos o no, se encuentran las especies que pueden sintetizar sustancias tóxicas, consideradas con el nombre de micotoxinas. I.c.2. Micoflora contaminante del maíz previa al almacenamiento La colonización fúngica del maíz está limitada en gran medida a las brácteas foliáceas que recubren las espigas (chalas). Aunque los largos estilos puede llevar esporas de especies de Penicillium, de hongos Mucoráceos y bacterias de pigmentación amarilla en el momento de la antesis, permaneciendo los granos estériles hasta unas tres semanas. Sin embargo, ocho semanas después de la antesis, todas las espigas presentan algunos granos contaminados (Hesseltine y Bothast, 1977). En la tabla 1.3 se mencionan las especies fúngicas en el maíz antes de la cosecha en los Estados Unidos de América. Aunque algunas de las especies mencionadas son las mismas que pueden contaminar al trigo y a la cebada, existen diferencias. Una de las más remarcables es la frecuente presencia de Fusarium monilíforme. King (1981) observó que la primera aparición de esta especie ocurre a las dos semanas después de la emergencia de los estilos y estigmas y 10 semanas después hasta un 66% de los granos pueden llevar a este hongo endógenamente. Otra especie como Acremom'um strictum es más variable en su aparición, registrándose la primera colonización a las 3-4 semanas de la emergencia de los estilos y estigmas, y su número incrementa hasta las 10 semanas cuando alrededor de un 45% de los granos muestra infección (King, 1981; Tuite, 1961). Estas dos especies también difieren en su distribución en la espiga, Imroducción - I3

19 mientras que F. moniliforme coloniza preferentemente la punta, A. strictum lo hace en la base de la misma. Wicklow (1983) y Hill y col. (1985), hallaron una asociación negativa en el maíz entre F. moniliforme y otros hongos, sugiriendo que la invasión por esta especie inhibiría la colonización por otros mohos. Las especies de Penicillium son a menudo consideradas como hongos del almacenamiento del maíz. Sin embargo, P. funiculosum y P. oxalicum aparecen como especies características de la invasión precosecha de este cultivo en el medioeste de Estados Unidos mientras que P. fimiculosum, P. purpurogenum y P. cirrinum predominan en el sudeste (Wicklow, 1983; Mislivec y Tuite, 1970). Tabla 1.3. Principales hongos que invaden el maíz antes de la cosecha en Estados Unidos de América. Acremom'um srrícrum Fusarium Alternaria alternara F. semitectum F. A. carbonum Aureobasídium Curvularia lunata Penícillíum cítrinum P. Fusarium acumínatum P. oxalicum F. P. Tríchodenna viridc Ref. Tuite, 1961; Mislivec y Tuite, 1970; Doupnik, 1972; Hesseltine y Bothast, 1977; Wicklow, 1983; Leslie y col., Introducción - 14

20 A su vez, P. oxalicum puede causar, en maíz, lesiones en las chalas y granos, afectando la viabilidad de los mismos y provocando podredumbre en las mazorcas, mientras que P. fimículosum puede producir un estriado en el pericarpio pero no causa pérdida de viabilidad de los granos ni podredumbre de las espigas (Caldwell y col., 1981). Doupnik (1972) observó que la infección del maíz con Helmínthosporium maydis, que provoca podredumbre de la mazorca, puede también incrementar la aparición de otros hongos. Así, A.flavus, Penicillium spp. y Fusaríum spp. fueron más frecuentemente hallados en granos con H. maydis que en otros provenientes de espigas sanas. En la tabla I.4 se puede observar la micoflora contaminante del maíz previo a la cosecha en la República de Sudáfrica. Marasas y col. (l979b), observaron en el cultivo del maíz que F. moniliforme era la especie predominante y estaba favorecido por el clima subtropical del norte del Transvaal, mientras que F. subglutinans prefería el clima fresco y húmedo del este del Transvaal, y vieron que Gibberella zeae (Fusarium gramínearum) era más común en el clima intermedio del oeste del Transvaal, infectando hasta un 8% de los granos. También en Sudáfrica (Marasas y col., 1981; Marasas y van Rensburg, 1986) se halló en muestras de maíz de Transkei, que el principal hongo asociado a los granos de este cereal era F. monilifonne y se cita por primera vez en maíz de Sudáfrica a F. compactum y Lasíodíplodia theobromae. A excepción de Estados Unidos y Sudáfrica, donde los estudios sobre micoflora contaminante del maíz previo a la cosecha fueron realizados en forma sistemática, en otros países existe información fragmentada, la cual se ha tratado de resumir en la tabla 1.5 para países de Europa, en la tabla 1.6 para países de Asia y Oceanía y en la tabla I.7 para países de América (a excepción de Estados Unidos y Argentina). En las mismas se indican los hongos detectados en cada país y no se incorporaron los datos encontrados en bibliografía basados en técnicas y medios de cultivo inapropiados para el aislamiento de las especies de interés. También puede observarse que en varios países se han identificado las especies de un determinado género en particular; y en Introducción - 15

21 muchos casos Ia identificación ha sido sólo hasta nivel de género. Tabla 1.4. Principales hongos que invaden el maíz antes de la cosecha en Sudáfrica. Acremoniella atra Acremom'um spp. Alternaria spp. Aspergillus níger Aspergillus spp. Botryosphaeria zeae Chaetomíum spp. Colletotrichum gramim'cola Díplodia macrospora Fusaríum poae F. semitectum F. solam F. subglutínans Gabarnaudia spp. (micoparásito de Fusarium spp.) Geotrichum candídum Gonarobotrys simplex Lasiodiplodia theobromae Mucorales D. maydis Neocosmospora vasinfecta Dreschlera spp. Epícoccum purpurascens Fusarium chlamydosporum Nígrospora spp. Penicillium Spp. Phoma sorghína F. compactum Phoma spp. F. equiseti Phomopsís spp. F. moniliforme Rhízoctom'a spp. F. oxysporum Trichoderma spp. Ref. Marasas y col., 1981; Marasas y van Rensburg, 1986; Rheeder y col., 1990.

22 F. trícinctum ><><><><><><><><><><><>< Tabla 1.5. Principales hongos que invaden el maíz antes de la cosecha en países de Europa. Especie Acremom'um Fusarium avenaceum F. crookwellense F. culmorum F. X X X X X X X X F. Fusaríum Gibberella Helmimthosporium carbonum Penicillium P. steckii P. Penicillium Phaeocytosrroma X Y Jimínez y col., 1985; (4) Hungría: Fischl y Halász, 1990; (5) Italia: Logrieco y Bottalico, 1988; (6) Polonia: Kwasna y Chelkowski, 1991; (7) Suiza: Winter y Menzí, Y Introducción - 17

23 Tabla I.6. Principales hongos que invaden el maíz antes de la cosecha en países de Asia y Oceanía. Especie Acremonium zeae A. A. ochraceus Curvularia Dreschlera D. turcica Dreschlera Fusarium F. graminearum F. F. F. F. sambucinum F. semitectum F. F. Fusarium Penicíllium P. citrinum (Cont.) Introducción - 18

24 Tabla 1.6 (cont.) Especie Penicíllíum P. P. fimiculosum P. oxalícum P. P. urtícae P. varíabile P. virídicatum Penicíllium Rhizoctom'a A X X X X X X X X Trichoderma Trichothecium roseum Ref. (1) China: Hsia y col., 1988; (2) Filipinas: García y Tuite, 1988; (3) m: Singh y col., 1986; (4) Vasanta y col., 1987; (5) Sinha, 1990; (6) Sinha, 1991; (7) M: El-Behadli y col., 1988; (8) Australia: Blaney y col., 1986; (9) Nueva Zelanda: Hussein y col., Introducción - 19

25 ><><><><><><><>< Tabla I.7. Principales hongos que invaden el maíz antes de la cosecha en países de América (excepto Argentina y Estados Unidos). Especie Países Acremonium strictum Altemaria alternata A. A. ochraceus A. versicolor A. wentii C. herbarum Eurotiwn Fusarium avenaceum Fusarium Gliocladium roseum Penicillíum. canescens. cím'rzum. raisn'ckii P. variabile Ref.(1)Bra;il: Castro y col.,l994;(2)canadá: Sutton, 1982; (3)Miller y col.,l983; (4)Foster y col., 1986; (5)Qolombia: Cuero y col., 1987; (6)Perú: Logríeco y col., Introducción - 20

26 En la República Argentina los datos de hongos que contaminan al maíz antes de su almacenamiento se encuentran reunidos en la Tabla 1.8. Cabe destacar que los trabajos de Etcheverry (1982), Bertinetti (1988) y Neira (1992), se realizaron sobre muestras de maíz recién cosechado en el departamento de Río Cuarto, provincia de Córdoba. Mendes da Silva y col. (1985), analizaron la micoflora contaminante del maíz en las cosechas 1983 y 1984 en el partido de 9 de Julio, provincia de Buenos Aires, y Saubois y Piontelli (1995), estudiaron solamente las especies del género Fusarium que aparecieron en maíz en el momento de la cosecha en la zona centro-norte provincia de Santa Fe. de la Tabla 1.8. Principales hongos que invaden el maíz antes de la cosecha en Argentina. Absidia spp. Fusarium moniliforme Penicilliumjanczewski Acladium spp. F. oxysporum P. olsom' Alternaría alternata F. poae TU oxalicum Alternaría spp. F. proliferatum P. purpurogenum Aspergillus chevalieri F. semitectum P. simplicissimum A.flavus F. sporotrichioides P. velutinum A. fumigatus F. solani P. verruculosum A. niger F. subglutinans P. viridicatum A. tamarii F. tricinctum Penicillium spp. Aspergillus spp. Fusarium spp. Phytophlhora spp. Chaetomium spp. Helminthosporium spp. Rhizoctonia spp. Cladosporíum spp. Microdochium nivale Rhizopus spp. Epicoccum spp. Mucor spp. Stigmella spp. Fusarium chlamydosporum Nigrospora spp. Trichoderma viride F. dimerum Penicillium canescens Trichoderma spp. F. equiseti P. citrinum Trichothecium roseum F. graminearum P. cyclopium Ulocladium spp. F. heterosporum Ref. Banchero y col., 1982; Etcheverry, 1982; Mendes da Silva y col., 1985; Bertinetti, 1988; Neira, 1992; Saubois y Piontelli, Introducción - 2/

27 I.d. Hongos toxicogénicos y micotoxinas en maíz Los hongos, por ser organismos heterótrofos son capaces de transformar la materia orgánica por medio de enzimas hidroli'ticas extracelulares pudiendo causar dos tipos de deterioro en los cereales; un deterioro químico "asimilativo", donde estos organismos utilizan al sustrato como fuente de nutrientes esenciales, o un deterioro químico "no asimilativo", donde estos organismos producen metabolitos como las micotoxinas, que junto a otros productos fúngicos, tales como antibióticos, alcaloides, pigmentos, han sido definidas como metabolitos secundarios (Thrane, 1991). Este término ha sido usado en bioquímica vegetal para designar alcaloides, terpenos, flavonoides que no son esenciales para el crecimiento de las plantas. Las micotoxinas no constituyen una categoría química única y no tienen características moleculares comunes, pero pueden agruparse en base a sus vías biosintéticas. La ruta policétida es la vía biosintética más característica de los hongos y la mayor parte de las micotoxinas aisladas de la naturaleza se sintetizan a través de ella (Bu Lock, 1980). El término metabolito secundario es el más conocido, pero se han propuesto otras designaciones como "idiolitos", asumiendo que corresponde a la idiofase, metabolitos "especiales" o metabolitos "de unión" (Betina, 1989). Las micotoxinas tienen la particularidad que son producidas por el metabolismo secundario, por una serie de enzimas, a través de unos pocos intermediarios del metabolismo primario. La función de los metabolitos secundarios ha sido planteada en varias hipótesis (Etcheverry, 1992): a) Estas sustancias podrían participar en las relaciones ecológicas del microorganismo productor. Por ejemplo, la presencia de micotoxinas tremorgénicas y aflatoxinas en los esclerocios de Aspergillus flavus se Introducción - 22

28 ha interpretado ecológicamente como un medio de defensa químico en situaciones de "stress" contra depredadores potenciales, y existe una relación con la supervivencia fúngica a través de los esclerocios (Bettina, 1983, 1989; Campbell y col., 1982). b) C) Las micotoxinas podrían actuar como reguladores del metabolismo, esta hipótesis es sustentada por Bu Lock (Campbell y col., 1982). Existe una similitud entre las micotoxinas y otros metabolitos como los antibióticos ya que se ha comprobado que en microorganismos productores de antibióticos estas sustancias regulan el metabolismo pn'mario inhibiendo varios procesos como la síntesis de proteínas y DNA (Betina, 1983). Se ha investigado la posibilidad de una interrelación entre la diferenciación y la formación de metabolitos secundarios. La biosíntesis de éstos cumplir-ía un rol regulador o al menos coincidente con la diferenciación; como ocurre durante la esporulación asexual. Bu Lock (1980) analiza el metabolismo secundario como un aspecto de la diferenciación y lo asocia con una limitación en el crecimiento. Por ejemplo, cuando Claviceps purpurea crece en una relación parasítica sobre plantas de arroz se forman esclerocios y la producción de alcaloides es máxima en ellos, cuando se realiza el cultivo sumergido, en relación saprofitica, la sintesis de alcaloides se produce en las células vegetativas (Rehaéek, 1977). Boltyanskaya (1979) observó que la síntesis de aflatoxina Bl por A. flavus comienza simultáneamente en la emergencia de los conidios y Wicklow y Shotwell (1982) encontraron acumulación de aflatoxinas tanto en conidios como en esclerocios de A. flavus y A. parasiticus. Introducción - 23

29 Entre los hongos filamentosos existen algunas especies que contaminan alimentos y son capaces de producir un amplio rango de micotoxinas. Los hongos micotoxicogénicos se agrupan en endomicotóxicos y exomicotóxicos. El primer grupo reúne aquellos hongos que producen toxinas intracelulares y que tienen efectos típicamente agudos y a veces fatales en el hombre y animales; incluyen especies de Amanita y Psilocybe entre los más importantes. El grupo de hongos exomicotóxicos excretan sus toxinas en sustratos generalmente ricos en hidratos de carbono y lípidos, como son las oleaginosas y cereales. Los hongos involucrados son especies de Aspergillus, Fusarium y Penícillíum entre los más importantes, sin descartar a especies de Alternarz'a y Cladosporíum. Su ecología es compleja y varía de una especie a otra en diferentes habitats (Simpson y Batra, 1983). En forma general, cada uno de los grupos de hongos toxicogénicos presenta diferentes características: las especies de Aspergillus son raramente patógenas de vegetales pero saprófitos dominantes en semillas de cereales y oleaginosas, en regiones templadas y cálidas y en condiciones de actividad acuosa reducida. Las especies de Fusarium atacan vegetales como patógenos activos pero se los encuentra como saprófitos en granos, produciendo varias toxinas. Las especies de Penícillium son patógenos vegetales en algunos frutales, pero son predominantemente saprófitos, especialmente en climas templados. Todos los ingredientes destinados a la alimentación humana o animal pueden estar expuestos a la contaminación fúngica. La naturaleza y el grado de contaminación con hongos toxicogénicos determinará la presencia o ausencia de micotoxinas en el producto. La identificación de los hongos contaminantes por si sola, tiene un valor limitado en el diagnóstico de las micotoxicosis, ya que las conclusiones finales sólo pueden ser obtenidas una vez realizadas la extracción y la identificación de las toxinas, debido a que: Introducción - 24

30 a) La presencia del hongo no asegura que haya producido la toxina. b) Una toxina determinada puede persistir en un producto aunque el hongo no esté presente. c) Un hongo puede ser capaz de producir más de una toxina. d) La producción de una micotoxina particular depende no sólo de la especie sino también de la cepa. e) La formación de micotoxinas depende de factores biológicos (daños causados por insectos y otros hongos, concentración de inóculo, diferencias varietales), químicos y físicos (Resnik, 1989; González y col., 1995). t) Una toxina dada puede ser producida por más de un género fúngico. Sin embargo, es importante recalcar que la presencia de un hongo toxicogénico en un alimento es, sin dudas, un llamado de atención del peligro potencial de encontrar micotoxinas (Smith y Moss, 1985). Entre los sustratos más apropiados para la biosíntesis de micotoxinas figuran los alimentos de origen vegetal, ricos en proteínas y calorías, que constituyen un valioso aporte a la dieta de gran parte de la población mundial. El maiz es uno de los cereales con estas características que se produce y comercializa en el mundo entero. Sin bien en todas las naciones productoras se lo destina en mayor o menor medida al consumo humano, no podemos dejar de mencionar que en ciertas regiones constituye el alimento básico de la población. Así, en varios países de América y de Africa, el maíz provee el 40-50% de las calorías y proteínas de la dieta. Es en estas áreas donde los riesgos derivados de la ingestión de maíz contaminado con micotoxinas exigen una consideración especial. La colonización de los granos antes del almacenamiento por hongos potencialmente toxicogénicos y la producción de micotoxinas antes y durante la cosecha, han tenido recientemente una mayor atención (Australian Mycotoxin Introducción - 25

31 Newsletter, 1994). Los principales géneros implicados en la producción de micotoxinas en el maíz son Aspergillus, Fusarium y Penicillium. Fusarium está considerado el género micotoxicogénico más comúnmente asociado al maíz recién cosechado, sin embargo, no son de poca importancia las especies de Aspergillus y Penicillium. Si bien estos dos últimos géneros han sido considerados como hongos del almacenamiento, los mismos han sido encontrados en el momento de la cosecha (Mislivec y Tuite, 1970; Moubasher y col., 1972; Lillehoj y col., 1976 a y b). Aunque son numerosas las especies fúngicas capaces de producir micotoxinas, en este trabajo se detallarán algunos aspectos de los géneros que se aislaron en las muestras de maíz recién cosechado en 1990 en la principal zona de producción de la Argentina, como así también de las micotoxinas que potencialmente podrían producir algunas especies de estos géneros. Se consideraron a: Alternaria, Aspergillus, Fusaríum y Penicíllíum y se mencionarán las micotoxinas que pueden producir. El orden en que se describen, tanto los géneros como las micotoxinas que se analizaron, responde a un ordenamiento alfabético y no al grado de importancia que le cabe a cada grupo. Por otra parte, se trata de aportar la mayor información posible en cada caso, lo cual se refleja en la cantidad de referencias para los géneros Fusarium y Aspergillus en comparación con Penicíllium y Alternaria, para los cuales los datos existentes en maíz son escasos, especialmente para esta última. I.d.l. Ocurrencia natural de micotoxinasen maíz En las tablas 1.9 y 1.10 se mencionan las toxinas detectadas en maíz en grano en países de Europa, Africa, Asia y Oceanía y en el continente americano, respectivamente. Los estudios realizados en los diferentes países han demostrado la presencia de varias micotoxinas como contaminantes naturales del maíz. Las más Introducción - 26

32 Alemania (cont.) Pals Tabla 1.9. Micotoxinas detectadas maíz países Europa, Africa, Asia Oceanía. en y Introducción - 27

33 Introducción - 28 Tabla 1.9. (cont.) Polonia Zimbawe X l: ácido ciclopiazónico; 2: aflatoxinas; 3: ácido kójico; 4: citrinina; 5: diacetoxiscirpenol; 6: deoxinivalenol; 7: 3-acetil-deoxinivalenol; 8: 15 acetil-deoxinivalenol; 9: esterigmatocistina; 10: fumonísinas; ll: fusarenona X; l2: fusarina C; 13: moniliformina; 14: monoacetoxiscirpenol; 15: neosolaniol; 16: nivalenol; 17: 4,l5-acetil-nivalenol; 18: ocratoxina A; 19: toxina PIT-2; 20: toxina T-2; 21: T-2 tetraol; 22: T-2 trio]; 23: zearalenona. Ref. Blane, 1985; Thalmann y col., 1985; Krogh, l987a; Sdenham y col., 1990; IPCS, 1990; Sharman y col., l99l; Kim y col., 1993; Okoye, 19 3; Beardall y Miller, 1994; Chelkowski y col., 19 4; Doko y Visconti, 1994; Lee y col., (*) Incluye a Transkei.

34 1.10. Tabla Micotoxinas detectadas maíz continente elen americano. Micotoxinas (Cont.) DAS 15 ADON Fum FusC Mon Ocra HT-2 Zea Ó cu t: < ><><><><><><><><><><><><>< ACp AP ; Pais Argentina Bahamas Belice Bolivia Brasil Canadá Colombia Costa Rica Cuba Chile X Ecuador Salvador El Estados Unidos X Introducción - 29

35 Micotoxinas Venezuela ACp: ciclopiazónico; AP: ácido penicflico; Afla: aflatoxinas; Cit: citrinina; DAS: diacetoxíscirpenol; deoxinivalenol; 15 ADON: fumonisinas; Fum: Fus C: fusarina C; Mon: moníliformina; Ocra: ocratoxina A; T-2; HT-2: HT-Z; X ><><><><><><><><><><>< ACp AP Afla Cit DAS 15 ADON Fum FusC Mon Ocra HT-2 Zea Tabla 10 I. (cont.) País Guatemala Honduras Haitf México Panamá Paragay Perú República Dominicana St. Vincent Trinidad Tobao ls-acetil deoxinivalenol; Zea: 1986; IPCS, Ref. 1990; Thiel Beardall Miller, 1994; Resnik col., y zearalenona. Introducción - 30

36 estudiadas en todos los países son las aflatoxinas y la zearalenona. También se han detectado tn cotecenos, fumonisinas, moniliformina, citn'nina, ácido ciclopiazónico, ocratoxina A y ácido penicilico, entre otras. En particular en Argentina, los estudios sobre incidencia de micotoxinas en maíz, muestran la presencia de aflatoxinas y zearalenona. Cronológicamente los estudios realizados se resumen a continuación: Estudios cualitativos (> 5 ig/kg) sobre incidencia de aflatoxina Bl en la provincia de Santa Fe (Egiazú y Bracalenti, 1981), demostraron la presencia de esta toxina en muestras de maíz tipo duro durante las cosechas de 1977 (en el 10% de 50 muestras) y de 1978 (en el 4,9% de 267 muestras). En 1980, el 33% de 85 muestras contenían zearalenona en niveles que iban de los 200 a los 1600 ug/kg (Banchero, 1987). En 1981 (Banchero y col., 1982) se halló que el 25% de 53 muestras de embarques de exportación analizadas, contenían aflatoxina Bl en niveles que van'aron entre 30 y 305 ig/kg. En el año 1982 en la provincia de Buenos Aires, los estudios en 41 muestras de maíz de plantas de acopio provenientes de Pergamino, evidenciaron un 34% de contaminación con aflatoxina Bl en niveles entre 1,7 y 24,8 ug/kg. Sólo una muestra presentó zearalenona con una concentración de 470 tg/kg (Puig y col., 1982). Chulze y col. (1989) realizaron un estudio de incidencia de aflatoxinas, zearalenona y deoxinivalenol en maíz recién cosechado en el Departamento de Río Cuarto (Córdoba); 150 muestras fueron analizadas para detectar aflatoxinas Introducción - 3]

37 Bl y G, y zearalenona, y 58 muestras fueron seleccionadas para analizar deoxinivalenol. Los valores de incidencia fueron: 3,3% para aflatoxina Bl (rango 5-50 Lg/kg); 1,3% para aflatoxina Gl (rango 2-26 Lg/kg); 6% para zearalenona (rango tg/kg) y 24% para deoxinivalenol (rango Lg/kg). Resnik y col. (1995) realizaron un estudio sistemático de la ocurrencia natural de aflatoxinas y zearalenona en 2236 muestras de maíz recién cosechado, distribuidas entre los años 1983 y En este trabajo se consideraron también 35 muestras de maíz obtenidas en el momento del embarque en el año Del total de las muestras el 53,5% estaban contaminadas con las micotoxinas analizadas, aflatoxina Bl se identificó en 445 muestras (19,6% de las muestras), aflatoxina B2en el 4,1% de las muestras y zearalenona en 676 muestras, lo que representó el 29,4% de las muestras tomadas. Aflatoxina Gl se detectó en una sola muestra del año 1985, mientras que G2nunca fue detectada. No se detectó contaminación con aflatoxinas en los años 1988, 1993 y 1994 y en las otras cosechas, a excepción de 1989, los niveles de contaminación con aflatoxinas fueron bajos. Respecto a zearalenona, cabe destacar que apareció en todas las cosechas analizadas. A continuación se describirán las micotoxinas analizadas en este trabajo, haciendo una breve referencia a los géneros que incluyen a las especies potencialmente productoras de las mismas (Alternaria, Aspergillus, Penicillium y Fusarium). I.d.2. Alternan'a Las especies de hongos del género Alternaria representan un grupo ubicuo que incluye especies de micoparásitos (Pandey y col., 1989), patógenos de plantas y Introducción - 32

38 saprófitos que pueden causar daños durante el cultivo o producir deterioro en la postcosecha (Ellis, 1971, 1976; Domsch y col., 1980; Bottalico y Logrieco, 1992). Diversas especies de este género han sido repetidamente observadas como causa de deterioro fúngico de cereales, frutas y vegetales durante el almacenamiento o durante el transporte (Christensen y col., 1968, Hasija, 1970; Domsch y col., 1980). Christensen (1978) encontró en trigo que en el momento de la cosecha se observaba un 100% de contaminación con Alternaria alternata. Chelkowski y Grabarkiewicz-Szczesna (1991) también determinaron en Polonia, que diferente cereales, entre ellos avena, cebada, trigo, centeno y arroz, presentaban alta contaminación con especies de Alternaría. Logn'eco y col. (1990) hallaron en cereales de grano fino provenientes de países del Mediterraneo una elevada presencia de especies de Alternaria. Algunas especies de este género son capaces de producir metabolitos tóxicos en plantas infectadas y en productos agrícolas, con lo cual la contaminación llegaría a los alimentos para humanos y animales. Se han observado efectos adversos sobre animales (Doupnik y Sobers, 1968; Schroederr y Cole, 1977; Stinson y col., 1985) que consumieron alimentos balanceados contaminados con metabolitos producidos por aislados de especies de Alternaria. Las toxinas de Alternaria muestran toxicidad en diferentes sistemas biológicos que incluyen mamíferos, invertebrados y bacterias (King y Shade, 1984; Chulze y col., 1993). Sin embargo, la literatura con respecto a la toxicidad de los metabolitos de Alternaria es escasa. Son pocos los ejemplos de alimentos y de productos agrícolas contaminados con metabolitos de Alternaria que se hallan en bibliografía. Se sabe que las especies de Altemaria producen alrededor de 70 metabolitos secundarios, especialmente A. alternata y sus prototipos (King y Schade, 1984; Nishimura y col., 1989), sin embargo, sólo 7 de ellos se han encontrado hasta el momento como contaminantes naturales en alimentos conllevando un riesgo toxicológico potencial (Pero y col., 1973; Introducción - 33

39 Stock y Prival, 1986; Griffin y Chu, 1987). Estos son el ácido tenuazónico (derivado del ácido tetrámico), el altemariol, el alteman'ol monometileter y el altenueno (derivados de la dibenzopirona), y las altertoxinas I, II y III (derivadas del perileno). Los más estudiados son el alternariol y el altemariol monometileter. I.d.2.l. Alternariol y alternariol monometileter El alternariol (AOH) y su éter metflico (AMB), son compuestos derivados de la dibenzo a-pirona (Figura 1.2). Ambos compuestos químicos forman agujas incoloras y su punto de fusión es 350 C y C para AOH y AME, respectivamente. Presentan fluorescencia azul y en presencia de FeCl3desarrollan color púrpura. Figura 1.2. Btructura química del AOH (R=I-I) y del AME (R=CI-I3). Las especies del género Alternaría que producen ambas micotoxinas son A. alternata, A. solani, A. dausi y A. cucumerina (Chelkowski y Grabarkiewicz-Szczesna, 1991). En la literatura, frecuentemente se menciona que los cereales son infectados por varias especies de Alternaria, especialmente A. altemata, que puede causar en campo y luego de la cosecha una enfermedad de los granos llamada "punto negro" (black point), que consiste en un oscurecimiento del germen y del grano debido a la presencia de micelio oscuro (típico de hongos Dematiáceos) y de la masa de conidios formados Introducción - 34

40 (Chelkowski y Grabarkiewicz-Szczesna, 1991). Asimismo, A. altemata fue hallada como agente de deterioro en cereales almacenados como el maíz (Lichtwwardt y col., 1958; Moubasher y col., 1972), entre otros. El AOH y el AME tienen un interés micotoxicológico primario pues han sido hallados como contaminantes naturales en alimentos en concentraciones variables (Watson, 1984). El AOH y el AME son tóxicos agudos débiles. La dosis letal 50 (DLSO)en ratones es mucho mayor de 100 mg/kg de peso corporal (Sauer y col., 1978), sin embargo, el AME causa necrosis visceral y también junto con el AOH son ñtotóxicos. El AOH administrado en dosis de 100 mg/kg de peso corporal en ratones, causa resorción y muerte fetal entre los 9 y los 12 días de administración subcutánea. El AME, administrado en hamsters dorados de Siria a razón de 200 mg/kg de peso corporal a los 8 días de gestación, aumento el número de resorciones fetales y disminuye el peso de los fetos (Pollock y col., 1982). También en estos animales se ha observado una severa necrosis de vísceras, sin embargo, no se sabe si la administración oral de este compuesto en los niveles ya citados produce tales lesiones (Sauer y col., 1978; Pollock y col., 1982). Se necesitaría más información acerca de la administración de estos compuestos por períodos prolongados de tiempo, en particular del AME, el cual es mutagénico en el Test de Ames (Scott y Stoltz, 1980) y podría ser carcinogénico (Mc Cann y col., 1975), para poder evaluar con mayor certeza el riesgo que implicaría la ingestión de estas micotoxinas, ya que los hongos productores, como se mencionó anteriormente, se aislan frecuentemente en los cereales en el momento de la cosecha. I.d.3. Aspergillus El género Aspergillus Micheli, están comúnmente asociado con el deterioro de alimentos y otros materiales en climas tropicales y subtropicales. El género es de Introducción - 35

41 particular importancia a causa de que contiene varias especies capaces de crecer y producir metabolitos a bajas actividades acuosas (Moss, 1991) y por ello están asociados con el deterioro de numerosas materias primas (Resnik, 1989). Algunas especies de Aspergillus son utilizadas en la industria alimentaria. Así, A. oryzae es usado en la manufactura del koji, un intermediario en la producción de alimentos orientales tales como el miso. Además, en otras industrias se aprovechan productos como el ácido cítrico obtenidos por fermentación del A. níger. Unas pocas especies son capaces de crecer en el cuerpo animal provocando enfermedades conocidas con el nombre de micosis. El género Aspergillus puede provocar una micosis oportunista conocida como aspergillosis, pero la mayoría son generalmente saprofíticos. Muchas especies de Aspergillus son considerados como característicos del almacenamiento de cereales, sin embargo, se sabe que A. flavus y, en menor medida, A. parasíticus, colonizan frecuentemente al maíz y producen aflatoxinas antes de la cosecha, especialmente en el sudeste de los Estados Unidos. La aparición de A. flavus y de aflatoxinas en las espigas antes de la cosecha, se correlaciona con las condiciones meteorológicas, siendo favorecido por las altas temperaturas y sequía durante la última fase del estado lechoso del grano que es cuando el maíz es más susceptible y también por el daño ocasionado por insectos. Las espigas dañadas están más expuestas a la colonización por A. flavus y a la formación de aflatoxinas que las sanas, no obstante en el sudeste de Estados Unidos solamente un 10% de la infección puede ser atribuida al daño causado por insectos (Lillehoj y Hesseltine, 1977). También ha sido señalada una asociación positiva entre A. flavus y A. niger y entre A. nigcr y Penicillium fimiculosum en el maíz, lo cual afectaría la producción de aflatoxinas (Wicklow, 1983). A. flavus está más adaptado a dispersar sus conidios en las zonas aéreas de cultivo como el maíz, el algodón, las nueces, el arroz y el sorgo (Davis y Diener, 1983). Sin embargo, como muchos hongos toxicogénicos, A.flavus puede invemar como micelio o esporar o como estructura de resistencia en los restos de plantas en el suelo. La Introducción - 36

42 esporulación de estas estructuras invemantes, denominadas esclerocios, resulta una fuente de inóculo el cual es dispersado a menudo por las corrientes de aire, gotas de lluvia o insectos (Wicklow y Donahue, 1984). Se ha comprobado que la germinación (esporogénica) de los esclerocios de A. flavus (y de A. parasiticus) produce cabezuelas conidíales verdes, producidas directamente sobre la superficie de los esclerocios (Figura 1.3). Esto constituiría un importante mecanismo, que le permite al hongo diseminar el inóculo conidíal. La presencia de esclerocios indica una mayor capacidad colonizadora de las cepas que los producen. En A.flavus, serían una fuente de inóculo primario pues se forman en los granos dañados y sanos del maíz y pueden sobrevivir el invierno en granos que quedan dispersos sobre el suelo luego del paso de las máquinas cosechadoras. Thom y Church (1926), caracterizaron en grupos a las cepas de A. flavus según la cantidad de esclerocios que producían en abundantes, escasos o ninguno, pero desde el punto de vista taxonómico, la presencia de esclerocios en algunas cepas de A. flavus, A. parasiticus, como así también de A. 0Iyzae, aparentemente no tendría interés diagnóstico (Klich y Pitt, 1988). El género Aspergillus es metabólicamente muy versátil e incluye varias especies productoras de metabolitos tóxicos, algunos de los cuales figuran en la Tabla I. ll. Los metabolitos de Aspergillus flavus y A. parasiticus, conocidos como aflatoxinas están reconocidos como los de mayor riesgo en la alimentación humana y animal. I.d.3. l. Aflatoxinas Las aflatoxinas fueron descubiertas a principios de la década de 1960 a raíz de una intoxicación aguda en pavos, en Inglaterra. El producto responsable fue harina de maní proveniente de Brasil (Allcroft y Camaghan, 1963). De la harina se aisló un factor tóxico que fue denominado aflatoxina. Además se encontraron cepas de Introducción - 37

43 Aspergillus flavus que en condiciones de laboratorio producían esas toxinas. l r REINFECCIONÏÉB Tubo INOCULO SECUNDARIO 639 germinativo Conidióforo - OLONIZACION/ INFECCION INICIAL g 4/ Micelio G \ Formación de / \ esclerocios / \\ DISPERSION ag: Conidios I 1:!. Jl4 {F GERMINACION ESPOROGENICA Figura 1.3. Relación entre los inóculos primario (esclerocios) y secundario (conidios) en el ciclo de vida de Aspergillus flavus (diagrama esquemático fuera de escala) Wicklow y Donahue (1984). Introducción - 38

44 Tabla I.ll. Especies toxicogénicas más importantes del género Aspergillus (Krogh, l987a; Samson y Frisvad, 1991; Abarca y col., 1994). Especies Toxinas A. candidus Terpenilina, clorflavonina. A. clavatus Patulina, ascladiol, citocalasina E, triptoquivalina. A. flavus Aflatoxinas Bl y B2, maltorizina, ácido ciclopiazónico, aflatrem, ácido kójico. A. fumigatus Fumitoxinas, viridotixinas, verruculógeno, gliotoxinas, fumitremorginas A y B, TR 2, fumigaclavinas, fumagilina. A. glauqu Equinulina, xantocilina X, gliotoxina. A. nídulans Emerina, esterigmatocistina, nidurufina. A. niger Malforminas, ácido oxálico, ocratoxina. A. nomius Aflatoxinas B,, BZ, Gl y GZ, ácido kójico. A. ochraceus Ocratoxinas, destruxina B, ácido penicflico. A. parasiticus Aflatoxinas Bl, Bz, Gl y Gz, ácido kójico. A. restrictus Mitogilina A. ruber Aflatoxina Bl A. tamaríi Acido ciclopiazónico, ácido kójico. A. terreus Citreoviridina, gliotoxina, aranotina, citrinina, patulina. A. ustus autocistinas, austamida, austdiol, deoxibrevianamida. A. versicolor Esterigmatocistina, ácido ciclopiazónico, versimida, nidurufina, estengmatma. En la actualidad, entre todas las toxinas fúngicas que han sido caracterizadas, las aflatoxinas siguen siendo las más importantes por sus propiedades carcinogénicas. Las aflatoxinas forman una familia de compuestos químicos con estructura difurano-cumarinas. Son compuestos heterociclicos altamente oxigenados. En la Figura I.4 pueden observarse las estructuras químicas de las aflatoxinas denominadas: aflatoxina Bl (AFBl), aflatoxina B2 (AFBz), aflatoxina Gl (AFGl) y aflatoxina G2 (AFGZ), que son las más frecuentemente halladas en la naturaleza. Introducción - 39

45 Otros miembros del grupo son derivados de estas cuatro aflatoxinas y se producen como consecuencia de la actividad metabólica de sistemas animales o microbianos tales como aflatoxicol M1, M2, Pl y Q1, o producidos espontáneamente en respuesta a los ambientes químicos tales como B2 G2, y D,. Aflatoxina G Aflatoxina Gz Figura 1.4. Btructura química de las aflatoxinas Bl, B2, Gl y G2. La propiedad más importante de las aflatoxinas es la intensa fluorescencia que presentan cuando se las ilumina con luz ultravioleta de onda larga (366 nm). Así reciben denominación B (blue) las que tienen fluorescencia azul y G (green) las que presentan fluorescencia verde. La unidad 5 metoxicumarina común a todas ellas parece ser la responsable de la propiedad de fluorescencia.

46 Los subíndices corresponden a su movilidad cromatográfica relativa siendo el Rf de la AFBl el mayor, siguiendo en orden decreciente AFBZ, AFGl y AFGz (Asao y col., 1965). Son solubles en solventes moderadamente polares tales como: cloroformo, metano], acetona e insolubles en agua y en solventes no polares como hexano y éter de petróleo. Las aflatoxinas son producidas por especies de la Sección Flavi (= grupo Aspergillus flavus: A. flavus y A. parasíticus, contaminantes de alta incidencia en semillas oleaginosas y granos de cereales (Samson y Frísvad, 1991); también producen aflatoxinas A. nomius que fue aislado de insectos y productos agrícolas (Kurtzman y col., 1987) y A. ruber que es otra especie tóxica que adquiere importancia porque es utilizada en la preparación de alimentos (Leitao y col., 1989). En general, las cepas de A. parasíticus y A. nomius producen las cuatro aflatoxinas, mientras que las cepas de A. flavus producen AFBl y AFB2 (Cruickshank y Pitt, 1990; Etcheverry, 1992). La proporción de las cuatro aflatoxinas producidas por los cultivos de Aspergillus varía con la constitución genética del hongo y con los parámetros ambientales asociados con el crecimiento fúngico. Se ha observado una gran variabilidad entre las cepas, ya que algunas no son toxicogénicas y otras que son altamente productoras de toxinas pierden esta capacidad con los subcultivos repetidos (Bilgrami y col., 1988). La acción biológica de las aflatoxinas ha sido estudiada con intensidad (Pacin, 1993). Los efectos de estas micotoxinas sobre las diferentes especies son muy variables, tanto en lo que respecta a toxicidad aguda como crónica, comprendiendo entre otros aspectos la letalidad, carcinogénesis, mutagénesis, teratogénesis y embriotoxicidad. La acción de estas toxinas ha sido determinada en diferentes sistemas biológicos que incluyen animales, vegetales, microorganismos y cultivos celulares vegetales y animales.

47 Los animales más jóvenes son los más sensibles, los machos más que las hembras, y contribuye a acentuar la toxicidad una alimentación deficiente en proteínas. Se ha propuesto que la diferente susceptibilidad entre los animales puede estar determinada por las diferencias cualitativas y cuantitativas en las actividades hepatometabólicas (Hsieh y col., 1977). Las aflatoxinas actúan sobre las membranas celulares, inhibiendo el ADN y la síntesis de ARN, dependiente de aquél (Hsieh, 1987; Lyman y col., 1988), asimismo impiden la incorporación de aminoácidos y fosfolípidos alterando el metabolismo de los lípidos (Merkley y col., 1987). La aflatoxina Bl es la sustancia biológica con mayor potencia carcinogenética; es mutagenética e inmunosupresora (Shaternikov y Marokko, 1984; Pier y col., 1986; Palmgren y Hayes, 1987; Petska y Bondy, 1989). Estudios recientes demuestran que la acción mutagénica estaría relacionada con la unión de carbono 8 de la aflatoxina con el C7 de de la guanina del ADN (Allen y col., 1992; Jennings y col., 1992; Kew, 1992). La actividad a nivel hepático estaría mediada por el citrocromo P-450 (Alldrick y col., 1992; Daniels y Massey, 1992; Guenguen'ch y col., 1992; Shimada y col., 1992; Trottier y col., 1992). El metabolismo de las aflatoxinas está influido por la edad, el sexo, la dieta, el estado sanitario y la especie biológica (Appleton y Ditcher, 1985; Palmgren y Hayes, 1987). Las manifestaciones clínicas que se conocen habitualmente se refieren a su toxicidad hepática, pero probablemente la primera manifestación es la inmunosupresión, especialmente celular (Shaternikov y Marokko, 1984; Pier y col., 1986; Palmgren y Hayes, 1987; Petska y Bondy, 1989). Ambas se producen frente a ingestas de alimentos, probablemente contaminados con valores bajos pero en forma frecuente. La lesión hepática ocasiona disfunción de tipo hepatocelular, a través de hiperplasia ductal, que puede evolucionar hacia hiperplasia nodular o carcinoma hepático (Heathcote y Hibbert, 1978; Kravchenko, 1984; Hsieh, 1987; Palmgren y Hayes, 1987; Bosch y Muñoz, 1988). Sin embargo, para el productor pecuan'o, lo más importante no es su Introducción - 42

48 potencialidad carcinogenética, sino la pérdida o falta de ganancia de peso, la inmunidad deprimida y la falta de conversión (Pier, 1992; Robens y Richard, 1992; Kichou y Walser, 1993). La aflatoxicosis aguda está asociada con el Sindrome de Reye que es una degeneración grasa hepática con encefalopatía (Rogan y col., 1982; Coulter y col., 1984). Habitualmente, este sindrome se presenta en niños que ingieren leche materna contaminada por aflatoxina Ml (Zarba y col., 1992). En la tabla I. 12 se expresa la toxicidad aguda de la AFBI en distintas especies (Smith y Moss, 1985). Tabla Dosis letal 50 para diferentes especies (una sola dosis oral de AFB.). Especie animal LDSo (mg/kg peso corporal) Conejo 0.30 Patito de 1 día 0.34 Gato 0.55 Cerdo 0.60 Trucha Arco Iris 0.80 Perro Oveja l Pollo 6.30 Ratón 9.00 Hamster 10.2 Rata Las aflatoxinas son consideradas tóxicas para todas las especies estudiadas (Doerr y col., 1974; Heathcote y Hibbert, 1978; Goldblatt, 1979; Huff y col., 1980; Tapia y col., 1980; Exarchos y Gentry, 1981; Hamilton, 1982; Reichmann y col., Introducción - 43

49 1982; Kravchenko, 1984; Schiefer, 1985; Cook y col., 1986; De Andrés y Miguel, 1986; Frolish y col., 1986; Bosch y Muñoz, 1988; Harvey y col., 1988; Johri y col., 1988; Kuiper-Goodman, 1990). Una micotoxina que ha sido motivo de preocupación en distintos ámbitos de investigación y que ha recibido poca atención en Argentina (Vaamonde y col., 1995), es el ácido ciclopiazónico. Como las aflatoxinas B y G, el ácido ciclopiazónico producido por cepas de Aspergillus flavus y puede coexistir con las mismas. es I.d.3.2. Acido ciclopiazónico El ácido ciclopiazónico (CPA) fue descubierto como un metabolito producido por una cepa de Penícillium cyclopíum aislado de maní (Holzapfel, 1968). Posteriormente se observó que esta micotoxina también era producida por cepas de Aspergillus flavus, A. oryzae, A. tamarii, A. versicolor, Penicillíum camembertii, P. caseicolum, P. crustosum, P. patulum, P. puberulum y P. viridícatum, entre otros (Rogan y col., 1982; Dorner y col., 1984; Khera y col., 1985; Betina, 1989). El CPA es un ácido indoltetrámico (Q0 H20N203) cuya estructura puede observarse en la figura 1.5. química Figura 1.5. Estructura química del ácido ciclopiazónico. Introducción - 44

50 Junto al CPA se aislaron precursores del mismo como ácido bissecodehidrociclopiazónico y la imina del CPA. El CPA cristaliza como agujas incoloras que funden a C. La información de los estudios sobre la actividad biológica del CPA ha sido analizada por Pacin (1993), quien destaca entre los aspectos fundamentales: La interferencia de esta toxina en el metabolismo del calcio (Riley y col., 1986, 1987; Demaurex y col., 1992; Lahouratate y col., 1992; Missiaen y col., 1992; Shima y Blaustein, 1992; Suzuki y col., 1992; Uyama y col., 1992; Agata y col., 1993), que trae como consecuencia la inhibición del transporte de calcio iónico dependiente de la ATPasa en el sistema retículo endoplasmático de los músculos y, por lo tanto, la depleción en el almacenamiento del mismo. Esta acción altera la síntesis y la utilización de las proteínas, por lo que también ejercen a un efecto inmunosupresor (Hill y col., 1986; Smith y col., 1992). Sin embargo, Richard y col. (1986) demuestran que no está inhibida la inmunidad mediada por células, ni el complemento. La alteración por esta micotoxina del metabolismo neuroquímico (Nishie y col., 1985a) y tener la característica de comportarse como dopaminérgica y serotoninérgica (Nishie y col., 1985b). Se han realizado estudios sobre la potencialidad embriotóxica y teratogénica de esta micotoxina, sin resultados satisfactorios (Morrissey y col., 1984; Khera y col., 1985), aunque se ha probado la citotoxicidad in vitro (Yates y col., 1987). El metabolismo del CPA es rápido y se acumula en músculos (Nishie y col., 1985a; Norred y col., 1985; Nishie y col., 1986; Norred, 1990). Como manifestaciones clínicas el CPA produce alteraciones neurológicas en todas las especies estudiadas: pollos, cerdos, ratones, ratas, guinea, pavos, patos, conejos (Cole, 1986a; Porter y col., 1988). Las aves son probablemente los animales más estudiados (Cole y col., 1988; Cullen y col., 1988; Norred y col., 1988; Wilson y col., 1990), debido a las Introducción - 45

51 pérdidas económicas que ocasiona la ingestión de alimentos contaminados por CPA y se determinó la toxicidad aguda en especies avícolas observándose las diferencias entre sexos y en los estudios de toxicidad (Wilson y col., 1989). Los resultados demuestran que la LDSOen 72 horas para pollos, no tiene diferencia de sexo y es de aproximadamente 12,2 mg/kg de peso corporal (PC). La LDSO en 72 horas para pavos, machos l9 y hembras 17,9 mg/kg PC, y la LDSO en 72 horas para patitos fue de 39,1 mg/kg PC. Las perdices maduras parecerían no presentar diferencias entre sexo, y el valor aproximado de LDSO sería 69,6 mg/kg PC. Es interesante destacar que las muertes por toxicidad aguda en las aves (Wilson y col., 1989), presentan los signos típicos neurológicos: temblor, ataxia y opistótono, encontrados a partir de la primera epidemia según Cole (l986b). Este autor revaluando los relatos sobre la etiología del clásico sindrome de la enfermedad X de los pavitos, ocurrido en 1960 en Inglaterra, verificó que ciertos síntomas clínicos descritos en esa ocasión no eran típicos de una aflatoxicosis y a la luz de los conocimientos actuales, los mismos podrían ser atribuidos al CPA o a un efecto sinérgico entre CPA y las aflatoxinas. En relación con la toxicidad en otros animales, un trabajo en perros señala la susceptibilidad de esta especie, en la que parecería existir una mayor tolerancia de las hembras con respecto a los machos. La sintomatología demostrada por los animales intoxicados (vómitos, diarrea, hipertermia, deshidratación), es el resultado de una importante acción vascular (Nuehring y col., 1985). Los cerdos presentan signos similares: debilidad, anorexia, diarrea; esto ocasiona una reducción de peso corporal de los animales. Los órganos alterados demuestran histológicamente que los cerdos son afectados en el hígado, tracto gastro-intestinal y riñón (Lomax y col., 1984). Los monos aparentan ser bastante tolerantes a niveles crecientes de contaminación de sus dietas (Jaskiewicz y col., 1988). Introducción - 46

52 Animales de laboratorio como ratas, demuestran que el CPA es tóxico hepático, muscular (miocardio, esquelético y liso) gastrointestinal, inmunológico y neurológico, y que las dosis múltiples de CPA podrían ser acumulativas (Cole, l986a; Morrissey y col., 1985, 1987). Frente a exposiciones crónicas parecería existir un sinergismo entre el efecto de las aflatoxinas y del ácido ciclopiazónico (Morrissey y col., 1987). Las ratas, al igual que otras especies con dosis altas, mueren durante estados convulsivos. Los "guinea pigs" también demostraron la toxicidad de esta micotoxina sobre hígado y riñón (Richard y col., 1986). Entre las asociaciones epidemiológicas referidas en la literatura se encuentra: el "Kodua poisoning" caracterizado por depresión e inmovilidad, detectado en la India, tanto en el hombre como en el ganado, y que se asoció con ingesta de mijo contaminado por Aspergillus flavus y A. tamaríi (Nishie y col., l985b); y la presencia de cáncer hepático de una tribu africana (Khera y col., 1985) asociado con la ingesta de alimentos contaminados con CPA. Desde el punto de vista epidemiológico, como riesgo potencial para el hombre, es necesario tener en cuenta que el ácido ciclopiazónico se transmite a la leche y se acumula en los huevos (Cole y col., 1988; Dorner y col., 1990) y en los músculos de los animales. Por esta razón se considera que esta micotoxina debería ser analizada con mayor frecuencia en los alimentos. Es de destacar que entre los hongos que se pueden utilizar en la producción de quesos, están incluidos P. camembertii, P. caseicolum y A. 0Iyzae, productores potenciales de CPA. Esta toxina se ha encontrado como contaminante natural en quesos, como así también en numerosos alimentos como: salchichas, jamones, salames y materias primas (maíz, maní, mijo) destinadas a la elaboración de alimentos balanceados para aves (Landsen y Davidson, 1983; Cole, l986a; Porter y Cole, 1988; Chang-Yen y Bidasee, 1990; Norred, 1990). Introducción - 47

53 I.d.4. Penicillíum Las especies del género Penícillium Link ex Gray están usualmente relacionadas a los hongos verde azulados causantes del deterioro en alimentos frescos como frutas y vegetales en las zonas de clima templado. La mayoría de las especies del género Penicillíum pueden ser aisladas del suelo, donde se las asocia con la descomposición del material orgánico. Este género incluye especies capaces de crecer a 57 C (con una especie, el P. dupontíi cuya temperatura óptima de crecimiento es 50 C), como también especies que crecen a 5 C, las cuales estan implicadas en la alteración de alimentos refrigerados. Algunas cepas de Penícillium son usadas en la producción de alimentos, como quesos madurados y alimentos cárnicos, lo cual ha llevado a estudiar la capacidad de producir micotoxinas por estos hongos. En un estudio sobre 442 aislados de Penicillium aislados de alimentos fermentados y en distintos países, Leistner y Pitt (1977) encontraron que 324 de ellos (73,3%) resultaron tóxicos en ensayos biológicos. En la tabla I.l3 se citan especies del género Penicillium y las toxinas que pueden producir. Como se puede observar, las especies de este género pueden producir una gran variedad de toxinas, pero sólo unas pocas se encuentran regularmente como contaminantes naturales de los cereales. Este grupo incluye las ocratoxinas, citrinina, ácido penicilico y, en menor medida, xantomegnina (y xantoquinonas relacionadas). En la Figura I.6 se observan las estructuras químicas de las principales toxinas de Penicillium que contaminan naturalmente a los cereales. La citrinina y la ocratoxina A son los metabolitos fúngicos más tóxicos de los mostrados en la Figura 1.6 y se describirá en el punto I.d.4.l, el primero de ellos. Introducción - 48

54 Tabla I. 13. Especies de Penicillíum y micotoxinas asociadas (Leitsner y Pitt, 1977; Krogh, l'987a). Especies Micotoxinas P. auriantogriseum penitren A, ácido ciclopiazónico, ácido penícflico, ocratoxina A P. brunneum rugulosina P. chrysogenum ocratoxina A, patulina, ácido penícílico, xantocilina X P. cítreom'grum citrinina y citreoviridina P. cítrínum citrinina P. clavíforme patulina P. crustosum penitrem A, patulina P. expansum patulina, citrinina P. fennelliae ácido penicflico P. granulatum patulina P. griseofidvum patulina P. implicatum citrinina P. islandícum luteoskirina, islanditoxina, cicloclorotina P. kloeckeri rugulosina P. lividum citrinina P. melim'i patulina P. miczynskii citrinina P. novae-zelandiae patulina P. paraherquei verruculógeno P. paxillii paxilina P. puberulum ácido ciclopiazónico (Cont.) Introducción - 49

55 Tabla I. 13 (Cont.) P. purpurescens citrinina, acratoxina A P. purpurogenum rubratoxinas, ácido glaucánico P. roqueforti toxina PR, roquefortina, citrinina, patulina P. rugulosum patulina P. spinulosum citrinina, penitrem A P. thomii citrinina P. variabile ocratoxina A, patulina, rugulosina P. verruculosum verruculógeno P. viridícatum patulina, ocratoxinas, citrinina, viomeleina, rubrosulfina, xantomegnina, viridicatína, Vlopurpunna Citrinina Ocratoxina A o oca, ll. 7CH2=C-C-C:C-CO0H l l I lens Acido penicílico Figura 1.6. Estructura química de las toxinas del género Penicillium encontradas frecuentemente en cereales. Introducción - 50

56 I.d.4.l. Citrinina La citrinina fue aislada por primera vez en 1931 por Hetherígton y Raistrick a partir del filtrado de un cultivo en medio líquido de Penicillium citrinum (Betina, 1989). Ewart, en 1933, aisló este metabolito secundario de hojas de Crotalaría crispata (leguminosa nativa de Australia). Entre los hongos productores de citrinina se destacan varias especies de la familia Aspergillaceae, en los géneros Penicillium y Aspergillus. En la tabla I.l4 figuran las especies conocidas de Penicillium y Aspergillus productoras de citrinina. Estos hongos están ampliamente distribuidos y han sido encontrados como contaminantes naturales en una gran variedad de alimentos y forrajes. También se ha aislado citrinina en cultivos de Pythium ultimumy de Clavaríopsis aquatica. Asimismo, se ha obtenido de varias cepas de Fusarium avenaceum un compuesto denominado antibiótico Y con propiedades físico-químicas y biológicas muy similares a la citrinina (Betina, 1989). Tabla I. 14. Especies de hongos productores de citrinina (Betina, 1989; Frisvad, 1992). Género Penicillium P. albocoremíum P. jensem'i P. canescens P. lívidum P. citreonigrum P. odoratum P. cítrinum P. pwpurescens P. clavzforme P. roqueforti P. expansum P. steckii P. fellutanum P. velutinum P. implicatum P. viridícatum P. janthinellum P. westlingíi Género Aspergillus A. candidus A. niveus A. cameus A. terreus A. flavipes

57 De las especies citadas en la tabla 1.14, tienen cierta importancia en cereales solamente Penicillium citrinum, P. viridicatum y Aspergillus terreus. Al descubrirse sus propiedades antibacten'anas creció el interés en la citn'nina como posible antibiótico, por otro lado, se observó que producía efectos farmacológicos típicos de un estimulante parasimpático, pero sus efectos tóxicos impidieron que fuera empleada como droga terapéutica. Actualmente está considerada como una micotoxina potencialmente importante como contaminante de granos tales como cebada, trigo, centeno, avena y maíz (Wilson, 1982). Químicamente la citrinina es el ácido 4,6-dihidro-8-hidroxi-3,4,5 trimetril-6 oxo-3h-2 benzopirano-7 carboxílico (Cole y Cox, 1981). El compuesto de peso molecular 250 y punto de fusión 175 C, con descomposición, es fácilmente soluble en cloroformo, acetona y soluciones de acetato de sodio y prácticamente insoluble en agua fría. La micotoxina es estable a ph ácido, pero no en medio alcalino. La citrinina puede producirse en distintos sustratos y condiciones ambientales y aparece conjuntamente con otras micotoxinas como la patulina y la ocratoxina A. El maíz ha demostrado ser uno de los mejores sustratos para la producción de citrinina. Respecto a su toxicidad y acción antibiótica la citrinina tiene actividad bactericida contra diversos microorganismos Gram positivos, modificando la respuesta según las condiciones del cultivo (Timonin, 1942; Wang y col., 1947; Jabbar y Rahim, 1962). Se determinó que la citrinina es activa contra Bacillus subtilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Víbrio cholerae y también para los tipos humano, bovino y aviar de Mycobacterium tuberculosis. Si bien no hay casos bien documentados de micotoxicosis producidas por citrinina, se cree que ésta puede estar involucrada en la nefropatía porcina endémica en ciertas zonas de Dinamarca. Se ha sugerido que esta enfermedad puede ser causada por la ingestión de alimentos contaminados con cepas de Penicillium viridicatum productoras de ocratoxina y citrinina. Ambas micotoxinas fueron encontradas conjuntamente en trigo y cebada. Los daños renales observados en los cerdos afectados Introducción - 52

58 son comparables a los inducidos experimentalmente, tanto en cerdos como en ratas, indicando que la ocratoxina o la citrinina, o ambas, pueden ser causantes de esta micotoxicosis (Krogh y col., 1970, 1973). La ocratoxina A aparece con mayor frecuencia que la citrinina, por lo tanto, es posible que juegue un rol más importante en estas micotoxicosis. Experimentalmente, la toxicidad de la citrinina se ha estudiado en diferentes especies animales, incluyendo rata, ratón, cobayo, conejo, perro, cerdo, pollo y embrión de pollo (Carlton, 1980). En todas ellas, el compuesto es primariamente una nefrotoxina, produciendo necrosis de la porción tubular del nefrón. Las lesiones renales inducidas por citrinina se caracterizan por degeneración del epitelio tubular y proliferación de células intersticiales. En ratas y conejos también se han observado daños hepáticos. Aparentemente la citrinina no es cancerígena, pero puede actuar como promotor de otros potentes carcinógenos renales, como N-nitrosodimetílamina (Wilson, 1982). También se han observado efectos sinergistas de la citrinina con otras micotoxinas, como la ocratoxina A y el ácido penicilico. No tiene efectos teratogénicos en el ratón pero sí en embrión de pollo y es mutagénica en ciertos sistemas microbianos (Bacillus subtilis) pero no en otros (Salmonella typhimurium y Saccharomyces cerevisiae) (Ueno y Kubata, 1976; Ueno y col., 1978). La toxicidad aguda de esta toxina queda reflejada en los valores de LDSO conocidos para algunas especies animales, por ejemplo: 67 mg/kg para ratas; 35 mg/kg para ratones; 37 mg/kg para "guinea pigs" y l9 mg/kg para conejos (Betina, 1989). Respecto a la incidencia de esta micotoxina, la citrinina ha sido encontrada como contaminante natural de trigo, centeno, cebada y avena, en cantidades variables entre 0,07 y 80 mg/kg (Scott y col., 1972). Chalam y Stahr (1979) analizaron 60 muestras de alimentos para animales y encontraron citrinina en dos de las mismas (maíz y ensilado) en concentraciones de 2-3 mg/kg. Introducción - 53

59 El número de muestras contaminadas con citrinina generalmente no es muy alto y las muestras positivas provienen de lotes de baja calidad. El análisis de citn'nina no es sencillo, no existen métodos cuantitativos adecuados para la mayoría de los sustratos naturales, de modo que la cantidad de toxina en las muestras contaminadas es difícil de determinar. Posiblemente los valores informados sean inferiores a los realmente existentes en los granos. I.d.5. Fusarium El género Fusarium Link ex Fr. es común en regiones tropicales y templadas, pero además es posible aislarlo en el desierto, en regiones alpinas y áreas árticas donde prevalecen condiciones climáticas adversas. Esta amplia distribución puede atribuirse a dos factores claves, su habilidad para colonizar un rango muy amplio de sustratos y a un eficiente mecanismo para dispersarse en el tiempo y/o espacio. Estos dos factores le permiten adaptarse rápidamente a nuevos nichos ecológicos creados por el hombre, así se encuentran como saprófitos en el suelo y sobre vegetales en descomposición de toda clase. Además juegan un rol en la biodegradación de materiales orgánicos como productos farmacéuticos (Thomas, 1984). Algunos son patógenos de insectos (Claydon y Grove, 1984) y otros son agentes de enfermedad en humanos y animales vertebrados, causando micosis y posiblemente alergias (Austwick, 1984; Ripon y col., 1988). La mayon'a son parásitos de plantas salvajes y cultivadas, causando podredumbre de frutos (Bottalico y col., 1983, 1987; Logn'eco y Bottalico, 1988; Zajkowski y Kwasna, 1987; Latus, 1987; Pronczuk y col., 1991; Arseniuk y col., 1991). De las plantas cultivadas, el maíz y otros cereales sufren la invasión de especies del género Fusarium causando una reducción severa en la producción de granos (Wakulinski y 001., 1991). Por ejemplo, la podredumbre de la espiga ("ear rot") que es un problema en todo el mundo, se traduce en la reducción de los rendimientos y en Introducción - 54

60 la acumulación de distintos metabolitos tóxicos que transforman los granos en inadecuados para el consumo humano y animal (Scott y col., 1985; Chelkowski y col., 1987; Bukovcaková y col., 1991; Perkowskí y col., l99la, 1991b). La formaciónde toxinas en cereales es un suceso que concierne a las áreas productoras de todo el mundo y su presencia en alimentos humanos y animales está asociada a menudo con micotoxicosis crónicas y agudas (Nelson y col., 1981; Marasas y col., 1984; Ueno y col., 1986; Schuh, 1987; Katkiewicz y col., 1991). Las micotoxinas del género Fusarium involucradas en casos de micotoxicosis incluyen principalmente: zearalenona, zearalenol, tricotecenos (como deoxinivalenol y toxina T-2), moniliformina butenólido, fusan'na C, fumonisinas y ácido fusán'co (Richardson y col., 1985; Marasas, 1988). El interés de las especies de Fusarium toxicogénicas está en incremento debido al descubrimiento de nuevos metabolitos tóxicos que adquieren importancia en salud pública. También requieren atención por su uso en microbiología industrial y biotecnología, como una fuente de metabolitos útiles y de proteínas de origen fúngico de excelente calidad nutricional (Anderson y Solomons, 1984; Bu Lock, 1984). Si bien el género Penicillíum y en menor medida Aspergillus presentan cierto grado de dificultad para su identificación, no aparece tanta controversia en los sistemas taxonómicos a los que se recurre para su clasificación como en el caso de Fusarium. La taxonomía de este género es difícil de aplicar, particularmente por el uso de diferentes sistemas en distintos países, y es complicada por la variabilidad extrema de las especies en cultivo y al hecho de que ellas mutan y degeneran rápidamente bajo condiciones de subcultivos repetidos en medios de laboratorio comunes. Esta situación ha llevado a una gran confusión en la literatura citada, a causa de que los mismos hongos son conocidos bajo una variedad de nombres distintos y varias toxinas han sido atn'buídas a especies incorrectas. Si sumamos a esto que en el cultivo de maíz a nivel mundial las principales especies fúngicas que se aislan pertenecen a este género; por ello se detallará a continuación una descripción abreviada de las características a tener Introducción - 55

61 en cuenta para la clasificación y la importancia de las mismas en los distintos sistemas taxonómicos usados hasta el presente por diferentes autores. l.d.5. l. Características morfológicas El género Fusarium (Hyphomycetes) fue creado por Link en 1809 para agrupar aquellas especies de hongos con esporas septadas y fusiformes, nacidas en un estroma; para ello se basó en observaciones sobre Fusarium roseum (Booth, 1971). En términos del Código Botánico Internacional, el género fue validado por Fries (1821), quien lo incluyó en su orden, Tuberculariae. Con el desarrollo de métodos de obtención de cultivos puros para la identificación de Fusarium, la presencia de estroma o esporodoquio, no fue más aceptada como un carácter esencial del género. La presencia de macroconidios fusoides, con una célula pie formando una especie de talón, se acepta como un carácter más definitorio, siendo la célula pie la que lo separa del género Cylindrocarpon, que es el género más cercano a Fusaríum. El estado peritecial (teleomorfo), cuando es conocido, pertenece a los géneros Nectria y Gibberella (Ascomycetes - Hypocreales); estos estados teleomórficos no se producen en cultivos agarizados o la hacen muy dificultosamente. Sin embargo, cepas fértiles de F. solani a veces forman peritecios marrón rojizo en agar papa glucosa y F. gramínearum a veces produce peritecios púrpura oscuro en agar hoja de clavel, estos teleomorfos son: Nectria haematococca y Gibberella zeae, respectivamente (Nelson y col., 1982). La morfología de los macroconidios es el principal rasgo de diagnóstico para las especies de Fusarium. Generalmente los macroconidios tienen por lo menos tres septos con una célula apical bien diferenciada, que puede ser redondeada, puntiaguda, filamentosa o en forma de gancho, y una célula basal que puede tener forma de pie con un talón distintivo (a veces levemente hendido). Introducción - 56

62 Los macroconidios generalmente exhiben cierto grado de curvatura, según la longitud de la cara ventral con respecto a la dorsal. Los macroconidios pueden estar producidos en pústulas discretas llamadas esporodoquios o en masas mucosas o limosas, más o menosconfluentes, llamadas pionnotes y aunque algunos macroconidios se producen en el micelio aéreo, son los producidos en esporodoquios los mejores para la identificación, ya que su forma y tamaño son más regulares. Muchas especies de Fusarium también producen pequeños conidios llamados microconidios uni o bicelulares. Los microconidios se producen usualmente en el micelio aéreo y su forma es importante en la identificación. Algunos Fusarium producen microconidios de un solo tipo, la forma más común es la elipsoidal o clavada. F. poae tiene microconidios esféricos y apiculados y F. sporotrichioides tiene microconidios elipsoidales, piriformes y esféricos. La forma de producción de microconidios y el tipo de células conidiógenas sobre la que nacen son criterios útiles para la identificación. F. monilifomie produce sus microconidios en cadenas secas, delicadas, largas, las cuales son bien observadas in situ, usando el aumento 10X del objetivo. En algunas especies, los microconidios son producidos en fiálides con un solo poro llamadas monofiálides, otros se producen en fiálides con más de un poro, las polifiálides. Especies que producen polifiálides producen monofiálides a la vez. Las clamidosporas son características de algunas especies y pueden ser terminales y/o intercalares, o en cadenas, o estar ausentes. Las colonias de Fusarium, en medios agarizados, son de crecimiento rápido y consisten en un micelio aéreo, como un fieltro, el que puede ser pálido, o brillantemente coloreado, con sombras o tintes rosados, rojos, vináceos, violáceos, purpúreos o marrones (Nelson y col., 1983). Introducción - 57

63 I.d.5.2. Taxonomía La fundación del actual sistema de clasificación de Fusarium fue definida por Appel y Wollenweber en su "Grundlagen" (1910) y por Wollenweber (1913) en su artículo publicado en Phytopathology. En 1915, Sherbakoff, trabajando independientemente en Estados Unidos, publica sus hallazgos más o menos confirmatorios. La parte más estable de la taxonomía ha sido la división del género en secciones o grupos. Wollenweber usó ambos términos indistintamente, pero es preferible, según Booth, el término sección para referirse a la reunión de especies relacionadas entre sí (Booth, 1971). Wollenweber en 1913, estableció seis secciones, cuatro de las cuales aún permanecen. La culminación del trabajo de Wollenweber, fue la publicación, conjuntamente con Reinking, de su monumental obra "Die Fusarien" en 1935; asimismo en 1943, Wollenweber publicó un extenso artículo ampliando sus hallazgos. "Die Fusarien" ha sido el estándar de referencia en la sistemática de Fusaríum y todos los sistemas de taxonomía de Fusarium, publicados desde 1935 se han basado en esta obra. Wollenweber y Reinking comenzaron con aproximadamente denominadas, que organizaron en 16 secciones: 1000 especies Eupionnotes Macroconia Spicarioides Submicrocera Pseudomicrocera Arachnites Sporotn'chiella Roseum Arthrosporiella Gibbosum Discolor Lateritium Liseola Elegans Martiella Ventricosum Estas secciones contenían 65 especies, 56 variedades y 22 formas. Introducción - 58

64 fueron: Los caracteres usados por Wollenweber y Reinking para separar las secciones la presencia o ausencia de microconidios la forma de los microconidios la presencia o ausencia de clamidosporas la locación de las clamidosporas (terminales o intercalares) la forma de los macroconidios la forma de la célula basal (pie) de los macroconidios Cada aislado fue estudiado en distintos medios (agar cerveza, agar zanahoria, agar harina de avena, tallos de alfalfa, espigas de cebada, masa de arroz y, en algunos casos, agar papa glucosa o trozos de papa). Las observaciones del crecimiento hechas en estos medios tienden a enfatizar las diferencias más que las similitudes, exagerando en las minimas diferencias halladas, tales como el largo y ancho de los macroconidios, resultando así en una fina separación de especies, variedades y formas. Esto produjo un sistema tan complejo que es dificultoso o casi imposible usarlo para construir una clave práctica y satisfactoria (Nelson, 1991). Muchos de los caracteres usados por Wollenweber y Reinking, para separar las especies, variedades y formas, no son estables y pueden ser alterados rápidamente haciendo crecer los cultivos en varios medios y bajo condiciones ambientales cambiantes. Posiblemente otros dos problemas pueden ser responsables, en parte, de la complejidad del sistema de "Die Fusarien": l - Las variantes o mutantes culturales no fueron reconocidos por Wollenweber y Reinking. 2 - Sus cultivos no fueron obtenidos a partir de una espora. Además, algunas especies han sido denominadas en base a la observación de uno o dos cultivos, cuando se debe observar un gran número de cepas representativas Introducción - 59

65 del organismo a identificar y así determinar el rango de variación morfológica que puede darse en ese organismo. La observación de una sola cepa no revela el rango de variación que puede aparecer, y esto puede producir dificultades y confusión para otros intentos de identificar esa especie. Los taxónomos de Fusarium a menudo se han dividido en "lumpers" y "splitters" ("todos juntos, sin distinción" y "los que están en desacuerdo"). Estos términos explican la filosofía empleada por los taxónomos en determinar las especies de Fusarium, pero no son necesariamente una reflexión sobre el número de especies reconocidas (Nelson, 1991). En la Figura I.7 se muestra la relación entre otros sistemas taxonómicos y el de Wollenweber y Reinking. Wollenweber & Reinking (1935) Alemania - 65 especies Gerlach & Nirenberg (1982) Alemania - 78 especies Raillo (1950) Gordon (1952) Snyder & Hansen (1940's) Rusia - 55 especies Canadá - 26 especies USA- 9 especies Bilai (1955) Booth (1971) Messiaen &Cassini (1968) Rusia - 26 especies Inglaterra - 44 especies Francia - 9 especies Joffe (1974) Nelson, Toussoun & Marasas Matuo (1972) Israel - 33 especies 1983) Japón - 10 especies USA-Sudáfrica - 30 especies Figura I.7. Relación entre los distintos sistemas taxonómicos del género Fusarium. Wollenweber & Reinking y Gerlach & Nirenberg son "splitters", con "splitters" adicionales a la izquierda y "lumpers" a la derecha. Gordon, Booth y Nelson, Toussoun & Marasas están en el medio pues han seguido una filosofía más moderada y han Introducción - 60

66 combinado los resultados de otros con sus propias observaciones para crear un sistema taxonómico. Todas las especies de Fusarium tienen una característica taxonómica en común: la producción de macroconídios de diversa forma, usualmente con una célula basal en forma de pie, cuando se producen en esporodoquios. Este criterio o característica estable, combinado con otras características primarias o secundarias, constituyen la base para la taxonomía clásica de Fusarium. Un problema fundamental inherente a la identificación de Fusarium, es que varían ampliamente en sus características morfológicas y fisiológicas. También son aspectos problemáticos en la taxonomía de Fusaríum: la conexión entre anamorfos y teleomorfos, las relaciones entre secciones, la delimitación de especies y las variantes mutacionales. Conexión entre anamorfos - teleomorfos Los teleomorfos de algunos Fusarium son conocidos y corresponden a los géneros Gibberella y Nectria, ambos géneros producen peritecios superficiales con estromas o sin él. Gibberella incluye especies con ascosporas con dos o más septos, peritecios color violeta o azul a azul negro. Necm'a incluye especies con ascosporas con uno o más septos o mun'formes, peritecios color blanco, naranja pálido o rojo brillante a marrón. La especie Calonectria rigidiuscula (anamorfo: F. decemcellulare) se reclasificó como Nectria rígídiuscula (Windels, 1991). F. nívale fue transferido al género teleomórfico Monographella como M. nivalis, cuando se comprobó que este hongo producía peritecios y ascos característicos más cercanos a los Amphisphaeriales que a los Hypocreales. El género anamórfico fue transferido de Fusarium a Microa'ochium como M. nivale. Se han descripto teleomorfos para 14 de las 29 especies de Fusarium en 9 de ll secciones (Nelson y col., 1983). Se desconocen los teleomorfos en las secciones Introducción - 61

67 Elegans y Arthrosporiella. En algunas secciones los teleomorfos han sido encontrados para algunas especies, pero no para todas. A partir de una ascospora se han obtenido cultivos puros utilizados para estudiar el rango de variación entre especies, pero el valor taxonómico de la conexión entre anamorfo y teleomorfo es de utilidad limitada y tampoco es necesario conocer el teleomorfo para la identificación de especies de Fusarium. Relación entre secciones Cada sección del género Fusarium tiene especies que comparten características morfológicas en común. Sin embargo, diferentes taxónomos colocan una misma especie en distintas secciones; por ejemplo, Booth (1971) coloca las especies con células conidiógenas poliblásticas en la sección Arthrosporiella (incluyendo F. semitectum, F. semitectum var. majus, F. camptoceras, F. avenaceum, F. sporotríchioides y F. fiuan'oides). Sin embargo, Nelson, Toussoun y Marasas (1983) no usaron el criterio de la presencia de células conidiógenas poliblásticas como una característica de la sección y colocan a F. avenaceum en la sección Roseum y a F. sporotrichioides y F. chlamydosporum (= F. fiuarioides) en la sección Sporotn'chiella. Una complicación adicional a la delimitación de secciones surgió recientemente con la descripción de 4 nuevas especies: F. beomzfonne, F. dlamíni, F. napzfonne y F. nygamai. Todas estas especies tienen algunas características de las secciones Elegans y Liseola; por ejemplo, F. nygamaí forma cadenas cortas de microconidios, lo que lo colocan'a en la sección Liseola, pero produce clamidosporas, lo cual lo acerca a la sección Elegans. Estas incongruencias sugieren que se debe crear una nueva sección que contenga a estas especies o las secciones Elegans y Liseola deberían ser combinadas (Windels, 1991).

68 Delimitación de especies Hay tres pasos críticos en la delimitación de especies de Fusaríum en un sistema taxonómico: l) La acumulación de una gran cantidad de aislados de tipo esporodoquial, provenientes de diferentes regiones geográficas. 2) Comenzar la obtención de cultivos a partir de un conidio o ascospora y hacerlo crecer en condiciones estandarizadas para poder observar así el rango de variación de la especie. 3) Determinar los caracteres útiles en la identificación de especies. Las diferencias individuales en los aislados o poblaciones no necesariamente deben'an formar la base para la designación de una nueva especie. La separación de especies de Fuxarium se basa en características primarias y secundarias. Las características primarias contemplan la forma del macroconidio, la presencia o ausencia de microconidios, su forma, si crecen o no en cadenas y el tipo de microconidióforo. Las características secundarias se refieren a la presencia o ausencia de clamidosporas, su configuración y posición; la presencia o ausencia de esclerocios y esporodoquios (Nelson y col., 1983). La morfología de la colonia, la pigmentación y la velocidad de crecimiento (diámetro de colonia) pueden ser de utilidad si se basan en procedimientos estandarizados. Por ello es necesario para la identificación con medios como el agar hoja de clavel (CLA) y el agar papa glucosa (APD). Las características microscópicas necesarias para la identificación se basan en el crecimiento en CLA, y las características culturales en APD. El CLA favorece la esporulación sobre el desarrollo miceliano, produciéndose conidios y conidióforos en abundancia, uniformes en tamaño y forma, reduciendo así la variación fenotípica. Introducción - 63

69 Los sistemas taxonómicos no son perfectos y ocasionalmente algunos cultivos parecen estar en la frontera que separa dos espacios, así algunos aislados de F. solani son difíciles de separar de especies del género Cylindrocarpon. También algunas especies producen exclusivamente microconidios y este problema podría atribuirse a mutaciones o que se han desarrollado en condiciones no estandarizadas. En cada especie de Fusarium hay un rango de variación en las caracteristicas morfológicas y es común que, por ejemplo como ocurre con F. oxysporum se encuentren distintos clones de esta especie según la planta particular o suelo del cual haya sido aislado, en una determinada área geográfica. La experiencia es el único camino para reconocer el rango de variación en cada especie de Fusarium, sin embargo la forma del macroconidio y otras características morfológicas deben aún distinguir cada especie (Windels, 1991). Variantes mutacionales Idealmente, todos los cultivos de Fusarium deberían representar el tipo esporodoquial. Sin embargo, en la naturaleza y en cultivo, pueden ocurrir mutaciones y perderse la capacidad de producir esporodoquios. Partiendo del tipo esporodoquial pueden darse dos tipos posibles de expresión fenotípica de las mutaciones, lo cual puede darse en toda la colonia o en sectores de la misma. El fenotipo "micelial" usualmente produce una colonia característicamente algodonosa, blanca y con pocos o ningún conidio. El fenotipo "pionotal" produce esporodoquios efusos y limosos o simplemente conidióforos con macroconidios, los cuales pueden ser deformes. Los cultivos son a menudo más intensamente coloreados que el tipo esporodoquial. No se conoce ningún tipo mutacional que haya revertido el tipo esporodoquial. Los cultivos con mutaciones a menudo difieren significativamente con respecto al tipo esporodoquial, en cuanto a la morfología y a la fisiología. Estas variantes Introducción - 64

70 mutacionales deben ser reconocidas y descartadas. Antes de conocerse la importancia a partir de cultivos monospón'cos, muchas variantes mutacionales fueron denominadas como especies de Fusaríum. También las mutaciones son importantes en especies fitopatógenas, ya que a menudo resulta de una pérdida o disminución de la virulencia (Nelson y col., 1983). Recientemente, varias técnicas relacionadas a la fisiología genética y biología molecular, han sido utilizadas para evaluar las relaciones taxonómicas, filogenéticas o patogénicas dentro y entre las especies de Fusarium. Estas herramientas podrian confirmar o definir las relaciones de secciones y especies, que normalmente se basan sólo en lo morfológico; sin embargo, es dudoso que estas técnicas reemplacen al microscopio en la examinación de los cultivos de Fusarium (Windels, 1991). Los sistemas taxonómicos deben ser confiables y razonablemente sencillos de aplicar, y no deberían requerir de equipamiento sofisticado y manejado por personal altamente preparado. En los pasados 10 años se ha consolidado un cierto grado de uniformidad en la sistemática de Fusarium; sin embargo, algunos desacuerdos aún existen entre los sistemas usados en distintos países (Lidell, 1991). Esta dificultad en obtener un acuerdo internacional en la taxonomía de un género como Fusarium no es algo inusual en las sistemática de Hongos. Las especies del género Fusarium son abundantes en suelos cultivados en regiones templadas y tropicales y está entre los hongos más frecuentemente aislados por los patólogos vegetales. Estas especies son reconocidas por su papel como patógeno de plantas, causantes de un amplio rango de enfermedades, tales como marchitamientos vasculares, podredumbre de raíces y tallos, tizones en pre y postemergencia y otros más (Lidell, 1991). El interés predominante en este género ha sido y aún lo sigue siendo, en parte por su rol como patógeno de plantas, aunque también interesa como productor de metabolitos tóxicos que afectan a los animales y al ser humano. Introducción - 65

71 En la tabla 1.15 se presentan las secciones y especies de Fusarium de posible aparición en maíz y con relevancia en la producción de micotoxinas. También se incluyen especies de Fusarium de taxonomía incierta (no incluídos en las secciones establecidas). Tabla I. 15. Principales especies toxicogénicas del género Fusaríum aisladas de maíz (de acuerdo al sistema taxonómico de Nelson y col., 1983). Secciones Especies Eupionnotes Spicaroides Sporotrichiella Roseum F. merismoides, F. dimerum F. decemcellulare F. poae, F. tricinctum, F. sporotrichioides F. avenaceum Arthrospon'ella Gibbosum F. semitectum F. equiseti, F. scirpi Discolor F. sambucinum, F. culmorum, F. gramínearum, F. crookwellense Liseola F. monílíforme, F. subglutinans, F. proliferatwn, F. anthophílum Elegans Martiella-Ventricosum Taxa indeterminada F. oxysporum F. solani F. napiforme, F. nygamai, F. beomzforme Las especies principalmente halladas en maíz son: F. moniliforme, F. subglutinans y F. proliferatum (Sección Liseola) y F. graminearum (Sección Discolor). En el trigo se aislan con más frecuencia F. culmorum, F. gramínearum (Sección Discolor) y F. avenaceum (Sección Roseum). La presencia de micotoxinas en el maiz ha sido investigada en granos, chalas, marlos y tallos (cañas).

72 Las principales toxinas producidas por las especies de Fusarium normalmente aisladas, se encuentran en la Tabla 1.16, en la cual puede verse que hay tres grupos principales de toxinas, la zearalenona (con más de lo derivados conocidos), los tricotecenos (con más de 50 derivados conocidos) y un tercer grupo que incluiría a la moniliformina, la fusarina C y las fumonisinas. En comparación con otros hongos, como Díplodía zeae, Nígrospora oryzae, Physalospora zeae, Dreschlera (anamorfo de Cochliobolus carbonum) y Colletorrichum gramim'cola, las especies de Fusarium son a menudo más comunes en granos porque la infección puede ocurrir desde la siembra (en el suelo) y hasta el período maduración de los cariopses. de Tabla I. 16. Principales micotoxinas y hongos toxicogénicos en el maíz (Krüger, 1989). Toxinas Hongos productores Zearalenona F. graminearum, F. tricinctum, F. oxysporum, F. monilíforme, F. culmorum, F. avenaceum, F. sambucinum, F. equiseti, F. sporotrichioides Tricotecenos F. tricinctum, F. graminearum, F. equiseti, F. oxysporum, F. solaní, F. poae, F. sporotrichioídes, F. culmorum Moniliformina F. subglutinans, F. monilg'forme,f. proliferatum, F. avenaceum Fusarina C F. monilzforme, F. graminearum, F. poae, F. avenaceum, F. culmorum, F. sambucínum, F. sporotrichioides Fumonisinas F. monilzforme, F. proliferatum Para el presente estudio, se decidió seleccionar cepas potencialmente productoras de algunos metabolitos tóxicos, los cuales se describen a continuación. Introducción - 67

73 I.d.5.3. Zearalenona La zearalenona es una micotoxina producida por diversas especies del género Fusan'um, ampliamente distribuido en la naturaleza. Es un contaminante frecuente del maíz y otros cereales (Jelinek, 1987; Dieckman y Green, 1992; Juszkiewicz y Piskorska-Pliszczynska, 1992). Las especies productoras de zearalenona son las siguientes: F. graminearum, F. culmorum, F. monilifonne, F. oxysporum, F. equiseti, F. tricinctum y F. sporom'chioidcs. F. graminearum, cuyo estado perfecto es Gibberella zeae, produce las mayores cantidades de zearalenona (Mirocha y col., 1977). La trans-zearalenona (ZEA), formalmente conocida como F-2, está descripta químicamente como una lactona del ácido 6(10 hidroxi-ó-oxo-trans-l-undecinil) B resorcílico (Fig. 1.8), con la fórmula molecular Cnszoj. Es un compuesto blanco cristalino con punto de ebullición C. Es poco soluble en agua, es ligeramente soluble en n-hexano y progresivamente más soluble en benceno, acetonitrilo, cloruro de metileno, metano], etanol y acetona (Hidy y col., 1977). Como consecuencia de la reducción del grupo cetona 6 a un alcohol secundario se produce la formación del a y B-zearalenol (Richardson y col., 1985; Olsen y col., 1987). La reducción concomitante del grupo cetona 6' y del doble enlace l -2 da dos diasteroisómeros, el a- y el B-zearalenol. El isómero a es un promotor de crecimiento en ganado vacuno (Hiddy y col., 1977). La trans-zearalenona (peso molecular 318) y sus derivados, presentan fluorescencia verde cuando se los observa con luz ultravioleta de 365 nm, que se hace más intensa cuando se los irradia con luz ultravioleta de 254 nm. De cultivos de hongos se han aislado por lo menos 7 derivados, pero sólo la trans-zearalenona y el a-zearalenol han sido aislados en productos naturales. La ZEA es estable al calor y no es afectada por los procesos de detoxificación con amoniaco utilizados para eliminar aflatoxinas de maíz. Se ha detectado ZEA en Introducción - 68

74 productos fermentados a base de maíz como la cerveza, hecho que demuestra su estabilidad (Hesseltine, 1983). Compuesto Zearalenona a-zearalenol B-zearalenol C" y CT CH = CH (trans) CH = CH (trans) CH = CH (trans) Figura 1.8. Estructura química de la zearalenona y a- y B-zearalenol. Este compuesto tiene actividad estrogénica y anabólica y sus manifestaciones se han observado especialmente en animales de granja. La acción biológica de estas toxinas está determinada por su habilidad de interactuar compitiendo con el receptor específico de unión de estradiol, en las células blanco (Hsieh, 1987). Además, estimula la síntesis de ADN, ARN, y proteínas en los órganos blanco (útero, glándulas mamarias). Su actividad estrogénica se observa tanto en machos como en hembras (López y Tapia, 1980; Mirocha y col., 1982; Allen y col., 1983; Kuiper-Goodman y col., 1987; Long y col., 1989). Los efectos de la ZEA y algunos de sus derivados son muy van'ables de acuerdo al animal y a la cantidad consumida (Tabla 1.17). El cerdo es, entre los animales de granja de gran tamaño, el más sensible y el más comúnmente afectado por el sindrome estrogénico. Este sindrome se caracteriza por infertilidad en ambos sexos. En las hembras los efectos son más pronunciados, observándose hinchazón de la vulva, atrofia Introducción - 69

75 de los ovarios, prolapso de vulva y a veces de recto, además de frecuentes abortos. En machos puede aparecer hipertrofia mamaria. También se han observado estrogénicos en cloaca en aves de corral. síntomas Tabla I. 17. Toxicosis en animales de granja asociadas a maíz con zearalenona (Shotwell, 1977; Etcheverry, 1982). Cereal Manifestaciones clínicas País ZEA (ppm) Maíz Hiperestrogenismo en animales de granja Francia 2,3 Maíz --- Yugoslavia 18,0 Maíz Envenenamiento en cerdos Yugoslavia 2,5-35,6 Maíz Enmohecimiento severo y rechazo por los Yugoslavia O,7-l4,5 cerdos Maíz Hiperestrogenismo en cerdos Yugoslavia 35,6 Maíz Hiperestrogenismo en cerdos EEUU. 2,7 Maíz Aborto en cerdos EEUU. 32,0 Maíz --- Inglaterra 306,0 Maíz Rechazo del alimento para cerdos EEUU. 2,5 Los niveles de zearalenona que provocan toxicidad en cerdos y aves oscilan entre 0,1 y 6,8 mg/kg de peso corporal, variando según las especies (Famworth y Trenholm, 1981; Tutelyan, 1984; Joffe, 1986; Kuiper-Goodman y col., 1987; López y col., 1988; Abhelhamid y col., 1992; Kordic y col., 1992). La importancia de esta toxina se debe a la forma en que puede afectar a la productividad del ganado cuando se encuentra en los alimentos, principalmente maíz. Niveles de l a 5 ppm en los alimentos se consideran fisiológicamente significativos en cerdos. Otras alteraciones en el ganado asociadas con la ingestión de maíz contaminado por ZEA, aparte del hiperestrogenismo han sido: rechazo del alimento, pérdida de peso Introducción - 70

76 y poseer en sus tejidos y fluidos (Mirocha y co]., 1982; Prelusky y col., 1990) niveles variables de zearalenona y a- y B-zearalenol; éste último, un derivado hidroxilado de la zearalenona, es lo veces menos tóxico que la misma (Kuiper-Goodman y col., 1987; Kuiper-Goodman, (1993): 1990). Esto se visualiza en los ejemplos presentados por Pacin # La ingesta de l g por día de zearalenona durante dos días por una vaca, permite detectar en la leche 100, 89 y 247 nanogramos por litro de leche, respectivamente de zearalenona, a-zearalenol y B-zearalenol. Esto significa un total equivalente de ZEA de 213,7 nanogramos por litro, o sea, una conversión de # En el caso de las aves, pollo en particular, la zearalenona y sus metabolitos se acumulan en el músculo. Si se alimenta con 100. gpor kilogramo de alimento, durante 8 días, es posible detectar entre 60 a 100 nanogramos por kilogramo, lo que implica una conversión de 1:1000. Si la contaminación del alimento es de 20 mg por día, se detecta un total equivalente de zearalenona de 1947 nanogramos por kilogramo en el músculo de pollo, lo que implica en este caso una conversión de # La ingesta durante 4 semanas de 40,ugpor kilogramo de alimento, en cerdos, permite detectar en el hígado de los mismos, 438 nanogramos por kilogramo, lo que significa una alta conversión de 1:100. La zearalenona presenta baja toxicidad aguda. En la tabla I. 18 se expresan los LDSOpara esta toxina. No se han determinado las LD,0 para otros animales y tales cifras, si se hubieran determinado, probablemente carecerían de sentido porque involucrarían cantidades mucho mayores que las que se podrían llegar a ingerir en la práctica. Se realizaron estudios de carcinogenicidad en ratas Fisher (F 344/N) y se observó que dosis de 7,9 y 15,8 mg/kg de peso corporal en machos, y 9,2 y 18,5 en hembras provocaban efectos estrogénicos y aumento de lesiones neoplásicas en el hígado o en la pituitaria (NTP, 1982). El IARC en 1983 colocó a la zearalenona en la categoría de "evidencias de carcinogenicidad limitada", ya que fueron obtenidos los Introducción - 71

77 hallazgos de tumores en una especie (IARC, 1987). Los efectos en el hombre son poco conocidos (Hart y col., 1982). Algunos autores sugieren que puede ser responsable de la alta incidencia de cáncer cervical humano en Africa por el consumo de maiz infectado con Fusarium (Etcheverry, 1992). Tabla Valores de LDSopara zearalenona (Kuiper-Goodman y col., 1987; Etcheverry, 1992). LDso (mg/kg de peso corporal) Especies ORAL INTRAPERITONEAL Machos Hembras Machos Hembras Ratón > 2000 > 2000 Rata > 4000 > 4000 > > 500 > > Cobayo - > Pollo - > Entre 1978 y 1981 se produjo un notable aumento en la incidencia de desarrollo sexual precoz en niñas de Puerto Rico, que por sus características se pensó que podría haber sido causada por zearalenona (Bongiovanni, 1983; Sáenz de Rodríguez y col., 1985). También se mencionó esta posibilidad en el caso de una inusual incidencia de desarrollo mamario en varones jóvenes, que fue informada en Italia en 1978 (Bertinetti, 1988). Entre las especies anteriormente citadas, los principales productores de ZEA son F. graminearum (estado teleomórfico Gibberella zeae) y F. culmorum. Estas especies también pueden producir otras toxinas conocidas como tricotecenos.

78 I.d.5.4. Tricotecenos Los tricotecenos son químicamente sesquiterpenos sustituidos. Se los agrupa en macrocíclicos y no macrocíclicos, según posean o no el anillo en su molécula. Entre estas toxinas se cuenta con los denominados tipos A, B, C y D (Ueno, 1983). Los macrocíclicos tipos C y D, son producidos principalmente por hongos pertenecientes al género Myrothecium, y en menor medida a los géneros Cylíndrocarpon, Stachyborrys y Verticimonosporíum. Un ejemplo de tricotecenos macrocíclicos es el bacariol Bl y B2, hallados en el Bacharis coridifolía, planta que se encuentra naturalmente en los campos y es ingerida por los animales cuando ralea la pastura. Esta planta tiene la propiedad de acumular en su follaje la toxina, producida por los hongos que colonizan próximos a sus raíces (Jarvis, 1986; López, 1988). Otros tricotecenos macrocíclicos son las roridinas A, D, E y las verrucarinas A, B, J y K. Los tricotecenos no macrocíclicos, más interesantes desde el punto de vista de la toxicidad para humanos, son producidos por una variedad de hongos imperfectos, pertenecientes a los géneros Trichotecium, Trichoderma, Myrothecium, Fusarium y Stachybotrys. Entre los tricotecenos no macrocíclicos naturales (Ueno, 1983), se destacan los del tipo A: la toxina T-2, diacetoxiscirpenol (DAS), neosolaniol, toxina HT-2, y otros. En el tipo B se incluyen, entre otros, nivalenol (NIV), fusarenona X, deoxinivalenol (DON o vomitoxina) y derivados acetilados del DON. Ambos tipos A y B incluyen toxinas que se producen naturalmente en los cultivos. Los mismos se encuentran como contaminantes naturales de gramíneas y otras plantas destinadas a consumo humano y animal; y se desarrollan tanto durante el cultivo como en el almacenamiento (Mirocha y col., 1976; Kamimura y col., 1981; Ueno y col., 1983, 1985; Hagler y col., 1984; Osborne y Willis, 1984; Lee y col., 1985, 1986; Tanaka y col., l985a, l985b, 1986, 1988; Abbas y col., 1986; Clear y Abramson, 1986; Ishi y col., 1986; Petterson y col., 1986; Visconti y col., 1986; Mills, 1989). Introducción - 73

79 Los tricotecenos del grupo A y B (Figura 1.9) son moléculas de gran tamaño, escasamente coloreadas, solubles en solventes orgánicos y termoestables. TRICOTECENOS TIPO A Nombre Rl R, R, R. R, Toxina T-2 OH OAc OAc H OCOCHzCH(CH,)2 T-2 tetraol OH OH OH H OH Toxina HT-Z OH OH OAc H OCOCH2CH(CH,)2 DAS OH OAc OAc H H Neosolanjol OH OAc OAc H OH Toxina acetil T-2 OAc OAc OAc H OCOCH,CH(CH,)2 TRICOTECENOS TIPO B 15CH2R3 Nombre Rl R2 R3 R. DON OH H OH OH Nivalenol OH OH OH OH Fusarenona-X OH OAc OH OH 3-acetil DON OAc H OH OH ls-acetil DON OH H OAc OH Figura I.9. Estructura química de algunos tricotecenos no macrocíclicos. Introducción - 74

80 Además, a estas toxinas se les reconocen propiedades biológicas ya que poseen efectos antifúngicos, antibacten anos, antivirales, fitotóxicos e incluso actividad citostática e insecticida (Ueno, 1983, 1985; Joffe, 1986). Los tricotecenos son sustancias con una potente acción irritativa local (Ueno, 1983; Schiefer y col., l986a, b y c; Yarom y col., 1987; Bhavanishankar y col., 1988). La actividad tóxica presenta tres manifestaciones principales (Pacin, 1993): # La primera se realiza a través de la inhibición de la biosíntesis proteica, que se expresa especialmente en los tejidos de rápido recambio celular. La misma es el resultado de una potente inhibición de la peptil-transferasa, que impide la incorporación de aminoácidos al comienzo o al final de la cadena proteica (Carrasco y col., 1973; Cannon y col., 1976; Carter y col., 1976; Davis y Schiefer, 1982; Abbas y col., 1984; Farrel y col., 1985; Gyongyossy-Issa y Khachatourians, 1985; Ueno, 1985, 1987; Joffe, 1986; Pace y col., 1988; Pacin y col., 1994). # La segunda es inhibir la producción de energía, lo que afecta el funcionamiento de las membranas celulares (Hsieh, 1987). # La tercera es actuar sobre el metabolismo de las aminas biógenas del cerebro, debido a que inhiben la síntesis de monoaminoxidasa (Boyd y col., 1988; Fitzpatrick y col., l988a y b; Mac Donald y col., 1988; Wang y col., 1993a) ocasionando diversos trastornos neurológicos (Prelusky y col., 1992; Sirkkaa y col., 1992). Son embn otóxicos en ratas, ratones y cerdos (Khera y col., 1982, 1986; Morrissey, 1984; Morrissey y Vesonder, 1985; Ito y col., 1986). Actualmente se ha propuesto que a través de la disregulación de la IgA, el DON podría ser nefropático (Dong y Petska, 1993; Minervíni y col., 1993). La irritación severa de piel y mucosas, llega hasta a producir úlceras. Las alteraciones neurológicas del sistema nervioso central son responsables del rechazo al alimento en algunas especies y de la desorientación del vuelo de las aves. Introducción - 75

81 Probablemente las manifestaciones más evidentes son en el sistema hemopoyético y linfático, que adquieren distinta gravedad según la toxina y el tiempo de exposición a la misma. Entre las micotoxinas estudiadas, los tricotecenos son los que presentan mayor efecto inmunosupresor (Mann y col., 1983; Tryphonas y col., 1984; Schiefer, 1985; Pier y col., 1986; Hsieh, 1987; Pace y col., 1988; Petska y Bondy, 1989; Ayral y col., 1992). Además, producen diatesis hemorrágica y aplasia medular en los casos severos (Pearson, 1978; Hayes y col., 1980; Hayes y Wobeser, 1983; Terao, 1983; Chan y Gentry, 1984; Joffe, 1986). El mecanismo de acción es similar en todas las especies, pero los efectos tóxicos varían según la vía de administración o exposición (Vanyi y col., 1980; Hoerr y col., 1982; Ueno, 1983; Young y col., 1983; Trenholm y col., 1984; Forsell y col., 1985; Lorenzana y col., 1985; Harvey y col., 1986; Schiefer y col., y b; Hsieh, 1987; Ryu y col., 1988; Bergst y col., 1992; Parkhurst y col., 1992), siendo el gato el único animal que manifiesta un comportamiento similar al humano (Lutsky y Mor, l98la y b). En los animales de producción es frecuente que se observen alteraciones hepáticas, pero es necesario tener en cuenta que cuando se está frente a un brote epidémico, exista una elevada probabilidad que la intoxicación sea producida por más de una micotoxina. Si consideramos los problemas del productor, además de la inmunidad deprimida, la baja ganancia de peso, la morbi/mortalidad, también le ocasiona pérdidas la baja calidad en la producción de huevos (Tobías y col., 1992). Las intoxicaciones por tricotecenos detectadas en el hombre, datan de principios de siglo; pero la mayor epidemia ocurrió en Rusia durante la Segunda Guerra Mundial (Joffe, 1986). En 1943 se relacionó la presencia de Fusarium contenida en los alimentos con la epidemia de ATA (alimentary toxic aleukia - leucemia tóxica alimentaria) que padecía la población y más tarde se consideró que las micotoxinas Introducción - 76

82 implicadas en la misma fueron la toxina T-2, HT-2, T-2 tetraol y esporofusarina. La sintomatología en humanos es de una leucopenia progresiva que evoluciona a una aplasia medular similar a la ocasionada por efecto de la radiación. La ATA dejó secuelas severas en la población rusa (Efremov, 1984), lo que indicari'a que después de la eliminación de la toxina el organismo tarda en recuperarse un período variable. En India, China y Japón también se han detectado epidemias menores (Yoshizawa, 1983; Bhat, 1987; Wang y col., 1993b), en relación con el consumo de diversos cereales o subproductos (fideos de trigo, sopa de avena, arroz y cebada). Los episodios se caracterizaron por un sindrome gastrointestinal agudo, que desapareció al suspender la ingestión del alimento. Otro aspecto a considerar desde el punto de vista de la exposición del humano a estas micotoxinas, es la presencia de residuos tóxicos de las mismas en los huevos (Tobías y col., 1992). Teniendo en cuenta la importancia toxicológica de este grupo de toxinas y que han sido detectadas como contaminantes naturales del maíz en varios países (Tablas 1.8 y 1.9), incluyendo la Argentina (Jelinek, 1987), es importante evaluar la posibilidad de aparición de las mismas en la zona núcleo de producción maicera de nuestro pais. I.d.5.5. Moniliformina La moniliformina fue descripta por primera vez por Cole y col. (1973). Obtenida a partir de cepas de Fusarium moniliforme aisladas de maíz en EE.UU., la cepa productora original fue F. moniliforme NRRL Marasas y col. (1984), confirmaron la identidad de esta cepa como F. moniliforme y la misma está depositada en el IFRC (International Fusarium Reference Collection) como cepa Para su purificación y posteriores estudios de estructura y toxicidad se utilizó una cepa de Gibberella fijikuroi (estado teleomórfico). La toxina fue purificada como sal sódica y Introducción - 77

83 potásica y su estructura química corresponde a una 3-hidroxiciclobutano 3-ene-l,2 diona (Figura 1.10). H O'Nn Figura Estructura química de la moniliformina En cuanto a sus características físico-químicas, se conoce que es soluble en agua y los cristales puros en metanol se descomponen a temperaturas superiores a los 350 C. Los extractos de moniliformina pueden ser examinados bajo luz ultravioleta de 254 nm. La moniliformina es moderadamente estable a temperatura ambiente, permaneciendo un 68-77% después de 6 días, pero menos estable después de media hora a 100 C (Scott y Lawrence, 1987). Las pn'ncipales especies productoras, además de F. moniliforme son: F. subglutinans, F. proliferatum, F. anthophilium, F. graminearum, F. culmorum, F. sambucinum, F. avenaceum, F. acuminatum, F. equiseti, F. oxysporum, F. semirectum, F. concolor, F. chlamydosporum, F. sporotrichioides, F. beomiforme, F. nygamaí y F. napzforme (Rabie y col., 1978, 1982; Bottalico y col., 1982; Marasas y col., l986b, 1991; Vesonder, 1986; Scott y col., 1987; Farber y col., 1988; Bosch y col., 1989; Zhang y Li, 1989; Abbas y col., 1990; Lew y col., 1991; Logrieco y col., 1992, 1993). Estas especies, provenientes de diferentes áreas geográficas en el mundo, han sido aisladas a partir de diversos cultivos como por ejemplo maíz, sorgo, mijo y algodón (Cole y col., 1973; Marasas y col., l979b; Rabie y col., 1982, Logrieco y Bottalico, 1988). No se conoce si la moniliformina representa un n'esgo real para la salud humana y animal, pero se ha demostrado que es extremadamente tóxica para animales de Inlroduc ción - 78

84 laboratorio (Nelson, 1992). Los efectos tóxicos descriptos fueron: parálisis muscular progresiva, problemas respiratorios, cianosis, coma y muerte en ratas y patitos. Las investigaciones patológicas demostraron degeneración del miocardio, de células hepáticas, pancreáticas, suprarrenales, de la mucosa gástrica y del intestino delgado. La dosis letal, LDSO para pollitos de un día fue de 4 mg/kg, y la LDSO de toxina pura en ratas machos fue de 50 mg/kg (Kriek y col., 1977; Burmeister y col., 1979). Kriek y col. (1981), aislaron 21 cepas de Fusarium moniliforme de las cuales una, la MRC 602 fue responsable de nefrotoxicidad, hepatotoxicidad y cardiotoxicidad en ratas. Abbas y col. (1990) observaron que una cepa de Fusarium oxysporum aislada de pastura causó efectos tóxicos agudos en ratas provocando la muerte por hemorragia intestinal y tímica. La cepa en cuestión era productora de moniliformina. Thiel y col. (1982), informaron sobre la presencia natural de esta toxina conjuntamente con ZEA, DON, NIV y fusarina C en maiz proveniente del distrito de Transkei (Sudáfrica) contaminado con tres especies del género Fusaríum, F. moniliforme, F. subglutinans y F. graminearum. Previo a este estudio sólo se conocía la síntesis de moniliformina por las especies productoras bajo condiciones experimentales de laboratorio. En Sudáfrica se asoció la presencia de F. moniltforme en maíz con el riesgo de aparición de cáncer de esófago en humanos (Marasas y coi., 1981, 1988). Esto condujo al estudio de las micotoxinas que esta especie produce cuando se la cultiva en maíz. Se observó que F. monilzforme muestra una baja frecuencia de producción de moniliformina y por ello se continuó tratando de identificar otros metabolitos tóxicos producidos por esta especie y que exhibieron actividad promotora de cáncer. Gelderblom y col. (1988) aislaron e identificaron un grupo de toxinas que mostraban la actividad anteriormente citada, a partir de cultivos monospóricos de F. moniliforme MRC 826 y que serán descriptos en particular en el punto siguiente. Introducción - 79

85 I.d.5.6. Fumonisinas La historia de estas micotoxinas está asociada en principio a la presencia de Fusarium moniliforme, como contaminante de los alimentos del ganado equino, situación que ocasionó brotes epidémicos de leucoencefalomalacia equina (ELEM) en varios países incluyendo Argentina (Haliburton y Buck, 1986; Marasas y col., l988b; Kellerman y col., 1990). Se había observado que equinos alimentados con forrajes infectado con F. moniliforme desarrollaban ELEM, por lo tanto la sustancia que la producía era sintetizada por este hongo. En Sudáfrica se indujo la aparición de ELEM en caballos (Marasas y col., 1988b) con alimento infectado con cultivos puros de F. moniliforme, aislado de maíz. También se observó que estos alimentos contaminados podían producir una afección hepática fatal en los caballos. Analizando el maíz implicado en los brotes de ELEM había metabolitos como fusan'na C, moniliformina y 2-metoxi 4-etil fenol; sin embargo, al ser inyectadas estas micotoxinas en forma intravenosa, ninguno de ellas producía ELEM en los asnos usados en la experiencia, por lo tanto, la sustancia responsable de la ELEM no se conocía. Una cepa de F. monilifonne (MRC 826), aislada de maíz mohoso en Transkei (Sudáfrica) se mostró capaz de producir ELEM en caballos y hepatocarcinoma en ratas; también exhibia actividad promotora de cáncer en un bioensayo; usando dietil nitrosamina (DEN) como iniciador en ratas, en las que inducía la aparición de gama glutamil transpeptidasa en hígado. Este bioensayo es un método biológico para detectar sustancias tóxicas promotoras de cáncer (short-term cancer initiation-promotion bioassay) y consiste en alimentar durante 4 semanas ratas, con una dieta con 5% de material infectado con la cepa a estudiar. Con este método se llegó a que una misma sustancia en la cepa MRC 826 parecía tener efecto tóxico y cancerígeno a la vez. Así, Gelderblom y col. (1988) aislaron y purificaron por primera vez unas nuevas micotoxinas, las fumonisinas Bl y B2a partir de un extracto de la cepa MRC 826. Introducción - 80

86 Cuando se inyectó fumonisina Bl en caballos se vio que se reproducían los síntomas de ELEM (Marasas y col., 1988b). Bezuidenhout y col. (1988) elucidaron por espectrofotometn'a de masa y por resonancia magnética nuclear de carbono e hidrógeno la estructura de las fumonisinas que desde el punto de vista químico, conforman una cadena hidrocarbonada lineal de 20 carbonos sustituidos en el C2 por una amina, en el C3 y C5 por oxhidn'los, en el C12 y C16 por metilos, en el C14 y C15 por radicales iguales y en el C10 el radical que sustituye difiere según la fumonisina (FB), como se observa en la Figura ll n ghau u CH. 3 ro a a 1 y 21-43%CHQa-gH-CEH- CEH-CH SH-CHz-QH'(Cth-CEH-QHECEH-EÉH-CHs O o R, R2 R3 NHR4 0:? ( 2:0 "29 9": Hozc-Hc (EH-002}! H2? (EH: Ft1 Ft2 R3 R4 H FB, OH OH OH H F82 H OH OH H Fe, H H FB HHOHH FA, OH OH OH OHacO FA2 H OH OH CHaCO Figura Estructura química de las diferentes fumonisinas producidas por F. moniliforme En la actualidad se sabe que la FBl también puede ser producida por Otras especies de Fusarium, como F. proliferamm, F. anthophilum, F. dlamini, F. napiforme y F. nygamai (Nelson y col., 1992). El sustrato primordial que colonizan estos hongos y en el que producen micotoxinas es el maíz, por esta razón la mayoría de la información sobre brotes Introducción - 8]

87 epidémicos está referida a animales que consumen maíz en su dieta: cerdos, pollos, caballos. Teniendo en cuenta que Fusarium moniliforme constituye un contaminante muy frecuente de maíz, Finchan y col. (1992) sugieren que todos los productos elaborados con maíz deberían ser analizados en su contenido de fumonisinas. La acción biológica de las fumonisinas está en estudio en la actualidad, sin embargo existen datos sobre el efecto de las mismas en el metabolismo de los neurotransmisores cerebrales (Marasas y col., 1988b; Porter y col., 1993), ya que es un potente inhibidor de la biosíntesis de los esfingolípidos (Norred y col., 1992; Wang y col., 1992; Yoo y col., 1992), en el hepatocito, por intermedio de la inhibición de la enzima esfinganina N-acetiltransferasa, que ocasionaría, como consecuencia, un incremento de esfingosina y esfinganina (Rother y col., 1992; Riley y col., 1993). El incremento de estas enzimas podría ser un indicador indirecto de la intoxicación por fumonisinas. Un dato interesante a destacar es que, en forma similar a lo que ocurre con la mayon'a de las micotoxinas, la fumonisina Bl podría ser inmunosupresora (Qureshi y Hagler, 1992). Las investigaciones sobre el metabolismo (Shepard y col., l992a) de estas toxinas parecería indicar que las mismas se eliminan sin metabolizar por heces, prácticamente en su totalidad, cuando es administrada por vía oral (Shepard y col., l992b). Ya se han llevado a cabo trabajos sobre la posible carcinogenicidad de las fumonisinas, pero aún sin resultados concluyentes (Gelderblom y col., 1988, l992a y b; Norred y col., 1992; Park y col., 1992). Las manifestaciones clínicas ocasionadas por la ingesta de alimentos contaminados por fumonisinas son diferentes según la especie anima] en estudio. Así la ELEM es una enfermedad neurotóxica que afecta équidos (caballo, asno y mulas), está caracterizada por una necrosis licuefactiva multifocal, predominantemente de la maten'a blanca, en los hemisferios cerebrales. Los animales con ELEM, pueden iniciar su sintomatología con nerviosismo, apatía, temblores, ataxia, ceguera, hipertensión cerebral, incordinación en los movimientos, paresis de lengua y labios y muerte en Introducción - 82

88 convulsiones de tipo tetánicas (Marasas y col., 1988b; Voss y col., 1989; Kellerman y col., 1990; Wilson y col., 1990; Ross y col., 1991). El ganado porcino presenta edema pulmonar e hidrotorax (Calvin y Harrison, 1992; Haschek y col., 1992; Osweiler y col., 1992). Cerdos alimentados con niveles variables de fumonisinas incrementan las enzimas hepáticas, la bilirrubina y el colesterol, además de presentar síntomas pulmonares hasta finalizar con edema pulmonar. Los estudios anato-histopatológicos demuestran que los órganos afectados por estas toxinas son: pulmón, hígado y páncreas. La denominada Mystery Swine Disease que se caracterizó por epidemias de mortalidad pre y neonatal y disfunción respiratoria en cerdos adultos, fue detectada en Estados Unidos desde 1988 y ha ocasionado enormes pérdidas, se la asocia actualmente con la presencia de fumonisinas en los alimentos (Bane y col., 1992). El ganado vacuno ha sido poco estudiado en relación con la toxicidad de estas toxinas. Osweiler y col. (1993) sugiere que estos animales serían menos sensibles que los cerdos y los caballos, aunque también presentaron alteraciones hepáticas a dosis altas. Estudios llevados a cabo en pollos, señalan que animales tratados con dietas contaminadas con niveles variables de fumonisina B, presentan una pérdida de ganancia de peso, síntomas de hepatotoxicidad e incremento de los pesos del higado, preventn culo y molleja (Brown y col., 1992; Ledoux y col., 1992). Existen asociaciones epidemiológicas que se refieren a la ingesta de alimentos contaminados por Fusarium monilíforme, productor de fumonisinas y cáncer de esófago (Sydenham y col., l990b). Los estudios realizados hasta el presente sobre la toxicidad de estas nuevas micotoxinas del género Fusarium y el elevado nivel de ocurrencia natural de las mismas en maíz, en otros países, ha generado un área de investigaciones muy amplio en este tema y que merecería una mayor atención en la República Argentina. Introducción - 83

89 El maíz en la República Argentina representa el rubro principal en las exportaciones de cereales, por lo tanto es necesaria una calidad sanitaria adecuada para mantener esta importante fuente de ingresos. La presencia en el maíz, destinado a la elaboración de alimentos y balanceados, de mohos y sus toxinas, puede producir efectos deletéreos que se reflejan an en la salud humana y animal. El objetivo principal de este trabajo es evaluar la posibilidad de aparición de micotoxinas en el maíz cosechado en la Zona Núcleo de producción de este cereal. Las etapas cumplimentadas para alcanzar el objetivo delineado fueron: El aislamiento e identificación de las micofloras interna y externa del maíz recién cosechado en El estudio de las relaciones existentes entre las micofloras para establecer la distribución de los géneros predominantes en las distintas localidades. El aislamiento e identificación de la endomicoflora contaminante de mazorcas provenientes de campos visiblemente atacados por mohos en

90 El estudio de la capacidad toxicogénica en especies, potencialmente productoras de micotoxínas, y pertenecientes a los géneros de mayor interés toxicológico (Alternaria, Aspergillus, Fusarium y Penicillium).

91 INDICE DEL CAPITULO ll.a. II.b. Materiales II.a.l. Medios de cultivo li.a.l.l. Medios para el aislamiento II.a.l.2. Medios para la identificación Il.a.2. Reactivos, solventes y estándares Il.a.2.l. Reactivos y solventes Il.a.2.2. Estándares de micotoxinas Métodos II.b. l. Medio de cultivo agarizado para el aislamiento simultáneo ll.b.2. Muestreo ll.b.3. Aislamiento de la micoflora contaminante II.b.4. Identificación de los aislados II.b.4.]. Identificación de los aislados de Fusarium II.b.4.2. Identificación de los aislados de Aspergillus y Penicillium Il.b.4.3. Identificación de los aislados de otros géneros Il.b.S. Preservación de los aislados Il.b.6. Cálculo de la frecuencia de aislamiento y densidad relativa de géneros y especies ll.b.7. Capacidad toxicogénica ll.b.7.]. Preparación de los cultivos para la determinación de capacidad toxicogénica ll.b.7.2. Análisis de las micotoxinas ll.b.8. Análisis estadístico

92 li.a. Materiales II.a.1. Medios de Cultivo II.a.1.l. Medios para el aislamiento 1) 2) 3) 4) 5) Agar dicloran-cloranfenicol-peptona (DCPA) Composición (g/l de agua destilada): Peptona (Merck art. 7043) 15 KH2PO4 (Merck art. 4873) 1 MgSO4-7H20 (Merck art. 5886) 0. Cloranfenicol (Merck art ) 0 dicloran (0.2% p/v en etanol, 1.0 ml) 2 m Agar-agar (Merck art. 1613) 1 Agar dicloran-18% glicerol-cloranfenicol (DG18) Composición (g/l de agua destilada): Glucosa (Merck art ) 10 Peptona (Merck art. 7043) 5 KH2PO4 (Merck art. 4873) 1 MgSO4-7H20 (Merck art. 5886) 0. Glicerol p.a. (Merck art. 4094) 220 dicloran (0.2% p/v en etanol, 1.0 ml) 2 Cloranfenicol (Merck art ) O Agar-agar (Merck art. 1613) 15 Agar dicloran-rosa de Bengala-cloranfenicol (DRBC) Composición (g/l de agua destilada): Glucosa (Merck art ) 10 0 Peptona (Merck art. 7043) 5.0 KH2P04 (Merck art. 4873) 1 0 MgSO4-7H20 (Merck art. 5886) O 5 Rosa de Bengala (Merck art. 1843) (5% p/v en agua, 0.5 ml) dicloran (0.2% p/v en etanol, 1.0 ml) 2 mg cloranfenicol (Merckart ) 0.1 Agar-agar (Merck art. 1613) 15.0 Agar malta-sal (MSA) Composición (g/l de agua destilada): Extracto de malta (Merck art. 5391) 20.0 Extracto de levadura (Merck art. 5373) 5.0 NaCl (Merck art. 6404) 50.0 Glucosa (Merck art ) Agar-agar (Merck art. 1613) 20.0 Agar oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura (OGY): Merck art Composición (g/l de agua destilada): Extracto de levadura 5.0 D(+)-glucosa 10.0 Agar-Agar 15.0 Aditivo: gentamicina (Merck art ) l ml o bien oxitetraciclina 0.1 g ph: 6.5 t 0.1 Materiales y Métodos - 87

93 Las OOOU OO 6) Agar extracto de levadura-glucosa-cloranfenicol (YGCA): Merck art Composición (g/l de agua destilada) Extracto de levadura 5 D(+)-glucosa Cloranfenicol Agar-agar ph: 6.6 t II.a.l.2. Medios para la identificación 7) 8) 9) 10) Agar Czapek-Dox (CDA): Merck art Composición (g/l de agua destilada): Sacarosa NaN03 KCl FeSO4-7H20 K2HPO4 Agar-Agar ph: 7.3 t 0.1 Agar Czapek-extracto de levadura (CYA) Composición (g/l de agua destilada): KH2PO4(Merck art. 4873) 1.0 Concentrado de Czapek 1 ml Extracto de levadura en polvo (Merck art. 3753) 5.0 Sacarosa (Merck art. 7651) 30.0 Agar-agar (Merck art. 1613) Concentrado de Czapek Composición (g/100 ml de agua destilada): NaN03 (Merck art. 6537) 30 KCl (Merck art. 4936) 5 MgSO4'7H20 (Merck art. 5886) 5 FeSO4-7H20 (Merck art. 3965) O Agar extracto de malta (MEA):Merck art Composición (g/l de agua destilada): Extracto de malta Peptona de harina de soja 3.0 Agar-Agar 15 ph: 5.6 t 0.1 Agar 25%glicerol-nitrato (G25N) Composición (g/l de agua destilada): K2HPO4(Merck art. 5104) 0.75 Concentrado de Czapek 7.5 ml Extracto de levadura (Merck art. 3753) 3.7 Glicerol p.a. (Merckart. 4094) Agar-agar (Merck art. 1613) 12.0 Agar harina de maíz (CMA) Composición (g/l de agua destilada) Harina de maiz 30.0 Agar-agar (Merck art. 1613) 20.0 Agar hoja de clavel (CLA) Composición (g/l de agua destilada): Agar-agar (Merck art. 1613) Hojas jóvenes de clavel, sanas y libres de pesticidas (Dianthus caryophyllus) en fragmentos de 5 x 5 mm. u H H Materiales y Métodos - 88

94 13) Agar hoja de clavel con cloruro de potasio (CLA-KCl) Composición (g/l de agua destilada): Agar-agar (Merck art. 1613) 15.0 Kcl (Merck art. 4936) ) Agar papa glucosa (PDA): Merck art Composición (g/l de agua destilada): Infusión de papa (preparada a partir de 200 g de papa) 4.0 D(+)-glucosa 20.0 Agar-Agar 15.0 ph: 5.6 t ) Medio semisólido (SM) Composición (g/l de agua destilada): Agar-agar 2.0 Tween BO (Merck art ) 0.5 minutos. Todos los medios de cultivo fueron esterilizados en autoclave a 121 C por 15 En la preparación del medio OGY, la gentamicina se agregó después de autoclavar a 121 C durante aproximadamente a 50 C. 15 minutos y cuando la temperatura del medio llegó II.a.2. Reactivos, solventes y estándares II.a.2.l. Reactivos y solventes Acetato de etilo (Merck art. 9623) Acetona (Merck art. 14) Acetonitrilo (Merck art. 3) Acido acético (Merck art. 42) Acido acético glacial (Merck art. 63) Acido clorhídrico (Merck art ) Acido fórmico (Merck art. 264) Acido oxalico (Merck art. 495)

95 Acido sulfún'co 95-97% (Merck art ) Alúmina (Merck art. 5550) Anhídrido heptafluorobutírico ácido (HFBA) (Sigma H 1006) p-anisaldehido 98% (Mallinckrodt art. 1998) Benceno (Merck art. 1780) Borato de sodio decahidratado (Merck art. 6303) Carbón (Merck art. 963) Celite (Merck art. 269) Cloroformo (Merck art. 2445) Cloruro de aluminio (Merck art. 1084) Cloruro de potasio (Merck art. 4936) Cloruro de sodio (Merck art. 6404) Columnas de intercambio aníónico (SAX) (Bond Elut Analytichem art ) Columnas de CLAR Lichrosorb 5 ym Ca (Merck art. 9332) Diclorometano (Merck art. 6050) 2,6 dicloro-4-nitroanilina (dicloran) (Merck art ) p-dimetilamin.-h-.- '-' A v(merck art. 3056) 2,4 dinitrofenílhidracina (Merck art. 3081) Etanol (Merck art. 983) Fosfato dipotásico (Merck art. 5090) O-ftaldialdehido (OPA) (Merck art ) Glicerofosfato de magnesio (Merck art. 4151) Glucosa (Merck art. 8342) Hexano (Merck art ) Metanol (Merck an ) Molibdato de amonio tetrahidratado (Merck art. 1181) Nitrato de sodio (Merck art. 6535) 2-propanol (Merck art. 9634) Sacarosa (Merck art. 7651) Materiales y Métodos - 90

96 Silicagel 60 TLC (Merck art. 5553) Aluminio Silicagel 60 F254 (Merck art. 5554) Aluminio Sulfato de amonio (Merck art. 1217) Sulfato de cobre pentahidratado (Merck art. 2787) Sulfato ferroso heptahidratado (Merck art. 3963) Sulfato de magnesio heptahidratado (Merck art. 5886) Sulfato de manganeso monohidratado (Merck art. 5960) Sulfato de potasio (Merck art. 5153) Sulfato de sodio (Merck art. 6649) Sulfato de zinc (Merck art. 8882) Tetraborato disódico decahidratado (Merck art. 6308) Tolueno (Merck art. 8325) Tween 80 (polioxietilensorbitano monooleato, Merck art ) II.a.2.2. Estándares de micotoxinas Aflatoxina Bl (Sigma A 6636) Aflatoxina B2 (Sigma A 9887) Aflatoxina Gl (Sigma A 0138) Aflatoxina G2 (Sigma A 0263) Alteman'ol (Sigma A 1312) Alternan'ol monometil eter (Sigma A 3171) Acido ciclopiazónico (Sigma C 1530) Citn'nina (Sigma C 1017) Deoxinivalenol (Sigma D 0156) 3-acetil deoxinivalenol (Sigma A 6166) 15-acetil deoxinivalenol (Sigma A 1556) Diacetoxiscirpenol (Sigma D 0761) Materiales y Métodos - 91

97 Fumonisina B, B2y B3 (producidas por el Medical Research Council, Ciudad del Cabo, Sudáfrica) Moniliformina (Sigma M 5269) Neosolaniol (Sigma N 1761) Nivalenol (Sigma N 7769) HT-2 (Sigma T 4138) T-2 (Sigma T 4887); T-2 triol (Sigma T 4013); T-2 tetraol (Sigma T 3888) Zearalenona (Sigma Z 2125) II.b. Métodos II.b.l. Medio de cultivo agarizado para el aislamiento simultáneo La presencia de mohos en los cereales y sus subproductos constituye un problema potencial, ya que algunas especies de hongos filamentosos pueden producir metabolitos tóxicos para la salud humana y animal que se asocian a grandes pérdidas económicas. En bibliografía no se encuentran descriptos medios de cultivo para el aislamiento simultáneo de especies toxicogénicas pertenecientes a distintos géneros como ser Aspergillus, Fusarium y Penicíllíum. Por ello, para evaluar la factibilidad de aislar en un solo medio las especies de mayor importancia toxicológica, se analizó la cinética de crecimiento de cepas potencialmente productoras de micotoxinas en distintos medios agarizados. Microorganismos: Se estudió el comportamientode los siguientes hongos filamentosos: Aspergillus flavus Link; A. níger Van Thiegem; A. ochraceus Wilhelm; Fusaríum graminearum Schwabe; F. monilíforme Sheldon; F. prolzferatum (Matsushima) Nirenberg; Penicillium citrinum Thom; P. roseopurpureum Dierckx y P. verruculosum Materiales y Métodos - 92

98 cultivaron en tubos con PDA inclinado y se incubaron a 25 C durante 7 días (González y col., 1988). Al término de la incubación y a fin de obtener las suspensiones de conidios necesarios para inocular en cada uno de los medios a estudiar, se agregaron 5 ml de agua peptonada estéril con 0,1% de Tween 80 en cada tubo. Luego de agitar cada cultivo inclinado en Vortex durante un minuto se recogieron las suspensiones de conidios con una concentración del orden de 107conidios/ml (González y col., 1987). Este valor se determinó haciendo recuentos de conidios en una cámara cuenta-glóbulos de Neubauer (Gonzalez, 1984). Medios de cultivo: Los medios de cultivo para el aislamiento deben reunir los siguientes requerimientos: suprimir el crecimiento bacteriano, inhibir el desarrollo expansivo de los hongos Mucorales, promover el desarrollo de colonias compactas para facilitar la observación y estimular el crecimiento de las especies de interés y no de otros contaminantes. Para poder seleccionar el medio más adecuado para el aislamiento simultáneo, se estudiaron medios de cultivo agarizados mencionados en bibliografía para el aislamiento, identificación y recuento de hongos filamentosos. En la Tabla II. l. figuran los medios elegidos para este estudio. Medición del crecimiento: Un método simple de medición del crecimiento de hongos filamentosos es la estimación del incremento lineal de las colonias en medios sólidos. Comúnmente se realiza en cajas de Petri y el incremento en el diámetro de la colonia es estimado a intervalos adecuados (Mandels, 1965). Cuando se trabaja con colonias en medios de cultivo sólidos, el método consiste en medir con un calibre dos diámetros perpendiculares de cada colonia (Pirt, 1967). Las ventajas de la medición lineal residen en su simplicidad, y en su naturaleza no destructiva, pudiendo realizarse van'as mediciones en una misma colonia. Materiales y Métodos - 93

99 Tabla II.1. Medios seleccionados y la aplicación sugerida en literatura. Nombre Abreviatura Aplicación Bibliografia Agar Dicloran-Clo- DCPA Aislamiento e Andrews y ranfenicol-peptona identificación Pitt, 1986 Agar Dicloran 18% Recuento Hocking y glicerol cloranfe- DG18 xerofïlicos Pitt, 1980 nicol Agar Dicloran Rosa King y col., de Bengala Cloran- DRBC Recuento 1979 fenicol Agar malta sal MSA Identificación Pitt, 1985 xerofïlicos Agar oxitetracicli Mossel y na glucosa extrac- OGY Recuento col., 1970 to de levadura Agar extracto de Aislamiento y Engel, 1982 levadura-glucosa- YGCA recuento cloranfenicol El diámetro de las colonias de los hongos y la longitud de las hifas no ramificadas, crecen linealmente con el tiempo, o sea a una velocidad constante (kd), siendo la ecuación que vincula el incremento del diámetro de la colonia en función del tiempo, la siguiente: D = Do + kd (t-to) donde: D0 [cm]: D [cm]: kd [cm/h]: diámetro de la colonia a tiempo cero (to) diámetro de la colonia a tiempo t velocidad o constante de crecimiento radial. Esta ecuación representa la velocidad de incremento del diámetro de la colonia y kdexpresa ese incremento en el diámetro por unidad de tiempo (Tn'nci, 1969). Este Materiales y Métodos - 94

100 incremento del diámetro se puede asemejar a una reacción de orden cero (Pirt, 1967). Para determinar el crecimiento de los distintos hongos en los diferentes medios, se sembraron por quintuplicado 10 pl de suspensión de esporas (González y col., 1995) de cada una de las cepas en el centro de cajas de Petri con los medios elegidos. Las placas se incubaron a 25 C. El crecimiento radial de las colonias se determinó por la medición de los diámetros perpendiculares en función del tiempo. Las observaciones se realizaron cada 24 horas. Determinación del tiempo de diferenciación macroscópica: Para este estudio se emplearon cultivos inclinados en PDA deaspergillus ochraceus, Fusarium moniliforme y Penicillíum citrinum, los cuales fueron incubados a 25 C durante 7 dias. Al término de la incubación se procedió a la obtención de las suspensiones de conidios de manera similar a la descripta en el párrafo referido a Microorganismos, dentro de este mismo punto. Las suspensiones se mezclaron y se realizaron diluciones decimales de la mezcla en base a los recuentos iniciales (z lo7conidios/ml). Las diluciones se sembraron por quintuplicado en los medios de cultivo DCPA, DGl8, DRBC, MSA, OGY e YGCA, colocando 0,1 ml en superficie y distribuyéndolos con espátula de Dn'galsky estéril. Las placas fueron incubadas a 25 C y se observaron diariamente hasta poder distinguir las características macroscópicas de cada género. II.b.2. Muestreo Las muestras de maíz de la cosecha 1990se tomaron siguiendo el procedimiento descripto por Apro y col. (1987), que se puede resumir de la siguiente manera: Materiales y Métodos - 95

101 Se recolectaron muestras de maíz en flujo de 10 kg, cada una representativa de un lote, en el momento de la cosecha. A partir de los 10 kg se realizó un cuarteo hasta obtener una submuestra de 1 kg para el análisis micológico. Las muestras provinieron de S localidades de la principal área de producción maicera argentina. Se tomaron 178 muestras, cuya distribución geográfica fue de la siguiente forma: 48 muestras de Pergamino, 40 muestras de Chacabuco y 31 muestras de El Salto, en la provincia de Buenos Aires; 49 muestras de La Dolores, provincia de Santa Fe y 10 muestras de Killgruman, provincia de Córdoba. En 1991 se muestreó en Pergamino once lotes de maíz visiblemente afectados por mohos. II.b.3. Aislamiento de la micoflora contaminante Micoflora interna: De cada una de las muestras se tomaron al azar loogranos, los cuales fueron desinfectados superficialmente sumergiéndolos en una solución de etanol al 70% durante l minuto, luego fueron tratados con una solución acuosa al 5% de hipoclon'to de sodio comercial por un minuto, se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril y luego se secaron en flujo laminar con aire estéril. Cuarenta y cinco granos por muestra fueron dispuestos a razón de 15 granos por placa en cajas de Petri con YGCA. Las placas fueron incubadas en oscuridad a 25 C durante 4 a 7 días. Las colonias de hongos resultantes se pasaron a tubos con PDA inclinados, para ser inmediatamente identificadas (aislamientos priman'os). Cuando sobre un mismo grano desarrollaron varios hongos, se aislaron todos. Micoflora externa: De cada una de las muestras se agitaron 10 gramos, con 90 ml de agua peptonada estéril con 0.06 g/l de Tween 80, durante 5 minutos (Richard-Molard, 1986). De esta dilución 1/10 se realizó una dilución decimal y de cada una de éstas se sembraron en superficie 0,1 ml en agar YGCA por triplicado. Las placas fueron Materiales y Métodos - 96

102 incubadas a 25 C durante 4-7 días y las colonias fúngicas desarrolladas se contaron y se aislaron en tubos con PDA inclinado para su identificación (aislamientos primarios). II.b.4. Identificación de los aislados La identificación de los aislamientos primarios se realizó observando características microscópicas mediante la técnica de microcultivo en cámara húmeda (Onions y col., 1981). Para realizar cada microcultivo se usaron cajas de Petri dentro de las cuales se colocaron l disco de papel de filtro, una varilla de vidrio en forma de "U" y un portaobjeto, todos estos elementos se esterilizaron junto con la caja. En otra cápsula de Petri estéril se plaqueó agar Czapek Dox, hasta formar una capa de = 2 mm de espesor. Una vez solidificado el agar, se cortaron -con bisturí estérilcuadraditos de = l cm2. Cada uno de estos rectángulos se colocó en el centro del portaobjeto apoyado en la varilla de vidrio. Con ansa recto se inocularon los cuatro lados del bloque de agar con el hongo en estudio y se cubrió con un cubreobjeto de mayor tamaño que e] trozo de agar. Sobre el papel de filtro se agregaron 1-2 ml de agua destilada estéril para obtener una atmósfera húmeda y se incubaron a 25 C, realizando observaciones cada 12 horas (con aumento 640K). En el caso de especies de Fusarium se utilizaron cuadraditos de CLA y CLA + KCl para observar cadenas de microconidios en la sección Liseola (Fischer y col., 1982, 1983). También se realizaron observaciones microscópicas de conidios entre porta y cubre con lactofenol y lactofenol - azul de algodón, como líquido de montaje (1600X). Materiales y Métodos - 97

103 II.b.4.1. Identificación de los aislados de Fusarium Para la identificación de los aislados del género Fusarium se siguió la metodología propuesta por Nelson y col. (1983). Para ello a partir de aislamientos primarios en PDA, incubados a 25 C durante 7 días, se realizaron cultivos monospóricos, para ésto se utilizaron placas de Agar agua al 1.5% con el agregado de sulfato de estreptomicina (0.5 g/l). Sobre el medio se colocaron, con pipetas Pasteur, 6 gotas de agua destilada estéril, se dísgregó el micelio en una de ellas y posteriormente se homogeneizó la muestra. Luego de un período de incubación de 24 hs. a 25 C se procedió a la obtención de conidios germinados bajo lupa (40X), mediante el uso de aguja histológica. Un conidio fue transferido a un tubo con PDA inclinado, para observar características macroscópicas (coloración del micelio y del envés del cultivo) y otro conidio fue inoculado en CLA para observar características microscópicas de los conidios y conidióforos. En el caso de aislados pertenecientes a la sección Liseola, un conidio se inoculó en agar hoja de clavel con cloruro de potasio, para confirmar las características microscópicas de los conidióforos. Desarrollo de los aislados en medio Agar hoja de clavel (CLA): Las hojas de clavel se obtuvieron de plantas jóvenes libres de residuos de pesticidas, los cuales se cortaron en trozos de aproximadamente 5 mmz. Luego se procedió a la desinfección superficial de las hojas colocándolos en un recipiente estéril con etanol al 70% durante un minuto, pasado ese tiempo se transfirieron a una solución de hipoclorito de sodio al 5% por l minuto y finalmente se realizaron 3 lavados con agua destilada estéril. Posteriormente se procedió a la preparación del medio, las placas se dejaron durante 3 días a temperatura ambiente como control de esterilidad. Luego de este período fueron inoculadas monospóricamente e incubadas durante 7 días a 25 C con ciclos de luz blanca y luz U.V. de 12 hs. cada uno. Materiales y Métodos - 98

104 Una vez colonizadas las hojas con el micelio se tomó una de ellas y se montó sobre un portaobjetos para la posterior identificación microscópica de los conidios, conidióforos y demás estructuras características (Fischer y col., 1982). Desarrollo de los aislados en Agar hoja de clavel con cloruro de potasio (CLA KCl): Se procedió a la preparación del medio según la composición descripta en II.a. l, posteriormente se realizaron los microcultivosdelos aislamientos primarios a clasificar y se incubaron a 25 C (Fischer y col., 1983). Una vez transcurrido este período se inspeccionaron las cámaras de microcultivos bajo microscopio diariamente para la observación de las cadenas de microconidios, tipo de fiálides y presencia o ausencia de clamidosporas. II.b.4.2. Identificación de los aislados de Aspergillus y Penicillium A partir de los aislamientos primarios en PDA incubados a 25 C durante 7 días, se realizó la identificación de las especies siguiendo los esquemas propuestos por Pitt (1979) y Ramírez (1982) para el género Penicíllium, y por Pitt y Hocking (l985a y b) y Samson (1985) para el género Aspergillus. De cada uno de las estn'as desarrolladas se cosecharon los conidios, suspendiéndolos en 5 ml de medio semisólido. Estas suspensiones fueron utilizadas para inocular cápsulas de Petri que contenían los siguientes medios: MEA, GZSN y CYA. Se usaron un total de 7 cápsulas de Petri por cada 2 cepas, en base al siguiente esquema: CYA2 2 MEA G25N 2 CYA CYA CYA MEA 25 C 3 7 C 5 C Materiales y Métodos - 99

105 Las placas se incubaron durante 7 días a las temperaturas indicadas en el esquema. La identificación se realizó teniendo en cuenta las siguientes características: CRECIMIENTO: Se midió el diámetro de las colonias en el reverso de las placas desarrolladas en los medios a 25 C y 37 C. A 5 C se determinó la germinación de las esporas a una magnificación de ZOOX. CARACTERES DE LAS COLONIAS: Se observó el color y textura de las colonias, por observación directa o en lupa. OBSERVACION MICROSCOPICA: Se midió y determinó la forma de las fiálides y conidios. II.b.4.3. Identificación de aislados de otros géneros A partir de los aislamientos primarios en PDA, se realizó la identificación usando distintas metodologías de acuerdo al género en estudio. a. Los géneros Dematiáceos como: Acremonium, Alternaria, Anellophorella, Arthrinium, Cladosporium, Curvularia, Epicoccum, Humicola, Nigrospora y Sthemphyllum, fueron identificados según la metodología descripta por Pitt y Hocking (1985), resumida en II.b.4.2, y se confirmaron las observaciones morfológicas de acuerdo con Ellis (1971). b. El género Chaetomium fue identificado según la metodología descripta por Von Arx y col. (1986), lo que brevemente consiste en hacer crecer los aislamientos primarios en CMA con trozos de papel de filtro, incubarlos a 25 C y observarlos a los 3-5 días. También se realizaron Materiales y Métodos - 100

106 microcultivos en cámara húmeda y preparados entre porta y cubre con lactofenol. Se determinó la presencia de ascocarpos; la forma y estructura de los pelos y setas y el tamaño y forma de ascos y ascosporas. Para los géneros Geotrichum, Diplodia y Ovularia se utilizó la metodología propuesta por Pitt y Hocking (1985), resumida en Il.b.4.2, y se confirmaron las observaciones microscópicas de acuerdo con Von Arx (1981). Los aislados del género Trichoderma se identificaron según la metodología descripta por Pitt y Hocking (1985), brevemente expuesta en II.b.4.2, y se confirmaron las observaciones microscópicas de acuerdo con Rífai (1969). II.b.5. Preservación de los aislados Para mantener los aislados identificados y puros, se recurrió a las metodologías propuestas por Smith y Onions (1983). Para los géneros Alternaria, Aspergillus, Penicillium y Trichoa'erma, se empleó la técnica almacenamiento de conidios en tierra esterilizada. Los aislados de los demás géneros Dematiáceos y de Chaetomium se conservaron en silica gel esterilizada. Los aislados del género Fusarium, se preservaron en hojas de clavel, según el método descripto por Fischer y col. (1982). Materiales y Métodos - 101

107 II.b.6. Cálculo de la frecuencia de aislamiento y densidad relativa de géneros y especies Las frecuencias de aislamiento (Fr) y la densidad relativa (DR) de géneros y especies fueron calculadas de acuerdo a las siguientes ecuaciones (Marasas y col., 1988a): número de muestras contaminadas con hongos pertenecientes a un género o especie Fr(%) = x 100 número total de muestras númerode aislados pertenecientes a un género o especie DR (%) = x 100 númerototal de aislados füngicos o de aislados pertenecientes a un género II.b.7. Capacidad toxicogénica Para determinar la capacidad de producción de micotoxinas se procedió en dos etapas, una primera en la cual las cepas escogidas fueron inoculadas en sustratos diversos y bajo condiciones adecuadas para la acumulación de la o las micotoxinas de interés. La siguiente etapa fue la extracción de las toxinas del sustrato y su posterior análisis. II.b.7.]. Preparación de los cultivos para la determinación de capacidad toxicogénica Los sustratos y condiciones de incubación para la acumulación de micotoxinas varió según la 0 las toxinas de interés. Se prepararon los inóculos de las cepas seleccionadas para estos estudios. Para ello se transfirieron conidios de los cultivos conservados en tierra estéril o en CLA a Materiales y Métodos - 102

108 tubos con PDA inclinado. Los mismos fueron incubados a 25 C durante 7 días. La preparación de las suspensiones de conidios para las posteriores inoculaciones se realizó de manera similar a la descripta en II.b.l, con excepción de los aislados del género Alternaria, cuyo procedimiento se describirá en b). A continuación se detallan brevemente las metodologías empleadas en cada caso. a) Aflatoxinas (AF): Cada una de las cepas de Aspergillus flavus se inoculó en 100 g de maíz, previamente esterilizado a 121 C por 15 minutos, donde se ajustó la humedad al 40% por agregado de agua destilada estéril, se mezcló cuidadosamente durante lo minutos y se incubó a 25 C durante 7 días. Una vez desarrollados se autoclavaron a 121 C durante 15 minutos y se guardaron en freezer hasta su análisis (Montani, 1991). b) Alternariol (AOH) y alternariol monometil eter (AME): Las cepas pertenecientes a las distintas especies del género Alternaria fueron cultivadas en cajas de Petri con PDA e incubadas a 25 C durante 7 días. Transcurrido ese lapso se obtuvieron discos de 6 mm de diámetro con sacabocado estéril. Con estos discos de micelio se inocularon paralelamente 25 gramos de arroz, llevado a 35% de humedad y esterilizado a 121 C por 15 minutos y 25 gramos de maíz, llevado a 35% de humedad y esterilizado a 121 C por 15 minutos. Una vez inoculados se incubaron 28 días en la oscuridad a 25 C. Semanalmente los cultivos se agitaron manualmente para disgregar los granos. Finalizado el período de incubación se determinó la concentración de AOH y AME (Logrieco y col., 1990). c) Acido ciclopiazónico (CPA): Las suspensiones de conidios de las cepas de A. flavus aislados de maíz en este estudio fueron inoculados en un medio líquido sintético cuya composición (en g/l) es la siguiente: glucosa, 60.0; nitrato de sodio, 4.5; sulfato de magnesio heptahidratado, Materiales y Métodos - 103

109 0.5; cloruro de potasio, 0.5 y fosfato dipotásico, 1.0. El medio fue suplementado con 0.5 ml/l de una solución de trazas de metales que contenía (en g/l): borato de sodio decahidratado, 1.4; molibdato de amonio tetrahidratado, 1.0; sulfato de cobre pentahidratado, 0.6; sulfato de manganeso monohidratado, 0.22; sulfato de zinc heptahidratado, 35.2 y sulfato ferroso heptahidratado, Los ingredientes fueron mezclados y el ph ajustado a 5.5 con ácido clorhídrico 2N. Se colocaron porciones de 100 ml de este medio en erlenmeyers de 500 ml, se taparon y se esterilizaron a 121 C por 20 minutos. Una vez fríos se inocularon con las suspensiones de conidios y se incubaron a 25 C durante 8 días en la oscuridad (Trucksess y col., 1987). Paralelamente se sembraron las mismas cepas de A.flavus en maíz, siguiendo la misma metodología descripta para las aflatoxinas (a). d) Citrinina: A las cepas de Penicillium citrinum aisladas de maíz en este estudio se le determinó su capacidad de producir citrinina en medio Czapek líquido, cuya composición (en g/l) es la siguiente: nitrato de sodio, 2.0; cloruro de potasio, 0.5; sulfato ferroso heptahidratado, 0.01; sulfato de potasio, 0.35; glicerofosfato de magnesio, 0.5 y sacarosa, Los ingredientes fueron mezclados y el ph fue ajustado a 6.8 con ácido clorhídrico 2N. Se colocaron porciones de 100 ml en erlenmeyers de 250 ml, se taparon y se esterilizaron a 121 C por 15 minutos. Una vez fríos se inocularon con la suspensión de conidios y se incubaron a 25 C durante 7 días en la oscuridad (Montani y col., 1985). e) Fumonisinas (FB): Cada una de las cepas de Fusarium monilifonne y F. proliferatum estudiadas fueron inoculadas en Erlenmeyers de 500 ml con SOgramos de maíz amarillo partido. Este sustrato fue previamente esterilizado a 121 C por una hora y la humedad se ajustó Materiales y Métodos - 104

110 al 40% en agua destilada estéril. Como cepa de referencia se utilizó F. monílíforme M 2326 (Nelson y col., 1991), remitida desde el Fusarium Research Center de la Pennsylvania State University. Una vez inoculado, el maíz fue incubado en la oscuridad durante dos ciclos sucesivos de dos semanas cada uno, uno a 25 C y otro a 15 C (Sydenham y col., 1990). Al término de la incubación los cultivos desarrollados fueron secados durante la noche a 45 C, homogeneizados en un molino de laboratorio y guardados a 0 C hasta su análisis. f) Moniliformina (MO): Cada una de las cepas de Fusarium monilifonne, F. proliferatum y F. subglutinans estudiadas fueron inoculadas en erlenmeyers de 500 ml con 50 gramos de maíz amarillo partido. Este sustrato fue previamente esterilizado a 121 C por una hora y la humedad se ajustó al 40% con agua destilada estéril. Una vez inoculado el maíz, fue incubado a 25 C en la oscuridad durante 21 días (Marasas y col., l986b). Al término de la incubación los cultivos desarrollados fueron secados a 50 C en estufa de circulación forzada durante 48 horas, finamente molidos y guardados a 0 C hasta su analisis. g) Tricotecenos y Zearalenona: Cada una de las cepas de Fusaríum estudiadas fueron inoculadas en erlenmeyers de 500 ml con 50 gramos de maíz amarillo partido. Este sustrato fue previamente esterilizado a 121 C por una hora y la humedad se ajustó al 40% con agua destilada estéril. Una vez inoculado el maíz fue incubado a 25 C durante 7 días y a 15 C durante otros 14 días. Se agitó cada frasco diariamente durante los primeros 4 días para distribuir el inóculo. Al término de la incubación los cultivos desarrollados fueron secados durante la noche a 45 C, homogeneizados en un molino de laboratorio y guardados a 0 C hasta su análisis. Materiales y Métodos - 105

111 II.b.7.2. Análisis de las micotoxinas a) Aflatoxinas (AF) Se empleó la modificación propuesta por Quiroga (1985) del método oficial BF (AOAC, ). Se tomaron 20 g del cultivo en maíz y se colocaron en una licuadora, se agregaron 100 ml de metanolzagua (60:40), 40 ml de hexano y l g de cloruro de sodio y la mezcla se agitó en licuadora durante 5 minutos. La mezcla se filtró a través de papel de filtro y se dejó reposar hasta que se separaron las dos capas. Una alícuota (25 ml) de la capa metanol-agua fue extraída en pn'mer lugar en ampolla de decantación con 25 ml de tolueno agitando durante l minuto, y luego con 15 ml del mismo solvente. Ambos extractos se recogieron en un balón luego de filtrar a través de sulfato de sodio anhidro. El sulfato de sodio se lavó con dos porciones sucesivas de 5 ml de tolueno que fueron recogidos en el mismo balón. El extracto se evaporó en evaporador rotatorio hasta sequedad. Luego se redisolvió en un volumen adecuado de benceno-acetonitn'lo (98:2) en el momento de su cuantificación por cromatografía planar en capa delgada. Se utilizaron placas de sílica gel G60 de 0.25 mm de espesor. A 2 cm del borde de la placa se sembraron con microaplicador (CAMAG) 0.5, 1, 1.5 y 2 ul de la solución patrón junto con 2 y 5 ul del extracto del cultivo a una distancia de 1.5 cm entre sí. El solvente de desarrollo fue cloroformozacetona (9:1) y la cromatografía se desarrolló a temperatura ambiente en cuba sin saturar, hasta que el frente de solvente alcanzara 10 cm de la línea de siembra. Las placas se examinaron con lámpara ultravioleta (Desaga U.V ) a 366 nm. En las condiciones de trabajo descn'ptas se obtuvo una buena resolución de las cuatro aflatoxinas. La concentración de cada una de ellas se determinó por el método de comparación visual. La concentración de cada aflatoxina en el cultivo, expresada en ug/ kg se calculó mediante la ecuación Materiales y Métodos - 106

112 Vp 'Cp 'Md Contenido aflatoxina ( tg/kg) = Vm -P Vp: Cp: ul de solución patrón de aflatoxina que iguala el extracto del cultivo Concentración de la solución patrón en ug/kg Md: Volumen en 1.1de la dilución final del cultivo Vm: pl de cultivo cuya fluorescencia coincide con la de Vp P: Gramos de la muestra original contenidos en el extracto final. La confirmación de las toxinas se realizó rociando las placas con solución de ácido sulfúrico al 20% y observando el cambio de colocación de las manchas fluorescentes de azul o verde al amarillo. El estándar de aflatoxinas utilizado fue 2,4 tg/ml AFBl, 1,0.Lg/mlAFB2, 2,4 tg/ml AFGl y 1,0 tg/ml AFGZ. b) Alternariol (AOH) y Alternariol monometil eter (AME): Finalizada la incubación se determinó la concentración de AOH y de AME a partir de los cultivos en maíz y arroz. Las toxinas se extrajeron con 50 ml de metanol por 2 horas en agitador mecánico, luego se filtraron los extractos y 30 ml de cada uno se trató con 60 ml de sulfato de amonio al 20% en ampolla de decantación. Se realizó una segunda filtración y los extractos acuosos provenientes de maíz se desgrasaron con 30 ml de hexano. Se dejó reposar y se descartó la fase de hexano (superior). Las toxinas se extrajeron dos veces con 5 ml de cloroformo. Se combinaron los extractos orgánicos y se llevaron a sequedad en evaporador rotatorio. Los extractos secos se resuspendieron en 200 ul de cloroformo. La detección y cuantificación de las toxinas se hizo por cromatografía planar en capa delgada, en placas de sílica gel GóO de 0.25 mm de espesor, sin indicador de fluorescencia, observándose las placas con luz U.V. de 366 nm. Como sistema de Materiales y Métodos - 107

113 solvente de desarrollo se empleó cloroformo:acetona (88:12), con Rf para AOH = 0,32 y Rf para AME = 0,71. Los testigos de AOH y AME se prepararon en metano], con concentraciones de 248 Lg/ml de AOH y 262 ig/ml de AME a partir de los estándares de las toxinas (Logrieco y col., 1990). Estas toxinas presentaron fluorescencia azul bajo luz U.V. La confirmación de las toxinas se realizó comparando los valores de Rf de los estándares con los extractos de las cepas luego de correrlos en solvente de desarrollo TEF (toluenozacetato de etilozácido fórmico 90%, 60:30: lo)con Rf para AOH = 0,52 y Rf para AME = 0,66. La cuantificación se realizó en forma similar a lo descripto para las aflatoxinas. c) Acido ciclopiazónico (CPA) Al término de la incubación se agregaron 100 ml de cloroformo en cada frasco con el cultivo en medio líquido, extrayéndose en agitador mecánico durante 24 horas; posteriormente la mezcla se calienta en Baño María hasta ebullición y luego de enfriada, 20 ml de la capa clorofórmica se filtró a través de 10 g de de sulfato de sodio anhidro, el cual se lava dos veces con 2 ml de cloroformo recogiendo todo el filtrado en un vial. Los extractos se secaron en evaporador rotatorio. La extracción del cultivo en maíz se realizó de la siguiente manera: finalizada la incubación se tomaron 25 g de cultivo y se le agregaron 75 ml de cloroformo, agitando mecánicamente durante 24 horas. Luego la mezcla se calentó hasta ebullición dejándola 2 minutos, se enfrió y se centrifugó. Se tomaron de la capa clorofórmica 50 ml y se filtraron a través de sulfato de sodio anhidro, tal como se describió anteriormente; posteriormente se evaporó a sequedad. Para desgrasar se realizaron extracciones repetidas con hexano (l ml). El CPA se determinó por cromatografía planar en placas de sílica gel GóO. Las placas fueron previamente sumergidas en una solución etanólica al 2% de ácido oxálico y secados a 80 C por una hora. Los residuos fueron redisueltos en de cloroformo y fueron sembrados en las placas con el estándar de CPA (100 ig/ml de cloroformo). Materiales y Métodos - 108

114 Las placas se desarrollaron con bencenozácido acéticozmetanol (90:5:7) y luego secadas a temperatura ambiente. El CPA se visualiza rociando con una solución a] 1% de p-dimetilbenzaldehido en 75 ml de etanol y 25 ml de ácido clorhídrico. El color se desarrolla después de lo minutos a temperatura ambiente. El CPA aparece como una mancha púrpura azulada con un Rf = La intensidad del color de las manchas se comparó visualmente con la de los estándares. La confirmación se realizó por espectrometría de masa, usando un espectrómetro de masa VG MASS LAB (Modelo TRIO-2). El método empleado fue de ionización química de iones positivos utilizando metano como gas de ionización. La técnica seguida fue de introducción directa de la muestra ( unidades de masa). Esta confirmación fue realizada en el Laboratorio Nacional de Investigaciones y Servicios de Espectrometría de Masa de Alta Resolución (LANAIS-EMAR) de] Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires. d) Citrinina Una vez finalizada la incubación se observó la coloración del medio, ya que la citrinina en medio Czapek líquido da una tonalidad amarillo dorada. El pigmento citrinina, se obtiene como precipitado amarillo intenso por acidificación del medio con ácido clorhídrico ln. Se comprobó si las cepas eran productoras de citrinina, redisolviendo el precipitado amarillo en 40 ml de cloroformo y agitando mecánicamente por una hora. El extracto fue separado por filtración y el residuo reextraído tres veces con 40 ml de cloroformo agitando 30 minutos cada vez. Los extractos combinados fueron evaporados a sequedad y redisueltos en cloroformo. La micotoxina fue detectada mediante cromatografía planar (Montani, 1985). Se utilizaron placas de sflica gel 660 de 0.25 mm de espesor, a temperatura ambiente en cuba sin saturar. El sistema de desarrollo usado fue bencenozácido acético glacialzacetona (90: 10:9) y la citrinina fue detectada por comparación visual con el estándar de citrinina bajo luz U.V. (366 nm). Materiales y Métodos - 109

115 Se observó tanto en el extracto como en la solución patrón la misma mancha característica, con formación de cola y con intensa fluorescencia amarillo verdosa a la luz U.V. e) Fumonisinas (FB) Análisis cualitativo (Sydenham y col., 1990): Una vez finalizada la incubación, 5 gramos del cultivo en maíz fueron extraídos con 50 ml de metanolzagua (3:1), se agitó 5 minutos en agitador mecánico y se filtró. Una alícuota de 25 m1del filtrado se evaporó a sequedad a 50 C en evaporador rotatorio. El residuo se disolvió en 25 ml de metanol:agua (1:3) y se particionó dos veces con 50 ml de cloroformo. La fase acuosa se evaporó a sequedad y se resuspendió en 50 ml de metanolzagua (1:3). La presencia de FB se determinó sembrando alicuotas del extracto metanólico acuoso purificado en placas de sílica gel GóO. Las placas se desarrollaron en cloroformo:metanol:ácido acético (6:3:1), se secaron y se rociaron con una solución al 5% de p-anisaldehido en metanolzácido acéticozácido sulfúrico (85:10:5). Las placas se calentaron 5 minutos a llo C y se inspeccionaron visualmente. La aparición de una mancha marrón purpúrea con un Rf = 0.25 reveló la presencia de FB. Estas manchas se compararon con las del extracto de la cepa M Análisis cuantitativo (Sydenham y col., l992b): A 25 gramos del cultivo en maíz se le agregaron 50 m1 de metanolzagua (3:1) y se procedió a agitar durante 3 minutos a rpm. Luego de la separación de los extractos por centrifugación, 10 ml de los mismos se limpiaron por cartuchos SAX (Strong Anion Exchange). Los cartuchos fueron humidificados previamente con 5 ml de metano], primero y con 5 ml de metanolzagua (3:1), después. Las FB fueron selectivamente eluídas con lo ml de ácido acético al 1% en metano]. Los eluídos fueron evaporados en evaporador rotatorio hasta sequedad. Se den'vatizaron con OPA previo a su análisis en cromatógrafo líquido de alta resolución (CLAR) Waters M-45 (Columna fase reversa Lichrosorb 5 pm C8, Materiales y Métodos - 110

116 detector de fluorescencia Perkin-Elmer 650 S). La identificación y cuantificación de las fumonisínas se realizó por comparación de los tiempos de retención y áreas de los picos observados entre los extractos de las cepas analizadas y los correspondientes a la de los estándares de FB (FBI, FB2 y FB3), preparados en forma similar. Los estándares fueron aislados y purificados de cultivos de F. moniliforme MRC 826 por el Dr. Eric Sydenham del Medical Research Council de Ciudad del Cabo, Sudáfrica. Los mismos fueron preparados en solución en acetonitrilo:agua (1+1), consiguiéndose una concentración de 50 4g por mililitro de cada estándar. f) Monilíformina (MO) Los cultivos de maíz fueron analizados para determinar la presencia de MO según el método descripto por Bottalico y col. (1982). Brevemente se puede resumir de la siguiente manera: A 3 g de maíz fermentado molido se le agregó 40 ml de agua destilada y se agitó durante 2 horas en un agitador rotatorio. Posteriormente se centrifugó 30 minutos a 5000 rpm en centrífuga refrigerada y el sobrenadante fue filtrado a través de filtros Millipore de 0.45 um para clarificar la muestra. Se tomaron 20 ml de filtrado y se liofilizaron para concentrar y conservar la toxina. Los extractos secos fueron resuspendidos en 2 ml de agua destilada y se analizaron en forma cuantitativa por cromatografía en capa delgada (TLC) utilizando placas de sílica Gel 60F 264 (con indicador de fiuorescencia). Conjuntamente se sembró en las placas solución estándar de moniliformina (0.5 mg/ml en metanol). Como sistema de solvente para la corn'da se utilizó cloroformozetanol (3:2). La visualización de la toxina se realizó por comparación visual con el testigo de moniliformina bajo luz U.V. a 254 nm. Para confirmar la identidad y cuantificar la producción de moniliformina se usó TLC bidimensional. En placas de sflica gel 60F254 de 10 cm x 10 cm de lado se corrió Materiales y Métodos - III

117 primero en etanolzagua (92:8) como fase móvil, se secó y luego se corrió en tolueno: acetonazmetanol (5:3:2). La confirmación dela toxina se realizó por medio del rociado de las placas con 2,4 dinitrofenilhidracina (0.32 g/loo ml de ácido clorhídrico 2N) y posterior calentamiento de las mismas durante 10 minutos a 110 C. También la identidad de la toxina fue confirmada por la determinación de los espectros de absorción obtenidos con Densitómetro Desaga CD60. g) Tricotecenos y Zearalenona Los cultivos de maíz fueron analizados para determinar la presencia de tricotecenos (nivalenol (NIV), deoxinivalenol (DON), ls-acetil DON (ls-adon), 3 acetil DON (3-ADON), neosolaniol (NEO), diacetoxiscirpenol (DAS), toxina HT-2 (HT-2) y toxina T-2 (T-2)) y zearalenona (ZEA). Brevemente se puede resumir la metodología empleada de la siguiente manera: En un erlenmeyer se colocaron 50 g del cultivo en maíz molido, se le agregaron 100 ml de hexano para desgrasar y se añadieron 200 ml de metan012agua (1:1), se agitó por 2 horas en agitador mecánico y se filtró por papel (Scott y col., 1981, 1983). Se tomaron 50 ml de 1aparte acuosa y se particionaron con 150 ml de hexano y a la fase acuosa se le agregó solución acuosa de sulfato de amonio al 10% en una relación de 120 ml cada 150 ml de solución (Scott y col., 1983, 1986, 1989). Se le agregó Celite medido en probeta (en una relación de 50 m1de Celite por cada 150 ml de solución). Se agitó durante 2 minutos y se dejó decantar, luego se tomaron 10 ml del sobrenadante y se colocaron en una ampolla. Se realizaron tres particiones líquidolíquido con 20 ml de acetato de etilo. Se evaporó a sequedad y se trasvasó el residuo a un vial con 3 volúmenes de 0,5 ml de diclorometan02metanol (3:1) y se evaporó a sequedad. Luego se preparó una columna para limpiar el extracto que estaba en el vial (Scott y col., 1989). Para ello se tomó una columna de vidrio de l a 3 cm de diámetro y aproximadamente 20 cm de longitud. En el fondo se colocó un tapón de algodón, Materiales y Métodos - 112

118 luego se llenó la columna con tolueno y se agregó lenta y suavemente para que decante en forma pareja l g de sulfato de sodio y posteriormente se agregaron 2 g de sílica gel y otro gramo de sulfato de sodio en las mismas condiciones que en el primer caso. Al término de esta operación, se abrió la columna y se drenó bajando el nivel del tolueno hasta el comienzo de la columna, evitando que se secara y se formasen canales. Una vez preparada la columna se resuspendió el extracto con 0,3 ml de diclorometano: metanol (3:1), se enjuagó el vial con 0,2 ml de la mezcla anterior y se añadió también a la columna, posteriormente se agregaron 0,5 de diclorometano solo, abriendo la columna hasta que llegase al nivel del relleno (Scott y col., 1989). Se añadieron 15 ml de tolueno y luego 15 ml de hexano. Por último se eluycron las toxinas con 10 ml de diclorometan02metanol (9:1) (Scott y col., 1989). Una vez obtenido el extracto limpio se secó en corriente de nitrógeno. Se resuspendió con 500 il de tolueno:acetonitrilo (95:5), se agregó HFBA (35 ul), se agitó durante l minuto en agitador mecánico y luego se calentó en baño de arena a 60 C durante una hora. Se enfrió a temperatura ambiente, se agitó durante un minuto y se agregó l ml de solución acuosa de bicarbonato de sodio al 10% (para neutralizar el exceso de HFBA), se agitó 2 minutos en agitador mecánico y se esperó que se separen las fases. Para ayudar a la separación de fases se centrifugó l a 2 minutos a 2000 rpm. Luego se colocaron 50 ul de la fase toluénica en un vial de 2 ml y se le agregó 950 ul de hexano. Se. homogeneizó en Vonex 30 segundos y se procedió al análisis (Scott y col., 1981) en un cromatógrafo gaseoso Hewlett Packard 5890 Series II, equipado con detector de captura de electrones de Ni63y columna capilar (no polar) de sílica fundida HP-S (composición: 5% de difenil y 95% de dimetilpolisiloxano) de 25 m de largo, 0,2 mm de diámetro interno y 0,5 umde espesor de film. Dicho equipo cuenta con un integrador Hewlett Packard Modelo 3396 Sen'es II. El gas carrier y el gas auxiliar fue nitrógeno, ambos gases pasaron por una trampa de sílica gel para eliminar agua y por otra para eliminar oxígeno. La temperatura del inyector fue de 250 C, mientras que la del detector fue de 300 C. Materiales y Métodos - H3

119 Para el análisis de NIV, DON, ls-adon y 3-ADON, se utilizaron las siguientes condiciones: 70 C durante l minuto, incremento de la temperatura a 20 C/min hasta 170 C, 3 minutos a 170 C, incremento de la temperatura a 5 C/min hasta 270 C y ll minutos a esta temperatura (presión de cabeza de columna 20 psi, siendo l kg/cm2 = 14,2 psi). Las toxinas NEO, DAS, HT-2, T-2 y ZEA fueron analizadas de acuerdo a las siguientes condiciones: 200 C durante l minuto, incremento de la temperatura a 5 C/min hasta 270 C y 30 minutos a esta temperatura (presión de cabeza de columna lo psi). En función de los resultados obtenidos por cromatografía gaseosa, la confirmación de las toxinas se realizó por cromatografía planar. Las cromatoplacas de sflica gel 660, de 0,25 mm de espesor, se desarrollaron con cloroformo: acetona : 2-propanol (80: 10:10). Para los tricotecenos del grupo B (DON, ls-adon, 3-ADON y NIV) la placa fue tratada con cloruro de aluminio al 20% en etanol y calentada a 150 C durante 7 minutos. Estas toxinas y la ZEA exhiben fluorescencia azul a 366 nm. Otra placa se revela con una solución de metanol : ácido sulfúrico : ácido acético (80:10:10) y se calienta a 120 C durante 7 minutos. Los tn'cotecenos del grupo A (T-2, HT-2, NEO y DAS) exhiben fluorescencia a 366 nm y a la luz visible se observan como manchas pardas. II.b.8. Análisis estadístico Frecuencias de aislamiento y densidades relativas Para la comparación de las frecuencias de aislamiento y densidades relativas entre las micofloras endógena y exógena, se empleó un test asintótico para igualdad de proporciones (Devore, 1987). El análisis de las posibles diferencias en el comportamiento de las frecuencias de aislamiento de las micofloras endógena y exógena entre localidades, se basó en Materiales y Métodos - H4

120 Modelos Logit para datos categóricos (Agresti, 1990) y se utilizó el procedimiento CATMOD de SAS (SAS Institute Inc., 1988). Test asintótico para igualdad de proporciones Sean pl y p2 la proporción de individuos en las poblaciones l y 2, respectivamente, que poseen una característica particular. Alternativamente, si marcamos con S un individuo que posee la característica de interés, pl y p2 representan las probabilidades de hallar una marca S al elegir aleatoriamente un individuo de las poblaciones l y 2, respectivamente. Se supone la disponibilidad de una muestra de m individuos a partir de la primera población y n de la segunda. Las variables X e Y representarán el número de individuos en cada muestra poseyendo la caracteristica de interés. Dado que el tamaño de las poblaciones es mucho mayor que el tamaño de las muestras, la distribución de X puede ser considerada como binomial, con parámetros m y pl, y similarmente Y es considerada como variable binomial con parámetros n y pz. Suponiendo que las muestras serán independientes una de otra, X e Y son variables aleatorias independientes. El estimador natural para pl - pz, la diferencia de proporciones en la población, es la correspondiente diferencia entre las proporciones muestrales: X/m - Y/n. Con 6 = X/m y p} = Y/n, el estimador de pl - p2 puede ser expresado como Pi 'Pz Si X - Bin(m,p,) e Y - Bin(n,p2) con X e Y variables independientes, tenemos: E(fil _ pz) = P1 _ pz Entonces 51- '52 es un estimador A A Í _ insesgado de pl - pz y = p1q1 m + (donde qi = 1 - pi) Materiales y Métodos - 5

121 Si m y n son grandes, '13.y p, individualmente tienen distribución aproximadamente normal, el estimadorñ, - 6, tiene una distribución aproximadamente normal y entonces: Z: Él _fi2 '(p1 _p2) p1 q1 + p2 q2 m m (II.b.8.1) tiene distribución aproximadamente normal estándar. Si la hipótesis H0 : pl -p2 = O, o sea Ho : pl = p2 es cierta, entonces Z: fi1 fi2 0 _ l + _ l (II.b.8.2) (m n) Bajo Ho : pl = p2 = p, entonces si H0 es cierta, en vez de muestras separadas de tamaño m y n de dos poblaciones diferentes (dos distribuciones binomiales diferentes), podemos considerar que tenemos realmente una muestra de tamaño m + n de una población con proporción p. Dado que el número total de individuos, en esta muestra combinada con la característica de interés, es X + Y, el estimador de p es: A X+ Y m A n A p=- = pl+ p2 (II.b.8.3) El término del extremo derecho de la ecuación anterior muestra que p es realmente un promedio ponderado de los estimadores B, y 3,. Si tomamos la ecuación (II.b.8.3), con = l - '13,y sustituímos en (ll.b.8.2) el estadístico resultante tiene aproximadamente una distribución normal estándar. Por lo tanto el estadístico del test es: Materiales y Métodos - 116

122 Si la hipótesis alternativa es Hl : pl - p2 # O, la región de rechazo para un test de nivel aproximado a es: Z 2 zm,2 o Z s -za /2 Si la hipótesis alternativa es unilateral, Hl :pl - p2 > 0 o Hl : pl - p2 < O, las regiones de rechazo son: Z > za y Z < -za, respectivamente, siendo za el valor tal que l - <I>(za)= a (é: fc. de distribución normal estándar). Modelo Logit para tablas I x 2 Suponiendo que hay un solo factor explicativo que consta de I categorías, y una variable respuesta que toma sólo dos valores (Si,No o 1,0 o E/F), en la fila i de la tabla I X 2, las dos probabilidades de respuesta son pl/i y pz/i con p /i + pz/i = l. En el modelo Logit _l:)=a +51. (II.b.8.4) donde {B }describe los efectos del factor sobre la respuesta. En el lado derecho la ecuación se asemeja a la fórmula para medias por celda en un análisis de varianza de un factor (ANOVA). Como en el modelo ANOVA, la identificabilidad requiere una restricción lineal sobre los parámetros, tales como EB = 0 o B = O. Entonces (I-l) de los {B } caracterizan la relación. Para la Materiales y Métodos - 117

123 restricción Em = O, a es la medía de los logits, y l3 es la desviación respecto a la media para la fila i. El B mayor es el mayor logit en fila i y el mayor valor de p /i, o sea que los sujetos de la categoría i es más probable que tengan respuesta l. Denotemos {nü}el número de veces que la respuesta j ocurre cuando el factor está a nivel i. Es usual tratar como fijo el total de conteos {n + = n + nn} en cada nivel del factor. Cuando las respuestas binarias son variables aleatorias independientes Bernoulli, {nn} son variables binomiales independientes con parámetros {pl/i}. Para cualquier conjunto {p,/i > 0}, existen {B }tales que el modelo (II.b.8.4) se satisface. Ese modelo tiene tantos parámetros como observaciones binomiales y se le dice "saturado". simplificado es: Cuando el factor no tiene efecto sobre la variable respuesta, el modelo p /i 1 1 _ = II.b. 8.5) 09(p2/1) a ( Este es el caso especial de (II.b.8.4) en el cual B. = [32= = B. Dado que es equivalente a pl/l = = pl/i, (II.b.8.5) es el modelo de independencia estadística de la respuesta y el factor. Los parámetros del modelo logit pueden ser estimados por el método de máxima verosimilitud. Dado que la función de verosimilitud para el modelo logit es cóncava, los estimadores de máxima verosimilitud existen y son, en general, únicos. Sin embargo, dado que las ecuaciones de verosimilitud son no lineales es necesario utilizar procedimientos iterativos, por ejemplo, el método de Newton-Raphson (Agresti, 1990). Definición de valor p El valor p es el menor nivel de significación al cual la hipótesis nula es rechazada, cuando se usa un procedimiento de testeo específico sobre un determinado conjunto de datos. Una vez que el valor p ha sido determinado, la conclusión a Materiales y Métodos - 118

124 cualquier nivel particular de a resulta de comparar el valor p con a, de la siguiente forma: a. valor p S a = rechazamos Hoa nivel a. b. valor p > a =>no rechazamos H0 a nivel oz. Es costumbre llamar a los datos "significativos" cuando l-loes rechazado y "no significativos" en caso contrario. El valor p es entonces el menor valor al cual los datos son significativos (Devore, 1986). Caracteres morfofisiológicos de Penicillium cítrinum Para el análisis estadístico de la relación entre los caracteres morfofisiológicos de las cepas de P. citrinum aisladas y la producción de Citrinina, se utilizó un test de "chi cuadrado". Los datos fueron clasificados según dos criterios, uno la producción de citn'nina y otro el carácter morfológico y se arreglaron en tablas de doble entrada: Citrinina si Citrinina no O22 I' Totales Cl C2 Las r filas corresponden a las r categorías del carácter morfológico. La hipótesis testeada es que el carácter morfológico es independiente de la producción o no de Citrinina. El estadístico de este test es: Materiales y Métodos - l 19

125 donde E,ijes el valor esperado bajo la hipótesis de independencia y Oü es el valor observado de la fila i y columna j. La hipótesis se rechazó cuando el valor de T excedió el cuantil 0,95 de la distribución de chi cuadrado" con (r-l) libertad. grados de Para los casos en que se estudiaba la relación entre bandas y citrinina, y la relación entre textura y citrinina se prefirió usar el "Test Exacto de Fisher" (Conover, 1980) debido a que un porcentaje importante de frecuencias estimadas tomaba valores nulos o muy bajos, con lo cual no fue aplicable el test de "chi cuadrado". Se dispone de tablas que contienen los percentiles de la distribución exacta del estadístico de este test. Materiales y Métodos - 120

126 INDICE DEL CAPITULO Ill. "La. lll.b. lll.c. lll.d. lll.e. Resultados Selección del medio de cultivo para el aislamiento simultáneo Aislamiento e identificación de las micol'loras endógena y exógena lll.b. l. Claves de los principales géneros aislados en el maiz recién cosechado (1990) lll.b.2. Claves de especies de los principales géneros de interés micotoxicológico lll.b.2. l. Género Alternaria Ness (Fr.) lll.b.2.2. Género Fusarium Link lll.b.2.3. Género Aspergillus Link lll.b.2.4. Género Penicillíum Link lll.b.3. Desarrollo de los hongos en medio YGCA Relación entre las micol'loras endógena y exógena del maíz cosechado en 1990 Análisis de la micoflora endógena del maíz cosechado en Pergamino en 1991 Análisis de la capacidad toxicógenica l81 lll.e.l. Capacidad de producción de alternariol (AOH) y alternariol monometil eter (AME) Ill.e.2. Capacidad de producción de atlatoxinas (AF) Ill.e.3. Capacidad de producción de ácido ciclopiazónico (CPA) lll.e.4. Capacidad de producción de citrinina Ill.e.S. Capacidad de producción de tricotecenos y zearalenona (ZEA).207 Ill.e.6. Capacidad de producción de moniliformina (MO) lll.e.7. Capacidad de producción de fumonisinas (FB) l l3l l56 l7l 121

127 III. Resultados III.a. Selección del medio de cultivo para el aislamiento simultáneo En contraste con la bacteriología, la formulación de medios selectivos para hongos 'en alimentos está poco desarrollada. En la literatura se encuentran algunas formulaciones de medios selectivos aplicables al estudio de hongos toxicogénicos, especialmente para las especies de mayor importancia (Nash y Snyder, 1962; Bothast y Fennell, 1974; King y col., 1979; Burgess y Liddell, 1983; Frisvad, 1983; Pitt y col., 1983; Andrews y Pitt, 1986; Abarca y col., 1988; Cutuli y col., 1991). En algunos de estos medios, de difícil preparación e inestables y que no se encuentran formulados comercialmente en nuestro país, ciertos de sus componentes son costosos o no se hallan disponibles, lo cual dificulta la utilización de los mismos para exámenes de rutina. Es de gran importancia para la prevención de serias pérdidas económicas, la examinación de los cereales que se usarán en la formulación de alimentos. La determinación de la presencia cuantitativa de los mohos, como así también la detección de hongos potencialmente toxicogénicos es indicativo de cuál o cuáles micotoxinas pueden estar presentes. Idealmente un medio para el aislamiento y enumeración de hongos debería permitir la recuperación de todos los propágulos viables presentes y restringir el crecimiento excesivo de otros hongos, como los Mucorales, inhibir el desarrollo de bacterias, promover el desarrollo de colonias compactas para facilitar la observación, estimular el crecimiento de los mohos de interés y no de otros contaminantes y ayudar en la identificación de hongos por lo menos a nivel de género (Pitt y Hocking, 1985). En este trabajo se estudiaron varios medios de cultivo agan'zados, para encontrar aquéllos que permitan el aislamiento y la diferenciación simultáneos, en forma rápida y segura de especies de hongos potencialmente toxicogénicos. Para ello se analizó la Resultados - 122

128 cinética de crecimiento de diversas cepas en los diferentes medios. Los estudios realizados con hongos filamentosos creciendo en medios sólidos o semisólidos, muestran que el diámetro de la colonia se incrementa en forma lineal con el tiempo (II.b. l), evaluándose con la pendiente de la parte lineal la kd. En la figura III.1 se muestra la variación del diámetro de las colonias para Aspergillus ochraceus, Fusarium graminearum y Penicillium Citrinum, en función del tiempo de incubación a 25 C en los medios MSA (a) y YGCA (b). En MSA se observa que los diámetros incrementan en forma muy diferente a cada tiempo de medición, siendo mayor la velocidad de crecimiento de F. gramínearum, siguiéndole en orden decreciente A. ochraceus y P. citrinum. En el medio YGCA, por el contrario, los diámetros de las colonias de las tres especies incrementan en forma similar hasta aproximadamente las 120 horas (5 días) de incubación. Para la selección de un medio que permita el aislamiento simultáneo de las tres especies arriba mencionadas, sería preferible el YGCA respecto del MSA, ya que en este último el rápido desarrollo de F. gramínearum podn aenmascarar la presencia de A. ochraceus y P. cítrinum que crecen más lentamente. En la tabla III.l se encuentran las medias de las kd, obtenidas por regresión lineal de las curvas de crecimiento (quintuplicado) en los diferentes medios para todas las especies estudiadas y las desviaciones estándar (Sx) de las kd. Además muestra el valor de la media de las kdy la Sx, para todas las especies en conjunto en cada medio. Se presentan también los valores de los coeficientes de variación para cada medio estudiado. En la tabla III.2 se muestran los valores de mediana y desviación mediana absoluta (MAD), donde la MAD se calcula como: Resulmdos - 23

129 Figura III.l. Crecimiento radial de las colonias de Aspergillus ochraceus, Fusarium graminearum y Penicillium citrinum en medio Agar malta sal (MSA) y medio Agar extracto de levadura-glucosa-cloranfenicol (YGCA) a 25 C (a) Medio MSA diámetro de la colonia (cm) o Í l tiempo de incubación (horas) (b) Medio YGCA diámetro de la colonia (cm) l L J tlempo de lncubación (horas) - P. cirrinum * A. ochraceus + F. graminearum Resultados - 124

130 Resultados Tabla III.1. Media de las constantes de velocidad de crecimiento lineal (kn), desviaciones estándar (Sx) de cada especie en los distintos medios. Medias de las kn, Sxy coeficientes de variación de las distintas especies en cada medio. Medios de cultivo microorganismos DCPA DG18 DRBC MSA OGY YGCA kd 5x kd Sx kd Sx kd Sx kd Sx kd Sx Aspergillus flavus 1,80 0,10 5,95 0,02 4,60 0,07 9,91 0,11 5,06 0,04 5,31 0,03A. niger 2,39 0,04 6,38 0,08 4,18 0,02 10,32 0,06 5,97 0,09 6,40 0,03 A. ochraceus 2,11 0,07 3,88 0,10 1,94 0,06 4,07 0,32 2,05 0,16 3,20 0,46 Fusarium graminearum 2,98 0,10 2,58 0,02 4,21 0,04 10,78 0,05 n.c. - 2,79 0,03 F. moniliforme 1,97 0,25 2,27 0,10 1,90 0,04 3,26 0,23 3,58 0,15 3,01 0,16 F. proliferatum 2,50 0,18 2,36 0,07 2,49 0,08 4,14 0,03 3,54 0,11 3,54 0,04 Penicillium citrinum 2,30 0,01 2,30 0,03 1,14 0,14 1,30 0,08 0,69 0,03 2,57 0,18 P. roseopurpureum 0,94 0,03 1,56 0,08 1,67 0,03 2,37 0,05 1,86 0,04 2,34 0,03 P. verruculosum 0,68 0,03 1,13 0,02 1,90 0,08 2,52 0,04 2,45 0,03 2,01 0,04 Media 1,96-3,16-2,67-5,41-2,80-3,46 Sx 0,70-1,76-1,22-3,59-1,83-1,37 cv 35,7-55,7-45,7-66,4-65,4-39,6 - n.c.: no creció (no se incluyó en el cálculo de lamedia, Sxy CV) kd: [cm x h"] x 10'2 Sx: desviación estándar CV: coeficiente de van'ación (%) = (SX/media) x 100

131 Resultados - 26 Tabla III.2. Mediana de las constantes de velocidad de crecimiento lineal (kn), desviación mediana absoluta (MAD) de cada especie en los distintos medios. Medianas de las kd, MAD y coeficiente de variación robusto de las distintas especies en cada medio. Medios de cultivo Microorganismos DCPA DG18 DRBC MSA OGY YGCA kdmad kdmad kdmad kdmad kdmad kdmad Aspergillus flavus 1,86 0,06 5,95 0,03 4,65 0,01 9,92 0,03 5,08 0,03 5,33 0,00A. niger 2,41 0,01 6,38 0,13 4,19 0,00 10,31 0,06 5,98 0,06 6,40 0,03 A. ochraceus 2,15 0,06 3,90 0,18 1,92 0,03 4,17 0,37 2,14 0,21 3,16 0,09Fusarium graminearum 2,99 0,16 2,57 0,01 4,21 0,06 10,75 0,03 n.c. - 2,79 0,03 F. moniliforme 2,11 0,25 2,26 0,10 1,91 0,03 3,34 0,24 3,51 0,13 2,93 0,01 F. proliferatum 2,50 0,12 2,33 0,00 2,47 0,03 4,14 0,04 3,56 0,10 3,54 0,03 Penicillium citrinum 2,30 0,01 2,29 0,04 1,07 0,12 1,33 0,09 0,69 0,04 2,45 0,06 p. roseopurpureum 0,93 0,00 1,54 0,12 1,68 0,03 2,38 0,04 1,87 0,04 2,33 0,01 P. verruculosum 0,69 0,03 1,13 0,03 1,87 0,10 2,52 0,06 2,44 0,04 2,03 0,03 Mediana 2,15-2,33-1,92-4,14-3,51-2,93 MAD 0,43-1,17-1,26-2,61-2,33-0,89 CVR 20,0-50,2-65,6-63,0-66,4-30,4 n.c.: no creció (no se incluyó en el cálculo de lamediana, MAD y CVR) kd: [cm x h"] x 10'2 MAD: desviación mediana absoluta CVR: coeficiente de variación robusto

132 _ mediana( X -med(x ) I) Huber,19 1 0,6745 ( 8 ) La mediana y la MAD son estimadores resistentes, no sensibles a la presencia de observaciones atípicas, de posición y de la escala. Se define un estimador resistente del coeficiente de variación como: mi mediana (Xi) q x 100 MAD ) Se observa que en el medio OGY, F. graminearum no creció durante el tiempo de observación; habiéndose repetido el ensayo en este medio en tres oportunidades. Por ello se descartó la utilización de este medio para el aislamiento simultáneo de las especies de mayor interés. En el medio MSA tal como se dedujo de la figura III.1, existen velocidades de crecimiento muy diferenciadas para las distintas especies estudiadas que varían de 1.30 x lo'2 cm/h para P. cítrinum a x 10'2cm/h para A. niger (Tabla III.1). Esto también se refleja en un CV de 66.4 (Tabla III. l) y un CVR de 63.0 (Tabla III.2). Por ello, se descartó la utilización de este medio para el aislamiento simultáneo, como así también de los medios D618 y DRBC. El mejor medio de acuerdo a este criterio sería el DCPA seguido por el YGCA. En la Tabla III.3 se muestran los tiempos de diferenciación macroscópica de A. ochraceus, F. manillfonne y P. citrinum, desarrollados en los medios DCPA, D618, DRBC, MSA, OGY y YGCA, incubados a 25 C. Como puede observarse, el medio YGCA es el que permite antes una mejor diferenciación de las características macroscópicas, ya que a las 72 horas se pueden distinguir claramente las tres especies (Figura III.2). De acuerdo a estos resultados el medio YGCA se seleccionó para proceder al aislamiento de las micofloras endógena y exógena del maíz. Resultados - 127

133 Tabla III.3. Tiempo de incubación (horas) para la diferenciación macroscópica en los medios de cultivo seleccionados. Microorganismos Medios de cultivo* DCPA DGlB DRBC MSA OGY YGCA A. ochraceus F. moniliforme P. citrinum * Temperatura de incubación: 25 C Figura Ill.2. Desarrollo de A. ochraceus, F. monilifomze y P. citrinum a las 72 horas en el medio YGCA (25 C).

134 III.b. Aislamiento e identificación de las micofloras endógena y exógena Seleccionado el medio YGCA, se procedió al aislamiento en el mismo de las micofloras endógena y exógena en las 178 muestras de maíz recién cosechado en 1990, de acuerdo a las metodologías descriptas en II.b.3. Se obtuvieron 2125 aislados primarios discriminados en 1163 pertenecientes a la endomícoflora y 962 a la exomicoflora. La identificación de todos los aislados primarios se realizó siguiendo los métodos descriptos en II.b.4. Las claves de géneros y de especies dentro de los géneros, mostradas a continuación, se confeccionaron de acuerdo a las observaciones morfológicas y a las claves descriptas por Nelson y col. (1983), Fischer y col. (1982 y 1983), Pitt (1979), Ramírez (1982), Pitt y Hocking (1985), Samson (1985), Ellis (1971), Von Arx y col. (1986), Von Arx (1981) y Rifai (1969). Luego de las descripciones, se encuentran las fotografías del desarrollo de las colonias en medio YGCA a 25 C de las especies pertenecientes a los géneros de interés micotoxicológico, encontradas como contaminantes del maíz en la República Argentina. III.b.l. Claves de los principales géneros aislados en el maíz recién cosechado (1990) l. Géneros con dictiosporas (conidios con septos transversales y longitudinales) A. Conidios obscuros, rostrados, que forman cadenas Alternaria Nees AA. Conidios obscuros, esféricos, ovoides u obovoides, en racimos o solitarios B.BB. B. Conidios irregularmente septados, rugosos y en racimos Epicoccum Link Resuilados - 129

135 BB. Conidios lisos o ligeramente rugosos, comúnmente solitarios Stemphylium Wallroth Géneros con fragmosporas (conidios con septos transversales únicamente) A. Conidios hialinos en masas mucilaginosas a partir de una célula conidiógena Fusaríum Link AA. Conidios obscuros B.BB. B. Célula central del conidio más dilatada y oscura que las restantes Curvularia Boedijn BB. Célula central del conidio sin diferenciación morfológica. Célula conidiógena con anelaciones distintivas Annellophorella Subram. Género con amerosporas (conidios sin septaciones) Fialídicos A. Conidióforo ramificado, conidios usualmente verdes, en racimos Trichoderma Persoon B. Conidióforo que surge de una célula basal y que termina en una vesícula Aspergillus Link C. Conidióforos verticilados, fiálides de cuello corto. Conidios normalmente verdes Penicillium Link D. Fiálides largas y solitarias, conidios hialinos y pequeños Acremoníum Link No fialídicos A. Conidios formados por brotación, en cadenas acrópetas verde oscuro. Conidióforo con aspecto de densa ramificación arbórea Cladosporium Link B. Conidios solitarios lenticulares, con una banda subhialina marrón oscura An hrinium Kunze Resultados - 130

136 C. Conidíos solitarios negros, lenticulares y lisos Nigrospora Zimmermann D. Conidíos formados por la ruptura de las hifas (artroconidios) Geom'chum Link E. Conidíos solitarios oscuros, esféricos, producidos en una célula conidiógena corta Humicola Traaen Dentro del género Epicoccum la única especie identificada fue E. nigrum Link; en el género Curvularia fue C. lunata (Wakker) Boedjin (Fig ); en el género Trichoderma fue T. harzianum Rifai (Fig. III.4.a); en el género Claa'osporium fue C. herbarum (Pers.) Link (Fig. III.4.b); en el género Arthrínium fue A. phaeospermum (Corda) M.B. Ellis y en el género Nigrospora fue N. sphaerica (Sacc.) Mason. También se identificaron algunosaislados primarios de hongos Dematiáceos sólo a nivel de género como por ejemplo Stemphylium spp.; Annellophorella spp.; Acremonium spp. y Humicola spp. Otros hongos menos prevalentes aislados de maíz e identificados fueron Chaetomíum globosum Kunze (Fig. III.5.a) y Geotrichum candidum Link. Entre los Mucorales se identificaron a nivel de género Mucor spp.; Micromucor spp. y Martiriella spp. III.b.2. Claves de especies de los principales géneros de interés micotoxicológico III.b.2.]. Género Altemaria Ness (Fr.) A. Conidíos en cadenas largas, a veces ramificadas B.BB. B. Conidíos de pared lisa o finamente rugosa. Largo de conidio 40 um A. alternata (Fr.) Keissler (Fig. III.5.b) Resultados - 13]

137 BB. Conidios de pared gruesa y muy rugosa. Largo de conidio 50 pm Estado anamórfico Alternaria de Pleospora infectoria Fuckel AA. Conidios solitarios o en cadenas cortas. C.CC. C. Conidios de pared lisa o finamente rugosa. Largo del conidio 60 um o más. A. tenuíssima (Kunze ex Pers.) Wiltshire CC. Cadenas de dos conidios, raramente tres, de pared lisa. Largo del conidio 40 um A. radicina Meier, Drechsler & Eddy III.b.2.2. Género Fusaríum Link Clave de secciones y especies A. Microconidios presentes y abundantes B.BB. B. Macroconidios sin curvatura dorsiventrai C.CC. C. Clamidosporas presentes D.DD. D. Micelio aéreo blanco. Microconidios formados en monofiálides largas Sección Mam'ella- Vemn'cosum F. solani (Mart.) Appel & Wollenw. (Fig. III.6.a) DD. Micelio aéreo púrpura. Microconidios formados en monofiálides conas Sección Elegans F. oxysporum Schlecht (Fig. III.6.b) CC. Clamidosporas ausentes EEE. Sección Líseola E. Microconidios en cadena F.FF. Resultados - 132

138 Microconidios formados en monofiálides F. monilifonne Sheldon (Fig. III.7.a) FF. Microconidios formados en monofiálides y polifiálides F. prohferatum (Matsushima) Nirenberg (Fig. III.7.b) EE. Microconidios en falsas cabezas, producidos en monofiálides y polifiájides F. subglutínans (Wollenw. & Reinking) Nelson, Toussoun & Marasas (Fig. III.8.a) BB. Macroconidios con curvatura dorsiventral marcada. Microconidios ovales y piriformes formados en polifiálides Sección Sporom'chiella F. sporotrichioides Sherb. (Fig. III.8.b) AA. Microconidios ausentes o escasos G.GG.GGG. Macroconidios producidos en polifiálides, en el micelio aéreo y en forma de huso Sección Arthrosporíella F. semitectum Berk. & Rav. (Fig. III.9.a) GG. Macroconidios en célula apical en forma de látigo y producidos en monofiálides Sección Gibbosum F. equiseti (Corda) Lacc. (Fig. III.9.b) GGG. Macroconidios curvados y robustos H.HH. Sección Discolor Esporodoquios anaranjados. Envés de la colonia naranja claro a tostado F. heterosporum Nees (Fig. III.10.a) HH. Esporodoquios rojo-amanonados, macroconidios con los lados más paralelos. Envés de la colonia rojo-carmín F. graminearum Schwabe (Fig. III.10.b) Resultados - 133

139 III.b.2.3. Género Aspergillus Link Clave de especies Colonias marrón oscuras. Conidióforos con estípites de 1-3 mm de longitud, de paredes lisas. Vesículas esféricas, con toda la superficie fértil, con métulas y fiálides. Conidios esféricos de 4-5 im de diámetro, marrones, con paredes rugosas y a veces estriadas A. níger van Tieghem (Fig. III.ll.a) Colonias amarillo-verdoso. Conidióforos con estípites de 400 im a 1 mm de longitud, de paredes rugosas. Vesículas esféricas, con tres cuartas partes de su superficie fértil, con métulas y fiálides o sólo fiálides. Conidios esféricos o subesfén'cos de 3.5 a 5 im de diámetro, amarillo verdosos, de paredes finamente rugosas, a veces lisos A. flavus Link (Fig. III.ll.b) III.b.2.4. Género Penicillium Link Clave para los subgéneros de Penicillium Penicilios monoverticilados o que en una menor proporción tienen métulas Subgénero Aspergilloides AA. Penicilios comúnmente biverticilados o más complejos B.BB. Penicilios predominantemente biverticilados o irregularmente monoverticilados y biverticilados. Colonias en GZSN, raramente mayores a 18 mm en 7 días C.CC. BB. Penicilios predominantemente terverticilados. Colonias en G25N, raramente menores de 18 mm en 7 días Subgénero Penicillium Penicilios biverticilados o menos comúnmente terverticilados, fiálides usualmente aguzadas, fiálides terminando en cólulas apicales angostas. Colonias en G25N menores a lo mm en 7 días Subgénero Biverticillium Resultados - 134

140 CC. Penicilios biverticilados o irregularmente monoverticilados a biverticilados, fiálides ampuliformes o por lo menos con cólulas terminando en poros apicales anchos. Colonias en G25N de 9 mm o más en 7 días Subgénero Furcatum Clave para el Subgénero Aspergilloides A. Colonias que producen esclerocios abundantes P. chermesinum Biourge (Fig. III.12.a) AA. Colonias que no producen esclerocios B.BB. B. Especies con estípites vesiculados C.CC. C. Colonias de rápido crecimiento en CYA (> 30 mm en 7 días) D.DD. D. Colonia aterciopelada. Conidios globosos y lisos. Conidióforos largos P. glabrum (Wehmer) Westling (Fig. III. 12.b) DD. Colonia flocosa. Conidios lisos elípticos. Conidióforos largos. Crece a 37 C en CYA P. decumbens Thom (Fig. III.13.a) CC. Colonias de crecimiento restringido en CYA (< 30 mm en 7 días) E.EE.EEE. E. Conidióforos largos. Estn'ctamente monoverticilados. Conidios elípticos, rugosos o espinosos P. lividum Westling (Fig. III.13.b) EE. Conidióforos moderados. Estn'ctamente monoverticilados. Conidios elípticos lisos. Crece a 37 C en CYA P. implicatum Biourge (Fig. III.14.a) EEE. Conidióforoscortos, ocasionalmente ramificados. Métulas presentes. Conidios elípticos o subglobosos, lisos o finamente rugosos P. fellutanum Biourge (Fig. III.14.b) Resultados - 135

141 BB. Especies con estípites no vesiculados. Colonia flocosa de crecimiento lento. Conidíóforo corto. Conidios globosos F.FF. F. En medio CYA presenta pigmentación vinácea. No crece en CYA a 37 C y sí a 5 C P. roseo-pumureum Dierckx (Fig. lll.15.a) FF. En medio CYA no hay pigmentación. Crece en CYA a 37 C y no a S C P. restrictum Gilman & Abbott (Fig. lii.15.b) Clave para el Subgénero Biverticillium A. Especies que producen coremios o sinemas B.BB. B. Sinemas producidos a los 7 días de incubación en CYA y MEA a 25 C P. duclauxii Delacroix (Fig. III.ló.a) BB. Sinemas producidos después de una incubación más prolongada. Micelio amarillo en CYA P. dendríticum Pitt (Fig. III.16.b) AA. Especies que no producen coremios o sinemas. Colonias velutinosas, flocosas o funiculosas C.CC. C. Conidíóforos cortos, desde hifas rastreras o trenzas de hifas D.DD. D. Conidios globosos, rugosos y anchos. Penicilios compactos P. verruculosum Peyronel (Fig. III.l7.a) DD. Conidios elípticos. Colonias muy aplanadas. Conidios ligeramente rugosos P. fimiculosum Thom (Fig. Ill.l7.b) CC. Conidíóforos largos que nacen a menudo desde el sustrato. Conidios rugosos y elípticos EEE. Resultados - 136

142 E. Pígmento rojo purpúreo en CYA, soluble P. purpurogenum Stoll (Fig. III.18.a) EE. Sin pigmento púrpura. Crecimiento restringido P. rugulosum Thom (Fig. III.18.b) Clave para el Subgénero Furcatum A. Penicilíos reducidos y regulares. Predomina un verticilo terminal de métulas. Colonias en medio CYA no exceden los 35 mm en 7 días B.BB.BBB. B. Conidióforos con 2-4 métulas iguales. Conidios esféricos, comúnmente de 3-4 umde diámetro P. melim'i Thom (Fig. III.19.a) BB. Conidióforos con 3-5 métulas iguales, divergentes. Conidios esféricos a subesfén'cos de 2-3 im de diámetro. Reverso de la colonia amarillo intenso P. citrinum Thom (Fig. III.19.b) BBB. Conidióforos con 4-6 métulas comprimidas. Conidios elípticos de más de 3,5 pm de largo. Micelio amarillo P. herquei Bain & Sartory (Fig. III.20.a) AA. Penicilíos irregulares, con métulas subterminales o intercalares o producidas como verticilios terminales. Estípites rugosos y conidios espinosos que no exceden los 4 pm. Colonias en MEA no exceden 25 mm en 7 días P. nalgiovense Laxa (Fig. III.20.b) Resultados - 137

143 IÍLb 3 Desarrollo de los hongos en medio YGCA Todas las especies identificadas y pertenecientes a los géneros de interés micotoxicológico fueron cultivadas en medio YGCA e incubadas a 25 C durante 7 días. Transcurrido ese tiempo se realizó el catálogo fotográfico que se muestra a continuación En cada lámina se puede observar a la izquierda el envés de las colonias y a la derecha, la superficie de las mismas. Figura III.3. Desarrollo de Curvularia lunata en medio YGCA (25 C, 7 días). Resultados - 138

144 l: guru Desarrollo de 'I I'I'chodermaIza/zl'alzum (a) y de Cladosporíum herbarum (l)) en medio YUCA (25 C, "/'días) R(.\'llÍI(I(I(I.\' - l} 9

145 li. guru LS. Desarrollo (lo (L/luclmm'mn glubnxum tu) ) (lo : ÍL WIIUI'I'U aller/ um vn medio \'(}( _v\ (ZS C. 7 días). (h!

146 Figura III.6. Desarrollo de Fusarium solaní (a) y de F. oxysporum (b) en medio YGCA (25 C, 7 días) Resultados - 14]

147 Figura lli.7. Desarrollo ( e Fusarium moníliforme (a) y de l". pra/'[jératum (D) medio YGCA (25 C. 7 días) Html/ml.

148 Figura Ill.8. Desarrollo dc "usalium subglutinans (a) y F. sporotrichzoides (b) en medio YGCA (25 C, 7 días) R('.\'HÍ/H(ÍU.\ - JJ

149 Figura III.9. Desarrollo de Fusarium semitectum (a) y de F. equíseti (b) en medio YGCA (25 C, 7 días) Resullados - 144

150 Figura [ Desarrollo de Fusarium heterosporum (a) y de F. gramineamm (b) en medio YGCA (25 C, 7 días) Ram/lados - 145

151 Figura III.ll. Desarrollo de Aspergillus niger (a) y de A. flavus (b) en medio YGCA (25 C, 7 días) Ravullun'u; -.'.íó

152 Figura Desarrollo de Penicíllium chemzesínum (a) y (le I. glabrmn (h) en medio YGCA (25 C. 7 días) K1'.\'N/IU(/m 47

153 l iglll zl LH. Dvszu'mIIu (Iv l IIHf/N H m rli Y(}(.-\ (25 1'. 7 (lízlx)

154 Figura III.l4. Desarrollo de Penicíllíum implicatum (a) y de P. fellutanum (b) en medio YGCA (25 C, 7 días) Rl'.\'Il/I(I(Í().\' - I 4 9

155 Figura III.15. Desarrollo de Penicillíum rosca-purpureum (a) y de P. restn ctum (b) en medio YGCA (25 C, 7 días) Resultados - 150

156 Figura III.16. Desarrollo de Penicillium duclauxii (a) y de P. dendríticum (b) en medio YGCA (25 C, 7 días) Resulladox - 151

157 Figura III.l7. Desarrollo de Penicillium verruculosum (a) y de P. fum culosum (b) en medio YGCA (25 C, 7 días) Resultados - 152

158 t fïï-ïíïfiha... Figura III.18. Desarrollo de Penícillium pm'purogenum (a) y de P. rugulosum (b) en medio YGCA (25 C, 7 días) Rm'u/mdm' - 153

159 Figura III.l9. Desarrollo de l elzicíllz'ummelinii (a) y dc P. cítrinum (b) cn medio YGCA (25 C, 7 días) RUAWim/u y

160 / \ V Á /\\.) /. (. N x k A < J> Figura [ Desarrollo de Penicíllium zerqueí (u) y (lo I. nalgiovense (b) cn medio YGCA (25 C. 7 días) R(.\'H/[(Ir/r):; - 55

161 III.c. Relación entre las micofloras endógena y exógena del maíz cosechado en Una vez identificados los aislados primarios de las micofloras interna y externa, se procedió a analizar los resultados de acuerdo al número de los mismos y a las muestras contaminadas por género. En la Figura se muestra el número de aislados de los géneros más frecuentes (a) en la endomicoflora y exomicoflora y en la parte inferior de la figura (b) los géneros menos frecuentes (menos de 50 aislados). Como puede observarse el género más aislado en ambas micofloras fue Fusarium, seguido de Penicillium y, en menor grado, Aspergillus, Alternaria y Trichoderma. Entre los géneros menos frecuentes sobresalieron Cladosporium, sobre todo en la endomicoflora, seguido de los Zigomycetes, Epicoccum, Nigrospora y Curvularia. En la Figura III.22 se muestra el número de muestras contaminadas por los géneros definidos como más y menos frecuentes en la figura anterior (a y b). Se puede observar que el género Fusarium apareció en más muestras como contaminante interno, mientras que Penicillium mostró un mayor número de muestras contaminadas en la exomicoflora. Entre los géneros menos frecuentes prevaleció Cladosporium, seguido por los Zygomycetes como contaminantes externos. Cabe destacar que Cladosporium, como contaminante externo, superó a Altemaria y a Trichoderma. Se calcularon las frecuencias de aislamiento y la densidades relativas de los géneros presentes en las micofloras endógena y exógena, de acuerdo a lo descripto en el punto II.b.6. En la Figura III.23(a) se observa que la frecuencia de aislamiento prevalente fue la del género Fusaríum, seguida por la del género Penicillium en la endomicoflora. Esta relación se invirtió en la exomicoflora. Las densidades relativas del género Fusaríum, fueron tanto en la endo como en la exomicoflora supen'ores a las de Penicillíum. Se mantuvo la prevalencia de Fusarium en la micoflora endógena respecto a la exógena e inversamente para Penicillium. Resultados - 156

162 No. de alalamlentoa _ (a), Puse/ um Géneros No. de alslamlentos (b) g: Géneros Endomlcollorl i: Elomlcollon Figura Número de aislamientos de los géneros más (a) y menos (b) frecuentes de la micoflora contaminante del maíz cosechado en Resultados - 157

163 oz mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm \% oz ooooooooooooooooooooooo :8 mo. 8.5an ai m8 cua: :o aa

164 Frecuencia(%) 80" _ o.l1 A.II_ densidad relativa ( 56) [:1 Endomicoflora Género m Exomicoflora l. Alle/nana; 2, Aspergillus; 3. Claaospor/um; 4. E010000um 5. Fusarlum; 6. Nigrospora; 7. Penicillium; 8. Tu choderma Figura Frecuencias de aislamiento y densidades relativas de las micofloras interna y externa, aisladas de maiz cosechado en Argentina en Resultadox - 159

165 En la tabla III.4 se comparan las frecuencias de aislamiento y las densidades relativas de los géneros predominantes de la endo y exomicoflora asociadas a maíz recién cosechado en cinco localidades de la zona núcleo de producción de dicho cereal en Argentina. Se puede observar que Fusarium fue el género más prevalente de la micoflora interna, tanto en frecuencia de aislamiento como en densidad relativa en las cinco localidades, resultado similar al obtenido al considerar todas las muestras (Figura ).En este caso no se encontraron diferencias significativas (p = 0,09) entre las frecuencias calculadas en las diferentes localidades (no indicado en la tabla). El género Penicillium fue el componente más prevalente de la micoflora externa con respecto a la frecuencia de aislamiento en las cinco localidades (Tabla III.4), similar al caso en el que se consideraron todas las muestras (Figura ). No se detectaron diferencias significativas (p = 0.31) entre las localidades (no indicado en la tabla). Con respecto a la densidad relativa de la exomicoflora, el género Fusarium estuvo más presente que Penícillium en tres de las cinco localidades (Tabla III.4), lo que también se observó en el total (Figura ). El género Trichodenna fue aislado como componente de la endomicoflora de maiz en Chacabuco con frecuencias de aislamiento y densidades relativas notoriamente altos; siendo moderadamente altos en El Salto y Killgruman, pero ausente en las otras dos localidades (Pergamino y La Dolores). De hecho, la frecuencia de aislamiento en Chacabuco fue significativamente diferente (p < 0.05) de las otras localidades. En Pergamino y Killgruman se hallaron frecuencias de aislamiento y densidades relativas de Aspergillus más altas, tanto en la micoflora endógena como en la exógena, respecto a las otras localidades. Al analizar las frecuencias de aislamiento en la micoflora interna, se observaron diferencias significativas (p < 0.05) entre las localidades de Chacabuco y Killgruman, Pergamino y El Salto (no indicado en la tabla). Resultados - 160

166 Tabla I]].4. Frecuencias de aislamiento y densidades relativas de los géneros fúngicos prevalentes en granos de maíz cosechados en cinco localidades en n mcoflora interna M1coflora externa Género Chacabuco El Salto La Dolores Pergamino Killgruman Chacabuco El Salto La Dolores Pergamino Killgruman Fr DR Fr DR Fr DR Fr DR Fr DR Fr DR Fr DR Fr DR Fr DR Fr DR Alternaria 17,5 7,0 29,0 8,7 20,4 6,3 18,8 6,7 10,0 2,8 12,5 2,9 6,5 2,2 16,3 4,0 4,2 0,8 Aspergillus 5,0* 1,9 29,0 10,3 20,4 4,7 43,8 21,5 40,0 27,8 30,0* 9,0 16,1 4,3 38,8 10,2 37,5 16,3 40,0 Fusarium 65,0 47,1 77,4 51,1 91,8* 65,4** 79,2 51,9 50,0 38,9 77,5 44,3 64,5 43,9 71,4 32,7 * 52,1* 33,8 60,0 Penicillíum 22,5' 16,6 45,2 21,2 44,9i 13,7 47,9 13,9 30,0 27,7 80,0' 27,9 74,2 43,2 79,6' 38,6 62,5 30,0 70,0 Trichoderma 30,0. 22,3** 9,7 3,8-10,0 2,8 2,5* 2,1" 3,2 1,4 10,2 6,2 12,5 10,0 Total de aislamientos Número de muestras B Fr: Frequencia de aislamiento (%) DR: Densidad relativa (%) Frecuencias entre las micoflotas interna yexterna difieren significativamente (p< 0.0 ) "Densidades relativas entre las micofiom interna y externa dificrcn significativamente (p< 0.0 ) Resultados - 161

167 En la Tabla III.S se puede observar el porcentaje de granos infectados (micoflora interna) y los propágulos por gramo (micoflora externa) de los géneros de Deuteromycetes más prevalentes. Tabla III.5. Micofloras interna y externa prevalentes en el maíz recién cosechado en Argentina en GENERO Endomicoflora Exomicoflora (%granos infectados) (Propágulos/g x 1000) Sobre el Sobre Sobre el Sobre total* muestras total* muestras infectadas** infectadas** Alternaria 0,9 4,7 0,1 1,3 Aspergillus 1,6 6,1 0,6 1,7 Fusarium 7,6 9,8 1,9 3,0 Penicillium 2,2 5,4 1,8 2,5 Trichoderma 0,6 5,9 0,3 3,7 promedio basado en 80l0 granos de las 178 muestras promedio basado sólo en las muestras infectadas Los valores de incidencia de Fusarium en base al total de granos plaqueados (8010) de las 178 muestras, fueron los más altos con respecto a la endomicoflora como también con respecto a la exomicoflora, expresado en número de propágulos por gramo. El segundo género más prevalente, tanto en endo como en exomicoflora, fue Penicillíum, seguido por Aspergillus. Estos resultados indican que el tipo de contaminación fúngica de los granos de maíz argentino, en cuanto a géneros más frecuentes, fue cualitativamente similar a lo observado en otros países productores de maíz (Tabla III.6) como Sudáfrica (Marasas y col., 1979b, 1981, 1988; Marasas y van Rensburg, 1986; Rheeder y col., 1990), Estados Unidos (Tuite, 1961; Hesseltine y col., 1981) y Australia (Blaney y col., 1986). Resultados - 162

168 OUO NOOO Tabla III.6. Género Alternaria Géneros prevalentes de la micoflora endógena del maíz recién cosechado en Sudáfrica, Btados Unidos y Australia. 0 1 (b) 0 1 (C) %de granos infectados (sobre el total de granos),o 3 (f )*,3 (f),8 (f) Aspergillus 0,1 (b) I 2 0,3 (b) I 0,2 (c) l 0,1 (d) h I 0,4 (d) oooouo Fusarium 20,1 (a) (f)* 43,0 (h) Penicillium (f)* 5,5 (h) Trichoderma (b) 0,4 (g).2,0 (h) PAIS Sudáfrica EE.UU. Australia * Cosecha año (a) Marasas y col., l979b; (b) Marasas y col., 1981; (c) Marasas y van Rensburg, 1986; (d) Marasas y col., 1988; (e) Rheeder y col., 1990; (t) Tuite, 1961; (g) Hesseltine y col., 1981; (h) Blaney y col., Los niveles de contaminación fúngica en las muestras cosechadas en 1990 en Argentina fueron menores que los citados en esos países, con excepción del año 1956 en Indiana, Estados Unidos (Tuite, 1961), como se aprecia en la comparación de las tablas III.5 y Resultados - 163

169 En la Tabla III.7 se muestran los géneros menos prevalentes encontrados en este trabajo en 1990 y los hallados en la literatura arriba mencionada. De los géneros que figuran en esta tabla, sólo Diplodia se ha manifestado en Sudáfn'ca como género prevalente en algunos años (Rheeder y col., 1990). Tabla III.7. Géneros menos frecuentes aislados en la endomicoflora del maíz en la zona núcleo (1990) y en Sudáfrica, Estados Unidos y Australia. Argentina Sudáfrica Estados Unidos Australia (1990) (alblcldle) (frg) (h) Acremonium Acremoniella Acremonium Acremonium Annellophorella Acremonium Cladosporium Curvularia Arthrinium Botryosphaeria Diplodia Dreschlera Bipolaris Chaetomium Helminthosporium Nigrospora (= Dreschlera) Colletotrichum Mucor Rhizoctonia Cladosporium Diplodia Nigrospora Chaetomium Dreschlera Rhizopus Curvularia Epiccocum Epiccocum Gabarnaudia Geotrichum Geotrichum Humicola Gonatobotrys Mucorales* Lasiodiplodia Nigrospora Stemphylium Macrophomina Mucorales Neocosmospora Nigrospora Paecilomyces Pestalotia Phoma Phomopsis Rhizoctonia * Micromucor, Mortierella, Mucor. (a) Marasas y col., l979b; (b) Marasas y col., 1981; (c) Marasas y van Rensburg, 1986; (d) Marasas y col., 1988; (e) Rheeder y co]., 1990; (t) Tuite, 1961; (g) Hesseltine y col., 1981; (h) Blaney y col., Comparando los datos obtenidos en la cosecha 1990 con las de otros países (Tabla III.7), cabe destacar dueacremonium y Nígrospora se encontraron sobre el maíz en todos los casos, mientras que Annellophorella, Arthrinium, Humicola y Stemphylium sólo se aíslaron en la zona núcleo de Argentina. Los otros géneros encontrados en la misma región se encuentran también en por lo menos otro de los países citados. Los Resultados - [64

170 datos de Australia corresponden a un año y una región (Queensland), los de Estados Unidos a cuatro años y dos regiones (Indiana y North Carolina); mientras que la información de Sudáfrica refleja observaciones de van'os años y de distintas localidades (incluyendo Transkei), lo que podría explicar la diversidad de géneros aislados sobre el maíz en ese país. En la Tabla III.8 se dan los valores de incidencia de las especies de Fusarium aisladas en granos de maíz recién cosechado. Se observa que al considerar las frecuencias de aislamiento y las densidades relativas, F. monillforme (Sección Liseola) fue por mucho la especie más aislada tanto en la micoflora endógena como en la exógena. Una situación similar fue observada en 25 muestras de maíz recién cosechado en Río Cuarto (Córdoba) por Bertinetti (1988) y por Neira (1992) en 30 muestras de maíz de la misma localidad. En la zona centro-norte de la provincia de Santa Fe, Saubois y Piontelli (1994) observaron que F. moniliforme fue la especie prevalente (52,6%) en 38 muestras de maíz recién cosechado. El predominio de F. monillforme como un contaminante endógeno en granos de híbridos comerciales de maíz, también se ha observado en otros países productores de maíz, como Sudáfrica (Marasas y col., l979b, 1981, 1988; Marasas y van Rensburg, 1986), Australia (Blaney y col., 1986) e Italia (Logrieco y Bottalico, 1988). Otras dos especies de Fusarium de la Sección Liseola, también aisladas como componentes de las micofloras endógena y exógena, fueron F. proliferatum y F. subglutínans. Los aislados de F. proliferatum se diferenciaron de los de F. moniliforme por la presencia de polifiálides en el primero y la ausencia en el segundo (Nelson y col., 1983); observaciones que fueron confirmadas utilizando agar agua con 4 g/l de KCl (Fischer y col., 1983). Resultados - [65

171 Tabla III.8. Especies prevalentes del género Fusarium aislados del maíz recién cosechado en Argentina en Micoflora interna Hicoflora externa Especies N9 de Fr DR N9 de Fr DR aislados (t) (t) aislados (%) (t) Sección Liseola _F. moniliforme S38 75,8* 88, ,9* 92,4 F. proliferatum 33 14,0 5,4 14 6,7 3,9 F. subglutinans 7 3,9 1,2 7 3,9 2,0 Sección Elegans F. oxysporum 4 1,1 0,7 S 2,8 1,4 Sección Discolor F graminearum 28 6,2* 4,6 r - - Fr: frecuencia de aislamiento DR: densidad relativa * Frecuencias entre las micofioras interna y externa difieren significativamente (p < 0,01) ** Densidades relativas entre las micofloras interna y externa difieren significativament (p < 0,01) La especie F. subglutinam estuvo presente en bajos niveles como contaminante del maíz cosechado en Argentina en Este hongo es conocido por ser una especie patógena de semilla en maíz en países como Sudáfrica (Marasas y col., l979c; Rheeder y col., 1990), donde se encuentra ampliamente distn'buído. Otra especie de Fusarium presente en bajos niveles de incidencia tanto interna como externamente fue F. oxysporum (Sección Elegans). La especie F. graminearum (Sección Discolor), que es un conocido patógeno de la espiga del maíz, fue aislada solamente como contaminante endógeno y con bajos niveles de frecuencia de aislamientos y densidad relativa. Además se aislaron, en menor número, otras especies de Fusarium como contaminantes endógenos: F. sporotrichioides (5 aislados), F. semitectum (7 aislados), F. equiseti (l aislado), F. heterosporum (l aislado) y F. solani (2 aislados). Rauhmúu-lóó

172 Entre las especies de Penicíllium aisladas de los granos de maíz recién cosechado en Argentina, P. decumbens fue la especie predominante tanto interna como externamente, seguido por P.fimiculosum, P. chermesinum, P. citrinum y P. duclauxíí como se muestra en la Tabla III.9. Asimismo, puede observarse que el número de aislados de cada una de esas especies de Penicillium fue mayor en la micofiora externa que en la interna; contrariamente a lo hallado con P. duclauxií donde el número de aislados de la endomicoflora superó a los de la exomicoflora. Tabla III.9. Especies del género Penicíllíum aisladas del maíz recién cosechado en Argentina en Especies Micoflora interna Micoflora externa N9 de Fr DR N9 de Fr DR aislados (%) (%) aislados (t) (%) P. decumbens ,5* 60,1** ,8* 45,4** P. funiculosum 12 4,S* 7,1** 53 21,9* 16,4** P. chermesinum 22 6,7* 13, ,2* 13,0 P. citrinum 4 2,2* 2,4** 29 l3,5* 9,0** P. duclauxii 17 5,6 10,1** 2 1,1 0,6** P. fellutanum 1 0,6 0,6 5 2,2 1,5 P. herquei 3 0,6 1,8 - - P. implicatum 5 2,8 3,0 1 0,6 0,3 P. verruculosum 3 1,1 1,8 5 2,2 1,5 P. dendríticum ,2 1,2 P. melinii ,8 1,9 P. glabrum ,7 0,9 P. restrictum ,6 0,3 P. lividum ,4 1,9 P. nalgiovense ,6 0,3 P. purpurogenum ,1 0,6** P. roseopurpureum S 2,2 1,5 P. rubrum S,1* 3,1 P. rugulosum ,1 0,6** Fr: Frecuencia de aislamiento DR: Densidad relativa * La frecuencia entre las micofloras interna y externa difiere significativamente (p < 0,01) La densidad relativa entre las micofloras interna y externa difiere significativamente (p < 0,01) Resultados - 167

173 Hesseltine y col. (1981), encontraron que el 28,6% de los granos de muestras de maíz cosechado en Carolina del Norte (Estados Unidos) estaban infectados con especies de Penicillium y un 1,6% de los mismos con P. fimiculosum. En el maíz cosechado en Argentina durante 1990, el 2,16% de los granos fue infectado internamente con especies de Penicillium (Tabla III.5) y un 0,15% por P. fixniculosum. En el sudeste de los Estados Unidos, P. fimículosum, P. purpurogenum y P. citrinum han sido hallados como contaminantes característicos en la colonización de maíz antes de la cosecha (Mislivec y Tuite, 1970). También Jimínez y col. (1985) observaron una situación similar en España para la especie P. purpurogenum. Como se observa en la Tabla III.9 esta especie no se halló como contaminante endógeno y sólo se aislaron dos cepas en la exomicoflora en ese año. En la Tabla III. lose muestra la incidencia de las especies del género Alternaria en el maíz recién cosechado en Argentina. La especie que predominó tanto interna como externamente fue A. alternata. Esta especie es uno de los contaminantes ambientales más comunes que pueden colonizar cultivos de cereal, tales como el maíz, pudiendo ocurrir una penetración subepidérmica del hongo en el grano. En este estudio, de hecho, las especies de Altemaria fueron más frecuentemente aisladas en la endomicoflora que en la exomicoflora (Figura ). Lacey y Magan (1991) señalaron que A. alternata aparece en conjunto con otras especies del género, incluyendo el estado anamórfico (Alternaria) de Pleospora infecton'a, la cual sería referida como A. tenuíssima en algunas publicaciones. En este estudio también se hallaron dos aislados de A. radicina en el maíz argentino (Tabla III. lo). La especie del género Aspergillus más aislada tanto interna como externamente fue A. flavus, como se muestra en la Tabla III.ll. Este hongo fue aislado como contaminante interno del 1,35% de los granos de maíz en 21,35% de las muestras. La otra especie encontrada en este trabajo fue A. niger, el cual se aisló del 0,24% de los granos de maíz, con una frecuencia de 8,43%. Hesseltine y col. (1981) hallaron en Resultados - [68

174 maíz cosechado en Carolina del Norte (Estados Unidos) que A. flavus y A. níger infectaron en mayor proporción (34,8% y 10,9% de los granos, respectivamente) que los encontrados en las muestras de maíz analizadas en la zona núcleo argentina. Tabla III.10. Especies del género Altemaria aisladas de maíz recién cosechado en Argentina en Especies Micoflora interna Hicoflora externa N9 de Fr DR N9 de Fr DR aislados (%) (8) aislados (%) (%) A.a1ternata ,0* 91,9** 19 88,2* 82,6** A.tenuissima 3 5,7 4,1 1 5,9 4,4 A.radicina 2 2,9 2,7 - - Anamorfo de Pleospora infectoria 1 2,9 1,4** 2 5,9 8,7** Fr: Frecuencia de aislamiento DR: Densidad relativa * La frecuencia entre las micofioras interna y externa difiere significativamente (p < 0,01) La densidad relativa entre las micofioras interna y externa difiere significativamente (p < 0,01) Tabla III.ll. Especies de Aspergillus aisladas de maíz recién cosechado Argentina en Micoflora interna Micoflora externa Especies N9 de Fr DR N9 de Fr DR aislados (t) (3) aislados (%) (t) A. flavus ,4 85,0* 67 24,7 67,7* A. niger 19 8,4 15,0* 32 11,2 32,3* Fr: Frecuencia de aislamiento DR: Densidad relativa * La frecuencia entre las micofioras interna y externa difiere significativamente (p < 0,01) La densidad relativa entre las micofloras interna y externa difiere significativamente (p < 0,01) Resuhadox- 169

175 Otras especies identificadas en este trabajo fueron Epiccocum nigrum, Curvularia lunata, Trichoderma harzianum, Cladosporíum herbarum, Arthrim'um phaeospermum, Nigrospora sphaerica, Chaetomiumglobosumy Geom'chum candídum. Cabe destacar que N. sphaerica, que es unaespecie involucrada en podredumbre de las espigas, fue aislada en menor frecuencia que la observada en Sudáfrica (Rheeder y col., 1990) y Australia (Blaney y col., 1986). Por otra parte, entre los géneros citados como contaminantes del maíz en otros países productores de este cereal, se encuentra Díplodia. En Sudáfrica, Diplodía maydis se ha asociado a brotes de una micotoxicosis conocida como diplodiosis, que afecta al ganado vacuno y ovino (Rheeder y col., 1990). El género Diplodia está asociado a podredumbre de las espigas pero no fue observado en el maíz recién cosechado en la zona núcleo en Argentina en 1990, ni en los estudios realizados por Etcheverry (1982), Bertinetti (1988), Neira (1992) y Saubois y Piontelli (1994). Ante consultas realizadas sobre este particular, el Ing. Agrón. Eduardo Teyssandier, quien se desempeña como fitopatólogo de la Planta de Semillas de Cargill en Pergamino, plantea que especies del género Diplodia se consideran patógenas de espigas de relativa importancia, sólo en temporadas secas en algunas localidades, citando como ejemplo Río Cuarto en la provincia de Córdoba. Para analizar la probabilidad de que este patógeno se encontrara también en la zona núcleo de producción en Argentina, se seleccionó una localidad que durante 1991 presentara una menor precipitación, la cual resultó ser Pergamino, de donde se obtuvieron las muestras para estudiar la micoflora. Resultados - 170

176 Ill.d. Análisis de la micoflora endógena del maíz cosechado en Pergamino en 1991 En el año 1991, se realizó un análisis de la endomicoflora contaminante en muestras de maíz tomadas al azar de lotes visiblemente afectados por mohos, en Pergamino. El aislamiento e identificación de los aislados primarios fueron realizados de acuerdo a las metodologías empleadas para la endomicoflora de la cosecha de 1990 (puntos II.b.3 y II.b.4). En las figuras III.24 a III.28 se observa la contaminación visible por mohos en las mazorcas y el desarrollo de los hongos prevalentes en cada espiga, en medio YGCA e incubados a 25 C durante 7 días. Frecuentemente, durante las observaciones hechas a campo, se asigna a una fusariosis la apariencia enmohecida de estas mazorcas, sin embargo, como se observa, pueden estar implicadas especies de hongos de generos distintos a Fusarium. Figura [ Desarrollo de la endomicoflora en granos de maíz visiblemente atacados por mohos (Pergamino, 1991). Mazorca l: F. moniliforme, F. lateritium y F. graminearum. Resulta/( v - 171

177 Figura.25. Desarrollo (lo lu An(lnnnml'lnm cu granos.rlc (nui): visibll-zm-nhubicados por nolms (I u gmninn. [991). \I2l'/.()I C}l2A: F. gmmíncurum, Í". riiruií/íl'u/me. l. /}I/II'(,'1//r).\/HN Hu v'ux. \[}IZ(H ( 2I2B: Dip/mlíu "(UI/lx.

178 Figura {[1.26. Desarrollo de la cmlmnicol'lom en granos dc maíz a'ss'ihlozn-zmls atacados por :nuhns (I crgmninn, i991). Mazorcn 3: F. now/ [arma la grammearum _\.s phaerlca... Humrvn 4: dl'uiarm sp )., F. grammcamm y Í'. nmm/i/m'me.

179 v 1*. A AA rav" w'/v fr o). _y A. s Figura III.27. Desarrollo de la endomicoflora en granos de maíz visiblemente atacados por mohos (Pergamino, 1991). Mazorca 5: F. monilzforme y P. fum culosum. Mazorca 6: F. proliferatum, F. moniliforme y P. funículosum.

180 Figura Desarrollo de la endomicoflora en granos de maíz visiblemente atacados por mohos (Pergamino, 1991). Mazorca 7: F. moniliforme, D. maydis y F. graminearum. Mazorca 9: F. graminearum y F. monílíforme.

181 En la Tabla III.12 se observa el número de aislados, la frecuencia de aislamiento y la densidad relativa de los géneros encontrados en ll muestras de maíz de Pergamino (1991). Tabla III. 12. Número de aislados, frecuencia de aislamiento (Fr) y densidad relativa (DR) de los géneros contaminantes en el maíz cosechado en Pergamino en Género N9 de aislados Fr 1 51 Fusarium 909 Ovularia Penicillium Se puede ver claramente que el género Fusaríum fue el más predominante si consideramos todas las muestras, similar a lo ocurrido en Le siguen en importancia los géneros Penicillium y Diplodia. La detección de Díplodia confirma la factibilidad de aparición de este género en la zona núcleo. Teniendo en cuenta los mohos que están involucrados en la podredumbre de las espigas, se observa una mayor frecuencia de aislamiento y densidad relativa de Nígrospora (N. sphaerica) en 1991 respecto a 1990, donde la frecuencia de aislamiento fue de 4,5 y la densidad relativa de 0,9. En 1991, se identificaron aislados pertenecientes al género Ovularia, del cual no se encontró información bibliográfica sobre su aparición en el maíz en otros países productores (Figura ,Mazorca 4). Resultados - 176

182 En la Tabla III. 13 se dan los valores de incidencia de las especies de Fusaríum aislados de los granos de maíz cosechado en Pergamino en Se puede observar que F. monilrforme fue la especie más aislada en la micoflora endógena al considerar las frecuencias de aislamiento y las densidades relativas, como también se vio en Tabla III. 13. Especies del género Fusarium pertenecientes a la endomicoflora de maíz cosechado en Pergamino en Especies N9 de aislados Fr (%) DR (%) Sección Discolor F. graminearum ,6 28,5 Sección Lateritium F. lateritium 24 9,1 2,6 Sección Liseola F. moniliforme F. proliferatum ,0 18,2 60,0 8,9 Fr: frecuencia de aislamiento DR: densidad relativa Comparando con la incidencia de F. graminearum en 1990 (Fr = 6,2% y DR = 4,6), en 1991 se observa un aumento significativo de esta especie en el maíz proveniente de Pergamino. En 1988, Abbas y col. aislaron e identificaron cepas de Fusarium a partir de mazorcas con ataque visible de mohos, en el estado de Minnesota, Estados Unidos. La especie predominante fue F. subglutinans (DR = 28,0%), seguida por F. graminearum (DR = 25,0%), F._monilzforme (DR = 23,5%), F. proliferatum (DR = 13,5%) y F. oxysporum (DR = 10,0%). La DR de F. graminearum es similar a la obtenida en Pergamino en 1991, pero existe una notable diferencia en cuanto a la presencia de F. moniliforme, que fue predominante en 1990 y 1991 en Argentina, respecto a lo observado por Abbas y col. (1988). Resultados - 177

183 acumuladas (mm) 'ms La única especie del género Penicillium que se identificó fue P. funiculosum y el único aislado del género Aspergillus correspondió a A. flavus. Geotrichum identificada fue G. candidum. La especie de Los aislados de Diplodia identificados, en Pergamino en 1991, correspondieron a D. maydis, mientras que en Sudáfrica se aisló además de este especie a D. macrocarpa (Marasas y van Rensburg, 1986). Para analizar la hipótesis que la presencia de Diplodz'a se manifiesta en "zonas secas" (comunicación personal del Ing. Teyssandier), se recolectaron observaciones de lluvia en las localidades muestreadas en 1990 y La lluvia acumulada en todas las zonas estudiadas en la campaña maicera de y la de la zona de Pergamino de la campaña , se encuentran en la Figura III /90 ':ll '.r'.lm:.vn Figura III.29. Lluvia acumulada en las localidadesdela zona núcleo de producción de maíz muestradas en 1990 y Raul/(«lux - 178

184 Como puede observarse en el período 89/90, para todas las localidades, los valores de lluvia acumulados entre siembra y cosecha, variaron de 950 a 1050 mm, mientras que en la campaña 90/91 en Pergamino, la lluvia acumulada fue menor a 800 mm. En Sudáfrica, el total de lluvias acumuladas desde setiembre hasta febrero, en una región donde se aísla frecuentemente D. maydis (Marasas y van Rensburg, 1986), entre 1974 y 1982 osciló de 410,3 a 525,8 mm. La ausencia de aislados de los géneros Alternaria y Trichoderma en el maíz de Pergamino en 1991 respecto a 1990 en la zona núcleo, puede deberse también a la disminución de lluvias observadas entre estos dos años, ya que estos mohos tienen mayores requerimientos de agua disponible. El maíz puede ser colonizado endógenamente por hongos como D. maya'is, desde el momento mismo de la antesis, la cual en la principal zona de cultivo de la Argentina, se produce a comienzos de diciembre. En la Figura III.30 se puede observar que comparando los milímetros de lluvia caída mensualmente, en las campañas 89/90 para todas las localidades y 90/91 para Pergamino, a partir de diciembre los milímetros caídos en Pergamino en el período 90/91 fueron menores a los de las demás localidades en la campaña precedente. Este análisis permite suponer que la menor precipitación acumulada en Pergamino en 1991, podría explicar la aparición de D. maydis en esa zona y sería interesante conocer los requerimientos de agua biológicamente disponible de este género y la relación entre la presencia de Díplodia y el estrés hídrico, al que puede estar sometido el maíz, desde el momento de la antesis hasta la cosecha. Por otra parte, la aparición en el maíz cosechado en 1990 y en 1991 de especies potencialmente toxicogénicas, tales como F. monihforme, F. proliferatum, F. gramínearum, A. flavus, P. citrínum y A. alternata, entre otros, genera la necesidad de conocer si las mismas son capaces de producir micotoxinas y así establecer líneas adecuadas de acción con el fin de preservar la salud de la población y los mercados de exportación. Resultados" - l 79

185 [-0-1Pergamlno +Killgrurnan +Chacabuoo -o-salto +Doloras Pemamino 91 + sept oct dlc feb nov abr ene mar may ,3. ("lll-l) MAÑ O v Figura [ Lluvias mensuales las distintas localidades muestreadas lazona maicera núcleo lacampaña 1989/90yen Pergamino el período 1990/91. Resultados - 180

186 lll.e. Capacidad toxicogénica Ill.e.l. Producción de alternariol (AOH) y alternnriol nonometil eter (AME) La presencia de especies de Alternaria y la aparición de sus metabolitos tóxicos en cereales (sorgo, trigo, avena, cebada, centeno y arroz), ha sido señalada en la literatura (Sauer y col., 1978; Logrieco y col., 1990). Para estudiar la capacidad de producir AOH y AME por cepas de especies del género Altemaria aisladas de maíz en Argentina, se analizaron 87 aislados de A. alternata, 4 de A. tenuissima, 2 de A. radicina y 3 aislados del estado anamórfico en Alternaria de Pleospora infectoria, a fin de determinar su potencial toxicogénico en maíz y arroz. Las cepas fueron incubadas según lo descripto en II.b.7.l y una vez transcurrido el período de incubación se analizaron los cultivos según la metodologia expuesta en li.b.7.2. En la Figura IlI.3l se puede observar que del total de aislados del género Alternaría estudiados (96), solamente los pertenecientes a la especie A. alrernata (90,6%), mostraron capacidad toxicogénica en un 32,2% de los mismos. En trabajos hallados en bibliografía (Logrieco y col., 1990; Zajkowski y col., 1991; Visconti y col., 1992) el.porcentaje de cepas de A. alternata toxicogénicas, en todos los casos fue superior al 90%. Respecto a otras especies de Alternaria, Bilgrami y col. (1994) informaron que una de dos cepas de A. tenuiss'íma estudiadas, produjo AOH y AME en arroz (3 semanas de incubación a temperatura ambiente) y que en un aislado de A. radicina no se detectó producción de estos metabolitos en igualdad de condiciones. Los resultados de la producción de AOH y AME en maíz y arroz por cepas de A. alternata que mostraron capacidad toxicogénica se encuentran en la Tabla lll. 14. Se puede observar que utilizando maíz como sustrato, 21 de 28 aislados produjeron AOH y AME, mientras que en arroz 23 de 28 cepas produjeron AOH y 22 de 28, AMB. Resullados - 181

187 -... ñ.,_..._.. mxjoogénicas alternata Altemaria 32,2% Alternaria spp (ahamorfo radtcinq EIA. ze ïiiü'nïá infecloria) de Pleospora cosechado laen principal recién maíz Alternan a, aisladas de elen género toxicogénicas Porcentaje decepas zona [ Figura argentina maicera Resultados - 182

188 md- OONU CDN ZHHHUHHHNÚN issás sáás ÚÚQNOWQU ÚO ZUHOUHHO Uássásss 222 UUU 222 UUU OHMHHZOOHUOUHN ZONZHZZOHUHHHZuHHNOZHZOUHl- H OUNHMUMHNUOUHM Ná ásáássásssá uuxouwmxo UUNUUUOONUUUUU El método de análisis descripto en II.b.7.2, presenta para el caso del maíz recuperaciones de 92% para AOH y 85% para AME (utilizando 0,5 mg/kg de cada toxina). En el maíz utilizado como sustrato no se detectó previamente presencia de AOH ni de AME. Tabla III.14. Producción de AOH y AME por cepas de Alternan'a alternata aisladas de maíz recién cosechado en Argentina. CIM N9 AOH(mg/kg) AOH(mg/kg) AME(mg/kg) AME(mg/kg) maíz arroz maíz arroz U q. to s) u zohzozzoohhhhzhonoozhzonhohhus.u. CIM: Centro de Investigación en Micotoxinas ND: no detectado. Las concentraciones de AOH en las cepas positivas, van'aron entre 0,3 y 2,1 mg/kg en maíz y entre 0,4 y 9,9 mg/kg en arroz. Con respecto a la producción de AME en las cepas, el rango osciló entre 0,3 y 3,3 mg/kg tanto en maíz como en arroz. Resultados - [83

189 8.., ,, ,.. l. V... En la Figura III.32 se encuentran los boxplots de la producción de AOH y AME en maíz y arroz. En base a lo observado en este gráfico, los datos de producción de AOH y AME en ambos sustratos se examinaron para establecer si los mismos tenían una distribución normal. Cotejando los valores del estadístico del test utilizado (Wilk Shapiro) en tablas (Shapiro y Francia, 1972), se vio que no mostraban una distribución normal, razón por la cual se procedió a realizar el test para dos muestras apareadas (Test no paramétrico de Wilcoxon). Para el caso de AOH en maíz y en arroz, se rechazó la hipótesis de igualdad de las medianas (p < 0,01), mientras que para la producción de AME no se rechazó dicha hipótesis (p = 0,20). Tampoco se rechazó la hipótesis de la igualdad de las medianas cuando se compararon las dos toxinas en arroz (p = 0,5390), en cambio esa hipótesis se rechazó en maíz (p < 0,05). En la Tabla III.15 se encuentran resumidos los valores estadísticos descriptivos de la producción de AOH y AME en los dos sustratos. 10 U LI.) 2 <o 6- :1: O < U 'U DD.54 Fo E 2 o 1 J..._ AMEA AMEM AOHA Figura III.32. Boxplots de la producción de AOH y AME en arroz (AOHA y AMEA) y en maíz (AOHM y AMEM). Resultados - 184

190 Tabla III.15. Valores estadísticos de la producción de AOH y AME en maíz y arroz. " Valores ROE en maíz AMEen maíz A08 en arroz AMEen arroz " N Media 0,7714 1,1000 1,9464 1,5964 Sx 0,6318 0,9914 1,9832 1,2854 Mínimo 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 Mediana 0,7500 1,0000 1,9000 1,3000 Máximo 2,1000 3,3000 9,9000 3,3000 MAD 0,4500 0,6000 1,1500 1,1500 N: número de determinaciones Sx: desviación estándar MAD: desviación mediana absoluta En la Tabla III. 16 se encuentran los valores del análisis estadístico descriptivo de los datos recopilados en la bibliografía. En todos los aislados de A. alternata obtenidos de cereales de grano fino en países de la cuenca del Mediterráneo, Logrieco y col. (1990) no encontraron relación alguna entre el origen de las cepas y el tipo y cantidad de micotoxinas producidas. Tampoco observaron que las cepas que producían niveles altos de una micotoxina, necesariamente produjeron altas concentraciones de la otra, resultado similar al observado en este trabajo. Sin embargo, al comparar la influencia del sustrato, hallaron que sobre 5 cepas de A. alternata, 4 producían más AOH y AME en arroz que cuando se cultivaban en trigo, mientras que otra se comportaba en sentido inverso. En este trabajo es la primera vez que se observa que cepas de A. alternata aisladas de maíz recién cosechado en Argentina, fueron capaces de producir AOl-l y AME. A pesar que la especie de Alternaria más predominante fue A. alternata en el maíz cosechado en la zona núcleo en 1990, y de acuerdo a los resultados de producción de AOH y AME de esas cepas (Tabla III. 14), los niveles producidos por las mismas fueron menores a los observados en otras cepas de la misma especie (Tabla III. 16) en otros países. Resultados - 185

191 En un trabajo realizado por Chulze y col. (1994), en cepas aisladas de girasol, también se observaron niveles de producción bajos, similares a los de este trabajo. Tabla III. 16. Valores estadísticos de la producción de AOH y AME, en diferentes sustratos, hallados en bibliografía. - L L Logrieco y col. (1990) Zajkowski y col. (1991) Visconti y col. (1992) Arroz Trigo Trigo Arroz N Media 69,200 32, ,81 77,327 Sx 29,064 39, ,2 83,860 Minimo 47,000 6, ,000 0,0000 Mediana 62,000 14, ,00 50,000 Máximo 118,00 100, ,0 200,00 MAD 14,000 8, ,00 49,400 - L L Logrieco y col. (1990) Zajkowski y col. (1991) Visconti y col. (1992) Arroz Trigo Trigo Arroz N Media 25,200 22, ,1 66,418 Sx 16,754 27, ,0 75,383 Minimo 7,0000 2, ,00 0,0000 Mediana 20,000 13, ,00 50,000 Máximo 52,000 71, ,0 200,00 MAD 8,0000 4, ,50 49,400 AOH AMB N: número de determinaciones Sx: desviación estándar MAD: desviación mediana absoluta Hasta el presente no han sido analizadas muestras de maíz para determinar la ocurrencia natural de AOH y AME en este cereal, pero los resultados obtenidos en este parecerian indicar una baja probabilidad de incidencia de AOH y AME en maíz. Resulludox - 86

192 III.e.2. Producción de aflatoxinas (AF) Al analizar la micoflora contaminante del maíz recién cosechado en Argentina (III.c), se observó que dentro del género Aspergillus, A. flavus era la especie predominante. Esta especie que ha sido encontrada contaminando el maíz antes de la cosecha; es un hongo considerado como un saprófito de espigas de menor importancia que no despertó una gran preocupación hasta que se descubrió que producía aflatoxinas (Payne y col., 1988). Asimismo, se detectó que algunas cepas de A.flavus aisladas de maíz producían esclerocios. Estas estructuras fueron observadas a los 21 días de incubación a 25 C en medio MEA. La presencia de aflatoxinas y de micotoxinas tremorgénicas en los esclerocios de Aspergillus flavus ha sido interpretada como un medio de defensa química contra potenciales predadores (Wicklow y Donahue, 1984; Wicklow, 1988). A su vez, los esclerocios son importantes estructuras para la supervivencia fúngica, y participan en el ciclo de vida de A.flavus como fuente de inóculo pn'mario (I.d.3), por lo cual constituyen una característica relevante cuando A. flavus coloniza cereales y oleaginosas en la etapa precosecha. El objetivo de esta parte del trabajo, fue estudiar la capacidad de producir aflatoxinas y la formación de esclerocios por las cepas de A. flavus, aisladas de maíz en la zona maicera argentina. Se eligieron al azar 34 cepas, de entre los aislados obtenidos y se incubaron según lo descripto en el punto II.b.7.l. Una vez transcurrido el pen odo de incubación se analizaron los cultivos de acuerdo a la metodología descripta en el punto II.b.7.2. Con respecto a los esclerocios, se categorizó la formación de los mismos en MEA, de la siguiente manera: (-) no produce esclerocios; (+) < 50% de la colonia produce esclerocios; (++) 50% de la colonia produce esclerocios; (+ ++) > 75% de la colonia produce esclerocios. En la Figura III.33 se observan los ejemplos extremos de esta categorización. Resultados - 187

193 Figura Formación de esclerocios en MEA por cepas de A. flavus. l(-): colonia completamente esporulada (conidios); 2(+ + +): la esporulación prácticamente está reemplazada por los esclerocios. Resultados - 88

194 El maíz utilizado como sustrato fue analizado previamente y no se detectó presencia de aflatoxinas en el mismo. En estas condiciones de incubación y utilizando ese maíz como sustrato, los resultados del análisis de aflatoxinas mostraron que las cepas sólo produjeron AFBl. En la tabla III. 17 se pueden observar los niveles de concentración de AFBl producidos y la presencia de esclerocios. Tabla III.l7. Producción de AFBl y formación de esclerocios en cepas de A. flavus aisladas de maíz recién cosechado en Argentina. CIM N9 AFBl Esclerocios CIMN2 AFBl Esclerocios CIM: Centro de Investigación en Micotoxinas. ND: No detectado. Con respecto a la formación de esclerocios, puede observarse que el 38,2% de las cepas, identificadas como A.flavus, producían esclerocios en distinta cantidad. Un Resultados - 189

195 11,8% produjeron esclerocios en menos del 50% de la colonia, un 14,7% lo hacían en el 50%, mientras que 11,8% formaron esclerocios en más del 75% de la colonia. Un 62% de las cepas de A. flavus estudiadas no produjeron esclerocios en medio MEA (Figura III.33). Si bien Saito y col. (1989) hallaron cepas de A. flavus, aisladas de suelos de campos destinados al cultivo de maíz en Tailandia, que las mismas producían abundantes microesclerocios y que mostraban una alta producción de AFBl, en las cepas aisladas de maíz en este trabajo no se observó ninguna correlación en ese sentido. Los niveles de concentración de AFBl variaron entre 28,8 y 115,0 tg/kg (Tabla Ill. 17). En la Figura III.34 se observa la relación entre cepas de A. flavus productoras y cepas ensayadas. no ioxicoge'nicas 35,3% ÍOXÍCOUCÍ'ÉLCáS 4,7.43 Figura III.34. Porcentajes de cepas de A.flavus productoras de AFBl, aisladas de maíz recién cosechado en la principal zona maicera argentina. Res'ulladox - 90

196 En un estudio previo, van Gelderen y col. (1988) observaron que de 14 cepas de A. flavus (4 aisladas de maíz y 10 de soja, en la provincia de Tucumán), ninguna produjo alfatoxinas. En otros trabajos hallados en la bibliografía, los porcentajes de cepas de A. flavus productoras de aflatoxinas fueron superiores a los de este trabajo (Schroeder y Boller, 1973; Cuero y col., 1987; Klich y Pitt, 1988; Stenwig, 1988; Asevedo y col., 1994; Ichinoe, 1994; Vaamonde y col., 1995). Comparativamente, la frecuencia de aparición de cepas toxicogénicas de A. flavus en maíz, parecería ser inferior que la hallada en otros sustratos. Por otra parte, también parecen ser inferiores los niveles de producción de aflatoxinas. En el caso particular de estas toxinas, existen trabajos de ocurrencia natural en maíz, tanto en Argentina (Resnik y col., l995b) como en otras regiones del mundo (Jelinek, 1987; Jelinek y col., 1989; Resnik y col., l995a). En el caso de Argentina, en maíz recién cosechado, se ha observado presencia de AFBl y AFB2 (Resnik y col., 1995b), en particular se destaca la contaminación en la cosecha de 1989, donde la media de contaminación fue 15,25 tg/kg de AFBl y 1,35 ag/kg de AFB2, con más de un 40% de muestras contaminadas por AFBl y más de 15% contaminadas con AFB2. Resnik y col. (l995b) plantean que estos altos niveles de contaminación pueden deberse a las condiciones meteorológicas adversas que causaron estrés por sequía en las etapas cn'ticas de evolución del cultivo de maíz, favoreciendo la invasión de A. flavus y la aparición de aflatoxinas en la cosecha de La media de contaminación de AFBl y AFB2 en la cosecha de 1990, fue de 2,07 y 0,31 Lg/kg, respectivamente (Resnik y col., 1995b), y las frecuencias de contaminación fueron 25,1% y 5,3%; valores bajos que se repitieron en los otros años estudiados (pen'odo ). En conclusión, los niveles de concentración de aflatoxinas producidas por las cepas autóctonas de A. flavus nos indican que las mismas son productoras débiles (Schroeder y Boller, 1973; Niles y col., 1985; Wallin, 1986; Ichinoe, 1994). Si Rexullados - 19]

197 sumamos a esta situación que la frecuencia de aparición de cepas toxicogénicas observado fue baja y que si no se registran condiciones meteorológicas que favorezcan la invasión del maíz por A. flavus, la aparición de aflatoxinas en este sustrato no sería una problemática emergente. Para evaluar las consecuencias de la presencia de A. [lavas en maíz, se ha estudiado también la capacidad de producción de ácido ciclopiazónico por esta especie. lii.e.3. Producción de ácido cicl0piazónico (CPA) Una vez determinada la capacidad aflatoxigénica en las cepas de Aspergillus flavus, se decidió conocer la posibilidad de que las mismas produjeran CPA. Los aislados fueron sembrados en medio liquido y en maíz, como se describió en Il.b.7.l y al cabo del período de incubación se analizaron los cultivos según las metodologías previamente descn'ptas en II.b.7.2. En los cultivos en medio líquido, como puede observarse en la Figura III.35, una vez finalizada 1a incubación (8 días a 25 C con agitación) el medio adquirió distintas coloraciones. Figura Coloraciones del medio líquido para distintas cepas de A. flavus. l: beige-amarillento (CIM 2005); 2: anaranjado (CIM 2003); 3: marrón (CIM 2013); 4: beige (CIM 2002); 5: amarillento (CIM 2009); 6: beige-anaranjado (CIM 2001). Resultados - 192

198 Asimismo se observó que al término de la incubación, también era distinto el tamaño de los pellets formados durante la agitación mecánica, como se ve en la Figura [ Figura III.36. Tamaño de los pellets en medio líquido para distintas cepas de A. flavus. l: chicos (CIM 2009); 2: medianos (CIM 2000); 3: grandes (CIM 2014). En la Tabla III.18, figuran los valores de producción de CPA en los cultivos desarrollados en medio líquido y en maíz molido y la coloración del medio de cultivo líquido, como así también el tamaño de los pellets. Se puede observar que ninguna de las dos características antes señaladas (coloración y tamaño de pellets) se correlacionaron con la producción o no de CPA en medio líquido. La confirmación de la presencia de CPA en los extractos de las cepas de A. flavus se hizo por espectrometría de masa. En la Figura III.37, se muestran los espectros del estándar de CPA (parte superior de la figura) y del extracto de la cepa CIM 2007 desarrollada en medio líquido (parte inferior). Se puede observar que 33 de las 34 cepas produjeron CPA en medio líquido en concentraciones que variaron entre 3120 y ug/l de medio. En el maíz 27 de los 34 aislados estudiados produjeron CPA en un rango de concentraciones entre 833 y ug/kg. Solamente en una cepa, la CIM 2005, no se detectó producción de CPA ni en medio líquido ni en el maíz.

199 Resullados Tabla III. 18. Coloración del medio de cultivo líquido, tamaño de los pellets y producción de CPA en medio líquido yen maíz, decepas de A. flavus aisladas de maíz recién cosechado en Argentina en CIM Coloración Tamaño de pellets (1) (2) CIhd Coloración Tamaño de pellets (1) (2) 2000 N 6250 NI) NI) bn) 2005 IQD b") NI) DH) bn) WWVNVÑVF VWVVÜMWÚÜ' 2016 NMÑMMHNÑNMNMMMM NNV IVHNVVVMVWVF'VMN HÑNMNMÑNMF NNMÑMF M CIM: Centro de Investigación en Micotoxinas; (l): CPA en medio líquido ( Lg/l); (2) CPA en maíz (p. Coloración: l: beige-amarillento; 2: anaranjado; 3:marrón; 4: beige; 5: amanllento; 6: beige-anaranja o. Tamano de chicos; 2: medianos; 3: grandes. /kg); NQ: no detectado; Hemzlz

200 CPZIQ 112 (1.867) Scan C " 2.28e ' í m/z (1.800) Scan Cl e4 B %, 336 \ aa [ 41' 757 lll 59 l 97 Al "IJI'IJI'IL 139 l'l 154 l 167 ü 181 Il / ll224illl/ ' lx/ H : 3935 l "377 ' JS: u 1 l ' m z óo ' 350 ' 400 Figura Espectros de masa del estándar de CPA (A) y del extracto de la cepa de A. flavus CIM 2007 desarrollada en medio líquido (B). Resultados - 195

201 ( g/l En la figura III.38 se observan los boxplots para la producción de CPA en ambos sustratos ó Lg/kg de CPA CPAL CPAM Figura III.38. Boxplots de la producción de CPA en medio líquido (CPAL) y en maíz (CPAM). Según lo que se observa en la Figura III.38, la producción de CPA en medio líquido es mayor a la obtenida en maíz. Al aplicar el test de Wilk-Shapiro a ambas muestras se rechazó la hipótesis de normalidad en el caso de maíz. Por ello, se recum'ó al test de Wilcoxon (Conover, 1980), para testear la igualdad de las medianas en ambos grupos: producción de CPA en medio y producción de CPA en maíz. Como era de esperar, se rechazó la igualdad de las medianas (p < 0,01). Por lo tanto, existen diferencias significativas entre la producción de CPA de cada cepa en los dos sustratos. Resultados - 96

202 En la Figura III.39, se observan los porcentajes de cepas de A. flavus aisladas de maíz, productoras de CPA en medio líquido y en maíz molido. Klich y Pitt (1988), encontraron que de 80 aislados de A. flavus, obtenidos de diferentes colecciones, 52 de los mismos produjeron CPA. Trucksess y col. (1987), hallaron que 19 de 3l cepas de A.flavus, mostraron capacidad de producir CPA en medio líquido. En la Argentina, Vaamon'de y col. (1995), observaron que el 67% de las cepas de A.flavus, aisladas de maní en la provincia de Córdoba, produjeron CPA, al igual que el 40% de las cepas de esta especie aisladas en trigo en la provincia de La Pampa. Comparando estos estudios con los resultados obtenidos en las 34 cepas analizadas en este trabajo, el número de aislados de A.flavus obtenidos de maíz con capacidad de producir CPA, es mayor. Los niveles de producción hallados en las cepas autóctonas aisladas en 1990, son más altos que los encontrados por Trucksess y col. (1987), quienes analizaron 31 cepas de A. flavus en el mismo medio líquido utilizado en este trabajo. Estos autores obtuvieron los aislados a partir de porotos, harina de maíz, fideos secos y nueces de Pecán. Las concentraciones de CPA halladas variaron entre 100y ug/l. También estos investigadores estudiaron como control de producción de CPA, a la cepa de A. flavus NRRL 6388 (la que produjo entre 8000 y 2000 ug/lde CPA) y a la cepa NRRL 3251, utilizada como control de producción de CPA (entre 5000 y tg/l) y de aflatoxinas (entre 500 y 2000 ug/l). Estos resultados sugieren que el CPA podría ser un metabolito más frecuente que las aflatoxinas. La presencia en el maíz cosechado en la zona núcleo en 1990, de 5 cepas de A. flavus que produjeron AFBl y CPA (CIM 2016, 2022, 2025, 2029 y 2031), plantea la posibilidad de co-ocurrencia de estas toxinas. Por ello sería aconsejable realizar estudios de ocurrencia natural de estas micotoxinas conjuntamente en el maíz cosechado en la zona núcleo de producción. Resultados - 97

203 productoras productoras Mcdno hquido 79,4% capacidad de producir CPA medio líquido con en, 2,99.3 productoras no 97, l% Figura Porcentaje decepas flavus A. aisladas maíz 1990 maíz. yen R('.\'IlÍI(l(ÍU.\'- [98

204 Para completar el panorama sobre las posibles contaminaciones con micotoxinas del maíz proveniente de la zona núcleo de producción en la Argentina, es necesario evaluar a las cepas pertenecientes a los géneros más predominantes, como Penicillíum y Fusarium. III.e.4. Capacidad de producción de citrinina A1realizar la identificación de los aislados primarios del género Penicíllium, se observó que en algunas especies existían diferencias macroscópicas en las colonias desarrolladas en agar MEA a 25 C (II.b.4.2). Entre esas especies se encontraba P. citrinum, la cual tiene una probada capacidad de producir citrinina (Krogh, 1987). El objetivo de este trabajo fue, por una parte, estudiar la capacidad de producción de citrinina por cepas de P. citrinum aisladas de maíz para evaluar la posibilidad que este cereal pueda encontrarse contaminado por esta toxina y, por otra parte, evaluar la posibilidad que alguna característica morfofisiológica estuviera relacionada a dicha capacidad para facilitar la identificación de posibles cepas toxicogénicas. En el maíz cosechado en 1990 en la zona núcleo de producción, P. citrinum fue más frecuentemente aislado como contaminante externo que en la endomicoflora, como ya se mostró en III.c. Las distintas cepas se sembraron en MEA, siguiendo la técnica de colonia gigante. Se utilizó este medio, dado que su composición permitió un óptimo desarrollo del hongo, además de ser el medio que usan distintos autores para la identificación de las especies del género Penicillium (Pitt, 1979; Ramírez, 1982; Samson y Pitt, 1985). Luego de 14 días de incubación a 25 C, se tabularon los siguientes caracteres: color, textura, surcos y bandas de las colonias, algunos de los cuales se ilustran en la Figura III.40. Rexulludux - 99

205 Figura Caracteres morfológicos (macroscópicos) de cepas de P. citrinum desarrolladas en medio MEA (2 semanas a 25 C). (A): Colonia beige, aterciopelada, con bandas y surcos (CIM 4332). (B): Colonia verde, lanosa, con bandas y surcos (CIM 4343). (C): Colonia gris, algodonosa, con bandas y surcos (CIM 4339). (D): Colonia verde, aterciopelada, sin surcos y con bandas (CIM 4350). Resaltar/ox - 200

206 Color de la colonia: Se agruparon aquellas colonias que mostraron colores similares. Se reconocieron como caracteres los colores beige, verde, gris y amarillo. Textura: Según el desarrollo del micelio y la disposición de los conidióforos se pudieron distinguir los siguientes aspectos: - aterciopelado: los conidióforos nacen del sustrato y crecieron de manera de dar origen a un cesped homogéneo (Figura III.4O (A) y (D)). - algodonoso: en este caso se desarrollaron los conidióforos en distintos niveles con desarrollo miceliar intercalado (Figura III.4O (C)). - lanoso: con presencia de micelio estéril, los estípites de los conidióforos nacen de hifas aéreas simples (Figura III.4O (B)). Surcos: Se presentaron como radios sobre las colonias y se detectaron claramente en el envés de las mismas determinando pequeños pliegues (Figura III.40 (A),(B) y (C)). Bandas: Se dieron cuando el crecimiento y la esporulación en la colonia no fueron homogéneos en toda su extensión. Algunos autores explican este fenómeno argumentando que cuando la colonia crece rápidamente segrega sustancias de su metabolismo que podrían reducir el crecimiento, luego el micelio reasume el crecimiento avanzando sobre medio fresco. Para ver el crecimiento radial de las colonias se utilizó la metodología descripta en II.b.l. Cada cepa fue sembrada en medio MEA. El procedimiento para la detección de cepas toxicogénicas fue descripto en Il.b.7.l y Il.b.7.2. En la tabla III. 19 se resumen los caracteres morfológicos (macroscópicos) y la producción de citrinina de cada una de las cepas ensayadas (33 aislados provenientes del maíz cosechado en la zona núcleo en 1990 y 4 cepas de la colección del CIM aislada de maíz en 1989). Como puede verse, entre los colores observados predominaron el beige y el verde, siendo gris y amarillo los menos frecuentes. De las texturas presentes la aterciopelada fue la más común, seguida de la algodonosa y sólo Resultados - 201

207 una cepa presentó aspecto lanoso. La presencia de surcos y bandas no mostró ninguna tendencia, observándose con frecuencias similares la aparición o no de dichos Caracteres. Tabla III. 19. Caracteres morfológicos (macroscópicos) y producción de citrinina en cepas de P. citrínum aisladas de maíz. Cepas Color Textura Surco Banda Citrinina CIM 4222 Beige Aterciopelada No Si No CIM 4223 Beige Aterciopelada No Si No CIM 4224 Beige Aterciopelada No Sí No CIM 4225 Beige Aterciopelada No Si No CIM 4226 Beige Aterciopelada No Si No CIM 4319 Verde Aterciopelada No Si No CIM 4320 Verde Aterciopelada No Si No CIM 4321 Beige Aterciopelada No Si No CIM 4322 Beige Aterciopelada No Si No CIM 4323 Verde Aterciopelada No Si No CIM 4324 Beige Aterciopelada No Si No CIM 4325 Beige Algodonosa Si Si No CIM 4326 Beige Algodonosa Si Si No CIM 4327 Verde Aterciopelada Si No No CIM 4328 Beige Algodonosa Si Si No CIM 4329 Verde Algodonosa Si No No CIM 4330 Verde Aterciopelada Si Si No CIM 4331 Verde Algodonosa Si No No CIM 4332 Beige Aterciopelada Si Si No CIM 4333 Beige Aterciopelada Si Si No (cont.) Resultados - 202

208 Tabla III. 19 (cont.) Cepas Color Textura Surco Banda Citrinina CIM 4334 Beige Aterciopelada Si Si No CIM 4335 Beige Aterciopelada Si Si No CIM 4336 Verde Algodonosa Si No No CIM 4337 Verde Aterciopelada Si Si Si CIM 4338 Verde Algodonosa Si No Si CIM 4339 Gris Algodonosa Si Si Si CIM 4340 Gris Algodonosa No Si Si CIM 4341 Gris Algodonosa No No Si CIM 4342 Gris Algodonosa No Si Si CIM 4343 Verde Lanosa Si Si Si CIM 4344 Verde Algodonosa No Si Si CIM 4345 Amarillo Aterciopelada Si No Si CIM 4346 Beige Aterciopelada No Si Si CIM 4347 Beige Aterciopelada No Si Si CIM 4348 Beige Aterciopelada Si Si Si CIM 4349 Verde Aterciopelada Si Si Si CIM 4350 Verde Aterciopelada No Si Si CIM: Centro de Investigación en Micotoxinas. En la Tabla III.20 se muestran los resultados del test de independencia de los caracteres morfológicos en función de la producción de citrinina (la descripción del test utilizado se encuentra en la sección II.b.8). Como puede verse no se rechaza la hipótesis de independencia propuesta, ya que los estadísticos calculados en cada caso tienen valores de probabilidad menores a] nivel de significancia establecido de 95%, lo que significa que no se encontró relación alguna entre los caracteres morfológicos ensayados y la producción de citrinina. Si bien los caracteres ensayados fueron Rexulladox - 203

209 seleccionados por ser aquellos que se usan en la descripción taxonómica de especie y se suponen más estables, o sea que sus valores se repiten a través de la repetición de los ensayos, también se sabe que algunos de estos caracteres puede sufrir variaciones con el paso del tiempo y con el cultivo de la especie en el laboratorio. Por todo esto se tuvo especial cuidado al estudiar los datos y poder visualizar alguna tendencia que pudiera'sugerir alguna correlación significativa. En futuros trabajos habría que tener en cuenta al diseñar un ensayo para evaluar los caracteres taxonómicos, que algunos de estos pueden aparecer en frecuencias muy bajas, como por ejemplo las cepas de micelio amarillo, o de textura lanosa. De esta manera podrían aplicarse análisis estadísticos más sensibles que pudieran detectar posibles relaciones. Tabla III.20. Test de independencia de los distintos caracteres morfológicos (macroscópicos) con la producción de citrinina. CARÁCTER G. L. VALOR PROBABILIDAD COLOR (a) TEXTURA (b) BANDAS (b) SURCOS (a) Nivel de significancia (a): 0,05 G.L.: grados de libertad (a) "Chi cuadrado" (b) Test exacto de Fisher Para establecer la relación entre la velocidad de crecimiento radial k0 y la capacidad de producción de citrinina se realizó un primer ensayo exploratorio con las 37 cepas antes analizadas, a las cuales se les midió el diámetro en función del tiempo y los datos de la etapa de crecimiento lineal del hongo fueron ajustados a una función de primer grado (González y col., 1987), el coeficiente lineal (k0) se tomó como Resultados - 204

210 estimador de la velocidad de crecimiento en dicha etapa, de esta manera se contó con datos preliminares que indicaban una cierta tendencia y que permitieron diseñar el ensayo con las repeticiones necesarias para obtener datos que pudiesen compararse. De los 37 aislados iniciales, por razones metodológicas (cantidad de material de vidrio y medio de cultivo empleados), se tomaron al azar 27 y se sembraron con 8 repeticiones. Nuevamente se estimó la kdy luego los valores así calculados fueron agrupados en rangos y relacionados con la producción de citrinina. Si bien existen estudios sobre la cinética de producción de citrina en función de factores tales como, actividad acuosa y temperatura (Montani, 1985) y sobre el efecto de distintos sustratos en el crecimiento y la producción de toxinas (Srinivasa, 1990), dichos estudios no relacionan la velocidad de crecimiento con el porcentaje de cepas productoras de citrinina. En la Figura III.4l se puede observar la relación entre la producción de citrinina y la velocidad de crecimiento. Resulta interesante ver como aquellas cepas que crecieron más lentamente fueron productoras de citrinina en mayor número. 100I e Si 80 i 7,; 70 «Q E 604 a 50, a 4o Í É 30 U 20 lo o 4. 0 %. j, l , ,0291 0, KD Figura [ Velocidad de crecimiento radial de las colonias de P. citrinum (aisladas de maíz) y el porcentaje de cepas productoras de citrinina. Resultados - 205

211 El porcentaje de cepas de P. citrinum con capacidad de producir citrinina se muestra en la Figura Comparando con datos de bibliografía, el número de cepas productoras de citrinina es menor (Cuero y col., 1987). A pesar de que no se cuantificó la concentración de citrinina (por no disponer de estándar puro en el momento de la realización de esta parte del trabajo), la observación visual pareció indicar una alta producción de la toxina, lo que sumado al porcentaje de cepas productoras indicaría la necesidad de realizar estudios posteriores que demuestran la capacidad de producción de citrina de estas cepas en maíz y de confirmarse que en este sustrato las mismas produjeran la toxina, deberían también encararse estudios de ocurrencia natural para cuantificar la probabilidad de aparición de la misma, evaluar el riesgo y, si corresponde, establecer límites máximos para aquellas materias primas que se destinen para el consumo humano y/o animal. no productoras 64,9% productoras 35,1 % Figura Porcentaje de cepas de P. citrínum aisladas de maíz con capacidad de producir citrinina. Resultados - 206

212 III.e.5. Capacidad de producción de tricotecenos y zearalenona (ZEA) Los tricotecenos y la ZEA contaminan naturalmente el maíz y otros cereales infectados por especies del género Fusarium antes o después de la cosecha (Sigfried, 1977; Jemmali y col., 1979; Thiel y col., 1982; Bottalico y col., 1983; Szathmary, 1983; Richardson y col., 1985; Abbas y col., 1986, 1988; Quijie y col., 1988; Hussein y col., 1989; Wood y Carter, 1989; Sydenham y col., 1990; Luo y col., 1992; Kim y col., 1993; Oldenburg, 1993). El consumo de cereales atacados por especies de este género, a menudo, exhibe efectos tóxicos en humanos y animales de granja. La especie F. graminearum (Gibberella zeae Petch), perteneciente a la sección Discolor, es uno de los principales patógenos que afectan a los cereales (maiz y trigo). En F. graminearum se han diferenciado dos poblaciones naturales, en cereales, designadas como grupos l y 2 (Burgess y col., 1975; Francis y Burgess, 1977), las cuales no se pueden diferenciar certeramente en base a las caracteristicas morfológicas (Nelson y col., 1983). Los aislados de F. graminearwn, pertenecientes al grupo l se los asocia frecuentemente con la podredumbre del cuello de la planta de trigo y no forman peritecios en cultivo, mientras que los pertenecientes al grupo 2, son normalmente relacionados con la podredumbre de las espigas de maíz y trigo ("ear rot" y "head blight") y forman peritecios en cultivo (Marasas y col., 1988). F. graminearum puede producir tricotecenos del tipo A, tales como: monoacetoxiscirpenol (MAS), dicetoxiscirpenol (DAS), neosolaniol (NEO), toxina HT-2 (HT-2) y toxina T-2 (T-2); tricotecenos del grupo B, como: nivalenol (NIV), deoxinivalenol (DON), ls-acetil-deoxinivalenol (ls-adon), 3-acetil-deoxinivalenol (3-ADON) y fusarenona X (Fus X); como asi también una micotoxina estrogénica, la zearalenona (ZEA) (Marasas y col., 1984; Marasas, 1989). F. graminearum es la principal especie de Fusarium productora de DON y ZEA y es también importante productora de NIV, (Marasas, 1989). Otras micotoxinas que producen F. graminearum son el ácido Resullados - 207

213 4-acetamida-Z-butcnoico, butcnólido, fusarina C y moniliformina (Marasas y col., 1984; Marasas, 1989). En la República Argentina, F. gramínearum ha sido aislado frecuentemente de muestras de maíz (Winter y col., 1974; Lori, 1985; Bertinetti, 1988) y asimismo se ha observado en el maíz contaminación con ZEA y DON (López y Tapia, 1980; Odriozola y col., 1985; Chulze y col., 1989). Sin embargo, la capacidad de producción de estas toxinas u otros tn'cotecenos, por cepas regionales de F. graminearum aisladas de maíz ha sido escasamente estudiada (Bertinetti, 1988; Montani y col., 1988; Milano y López, 1991). En el punto III.c de este capítulo se observó que F. graminearum fue exclusivamente encontrado como contaminante endógeno del maíz cosechado en 1990 en la zona núcleo. Para evaluar la capacidad de producción de tricotecenos como: NIV, DON, ls-adon, 3-ADON, NEO, DAS, HT-2 y T-2; y de ZEA por cepas de F. graminearum se incubaron 27 aislados en las condiciones detalladas en II.b.7.l y luego de finalizada la incubación se analizaron los cultivos según lo expuesto en II.b.7.2. En la Tabla III.21 se encuentran las concentraciones de los tricotecenos y ZEA producidos por cepas de F. graminearum aisladas de maíz. Ninguna de las cepas ensayadas produjo NIV, ls-adon, ni T-2. Se incorporaron a la tabla dos columnas designadas como ZEAl y ZEA2. En la Figura lii.43 se muestran los cromatogramas de un estándar de ZEA puro preparado el día 28 de marzo de 1995 e inyectado el día siguiente (A). En el mismo se observa un pico definido con un tiempo de retención (TR) de 23,752 minutos. En la misma figura (III.43) se muestra el cromatograma del estándar de ZEA puro preparado el día 7 de febrero de 1995 e inyectado el 16 de marzo del mismo año (B). En el mismo se observan 3 picos, uno a TR = 23,278, el cual corresponde a la ZEA denominada en la tabla como ZEAl (denominación que se le dio al ser observado en los extractos de los cultivos de F. graminearum). En los extractos de los cultivos de las cepas se observó el pico correspondiente a TR = 30,815 y que fue identificado en la tabla como ZEAZ. Resultados - 208

214 Tabla III.21. Producción (ug/kg) dc DON, 3-ADON, NEO, DAS, I'IT-2 y ZEA dc aislados de F. gramínearum en maíz molido (25 C, l semana; 15 C, 2 semanas) ND CIM: Centro de Investigación en Micotoxinas. ND: No detectado. ' Rexulladux - 209

215 LEER ( ÉÜHJ:.: 28/3/95 > INUFiLID SYSÏEH CÜHI'lFlHÜ ai RUN u 4 nnr 29, 1995 ": 8mm 1.-, m'r A T HETHBLE STOP ENHHI En SYSÏEE! CÜHHRHÜ ïiheïrble sra? Figura III.43. Cromatogramas (CGL) delestándar de ZEA derivatizado con HFBA (A) inyectado a las 24 horas; (B) inyectado a los 39 días de la derivatización. El pico de ZEA2 probablemente corresponda a un metabolito de estructura similar a la ZEA o a un isómero de la misma. Se necesitan realizar mayores estudios para su identificación y para la evaluación de la toxicidad de dicha sustancia. Teniendo en cuenta la producción de tn'cotecenos del tipo B, Ichinoe y col. (1983), hallaron que cepas de F. gramínearum aisladas de cebada y trigo y de G. zeae aisladas de tallos de arroz en Japón, podían ser divididas en dos grupos quimiotaxonómicos, a saber: quimiotipo I o "DON quimiotipo", los cuales producían DON Resultados - 210

216 y 3-ADON y el quimiotipo II o "NIV quimiotipo", los que producían NIV y Fus X. A pesar de no ser indicado por los autores, se deduce que estos aislados tanto de F. graminearum como de G. zeae pertenecían al grupo 2. Logrieco y col. (1988), confirmaron la presencia de quimiotipos I y II en cepas de F. graminearum aislados de tallos de maíz en Italia. De acuerdo a los resultados obtenidos de producción en maíz, las cepas de F. graminearum aisladas de la zona núcleo en Argentina pertenecerían al quimiotipo I. Miller y col. (1991) reconocen dentro del quimiotipo I ("DON quimiotipo") dos subtipos según el derivado acetilado que se produzca, de esta manera denominan quimiotipo Ia, cuando producen DON y 3-ADON y quimiotipo lb, cuando producen DON y ls-adon. De acuerdo a esta tipificación las cepas de F. gramínearum productoras de DON y 3-ADON pertenecen'an al quimiotipo Ib. Bottalico y col. (1983), observaron en 14cepas de F. gramínearum aisladas en cereales en Italia, que "9 de las mismas sólo produjeron DON ( tg/kg) y 2 cepas produjeron DON (27000 Lg/kg) más 3-ADON (25000 Lg/kg)", las cuales sen'an del quimiotipo Ia. Sydenham y col. (1991) estudiaron la producción de tricotecenos en cepas de F. graminearum (5 aislados) obtenidas de maíz (grupo 2) en Sudáfrica. Los mismos fueron inoculados en maíz e incubados a 25 C por 3 semanas. Estos autores observaron que ninguno de ellos produjo DON y 3 produjeron NIV ( tg/kg). Szécsi y Bártok (1995) observaron al estudiar 26 cepas de F. graminearum aisladas de maíz en Hungría, que 9/26 no produjeron ningún tn'coteceno tipo B, 10/26 produjeron sólo DON, 4/26 produjeron DON y NIV, 1/26 produjo DON y ls-adon (quimiotipo Ib), 1/26 produjo NIV y Fus X (quimiotipo II) y 1/26 produjo sólo NIV. Piñeiro y col. (1995), analizaron cereales en Uruguay y encontraron que de 12 cepas de F. graminearum aisladas de cebada, ll produjeron DON y/o ZEA, 9 produjeron ls-adon (quimiotipo Ib: DON, ls-adon) y ninguno produjo NIV o Fus X. Resultados - 211

217 Los resultados observados indicarían sólo la presencia del quimiotipo la (DON, 3-ADON) en la zona núcleo de producción de maíz. Si en otras cosechas se confirman estos resultados, podrían simplificarse considerablemente las tareas de control de micotoxinas, pues no sería necesario buscar ls-adon, NIV o Fus x. Esto estaría en concordancia con los análisis realizados en trigo en el momento de la cosecha en la misma zona de producción, ya que las tres micotoxinas halladas en un relevamiento de 10 años fueron ZEA, DON y 3-ADON, no detectándose nunca ls-adon (Quiroga y col., 1995). Con respecto a la producción de ZEA, no se ha establecido una relación entre la cantidad de la toxina producida y el grupo al que pertenezca la cepa (l ó 2), como han comprobado Windels y col. (1989) en los Estados Unidos. En la Tabla III.2l se observa que el 48,0% de las cepas de F. graminearum aisladas de maíz en 1990, produjeron ZEA y 20 de los 27 aislados produjeron DON. Bottalico y col. (1983), hallaron que 3 de 14 cepas de F. graminearum aisladas de cereales en Italia produjeron ZEA ( ug/kgen promedio) y ll produjeron DON (entre tg/kg). Richardson y col. (1985), estudiaron la producción de ZEA y DON en arroz de cepas de F. graminearum aisladas de alfalfa, trébol y alimentos para cerdos en Carolina del Norte y observaron que 3 de ellas produjeron ZEA entre y ig/kg y 2 produjeron DON (4300 tg/kg en promedio). Abbas y Bosch (1990) observaron en una cepa de F. graminearum aislada de soja en Estados Unidos que la misma produjo lg/kg de DON y Lg/kgde ZEA, cuando la incubaron en arroz por 2 semanas a 25 C y 2 semanas a 12 C. Sydenham y col. (1991) encontraron que 4 de 5 cepas (80%) de F. graminearum aisladas de maíz en Sudáfn'ca, produjeron ZEA en concentraciones entre 2000 y ig/kg, mientras que ninguno de los aislados produjo DON. Milano y López (1991) hallaron que 4 cepas de F. graminearum aisladas de maíz en el SE de la Provincia de Buenos Aires produjeron en maíz molido (2 semanas a 25 C y 2 semanas a C) tg/kg en promedio de ZEA. Szécsi y Bártok (1995) observaron al estudiar 36 aislados de F. Resultados - 212

218 gramincarum provenientes de maíz, cn Hungría, que cl 55,6% de los mismos produjeron ZEA y que 10 cepas produjeron DON. Vrabcheva (1995) estudió la producción de ZEA en cepas de F. gramínearum aisladas de cereales (maíz y trigo) en Bulgaria y observó que el 100% de las cepas (19 en total) produjeron ZEA en cantidades que variaron entre y tg/kg de maíz. Megalla y col. (1987) analizaron en 20 cepas de F. graminearum, aisladas de granos de maíz en Estados Unidos, la capacidad de producción de ZEA y DON en maíz incubándolas l semana a 25 C y 2 semanas a 15 C. Observaron que todas ellas produjeron ZEA en concentraciones que variaron entre y g/kgy que el total de los aislados produjo DON en niveles que oscilaron entre 6680 y tg/kg. Las cepas de F. graminearum aisladas de maíz en la zona núcleo, incubadas en igualdad de condiciones con respecto a Megalla y col. (1987), son menos productoras de DON y ZEA (ZEAl en la Tabla ),y el porcentaje de cepas con capacidad de producir DON también es menor al observado por estos autores, siendo similar a lo hallado por Bottalico y col. (1983) y Sczécsi y Bártok (1995). En cuanto a la ZEA, a excepción de lo hallado por Bottalico y col. (1983), en las cepas aisladas del maíz en 1990 en la Argentina, es menor tanto el porcentaje de aislados con capacidad toxicogénica como el nivel de producción observado. Los límites de tolerancia más comúnmente aplicados para ZEA y DON en maíz son 200 y 2000 tg/kg, respectivamente. En cuanto a DON, la probabilidad que las muestras de maíz recién cosechado en la zona núcleo superen este límite de tolerancia, son muy bajas pero no así para ZEA, dependiendo de las condiciones meteorológicas. La probabilidad de superar los 200 ug/kgde ZEA en el maíz cosechado en la zona núcleo, de acuerdo a los niveles observados en este trabajo, se corrobora por lo observado por Resnik y col. (1995) en un relevamiento hecho entre los años 1983 y 1994, en el que hallaron muestras que superaron estos valores. En la República Argentina, Bertinetti (1988) observó cualitativamente que 2 de 5 cepas de F. graminearum aisladas de maíz cosechado en Río Cuarto (Pcia. de Resullados - 213

219 Córdoba), produjeron NEO, T-2 y HT-Z. Marasas y col. (1984), confirmaron que la identidad de cepas de especies del género Fusarium mencionadas como productoras de DAS, NEO, T-2 y HT-2 en distintas partes del mundo, correspondía a F. graminearum. La presencia de aislados productores de NEO, DAS y HT-2 (tricotecenos del grupo A) en el maíz cosechado en la zona núcleo en 1990, amerita un seguimiento de estas toxinas en el maíz, para evitar que sean consumidas en los productos elaborados. Las especies de Fusarium aisladas con menores frecuencias en el maíz cosechado en la zona núcleo en 1990 (III.c), fueron F. sporotrichioides, F. semirecrum, F. equíseti, F. heterosporum, F. oxysporum y F. solaní. F. sporotríchioides es un habitante normal de suelos y aparece como saprófrto de una amplia variedad de plantas como cereales y pasturas, invadiendo las semillas de los mismos y mostrando cierta agresividad por la toxicidad de los tricotecenos del tipo A que produce (toxina T-2 y derivados). Este hongo predomina en climas que van de templados a fríos (húmedos), pudiendo también ser aislados de cereales que pasaron el invierno bajo la nieve. F. xporotrichioides raramente causa podredumbres severas de los granos (Marasas y col., 1984). La principal toxina de esta especie, la T-2, que según Visconti y col. (1985), aparece ocasionalmente en el maíz cosechado en Italia en concentraciones significativas, es sin embargo una micotoxina altamente tóxica para el hombre y los animales de granja. Chelkowski y col. (1987), por otra parte, sugieren que F. sporotrichíoides es capaz de infectar las mazorcas de maíz en Polonia, desde la aparición de los estigmas y acumular cantidades significativas de toxina T-2 y derivados antes de la cosecha del cereal. Estas diferencias se deben probablemente al clima más frío en Polonia, respecto al de Italia. Según Marasas y col. (1984), F. semitectum es una especie extremadamente común, particularmente en países tropicales y subtropicales, pero también ha sido Resultados - 214

220 aislado en regiones frías y templadas. Es un saprófito en suelos y sobre materiales vegetales en descomposición. F. equiseri es una especie cosmopolita, sapróñta en suelos, particularmente común en áreas tropicales y subtropicales, aunque también se lo ha aislado en zonas de clima frío y se lo ha asociado a cereales en regiones templadas. Este hongo está involucrado en la descomposición de tallos, hojas, semillas y a la podredumbre de los frutos de varias especies vegetales. F. heterosporum es un hongo cosmopolita, que causa tizones en cereales y pasturas y está citado como hiperparásito del estado imperfecto (Sphacelia segetum) y de los esclerocios de Claviceps purpurea. Está particularmente relacionado con el mijo en Africa y en los Estados Unidos se lo ha citado parasitando esclerocios de Claviceps' paspali (que infecta especies del género Paspalum). F. oxysporum es una especie cosmopolita, saprófita, y es además un parásito altamente especializado, que ocasiona marchitamiento vascular y "damping off" (en almácigos) en una gran variedad de plantas. F. solani es un saprófito de suelos, cosmopolita, frecuentemente asociado a heridas e infecciones que causan podredumbres en el sistema radical, a cancros en tallos y a podredumbres en el almacenamiento, en una gran variedad de plantas. También causa queratitis e infecciones oportunistas en humanos y animales. Los aislados de las especies anteriormente citadas, que aparecieron en la zona núcleo en 1990, fueron incubados en maíz molido de acuerdo a lo expuesto en ll.b.7.l y analizados al término de la incubación, según ll.b.7.2. Los análisis de los extractos indicaron que ninguna de las cepas, en esas condiciones, fue productora de NIV, 3 ADON, ls-adon, NEO, l-lt-zy T-2. En la Tabla se muestran los resultados obtenidos para las otras toxinas estudiadas. Las cepas de F. sporotrichioides, aisladas de maíz en la zona núcleo de producción, mostraron capacidad de producir DON, T-2 trio], T-2 tetraol y ZEA. En la literatura se citan aislados de esta especie, de distintos orígenes geográficos, capaces de producir además de estas toxinas, otras como NIV, NEO, PIT-2, T-2 y derivados, Resultados - 215

221 DAS, fusarina C y butenólido, entre otras (Marasas y col., 1984; Ueno e Ishii, 1985; Visconti y col., 1985; Chelkowski y col., 1987; Abbas y Mirocha, 1988; Thrane, 1988; Marasas, 1989; Logn'eco y col., 1990; Abramson y col., 1993). Tabla Producción ( Lg/kg)de DON, DAS, T-2 triol, T-2 tetraol y ZEA; en aislados de especies de Fusarium en maíz molido (25 C, l semana; 15 C, 2 semanas). Especies Concentración de micotoxinas (p;/kg)* DON DAS T-Z T-2 ZEA triol tetraol F. sporotrichioides (Sección Sporotrichiella) CIM ND ND ND ND CIM ND ND ND ND CIM ND ND CIM ND ND ND ND CIM ND ND 'ND 874 F. semitectum (Sección Arthrosporiella) CIM 3031 ND ND ND ND ND CIM 3034 ND ND ND ND ND CIM 3035 ND ND ND ND ND CIM 3036 ND 232 ND ND ND CIM 3037 ND ND ND ND ND F. equiseti (Sección Gibbosum) CIM ND ND ND ND F. heterosporum (Sección Discolor) CIM 3030 ND ND ND ND ND F. oxysporum (Sección Elegans) CIM ND ND ND ND F. solani (Sección Martiella-Ventricosum) CIM 3043 ND ND ND ND ND CIM 3044 ND ND ND ND ND * No se detectó en el maíz utilizado como control ninguna de las toxinas analizadas. CIM: Centro de Investigación en Micotoxinas. Resultados - 216

222 La cepa CIM 3036 de F. semitectum, produjo solamente DAS. F. semitectum es citado en bibliografía como productor de: 4,acetoxiscirpenol, butenólido, DAS, Fus X, monoacetoxiscirpenol, NEO, NIV, nivalenol diacetato, scirpentriol, T-2, zearalenol y ZEA (Marasas y col., 1984). La cepa CIM 3029 de F. equiseti resultó productora de DON. En la bibliografía, aislados de esta especie han sido mencionados como productores de butenólido, NIV, Fus X, ls-adon, DAS, HT-2, T-2, moniliformina y ZEA (Bottalico y col., 1983; Marasas y col., 1984; Richardson y col., l985a; Marasas, 1989; Abbas y Bosch, 1990; Zhu y Zhnag, 1991; Abramson y col., 1993). La cepa CIM 3030 de F. heterosporum, no produjo ninguna de las toxinas analizadas en las condiciones experimentales utilizadas. En bibliografía tampoco se encuentran referencias de que esta especie sea capaz de producir tricotecenos o ZEA (Marasas y col., 1984). La cepa de F. oxysporum (CIM 3045) produjo solamente DON entre las toxinas investigadas. Esta capacidad también fue detectada en cepas de esta especie aisladas de soja (Abbas y Bosch, 1990). Además se han citado aislados de F. oxysporum capaces de producir toxinas como: ZEA, T-2, DAS, diacetilnivalenol, 7,8 dihidroxidiacetoxiscirpenol, Fus X, 7-hidroxidiacetoxiscirpenol, NEO y moniliformina (Chakrabarti y col., 1976; Marasas y col., 1984; Richardson y col., l985a; Abbas y col., 1991; Vrabcheva, 1995). Las cepas de F. solam' (CIM 3043 y 3044) no produjeron ninguna de las toxinas analizadas. En la literatura F. solani es citado como productor de ZEA y ácido fusárico (Marasas y col., 1984; Richardson y col., l985a; Vrabcheva, 1995). Si bien estas especies mostraron frecuencias de aislamiento y densidades específicas relativas bajas (III.c) muestran, como en el caso de F. sporotrichioides, capacidad de producir algunos tricotecenos y ZEA. Comparada con la bibliografía, muestran niveles de concentración relativamente bajos y poca variedad con respecto a los tipos de toxinas producidas. Resultados - 217

223 Tal como fuera descripto anteriormente, los estudios micológicos del maíz recién cosechado en la Argentina (III.c), mostraron que F. manillforme fue la especie predominante. Este hongo pertenece a la sección Liseola, en la que además se encuentran las especies F. subglutinans y F. proliferatum, también aisladas en la zona núcleo en Eusarium moniliforme es una especie que está ampliamente distribuida en trópicos y regiones templadas y húmedas de todo el mundo, pero también se lo ha aislado en zonas templadas frías (Marasas y col., 1984). Esta especie causa podredumbre de la caña y de la mazorca en el maíz y ya en el siglo XVI fue descripta esta enfermedad por un franciscano, quien la observó en México sobre el maíz cultivado por los aztecas (Booth, 1971). Se lo aísla comúnmente del maíz, tanto a campo como en el almacenamiento. También parasita otras grami'neascomo arroz, caña de azúcar y sorgo. Asimismo se lo ha aislado de avellanas, nueces de Pecán, maní, biltong y de quesos (Marasas y col., 1984). F. moniliforme ha sido mencionado produciendo afecciones en el ser humano, como por ejemplo, queratitis en córnea, micosis cutáneas y subcutáneas (Marasas y Nelson, 1987). En la bibliografía se cita que entre las micotoxinas que puede producir esta especie se encuentra la ZEA (Marasas, 1989). F. subglutinans tiene un espectro de hospedantes similar a F. monilifonne, siendo más frecuentemente aislado en el maíz (Marasas y col., 1978, l979b). F. subglutinans prefiere los climas más húmedos y frescos que F. moniliforme (Marasas y col., 1981). Esta especie ha sido citada en la literatura como toxicogénica (Marasas y col., 1984). F. prolíferatum es confundido frecuentemente, cuando se lo identifica, con F. moniliforme (Marasas, 1988) y se lo aísla normalmente de cereales y pasturas. Es una especie cosmopolita y ha sido citado como toxicogénico (Ross y col., 1990). A continuación se analizará la capacidad toxicogénica de las especies de la sección Liseola, arriba consideradas (F. moniliforme, F. proliferatum y F. subglutinans), encontradas en el maíz cosechado en la zona núcleo en Resultados - 218

224 III.e.6. Capacidad de producción de monilil ormina (MO) Aunque la producción de MO por especies de Furarium ha sido informada en varios países como una contaminación natural del maíz (Thiel y col., 1982,1986; Thalmann y col., 1985; Lew y col., 1990; Sydenham y col., 1990) y a pesar de su toxicidad, no existen en Argentina estudios cuantitativos acerca de la capacidad de producir esta micotoxina por hongos aislados en maíz. Para estudiar la capacidad de producir MO se seleccionaron al azar cepas de Fusarium de la sección Liseola aislados e identificados a partir del maíz recién cosechado en Argentina (II.b.2.2). Con estas cepas se realizaron cultivos monospóricos en medio CLA y se sembraron en maíz en las condiciones señaladas en II.b.7.l, 23 cepas de F. moniliforme, 10 de F. proliferatum y 9 de F. subglutinans. Una vez transcurrido el pen'odo de incubación se analizaron los cultivos según la metodología descripta en Il.b.7.2. Para confirmar la identidad de la MO se determinaron y compararon los espectros de absorción de la MO-2, dinitrofenilhidrozona obtenida luego de derivatizar al estándar con 2,4 dinitrofenilhidrazina y los provenientes de la den'vatización de los extractos de los cultivos en maíz y del extracto del maiz utilizado como control. Estos espectros fueron obtenidos al analizar las placas de TLC bidimensionales en el densitómetro. Como puede observarse en la Figura ,el espectro del derivado de toxina pura (A) es similar a los provenientes de los cultivos en maíz (B) (en la figura se encuentra el espectro del extracto de la cepa CIM-088). La identidad de las cepas de F. moniliforme y F. proliferatum productoras de MO ha sido validada por el Medical Research Council (MRC) de Tygerberg, Sudáfrica, y se encuentran depositadas en su colección (Sydenham y col., 1993). Resultados - 219

225 .4/ f x a "//_.- _\ x Nx B I ' Í I ' I M ü /Jff _. C I I l ' ÑI' ' I ' l ; Longitud de onda Figura III.44. Espectros de absorción de las MO-2,4 dinitrofenilhidrazonas correspondientes al estándar (A), extracto del cultivo en maíz (B)y control de maíz (C). Rexulladox - 220

226 En la Tabla , se encuentran los resultados del análisis realizado en los cultivos de maíz. Se puede observar que l de 23 cepas analizadas de F. moniliforme, 2 de 10 de F. prolzferatum y 3 de 9 de F. subglutinans, producen esta micotoxina en un rango entre 0,3 y 2,7 mg/g. Si bien el número de cepas ensayadas de cada especie es relativamente baja, todas ellas fueron aisladas de granos de maíz recién cosechado. El porcentaje de las cepas positivas para cada especie, refleja que en el caso de F. moniliforme la probabilidad de hallar cepas de esta especie productora de MO es baja, con respecto a F. proliferatum y F. subglutinans. Thiel y col. (1982) hallaron en muestras de maíz de Transkei naturalmente contaminado con F. moníliforme y F. subglutinans, con niveles de MO entre 0,016 y 0,025 mg/g, que solamente4 aislados de F. subglutínans provenientes de esas muestras producían la toxina in vitro (de 0,07 a 0,09 mg/g de MO). En la literatura existe información contradictoria acerca de la producción de MO por cepas de F. moniliformc. Bottalico y col. (1983), observaron que ninguna de las 13 cepas de F. monilzformeaisladas de maíz en Italia producían MO, lo mismo hallaron Logrieco y Bottalico (1988) sobre 22 aislados de F. moniliforme obtenidos de maíz en el sur de Italia. A su vez, Vesonder (1986) comprobó que ninguna de las 8 cepas de F. moniliforme por él ensayadas produjo MO, a pesar que los aislados fueron obtenidos de muestras de forraje tóxico elaborado a partir de maíz en Iowa (Estados Unidos). Marasas y col. (1979) y Kriek y col. (1981) encontraron que ninguna de las cepas tóxicas de F. moníliforme aisladas de maíz de Transkei y Sudáfrica producían MO. En ese mismo sentido, Chelkowski y col. (1990) informaron que de 7 aislados de F. monilífonne provenientes de cereales en Polonia, ninguno produjo MO. Sin embargo, Rabie y col. (1982) observaron que 28 de 36 cepas de F. monilrforme aislados de maíz, sorgo y mijo en distintos países africanos (Sudáfrica, Mozambique y Namibia) producían MO en un rango de 0,01 a 7,3 mg/g. También Marasas y col. (1986) hallaron que 13 de 52 cepas de F. monilg'formeaisladas de maíz y sorgo en Kenya, Mozambique y Sudáfrica produjeron MO en cantidades de 0,06 a 2,1 mg/g. Resultados - 22]

227 Tabla III.23. Producción de moniliformina (MO) por cepas monospóricas de Fusarium monilifomze, F. prolíferatum y F. subglutínans, aisladas de maíz en Argentina. Fusarium spp. CIM N2 MRCN9 Producción de M0 (a) (b) (mg/9) (c) F. moniliforme ND (d) ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND F. proliferatum ND ND ND ND ND ND ND ND F. subglutinans ND ND ND ND ND ND (a) Centro de Investigación en Micotoxinas (b) Medical Research Center (c) MO no fue detectada en el control de maíz (d) ND: no detectado Resultados - 222

228 Farber y col. (1988) encontraron en cepas de F. moniltforme aislados de maíz, cebada y trigo en Canadá que 2 de 6 aislados ensayados fueron productores de MO en un rango de 0,005 a 0,03 mg/g. La cantidad más elevada de MO producida fue informada por Rabie y col. en 1982, en Sudáfrica, quienes encontraron un aislado de F. moniliforme que produjo 33,7 g/kg. Con respecto a las cepas de F. subglutinans analizadas en este trabajo, se vio que la proporción entre cepas productoras y ensayadas (3/9) era menor a las halladas por Marasas y col. (1986), quienes informaron que 48 de 59 cepas de F. yubglutinans aislados de maíz, sorgo y caña de azúcar en Sudáfrica y Transkei, producían MO en una concentración entre 0,005 y 11,3 mg/g. Vesonder y col. (1980) encontraron que el 100% de las cepas (8) de F. subglutinans aisladas de alimento balanceado elaborado a partir de maíz en Iowa (Estados Unidos) producían MO en cantidades entre 0,05 y 0,5 mg/g. Lo mismo hallaron Rabie y col. (1982) al analizar 6 cepas de F. subglutinans aisladas de maíz y sorgo en Sudáfrica y Mozambique, ya que todas ellas produjeron MO en un rango entre 0,005 y 1,7 mg/g. A su vez, Farber y col. (1988) observaron que 11 de 15 cepas de F. subglutinans aisladas de maíz en Canadá producían MO en un rango de 0,001 a 0,2 mg/g. Una proporción similar a la de este trabajo, de cepas productoras sobre cepas ensayadas, encontraron Bottalico y col. (1983), quienes determinaron que l de 3 cepas de F. subglutinans aisladas de maíz en Italia produjo MO en una concentración de 3,7 mg/g. Chelkowski y col. (1990), analizaron 20 cepas de F. subglutinans aisladas de espigas de maíz, trigo y centeno, y de tubérculos de papa en Polonia y encontraron que sólo 8 de las mismas produjeron MO en un rango entre 0,07-1,7 mg/g. Por su parte la proporción de cepas de F. prolzferatum productoras de MO (Tabla ) es significativamente menor a la hallada por Marasas y col. (1986), quienes observaron que el 100% de las 8 cepas de F. proliferaum aisladas de maíz, sorgo, arroz, cebolla, entre otros sustratos de diversos on'genes geográficos (excepto Argentina), producían MO en una concentración entre 0,01 a 0,3 mg/g. Observaciones Resultados - 223

229 similares a las de este trabajo fueron publicadas por Logrieco y Bottalico (1988), quienes hallaron que 3 de 8 cepas de F. proliferatum aisladas de maíz en Italia eran productoras de MO en cantidades que iban de 0,2 a 1,5 mg/g y también en Polonia donde Chelkowski y col. (1990), encontraron que 3 de 7 cepas de F. proliferatum aisladas de cereales (maíz, tn'go y centeno) y de tubérculos de papa produjeron MO en concentraciones que variaron entre 0,13 y 0,4 mg/g. Los niveles de MO hallados en las cepas autóctonas de la sección Liseola, incubadas en maíz, son similares a los encontrados por otros autores en igualdad de condiciones de incubación (Rabie y col., 1982; Marasas y col., 1986). Sin embargo, cuando se comparan los datos obtenidos con las cepas argentinas y los hallados en Canadá por Farber y col. (1988), estos últimos serían más bajos, ya que los rangos de producción de MO informados por estos autores son de 0,007 a 0,03 mg/g para F. moniliforme y de 0,001 a 0,2 mg/g para F. subglutinans. Estos datos representan el primer aporte de datos de cuantificación de moniliformina producida por cepas de F. monilifonne, F. proliferatum y F. subglutinans aisladas de maíz en la República Argentina. III.e.7. Capacidad de producción de fumonisinas (FB) En el análisis de la distribución de la micoflora contaminante del maíz recién cosechado en la República Argentina (III.c) se observó que la especie prevalentemente aislada en la zona núcleo fue Fusarium moniliforme, y como esta especie está relacionada con la aparición de fumonisinas en el maíz (Gelderblom y col., 1988), se decidió estudiar la capacidad de producir fumonisinas por cepas monospóricas de esta especie, elegidas al azar entre los aislados identificados de muestras de maíz. También se estudiaron cepas de F. proliferatum, ya que Ross y col. (1990) observaron que esta especie producía fumonisinas en maíz. Resultados" - 224

230 Se sembraron en maíz, en las condiciones señaladas en II.b.7. l, l7 cepas de F. monilifomie y 3 de F. prolzfizratwn. Una vez transcurrida la incubación, se analizaron los cultivos según las metodologías descriptas brevemente en II.b.7.2. No se estudió ninguna cepa de F. subglutinans pues existen suficientes evidencias de que esta especie no es productora de fumonisinas (Nelson y col., 1992b y Thiel y col., 1991). Los resultados del análisis cualitativo realizado en los extractos de maíz incubado con F. monilífonne y F. proliferatum, aparecen en la Tabla III.24. Como puede observarse, el 100% de las cepas ensayadas mostraron la capacidad de producción de fumonisinas. En varios de los aislados se observó que la producción de fumonisinas fue comparativamente mayor a la exhibida por la cepa de referencia empleada, la M-2326 (F. monilifomze), la cual ha sido aislada de maíz destinado para alimento de pollos en Estados Unidos (Maryland, Pennsylvania y Virginia) y que produjo, incubada en maíz, 1406 ug/g de FBl (Nelson y col., 1991). Tabla III.24. Producción cualitativa de fumonisinas por cepas de Fusarium manihfonne y F. proliferatum, aisladas de maíz recién cosechado en la República Argentina. Fusarium spp. CIM N9 MRCN9 Producción de FB (a) (b) (C) F. moniliforme (d) (d) (d) (d) (d) (d) (d) (d) (d) (d) F. proliferatum (d) (d) (a) Centro de Investigación en Micotoxinas - (b) Medical Research Council - (c) FB no fue detectada en el control de maíz - (d) Confirmadas en el MRC. Resultados - 225

231 Cabe destacar que en la cepa CIM-021 (MRC-6416) se observó una intensidad de coloración de la mancha, al revelar la placa cromatográfica notablemente mayor que la correspondiente a lacepa de referencia. En función de estos resultados se decidió confirmar la presencia de fumonisinas y cuantificar la concentración de las mismas contra patrones. En la Tabla se encuentran los niveles de fumonisinas (FBI, FB2 y FB3) producidas en maíz por 12 aislados monospóricos de F. moniliforme y 3 de F. prolíferatum, originarios de la zona maicera argentina y que fueron analizados por cromatografía líquida de alta presión HPLC (II.b.7.2). Las cepas de F. monilifomze produjeron en su totalidad cantidades variables de las tres fumonisinas en un rango de valores de 50 a 8160 tg/g de FBI, de 5 a 1380 tg/g de FB2 y de ls a 1430 tg/g de FB3. Tabla III.25. Concentraciones de fumonisinas en maíz inoculado con cepas de F. manillfonne y F. proliferatum aisladas de maíz en la República Argentina. Concentración de fumonisinas t de fumonisinas (yq/9) Fusarium spp. CIM N2 MRCN2 (a) (b) F81 F82 FB3 TOTAL (c) F81 F82 FB3 F. moniliforme ,9 3,2 12, ,0 8,0 20, ,6 8,7 23, ,4 7,2 21, ,3 9,7 19, ,0 5,0 25, ,0 8,0 24, S ,9 10,9 30, ,5 8,3 29, ,4 10,7 18, ,0 3,0 9, ,4 12,6 13,0 F. proliferatum ,0 70,8 17, ,5 22, ND(d) 3o ND(d) 30 0,0 100 o 0,0 Control (e) 0,4 0,1 ND(f) (a) Centro de Investigaciones en Micotoxinas - (b) Medical Research Council -(c) Concentración total de FBl + FB2 + FB3 - (d) No detectado en el cultivo en maíz (< l tg/g) - (e) Maíz control utilizado para preparar los cultivos - (f) No detectado en el maíz control (< 50 ng/g). Resultados - 226

232 Con la excepción del aislado CIM-021 (MRC-6416), el cual produjo uno de los niveles de FBl más altos que se hayan registrado (8160 pg/g), los valores de producción de FBI y FB2 en los extractos de maíz de F. monilzforme fueron similares a los informados en trabajos previos. Ross y col. (1990) hallaron que el 100% de las 9 cepas de F. moníliforme aisladas 'de maíz y de alimentos derivados del mismo en Estados Unidos, produjeron FB] (de 960 a 2350 pg/ g) y FB2 (de 120 a 320 ug/g). Thiel y col. (l99la) encontraron que de 7 cepas de F. moniliforme aisladas de maíz enmohecido en Sudáfrica (Transkei), todos producían FBI y 6 de ellas FB2 en concentraciones de 85 a 7100, g/gy de 40 a 3000 tg/g, respectivamente. Estos autores, además, informaron de una cepa, la MRC-826 que produjo una concentración total de fumonisinas (FBI + FB2) de g/g. La cepa CIM-021, aislada en el maíz argentino, con una producción de FBI + FB2 de Lg/g, podría considerarse aún de mayor producción si se incluye FB3 ( ug/g). Los mismos autores (Thiel y col., l99lb) analizaron lo cepas de F. manillforme aisladas de maíz y alimentos derivados de este cereal, que estaban relacionados con casos de leucoencefalomalacia equina (ELEM) en Estados Unidos, y encontraron que el 100% de las mismas producían FBl y FB2 en concentraciones de 160 a ug/g para FBI y de 20 a 950 tg/g para FB2. Por su parte, Nelson y col. (1991) estudiaron la producción de FBl en 90 cepas de F. moniliforme proveniente de distintas zonas geográficas (sin incluir Argentina) y que fueron aisladas de diversos sustratos (maíz y derivados, sorgo, mijo y caña de azúcar). Del total de aislados, 62 produjeron FBl en concentraciones que iban de 10 a 6421 tg/g, en 26 aparecieron trazas (< de lo ag/g) y en dos cepas no se detectó producción de FBl. Abbas y col. (1992), encontraron que 4 aislados de F. monihforme, provenientes de una maleza (Datum stramom'um) en Mississippi, Estados Unidos, produjeron entre lls y 3200 tg/g de FBI. También produjeron en promedio 240, 210 y 160 tg/g de FB2, FB3 y FB4, respectivamente. Ross y col. (1992), observaron que el 100% de las 40 cepas de F. moníllforme aisladas de maíz y subproductos de diferentes zonas de Estados Unidos, Resulltulox - 227

233 producían FBI (de 7 a 996 pg/g) y que 38 de las mismas producían también F82 (de l a 316 ug/g). Los aislados fueron obtenidos de sustratos que habían estado implicados en casos de ELEM y en sindrome de edema pulmonar en cerdos (PPE). Sydenham y col. (l992a) analizaron 26 cepas de F. monilzforme, aisladas de muestras de maíz y derivados en Brasil, que estuvieron relacionadas con ELEM y con PPE. El 100% de los aisla'dos produjeron FBI y FBZ en concentraciones de 65 a 4420 ug/g y de 5 a 1380,ug/g, respectivamente. Visconti y Doko (1994), analizaron cepas de F. monilijbrme aisladas de maíz en España (lo aislados), Italia (lo), Francia (l) y Polonia (6) y encontraron que todas las cepas de cada país produjeron fumonisinas en cantidades que oscilaron entre 5 y 4100 ig/g de FBl y entre l y 855 ug/g de FB2. Castella y col. (1995), hallaron que 38 de 39 cepas de F. moniliforme, aisladas de maíz, soja y arvejas en España, produjeron FBI entre 55 y 6590 ig/g y que 31 de 39 cepas produjeron FB2 en concentraciones que variaron entre 21 y 379. g/g. En este trabajo, los niveles de FB3 hallados fueron superiores a los de FBZ en cada uno de los 12 cultivos de F. moniliforme. En la tabla se observa que el porcentaje de FB3 correspondiente a los valores combinados de FBI, FBZ y FB3 varió entre un 9 a un 30,2%. Observaciones similares fueron realizadas en los cultivos brasileños de F. monilifonne por Sydenham y col. (l992a) donde en 16 de las 26 cepas analizadas los niveles de FB3 excedieron los de FB2. Cada uno de los tres aislados de F. proliferatum del maíz argentino, produjeron diferentes cantidades de fumonisinas. Para los aislados CIM-009 (MRC-64l7) y CIM 016 (MRC-6418), las concentraciones de FBl fueron mayores que las correspondientes a FB2. Sin embargo, las concentraciones halladas son menores a las encontradas en bibliografía. Ross y col. (1990), observaron en tres cepas de F. proliferatum, aisladas de maíz y subproductos implicados en casos de ELEM y PPE, que todas produjeron FBI y FBZ en cantidades de 1670 a 2790 tg/g y de 150a 320 tg/g, respectivamente. En Sudáfrica, Thiel y col. (199la) analizando 4 cepas de F. prolzferatum (3 aislados de maíz y 1 de sorgo), hallaron que todos producían FBl (de 20 a 870 tg/g) y FBZ (de Resultados - 228

234 65 a 450 tg/g). Nelson y col. (1992b) hallaron que 9 de 31 cepas de F. prolifierarum aisladas de distintos lugares geográficos y sobre diferentes sustratos (ll de los cuales eran maíz o subproductos del mismo), producían FBI en cantidades que iban de 155 a 2936 ug/g. Por su parte, Ross y col. (1992) analizaron 8 cepas de F. proliferatum de maíz relacionado a casos de ELEM y PPE, y encontraron que la totalidad de ellas produjeron FBI (de 19 a 321 tg/g) y FB2 (de lo a 1026 tg/g). Visconti y Doko (1994), encontraron que una cepa de F. prolifieralum aislada de sorgo en España, produjo 7,9 tg/g de FBl y 1,5 tg/g de FB2. En la cepa CIM-016 la concentración de FB3 fue mayor que la correspondiente a la de FB2. Una observación similar fue hecha por Ross y col. (1992) en una cepa de F. proliferatum. Estos autores analizaron 8 cepas de F. proliferatum aislado de maíz mohoso en Estados Unidos y observaron que el 100% de las mismas producían FB3 en una concentración de 19 a 544 tg/g mientras que 3 de 8 cepas produjeron FBl (de 2 a 31 tg/g) y 6 de 8 cepas FBZ (de 3 a 67 Lg/g). Estos autores también hallaron que en 2 cepas de F. proliferatum, FB3 fue la única fumonisina producida. De las cepas aisladas en el maíz argentino, la CIM-022 (MRC-6421), difirió de las demás en que sólo produjo FB2; siendo ésta la primera vez que se encuentra un aislado de F. proliferatum sólo productor de F82, aunque Ross y col. (1992) encontraron una cepa de F. prolzferatum aislada de maíz en Estados Unidos, que produjo predominantemente FBZ (1026 tg/g de FBZ y 49 tg/g de FBI). Cabe destacar que aunque la producción de MO y de fumonisinas de las aislados de Fusaríum de la sección Liseola obtenidos del maíz recién cosechado en Argentina, fue analizada separadamente, es interesante señalar que la cepa de F. monilzforme CIM-014 aparece como productora de ambas micotoxinas. Los resultados obtenidos muestran que todas las cepas analizadas, tanto de F. moniliforme como de F. proliferatum, aisladas en la zona núcleo de producción de maíz en la República Argentina, son productoras de fumonisinas. Estudios recientemente publicados (Bottalico y col., 1995; Bresch y Urbanek, 1995; Castella y col., 1995; Resultados - 229

235 Farnochi y col., 1995; Hetmanski y Scudamore, 1995; Pietri y col., 1995; Sibanda, 1995; Sundheim y col., 1995; Yoshizawa y Yamashíta, 1995), indican que la presencia de fumonisinas en los cereales parecería afectar a todas las zonas productoras de maíz en el mundo y, en el caso particular de la zona núcleo de Argentina, la posibilidad de ocurrencia de fumonisinas es sumamente alta, y por los niveles de producción que muestran las cepas analizadas, también es altamente probable que los valores de contaminación sean notablemente elevados comparados con otros lugares del mundo. Resultados - 230

236 A partir de los resultados presentados y discutidos previamente en este trabajo, se pueden señalar dos aspectos principales. El primero está relacionado con la presencia cuali y cuantitativa de los mohos y el segundo con la detección de especies toxicogénicas. Ambos aspectos permiten evaluar cuáles micotoxinas pueden estar presentes en el maíz que se cosecha en la principal zona de producción de la República Argentina. l. Micoflora contaminante El medio agar extracto de levadura - glucosa - cloranfenicol (YGCA) fue el más indicado para el aislamiento de la micoflora contaminante del maíz. La selección de este medio de cultivo fue realizada de acuerdo a dos criterios: a) La comparación mediante estimadores resistentes del crecimiento radial de las colonias de hongos toxicogénicos de distintas especies en cada medio, con el fin de encontrar aquél en el cual los hongos crecieran con velocidades similares. b) La determinación del tiempo mínimo necesario para distinguir macroscópicamente los diferentes géneros en los distintos medios de cultivo estudiados. Se aislaron, purificaron e identificaron en el maíz recién cosechado en 1990, 2125 aislados primarios y 1100 de las mazorcas visiblemente contaminadas con hongos en la cosecha de

237 En la zona núcleo de producción de maíz en la cosecha correspondiente a 1990, se observó que en la endomicoflora el género Fusarium fue el más frecuentemente aislado y que el mismo mostró las mayores densidades relativas en las localidades muestreadas. Le siguió en importancia el género Penicillium. En la exomicoflora, Fusarium fue el género con más aislados y mostró las mayores densidades relativas en 3 de las 5 localidades. Penicillium se aisló en más muestras que Fumrium en todas las localidades. Dentro del género Fusarium la especie predominante fue F. monilíforme, seguida de F. proliferatum y F. graminearum. En el género Penicillium Ia especie más aislada fue P. decumbens, tanto endógena como exógenamente. Dentro del género Aspergillus, A. flavus predominó en ambas micofloras. El género Alternaria fue el único en el que no se observaron diferencias significativas (p < 0,01) entre la endo y la exomicoflora. La especie predominante fue A. alternata. En 1991, en las mazorcas visiblemente atacadas por mohos en Pergamino, se detectó la presencia de Díplodia mays, la cual no fue aislada en Esta diferencia podría atribuirse a las menores precipitaciones registradas en Pergamino en 1991, desde el momento de la antesis del maíz hasta la cosecha. Es interesante destacar, en 1991, el ataque de Ovularia en las mazorcas, situación de la cual no se encontraron referencias bibliográficas, ni sobre su patogenicidad, ni sobre la capacidad toxicogénica de la misma. A partir de las cepas de las especies identificadas, se constituyó un cepario, en el cual los aislados se conservan mediante técnicas adecuadas a los distintos mohos, con la finalidad que los mismos mantengan su capacidad toxicogénica. Conclusiones - 232

238 Se elaboró una guía pictórica, que incluye las claves correspondientes, para simplificar la identificación en medio YGCA de las especies más comunes que contaminan el maíz en el área de cultivo estudiada. En 1990 el nivel de contaminación fúngica del maíz cosechado en la zona núcleo fue bajo, comparado con otros países productores, pero cualitativamente entre las especies presentes, se encontraron algunas de las productoras potenciales de micotoxinas más importantes que se conozcan como F. monilzforme, F. graminearum, F. sporotrichíoides, A. flavus, P. cirrinum y A. alternata, entre otros. Esto indujo el estudio de la capacidad toxicogénica de algunas cepas de estas especies. 2. Capacidad toxicogénica Se observó, por primera vez en Argentina, que cepas de Alternaria altemata aisladas de maíz recién cosechado, produjeron alternariol y alternariol monometil eter. Los niveles de producción fueron menores a los hallados en otros países en condiciones similares, lo que indica una baja probabilidad de ocurrencia natural de estos metabolitos tóxicos en el maíz producido en la zona núcleo. No se determinó relación alguna entre la formación de esclerocios y la producción de aflatoxina Bl en maíz y tampoco entre la producción de ácido ciclopiazónico y el tamaño de los pellets y/o la coloración adquirida por el medio líquido, donde se desarrollaron las cepas de A.flavus. Los niveles de concentración de aflatoxina producidos por las cepas autóctonas, muestran que éstas son productoras débiles, mientras que la presencia de cepas de A. flavus capaces de producir ácido ciclopiazónico y la cantidad producida de esta micotoxina, indican una alta posibilidad de aparición de este metabolito, por lo cual es necesario realizar estudios de ocurrencia Conclusiones - 233

239 natural de ácido ciclopiazónico en maíz y de co-ocurrencia del mismo y aflatoxinas, ya que estas últimas son las sustancias canceri genasde origen natural, más potentes que SC conocen. No se rechazó la hipótesis de independencia entre los caracteres morfoló gicos (color, textura, surco y banda) y la producción de citrinína. Se pudo observar una relación entre el porcentaje de cepas de P. cim'num productoras de citrinina y la velocidad de crecimiento radial de las colonias. La observación de la producción de citn'nina y el número de cepas productoras indicarïan la necesidad de realizar estudios de capacidad de producción de citrinina, en maiz como sustrato, de estas cepas autóctonas y, de confirmarse altas producciones, recién entonces encarar estudios de ocurrencia. Las cepas de F. gramincarum aisladas demostraron capacidad de producción de tricotecenos del grupo A (NEO, DAS, I-IT-2),de tricotecenos del grupo B (DON y 3-ADON) y de zearalenona. El quimiotipo de producción de tricotecenos presentes es el Ia (DON, 3-ADON). El nivel de producción de estas micotoxinas fue bajo, pero la frecuencia de aparición de cepas productoras de DON y ZEA, indican la posibilidad de ocurrencia natural de las mismas en el maíz. Todos los aislados de F. sporotríchioides produjeron DON, algunos en concentraciones superiores a las observadas en cepas de F. graminearum. Se detectó una cepa de F. sporotrichioides que produjo también T-2 triol y T-2 tetraol. Las cepas de F. equiseti y F. oxysporum produjeron DON y una cepa de F. semitectum produjo DAS. Se cuantificó por primera vez en la República Argentina la producción de moniliformina por cepas pertenecientes a la sección Liseola (F. moniliforme, F. Conclusiones - 234

240 subglutinans y F. proliferatum), aisladas de maíz cosechado en la zona núcleo de producción. El 100% de las cepas de F. monilíforme y F. proliferatum ensayadas, produjeron fumonisinas en cantidades variables. Esta es la primera vez que se informa la producción de fumonisinas por cepas de F. monillforme y F. proliferatum en nuestro país. La cepa CIM 021 de F. moníliforme produjo uno de los niveles más altos de FBI + FB2 que se hayan observado en la bibliografia. Esto indicaría que la posibilidad de ocurrencia natural de fumonisinas en el maíz es muy grande. Una cepa de F. proliferatum (CIM 022) produjo sólo FB2, siendo la primera vez que se aisla una cepa con capacidad de producir solamente esta toxina. De lo expuesto, cabe resaltar que en el maíz, la problemática emergente aún no atendida en el país, se centraliza en la muy grande probabilidad de aparición de elevados niveles de concentración de fumonisinas y de ácido ciclopiazónico. Tampoco debe menospreciarse en función de la salud pública y de la importancia que este cereal representa para nuestra economia, la presencia en el mismo de aflatoxinas, zearalenona y deoxinivalenolcomocontaminantes naturales en el grano recién cosechado. la, fm} Silvia Liliana Resnik Héctor Horacio Lucas González Conclusiones - 235

241 Abarca M.L., Bragulat M.R., Bruguera M.T. and Cabañes F.l. (1988). Comparison of some screening methods for aflatoxigeníc moulds. Mycopathologia 104: Abarca M.L., Bragulat M.R., Castellá G. and Cabañes FJ. ( 994). Ochratoxin A production by strains of Aspergillus niger var. niger. Appl. Environ. Microbiol. 60: Abbas H.K., Mirocha CJ. and Shier W.T. (1984). Mycotoxins produced frorn fungi isolated from foodstuffs and soil: comparison of toxicity in fibroblasts and rat feeding tests. Appl. Environ. Microbiol. 48: Abbas H.K., Mirocha C.J. and Tuite J. (1986). Natural occurrence of deoxynivalenol, ls-acetyl-deoxynivalenol and zearalenone in refusal factor com stored since Appl. Environ. Microbiol. Sl: Abbas H.K. and Mirocha C.J. (1988). Production of fusarenon-x, nivalenol and zearalenone by Gibberella zeae isolates, and their toxicity in fibroblast and rats. Mycotoxin Res. 4: Abbas H.K., Mirocha C.J., Meronuck R.A., Pokomy J.D., Gould S.L. and Kommedahl T. (1988). Mycotoxins and Fusarium spp. associated with infected ears of com in Minnesota. Appl. Environ. Microbiol. 54: Abbas H.K., Mirocha C.J., Kommedahl T., Burnes P.M., Meronuck R.A. and Gunther R. ( 988). Toxigenicity of Fusarium prolíferruum and other Fusarium species isolated from com ears in Minnesota. Phytopathology 78: Abbas H.K., Mirocha C.J., KommedahlT., Vesonder R.F. and Golinski P. (1989). Production of trichothecenes and non-trichothecene mycotoxins by Fusarium species isolated from maize in Minnesota. Mycopathologia 108: Abbas H.K. and Bosch U. (1990). Evaluation of trichothecenes and nontrichothecene mycotoxins produced by Fusarium in soybeans. Mycotoxin Res. 6: Abbas H.K., Mirocha CJ. Vesonder R.F. and Gunther R. (1990). Acute toxic effects of an isolateof monilifonnin-producing Fusarium oxysporumand purified monilifonnin on rats. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 19: Abbas H.K., Mirocha CJ. and Gunther R. (1991). Production of zearalenone. nivalenol, moniliforrnin, and wortmanin from toxigenic cultures of Fusarium obtained from pasture soil samples collected in New Zealand. Mycotoxin Res. 7: Abbas H.K., Vesonder R.F., Boyette C.D., Hoagland R.E. and Krick T. (1992). Production of fumonisins by Fusarium monilifonne cultures isolated from jimsonweed in Mississippi..l. Phytopathol. 136: Abdelhamid A.M., Kelada I.P., Ali M.M., el-ayouty S.A. ( 992). Influence of zearalenone on some metabolic, physiological and pathological aspects of female rabbits at two different ages. Arch. Tieremahr. 42: Abramson D., Clear R.M. and Smith D.M. (1993). Trichothecene production by Fusarium spp. isolated from Manitoba grain. Can. J. Plant Pathol. 15: