Biología reproductiva y citogenética de la papa

Transcripción

1 Manual Técnico Biología reproductiva y citogenética de la papa Matilde Orrillo & Merideth Bonierbale Abril 2009 Red LatinPapa Centro Internacional de la Papa (CIP)

2 Biología reproductiva y citogenética de la papa Manual Técnico Matilde Orrillo & Merideth Bonierbale Centro Internacional de la Papa (CIP) 2009 ii

3 Tabla de Contenidos Prólogo Agradecimientos Introducción iv v vi 1 Biología reproductiva de la papa El ciclo de vida en papa Ciclo de vida asexual Ciclo de vida sexual 1 2 Mitosis (División nuclear somática) Determinación de ploidía en células somáticas Método de preparación de cromosomas en raíces de papa Conteo del número de cloroplastos en las células guarda Determinación de ploidía por Citometría de flujo 7 3 Meiosis Meiosis I Meiosis II Observación de meiosis en células sexuales Gametos 2n 13 4 Observación de polen y determinación de su fertilidad Cultivo de polen in Vitro Crecimiento del tubo polínico in vivo (en el pistilo) 17 5 Cultivo in vitro de embriones inmaduros 19 Literatura consultada 21 iii

4 Prólogo La citogenética surge de la necesidad de relacionar los hechos descritos por la genética con los fenómenos que ocurren dentro de la célula u órganos especializados. Ella ha permitido conocer la estructura y función de cada uno de los componentes de la célula, y de estructuras más especializadas, en relación con funciones como la reproducción sexual. La citogenética clásica y molecular ha hecho posible el análisis, interpretación y trascendencia de ciertas características, desde las más simples a las más complejas (cromosomas y genes, cromosomas condensados y linearizados), contribuyendo en gran medida a la resolución de problemas en aspectos taxonómicos, evolutivos y aplicativos. Asimismo, los estudios citogenéticos permiten realizar valiosos aportes al conocimiento de los mecanismos de aislamiento reproductivo y modos de especiación en las plantas. También permite la observación de los caracteres citológicos de células especializadas, su función y comportamiento ante cambios del entorno, o la serie de procesos que se suceden durante la fertilización, aportan conocimiento a la ciencia básica. En los programas de mejoramiento la citogenética ayuda dilucidar ciertos fenómenos genéticos, como: el apareamiento y entrecruzamiento entre los cromosomas homólogos, la relación entre el polen y pistilo (fertilización-fecundación) e identificación de incompatibilidades, irregularidades meióticas en híbridos, producción de gametos 2n y su relación con la formación de poliploides, etc. El presente manual servirá como guía de capacitación de investigadores, profesores, estudiantes y técnicos. El documento busca llevar a la práctica diversas técnicas clásicas y básicas, que faciliten la observación e interpretación de parámetros y resultados genéticos, ayudando a proyectar convenientemente un plan de mejoramiento, así como también en determinados estudios a nivel molecular. Los ejemplos y las ilustraciones han sido tomados de la papa, la cual, a pesar de contar con cromosomas pequeños, hace posible evidenciar ciertos fenómenos al nivel citológico y estos a su vez relacionarlos con la constitución y el comportamiento genético. Además, se da los conceptos teóricos en cada uno de los temas tratados, pudiendo estas técnicas ser aplicadas en otros cultivos. Los autores iv

5 Agradecimientos La publicación del presente Manual es gracias al soporte financiero de: Red Iberoamericana de Innovación en Mejoramiento y Diseminación de la Papa - Red LatinPapa INIA España FONTAGRO Federal Ministry for Economic Cooperation and Development (BMZ) Centro Internacional de la Papa (CIP) v

6 Introducción El número básico de cromosomas en el género Solanum es doce ( =12). En las papas silvestres y cultivadas existen diferentes números de ploidía, pueden ser 2n=2 =24, 2n=3 =36, 2n=4 =48, 2n=5 =60, 2n=6 =72. El más importante y de gran significación en la evolución de las especies de la papa es el nivel tetraploide, que cubre un amplio rango de distribución desde la parte meridional de EE.UU. a la región austral y sur de Chile. El nivel de ploidía se determina contando el número de cromosomas en las células somáticas y/o células sexuales. Otro método rápido y directo es por citometría de flujo que cuantifica la cantidad de de ADN nuclear, sin embargo necesita de un aparato llamado citómetro de flujo. El análisis citogenético ha sido ampliamente usado en estudios de genética, comportamiento de los cromosomas, compatibilidad cromosómica, evolución, filogenia, origen y taxonomía, así como también para determinar la viabilidad del polen evaluando su fertilidad tanto in vitro como in vivo (germinación in situ); determinar la presencia de gametos no reducidos, el mecanismo por los cuales se producen etc., estudios que nos permitirán estimar el potencial de las especies o híbridos para propósitos de mejoramiento permitiéndonos desarrollar las estrategias a seguir en la transferencia de resistencias a enfermedades, plagas, etc., a través de la manipulación de ploidía. Y es a través de la biología reproductiva ya sea asexual o sexual por la cual las plantas producen nuevos individuos, así: Microsporogénesis, megasporogénesis, barreras de pre y post fertilización, mutantes meióticos, polinización, embriogénesis, desarrollo del endospermo, etc., están involucrados en todo el proceso de vida, y su entendimiento nos provee de una guía para la selección de las hibridizaciones que serían exitosas tanto artificialmente como en la naturaleza, proporcionando las llaves para una eficiente y efectiva manipulación del material del germoplasma silvestre, cultivado y avanzado de papa. Alguno de los más importantes tipos de información necesitada por un mejorador incluye los principios de genética y citogenética. Nuevas técnicas citológicas moleculares como FISH, GISH, DNA fibers, abren actualmente un abanico de oportunidades, sirviendo como intermediario entre mapas físicos y mapas genéticos, mostrando posiciones aproximadas de genes y marcadores moleculares, en sus distancias relativas a marcadores estructurales como centrómeros, telómeros, bandas de heterocromatina y constricciones secundarias. vi

7 Capítulo 1. Biología reproductiva de la papa 1.1 El ciclo de vida en papa Hay una generación diploide, que consiste en una serie de divisiones mitóticas, seguido por meiosis. Continúa con una serie de divisiones haploides, seguido de la fusión de dos núcleos haploides (gametos), para dar un diploide. Es convencional llamar a la fase haploide gametofito y la diploide esporofito Ciclo de vida asexual Reproducción vegetativa de la papa: Asegura la conservación clonal del genotipo, una nueva planta se forma a partir de tubérculos, brotes o yemas dando lugar a clones genéticamente idénticos a la planta original, reproducción que se realiza por mitosis. La propagación asexual ha sido una gran ventaja para los mejoradores de papa puesto que se puede fácilmente obtener un genotipo seleccionado y multiplicarlo. Otro uso práctico de la propagación asexual es el cultivo de tejidos y el cultivo de meristemas para la erradicación de algunos patógenos Ciclo de vida sexual Reproducción sexual de la papa: Permite que el material genético de dos individuos se combinen y se formen nuevas combinaciones alélicas, requiere de la participación de órganos reproductivos femeninos (pistilos) y masculinos (anteras) y por el proceso de polinización se formen bayas con semillas y cada una de estas constituye un nuevo individuo. Morfología floral: las flores se encuentran reunidas en agregados llamados inflorescencias, sosteniendo a la inflorescencia se encuentra el pedúnculo, y lo que sostiene a cada flor es el pedicelo, que está dividido en pedicelo inferior y superior. Una flor contiene 2 juegos de envolturas florales: el cáliz y la corola los que forman el receptáculo floral ubicado debajo de las partes fértiles de la flor y compuesto por los estambres y el pistilo. El estambre consiste de un corto filamento que sostiene a la antera con dos lóbulos que contiene el polen, los cinco estambres se encuentran separados de la corola. El pistilo está diferenciado en ovario, en la parte baja lleva los óvulos, el estigma es el que recibe el polen y el estilo es el que conecta a ambos. Cada óvulo contiene una célula madre llamada megaspora, la cual está rodeada de un tejido llamado nucela y de un integumento, cuando es fertilizado y maduro el óvulo desarrolla en una semilla. Esta fase comprende dos aspectos: Meiosis y fertilización. El más importante acontecimiento de la reproducción sexual es la creación de variación genética, nuevos genotipos con atributos genéticos de ambos padres pueden estar combinados en las semillas formadas. De dos eventos en la meiosis como es el crossing over en la Profase I y la separación al azar de bivalentes en Metafase I, podemos decir que cada producto es un único genotipo. El uso práctico de la reproducción sexual es lo que constituye una de las formas para la conservación de germoplasma, especialmente silvestre, otro uso es para la producción de semilla verdadera de papa. 1

8 Megasporogénesis. Este proceso tiene lugar en el tejido del ovario (contiene de 300 a 600 óvulos) y en las células madre de las megasporas, dando lugar a células reproductoras llamadas sacos embrionarios, que contienen al gameto femenino u ovocélula. Una célula materna, megaspora, mediante la I y II división meiótica forma 4 megasporas, las 3 superiores degeneran y la inferior se convierte en megaspora funcional, esta dará origen al saco embrionario, que se agranda por megagametogenesis ocurriendo tres divisiones mitóticas, sin citocinesis que darán origen a 8 núcleos que al orientarse forman el saco embrionario. Uno de los 3 núcleos del extremo micropilar del saco embrionario se trasforma en huevo funcional. Hay varias alternativas en la formación del saco embrionario, la descrita ocurre en la mayoría de las Angiospermas. Microsporogénesis. Este proceso tiene lugar en el tejido esporágeno de las anteras, los núcleos de células madres del polen son muy largas justo antes de la meiosis y en la formación de las tétradas de las microsporas la pared de callosa alrededor de cada célula madre del polen puede ser detectada durante la iniciación de la meiosis y en cada nueva microspora joven de la tétrada, la que es también separada por una capa de callosa después de la II división meiótica, tan pronto como la formación de la pared externa del polen empiece a formarse, la callosa empieza a desaparecer. Las capas meristemáticas que dan origen a las diferentes estructuras u órganos en las plantas, son denominadas L1 que dan lugar a la epidermis (cloroplasto), L2 que forman las hojas, tallos y flor (órganos sexuales) y la L3 que generan los tejidos internos del tallo. 2

9 Capítulo 2. Mitosis (División nuclear somática) Este proceso ocurre en las células conocidas como meristemas (raíces, hojas, flores) y meristemas axilares, estas estructuras tienen la capacidad de dividirse a lo largo de todo el ciclo de vida del organismo. Es un proceso continuo, en el cual se suceden en una secuencia cuidadosamente ordenada los complejos preparativos para la división, por la cual se hace un reparto equitativo del material genético ya duplicado entre las dos células resultantes, manteniendo así la ploidía original de la célula. Implica que cada cromátida pueda migrar a un diferente polo, separación que es posible mediante el huso mitótico o acromático, estas fibras están formadas de microtúbulos y sus proteínas asociadas por un proceso de polimerización, que se asocian a las cromátides permitiendo que cada una migren hacia los polos una vez que ambas se separan a nivel centromérico. Esta polimerización puede ser inhibida experimentalmente y muchos tratamientos con sustancias como la colchicina, 8-hidroxiquinoleína, Tjio y Levan (1950), paradiclorobenceno, piretroides (Klein, 1990, Watanabe y Orrillo 1993, Chen, 2005) y tratamiento por frío pueden efectivamente acumular células en metafase y cromosomas condensados durante la mitosis. La mitosis comprende una división nuclear y somática (citocinesis) lo que permite que los organelos pasen más o menos al azar a una u otra de las dos células. El más importante carácter de la mitosis es que el número cromosómico permanece constante a través de sucesivas divisiones celulares, con una exacta distribución de cromosomas en las nuevas células formadas, genéticamente idénticas entre sí, manteniéndose la ploidía original de la célula. Convencionalmente la mitosis se divide en cuatro etapas: Profase, metafase, anafase y telofase. Interfase. Es el periodo entre las sucesivas divisiones donde los cromosomas son prácticamente invisibles aún con la ayuda del microscopio, durante esta fase antes que la célula se divida tiene lugar la replicación, que es la síntesis del ADN y formación de las fibras que conforman el uso mitótico o spindle bipolar. Este periodo pertenece a las etapas G1, S, G2. El genoma completo se replica una y solo una vez en cada ciclo. Profase. En esta etapa se aprecia la aparición nítida de los cromosomas en el núcleo, ya están suficientemente condensados y son visibles bajo el microscopio óptico. Se ve, que cada cromosoma consiste en dos copias longitudinales, llamadas las cromátidas hermanas, se observan claramente unidas por los centrómeros, el nucléolo pierde visibilidad, la membrana nuclear desaparece, el huso acromático va tomando cuerpo y muchas fibras cortas lo forman, las fibras polares, que llegan desde cada polo del huso a la región central hasta la mitad y las fibras cinetocóricas que se insertan en los cromosomas duplicados. Como vemos, estos dos grupos de fibras posibilitan la separación de las cromátidas hermanas durante la mitosis, los cromosomas inician un proceso de acortamiento y engrosamiento. Al final de la profase, los cromosomas están completamente condensados y con la desaparición de la envoltura nuclear, quedan en contacto con el citoplasma. 3

10 Metafase. En esta etapa, los pares de cromátidas, se acortan y se alinean en un solo plano alrededor del centro de la célula, se observan más gruesas. Anafase. En esta etapa se duplican y separan los centrómeros y las cromátidas hermanas se liberan, se repelen y son engarzadas por las fibras del huso que hacen tracción sobre ellas, dirigiéndose a los polos, convirtiéndose cada cromátida en un nuevo cromosoma. A medida que continúa la anafase, los dos conjuntos idénticos de cromosomas se mueven hacia los polos opuestos del huso. Telofase. Al iniciarse esta etapa se nota la futura región nuclear y aparece la membrana nuclear, los cromosomas pierden su estado de condensación y se alargan. Comienza la formación del nucléolo. Se produce simultáneamente la citocinesis, o sea la segmentación y separación del citoplasma, se termina de formar la placa celular, la nueva pared celular entre las células recién formadas. 2.1 Determinación de ploidía en células somáticas Ploidía es un término referido al número de grupos o juegos de cromosomas que una célula posee Método de preparación de cromosomas en raíces de papa Para una correcta determinación del número de cromosomas es necesario contar con técnicas citológicas que den buenos resultados, con un número aceptable de metafases contables, con cromosomas bien separados y coloreados, por lo que las muestras deberán ser colectadas en estado de metafase. Para la acumulación de cromosomas metafásicos varios pre-tratamientos químicos son usados y el mejor protocolo usado en nuestro laboratorio es descrito (Watanabe y Orrillo, 1993). No hay una técnica universal, cada laboratorio toma una o varias técnicas de acuerdo a las exigencias de cada cultivo. El conocer la ploidía de una especie es de gran ayuda en la determinación taxonómica y de gran importancia en los programas de mejoramiento. La papa no es una especie ideal para estudios citogenéticos. Los cromosomas somáticos de S. tuberosum miden de 1.0 a 3.5 μm (Dong et al., 2000), nuevas técnicas (FISH; GISH, Fiber FISH), estudios de cromosomas en estadío de Paquiteno, permiten hoy la identificación de los cromosomas y la caracterización del genoma de la papa. Figs. 1, 2 y Materiales Sembrar en macetas pequeñas, con musgo bien fino, o vermiculita tubérculos bien brotados (también se pueden usar esquejes de plantas bien enraizadas, semillas germinadas, plantas de in vitro). La colección de raíces se realiza en plantas bien pequeñas de unos 5-10 cm de altura. Unas horas antes de colectar es conveniente regar bien las plantas. La colección de las raíces se hace generalmente temprano, en la mañana alrededor de las 11 am. 2. Pre-tratamiento Usando una pinza de punta bien fina se colecta puntas de raíces, aproximadamente de 10 mm y se coloca en frasquitos o vials conteniendo agua destilada a temperatura ambiente, después de 1 h pasar a una solución de (Permetrina: La composicion quimica que figura en el envase es la siguiente: (3-Fenoxifenil)metil 4

11 Método de preparación de cromosomas en raíces de papa Colección de raíces en: (H 2 O destilada + 15uL Permetrina, ph 5-5.8) 24 horas Eliminar la solución de pre-fijación Hidrólisis con HCl 1 N previamente precalentado Colocar las raíces en Placa Petri Eliminar la solución & Adicionar H 2 O destilada 8-10 min a 60 0 C Fig. 1: Toma de la muestra de raíces de papa, prefijación e hidrólisis con HCl. Tinción con Lacto-Propiónico Orceína (15min aprox.) Cortar 1-2mm de la punta de las raíces Aplastado (Squash) Presionar para extender el tejido Lámina lista Fig. 2: Coloración con lacto propiónico orceína, aplastado (squash). a

12 Observar al microscopio 4X 2X 4X Fig. 3: Observación de células en metafase de raíces de papa, ploidías 2 y 4. b

13 (±) cis-trans 3-(2,2-dicloroetenil) 2,2-dimetil carboxilato de cicloropropano (Permetrina),15 μl en agua helada a ph 5 a ph 5.8, por 24 horas a 4 C. Caso de no tener disponible la Permetrina, utilizar agua helada por 48 horas a 4 C, colocando las botellitas conteniendo las raíces en un termo con hielo. 3. Fijación Es optativo, se puede obviar este paso si es que se desea ver las muestras inmediatamente, caso de querer guardar las muestras por más tiempo se fijaran en alcohol 96 % 3p: ácido acético 1p; y se deja a medio ambiente por 24 horas. Si se quiere guardar en fijador hacerlo en alcohol de 70% y en refrigeración a 4 C, prepare suficiente cantidad de solución fijadora, de tal manera de cubrir bien las raíces. Los fijadores se preparan al momento de ser usados. 4. Hidrólisis Se colocan las muestras en HCl 1N a 60 C de temperatura, por 8-10 minutos; el ácido se calentara previamente, transcurrido el tiempo de hidrólisis se procederá a quitar el ácido y a lavar con agua destilada. 5. Coloración Con lacto-propiónico orceína u orceína-acética, se procede a colocar las raíces en pequeños contenedores o Petris conteniendo el colorante. 6. Aplastado o squash Se colocan las raíces en un porta-objeto, usamos solamente 1-2 mm de la punta, con una gota del mismo colorante (también podemos usar ácido acético al 45 %), se coloca un cubre-objeto y asegurando uno de los extremos procedemos con una varilla de goma, o un borrador de un lápiz o la punta de él a presionar suavemente, o dando golpecitos repetidos, pero firmes, permitiendo la disociación del tejido. Colocar el porta-objeto entre papel de filtro y presionar fuerte con el dedo pulgar squash, pero tratando de evitar cualquier movimiento lateral del porta-objeto. 7. Observación La muestra se coloca bajo microscopio óptico, inicialmente a 10 X, 20 X con el objetivo de seleccionar las mejores metafases y luego pasar a objetivos de 40 X y 100X para el conteo de cromosomas, las células deben estar intactas, no superpuestas ni con artefactos que puedan distorsionar el conteo exacto de cromosomas. Preparación de Lacto-propiónico orceína: Disolver 1 g de orceína en una mezcla de 23 ml de ácido láctico y 23 ml de ácido propiónico a temperatura ambiente, completar a 100 ml con agua destilada, agitar bien y filtrar (Haskell y Wills, 1968) NOTA: Para obtener buenos resultados es necesario tener muy buenas raíces, finas, no muy gruesas; las plantas deben estar en perfecto estado de desarrollo. Pre - tratamiento Propósito: Separación de los cromosomas, acortarlos, y la clarificación de los centrómeros a fin de hacerlos visibles para chequear el número básico. 5

14 Otro pre-tratamiento que da buenos resultados es con agua helada, en lugar del uso de Permetrina, se utiliza agua destilada helada por 48 horas a 4 C y colocando los frascos (vials) que contienen las raicillas en un termo en el cual se ha colocado cubitos de hielo con agua, el resto del procedimiento es igual. Otras técnicas utilizan: 8-Hidroxiquinoleía, es insoluble en agua y éter. Soluble en alcohol, acetona, cloroformo y benceno. Preparación: 0.002M, solución en agua destilada. Pesar 0.29 g de 8- Hidroxiquinoleína y disolver en 25 ml del solvente escogido (generalmente alcohol) y se agrega el agua destilada poco a poco, haciéndola deslizar muy lentamente por una bagueta o vara de vidrio, evitando la precipitación de solución, hasta completar 1 l. Usar un frasco oscuro y guardar a medio ambiente. Tratamiento por un mínimo de 3 horas, lo óptimo sería 5 horas a 15 C. Colchicina, % W/V en agua destilada por 4-6 horas a C en refrigeración. Es una técnica popular desafortunadamente bastante cara y con posibilidad de ser este producto carcinogénico. Para obtener raíces en mitosis se puede usar bajas concentraciones de colchicina en semillas en estado de germinación. Paradiclorobenceno, alpha-bromonaftaleno, son otros de los químicos usados Conteo del número de cloroplastos en las células guarda Aunque no es una técnica para determinar la exacta ploidía de un genotipo, cuancdo manejamos una gran cantidad de material nos permite discriminar el grupo diploide de los otros grupos. Por ejemplo cuando queremos seleccionar haploides (2n=2 =24). 1. Toma de la muestra Colectar hojas o los folíolos terminales de una misma planta y colocarlos en una placa Petri con papel toalla o filtro humedecido con agua. 2. Procedimiento Obtener con la ayuda de una pinza fina el tejido epidérmico del envés de la hoja, de la zona próxima a las nervaduras, e inmediatamente colocarlo sobre un portaobjetos donde previamente se ha colocado una a dos gotas de solución de KI - I y luego volver a colocar muy suavemente encima de la muestra otras dos gotas de KI - I y cubrir suavemente con un cubre-objeto. 3. Observación Examinar la preparación bajo el microscopio óptico, a un aumento de 10 X, 20 X ó 40 X. El contaje de cloroplastos se realiza solo en una de las células guarda de los estomas. El número promedio de cloroplastos nos dará una indicación de nivel de ploidía, así para una ploidía 2x en papa, el promedio es de 5-8 cloroplastos por célula guarda, contajes mayores a 9 nos indica un nivel más alto de ploidía. Es aconsejable por lo menos obtener el promedio en 10 células guarda. Figs. 4 y 5. 6

15 Conteo del número de cloroplastos en las células guarda Colecta de hojas, foliolos Obtención del tejido epidérmico del envés usando una pinza fina Muestra lista para su cbservación Fig. 4: Procedimiento para la obtención de muestras para el contaje de cloroplastos en células guarda de estomas. Promedio del N de cloroplastos por célula guarda Posible ploidía núcleo Huamán, X 3X 4X 5X Cloroplasto Célula guarda Contar los cloroplastos en 10 células guarda, de tamaño similar y solo una célula por estoma Genotipo Diploide Posiblemente Genotipo Tetraploide Fig. 5: Criterios de evaluación para el contaje del número de cloroplastos. c

16 Determinación de ploidía por Citometría de flujo Fig. 6: Citómetro de Flujo (Ploidy Analyser) PARTEC I. Fig. 7: Materiales requeridos. d

17 Es recomendable utilizarlo en la selección de diploides y no para ploidías más altas. Huaman (1995) asocia niveles de ploidía al número de cloroplastos por célula guarda en determinaciones hechas en papas cultivadas. Preparación de KI-I 1. 1 g de KI 2. 1 g de I 3. Ambos reactivos disolver en 100 ml de Etanol al 70%, guardar en frasco oscuro Determinación de ploidía por Citometría de flujo La técnica de la citometría de flujo es, básicamente un método analítico que permite la medida de emisión de fluorescencia y dispersión de luz de muestras marcadas (núcleos) con sondas fluorescentes, que a medida que desfilan, de una en una y son arrastradas por un flujo portador del analizador de ploidía (Partec PA-II Ploidy Analyser), que fluye del punto de inyección al detector y finalmente a la botella de desecho, frente a un sistema de detección (lámpara de mercurio que emite luz ultravioleta de 488 nm de longitud de onda). La corriente de núcleos en suspensión pasa por una cámara de cuarzo (conducto de 10 µm que no permite el paso simultáneo de dos unidades), mientras es iluminada por la luz ultravioleta; produciéndose dos fenómenos simultáneos: Dispersión de luz y el fluorocromo DAPI fijado al ADN emite una fluorescencia proporcional a la cantidad de ADN en el núcleo, emisión de luz fluorescente que es reconocida y captada por un fotorreceptor. De esta forma, la citometría de flujo permite medir la cantidad de ADN existente en los núcleos de las células, es un método rápido y directo de establecer la ploidía de una planta. El citómetro de flujo debe ser previamente calibrado antes de iniciar el proceso de evaluación de ploidía. Fig. 6. Calibración del aparato El sistema se calibra previamente situando el pico correspondiente a un contenido de ADN igual a 2C (diploide) sobre el valor 100 de la escala de abscisas, o en su defecto sobre el valor 50. El patrón se determina según el área relativa en porcentaje de los picos correspondientes a las distintas poblaciones celulares (2C, 4C, 5C, etc.). El GAIN, se utiliza para mejorar la ampliación y el alto voltaje del foto multiplicador, entre 0 y 1000 V, según el aumento o reducción del Gain la relación eje de abscisas (eje x) y ploidía puede tener con valor = 50, 2C diploide, 75 igual a 3C (triploide) y 100 igual a 4C (tetraploide), mientras si se aumenta dicho GAIN, este puede tener la siguiente relación: 100= 2C (diploide), 150=3C (triploide) y 200= 4C (tetraploide). Es importante también el uso de controles de conocida ploidía en cada cultivo a evaluar. Procedimiento 1. Materiales Colectar folíolos jóvenes de la parte apical y colocarlos en placas Petri, y luego tomar apróximadamente unos mg. Fig. 7. 7

18 2. Preparación La muestra a analizar se coloca en una placa Petri y se adiciona 0.5 ml del buffer de extracción (CyStain UV Ploidy) y se cortan los folíolos con una hoja de afeitar, seccionando muy finamente en pequeños cuadraditos. Una vez está disgregado el tejido, se le adiciona nuevamente 1.5 ml del buffer de extracción y se incuba por 5 minutos a temperatura ambiente. Este buffer de extracción de núcleos, contiene el fluorocromo DAPI (4, 6 diamino-2-phenilindole), que tiñe el ADN. Una vez resuspendida la mezcla se pasa a través de un filtro de nylon de 30 µm (Partec 50 µm, Cell Trics TM ), lo cual permite separar los núcleos, que caen a un tubo receptor, el cual se coloca en el analizador. Figs. 8 y Observación Los resultados de la muestra son cuantificados por el sistema electrónico, que se encarga de la cuantificación de los destellos de la fluorescencia y de la luz dispersada, bajo el control del ordenador, el cual almacena los datos de miles de células por cada muestra, y representa los resultados gráficamente. El sistema informático que lleva incorporado el citómetro convierte cada señal fluorescente en un resultado que es presentado en un histograma en una escala logarítmica. El gráfico resultante ordena los datos según el contenido nuclear de ADN en el eje de abscisas, y contabiliza el número de núcleos de cada tipo en el eje de ordenadas. Figs. 9 y 10. Todas las células que pertenecen a un solo pico tienen la misma cantidad de ADN medido, y este pico representa un nivel de ploidía. El ruido consiste en una pequeña señal indeseada y aparece en los canales bajos. Una razón para este ruido son los fragmentos resultantes de las células al momento de su preparación. La cuantificación del ADN nos permite conocer también la existencia de aneuploidías, donde los histogramas se desplazan levemente hacia uno u otro lado de la ploidía esperada. Interpretación del histograma El histograma resultante muestra el número de células por ml, que han sido contabilizadas (eje y), mientras que en el eje horizontal (eje x) indica el contenido nuclear de ADN, así todas las células que pertenecen a un solo pico tienen la misma cantidad de ADN y un pico representa un nivel de ploidía. Fig

19 Colectar aprox. 50mg hojas jóvenes apicales Cortar solo los foliolos Colocarlos en 0.5 ml el buffer de extracción (Cystain UV ploidy) Adicionar 1.5ml de CyStain UV ploidy e incubar por 5 minutos Picar muy suavemente y de arriba hacia abajo Fig. 8: Procedimiento utilizado en la preparación de muestras para su análisis en el Analizador de ploidía (Citómetro de Flujo). Filtrar la muestra en filtros de 30µm (Partec Cell Trics 30) Colocar la muestra en el Clitómetro de Flujo Citómetro de Flujo Ploidy Analyzer (PA) Partec I Fig. 9: Filtración de la muestra y su colocación en el Citómetro de flujo para su lectura. e

20 Se establece los parámetros para la lectura de la muestra Histograma de la muestra K.Soto Fig. 10: Medición, procesamiento de los datos y representación de los resultados. 2x 4x < 4X Fig. 11: Histogramas con los resultados para plodías 2, 4 y <4, encontradas en GON, ADG y en un híbrido somático respectivamente. f

21 Capítulo 3. Meiosis Este término se deriva del griego meioum (reducir). Cada organismo tiene un número de cromosomas característico de su especie. Este proceso ocurre antes de la formación de las células reproductivas o esporas, en el cual el número diploide normal se reduce a un juego único o haploide (n) en cada gameto, el número haploide se designa como n y el número diploide como 2n. La meiosis es también precedida por una fase S, durante la cual ocurre la síntesis de ADN (algo de síntesis de ADN ocurre durante la primera profase de la meiosis). Antes de iniciarse la meiosis el material genético en el núcleo diploide ha sido replicado sólo una vez, cada cromosoma consiste de dos cromátidas hermanas idénticas. Consiste en dos divisiones nucleares sucesivas, ellas son distinguidas como meiosis I y meiosis II. La comprensión del proceso de la meiosis es fundamental para interpretar el proceso y función de la recombinación genética en la evolución cromosómica. Todo este proceso es dinámico, abarca atracción, apareamiento, intercambio y ulterior separación de los cromosomas homólogos paternos y maternos. Durante este proceso cada gameto lleva sólo un miembro de cada par de homólogos. En toda célula diploide, cada cromosoma proviene del gameto de uno de los progenitores y su pareja, del gameto del otro progenitor, estos pares de cromosomas se conocen como pares homólogos, los que se asemejan en tamaño, forma y en el tipo de información hereditaria que contienen. Además de mantener un número constante de cromosomas de generación en generación, es una fuente de nuevas combinaciones de material genético dentro de los mismos cromosomas. Cada división meiótica es formalmente dividida en profase, metafase, anafase y telofase. De esos el más complejo y largo es la profase I la cual está subdividida en: leptoteno, zygoteno, paquiteno y diacinesis. 3.1 Meiosis I Profase I La cromatina se condensa y los cromosomas se hacen visibles con el microscopio óptico. Durante este proceso cada gameto lleva sólo un miembro de cada par de homólogos. Leptoteno: Los cromosomas aparecen como largos filamentos, y repartidos a lo largo se pueden observar los cromómeros como las cuentas de un rosario. No se pueden individualizar los cromosomas y la membrana nuclear está presente. Zygoteno: Comienza el apareamiento de los cromosomas homólogos, a este proceso se le llama sinapsis, aquí se hace evidente la pareja de cromosomas homólogos, atraídos uno con otro. El apareamiento es muy preciso, punto por punto 9

22 a manera de un cierre de cremallera. Cada homólogo consta de dos cromátidas hermanas y el par de homólogos consta de cuatro cromátidas (tétrada) y a los pares asociados se les llama bivalentes. Es el complejo sinaptonémico de naturaleza proteica el que mantiene los cromosomas homólogos estrechamente unidos formando un bivalente, se cree que su existencia es necesaria para que se produzca el entrecruzamiento, la formación de quiasmas (del griego, Chiasma: punto de cruzamiento) y el evento de recombinación. Paquiteno: Este estado evidencia la unión longitudinal de los homólogos y desdoblados cada uno en dos cromátidas. Las cromátidas de cada homólogo se llaman cromátidas hermanas. Dos cromátidas homólogas se rompen al mismo nivel y de inmediato se intercambian en este punto ambos segmentos, las otras dos quedan intactas. Esto es lo que se conoce como entrecruzamiento, la evidencia citológica visible son las llamados quiasmas. Una serie de intercambios de material genético ocurre entre cromátidas no hermanas u homologas. Diploteno: Los cromosomas homólogos comienzan a repelerse entre sí, excepto en los puntos de intercambio o quiasmas. El nucléolo y la membrana nuclear desaparecen y el crossing-over se hace visible. La consecuencia es la formación de nuevas combinaciones de genes, con alteración de la información genética localizada en los cromosomas afectados. Diacinesis: Las bivalentes se hallan más condensadas. Paulatinamente el proceso de terminación continua a medida que el número de quiasmas disminuye y empieza a aparecer el huso acromático, los bivalentes quedan unidos por sus centrómeros al huso, y la membrana nuclear desaparece y comienza a formarse el spindle Metafase I Los bivalentes se sitúan a cada lado del plano ecuatorial. El huso (spindle) se ha formado completamente y cada homólogo tiene su centrómero. Por ello el cromosoma completo se dirige a uno de los polos. Los cromosomas aparecen más condensados Anafase I Los cromosomas homólogos se han separado y migran hacia los polos respectivos u opuestos de la célula por acción de los microtúbulos del huso acromático, sin embargo debido a los entrecruzamientos ocurridos, las cromátidas no son idénticas como lo fueron al comienzo de la meiosis. Nuevas combinaciones han surgido en cromátidas no hermanas, en tanto que las otras dos quedan intactas. Los centrómeros no se dividen, las cromátidas hermanas continúan unidas, pero los homólogos se separan. Como resultado para cualquiera de los pares homólogos, un polo recibe un cromosoma de origen paterno y el polo contrario un cromosoma de origen materno. Y no todos los cromosomas paternos se dirigen hacia el mismo polo. De hecho cualquier combinación de cromosomas maternos y paternos puede desplazarse hacia un polo determinado Telofase I Los cromosomas propenden a alargarse, algunas veces el nucléolo y la membrana nuclear reaparece. Las células formadas contienen la mitad del número de cromosomas presentes en la célula madre. Set haploide de cromosomas. Los cromosomas se encuentran reagrupados en cada polo. 10

23 Ha concluido la fase reduccional en la cual el par de cromosomas homólogos son separados en dos células hijas. 3.2 Meiosis II Se parece a la mitosis, excepto en que no está precedida por la duplicación del material cromosómico Profase II Cada célula es haploide, la membrana nuclear empieza a desintegrarse y el nucléolo desaparece al final de la profase II, ésta es corta y le sigue una reorganización del huso acromático Metafase II En esta etapa los cromosomas que han quedado en los polos se colocan en el plano ecuatorial y se adhieren a las fibras del huso Anafase II En esta fase los centrómeros se dividen y las cromátidas hermanas, que ahora son cromosomas, se separan y se van hacia los polos opuestos Telofase II En esta fase se forma una tétrada de microsporas, se han formado nuevas paredes celulares, cada núcleo lleva un número haploide de cromosomas, cada cromosoma está representado una vez, Y cada núcleo de un segmento puede recibir cualquier combinación factible de cromátidas de origen materno y paterno. La división meiótica tiene tres importantes eventos 1. Transformación de los cromosomas por la ocurrencia del entrecruzamiento (crossing-over) en combinaciones completamente nuevas. 2. Re-arreglo del genoma por una distribución al azar de los cromosomas homólogos. 3. Reducción del número de cromosomas de diploide (2n) a haploide (n). De estos eventos, el más decisivo es la recombinación, siendo probablemente la más importante contribución a la evolución y a la diversidad genética. 11

24 3.3 Observación de meiosis en células sexuales de papa El proceso de microsporogénesis generalmente termina entre los 7 y 14 días anteriores a la floración, muestras apropiadas de botones florales dependen de varios factores: como el medio ambiente, la hora y los factores genéticos. Figs. 12, 13, 14 y 15. Procedimiento 1. Fijación Usar Carnoy modificado fresco (3:1 alcohol absoluto: solución saturada de acetato férrico en ácido propiónico), el cual es dispensado en frascos con tapa rosca, sumergir la muestra de botones de diferentes estados de desarrollo, previamente haciendo un corte con un bisturí en la punta de los botones para permitir que el fijador penetre. Aquí deben permanecer de 24 a 48 horas a temperatura ambiental. Para largos periodos de almacenamiento en refrigeración, se recomienda guardar las muestras en etanol al 70 % a 4 C. 2. Preparación Tomar varios tamaños de botones en una placa Petri o en un vidrio de reloj con 70 % de etanol y chequear cada botón si está en estado óptimo para la observación de meiosis. Diseccionar la antera, sobre una lámina porta objeto, cortando los extremos aplastar presionándola con una aguja de disección para luego remover los restos de la antera y colocando rápidamente una gota de carmín propiónico o de lacto propiónico orceína, cubrir con un cubre objeto. Las agujas, pinzas de disección deben limpiarse frecuentemente para evitar su corrosión. 3. Observación Examinar la preparación bajo el microscopio óptico, a un aumento de 40 X o 100 X, si estuviera en un estadío óptimo, calentar levemente la muestra pasando por la llama de un mechero y retirar el exceso de tinte colocando la lámina entre 2 papeles de filtro. Se puede golpear suavemente el cubre objeto para expandir los cromosomas. Preparación de la solución saturada de acetato férrico: Se añaden 10 g de acetato férrico a 100 ml de ácido propiónico puro, mezclar bien, dejar sedimentar y decantar cuidadosamente la solución, evitando que parte del precipitado pase a la solución a usarse. Preparación de carmín propiónico: Preparar una solución al 45% de ácido propiónico, calentar hasta que hierva, luego añadir 1 g de carmín, dejar hervir y filtrar. A esta solución agregar 5 gotas de solución saturada de acetato férrico en 45% de ácido propiónico. 12

25 Observación de meiosis en células sexuales Botones florales recolectados en Fijador Carnoy Modificado Anteras en alcohol de 70% colocadas en placa Petri listas para su disección Antera diseccionada Fig. 12: Fijación y preparación de muestras de botones florales. Células madre del polen Microsporogénesis Células nutritivas Células madre del polen Arquesporio Células del Tapetum Meiosis Polen Fig. 13: Microsporogénesis -Tejido esporágeno - Formación del polen. g

26 Profase I Paquiteno Diacinesis AI MI Metafase I Anafase I Fig. 14: Meiosis I, mostrando Paquiteno - Diacinesis (Profase I), Metafase I y Anafase I. Telofase I M II AII Metafase II, ejes de los spindles (flecha) son paralelos Anafase II, ps y telofase temprana II (flecha) TI Telofase I, Anafase II AII Anafase II, husos normales y paralelos Fig. 15: Meiosis I, Telofase I y Meiosis II, Metafase II, Anafase II, Telofase II, husos normales y paralelos. h

27 3.4. Gametos 2n Gametos con el número somático de cromosomas (gametos 2n) son el resultado de mecanismos que afectan formación normal de los gametos, durante la fase premeiotica, meiótica y post meiótica. La incidencia de gametos 2n es frecuente en el reino vegetal, y su ocurrencia ha sido reportada en muchas especies de familias, incluyendo Crucíferae, Leguminosae, Rosaceae, Solanaceae y Vitaceae (Veilleaux, 1985). Los gametos no reducidos son de gran utilidad, ya que facilitan la poliploidización sexual y a la vez proporcionan un método muy efectivo para transmitir la heterocigosidad y la epistasis del nivel 2X al 4X. Pueden ser detectados: Por la ocurrencia de progenie tetraploide en cruzamientos 2x 4x, 4x 2x; distribución bimodal del diámetro del polen: grande (2n) & normal (n). La presencia de tétradas, diadas y/o triadas en el estadío de formación de microsporas. Fig. 16. La poliploidía es una característica distintiva del reino vegetal y ha tenido un papel muy importante en la evolución de las plantas superiores especialmente la Angiospermas, incluyendo las especies cultivadas de mayor importancia mundial tales como el trigo, papa, avena, caña de azúcar y algodón que son poliploides. Camadro (1986). Los poliploides pueden originarse por duplicación espontánea del complemento cromosómico somático (poliploidización asexual) o por el funcionamiento de gametos 2n (poliploidización sexual). 2n n Formación de tétradas y diadas Formación de polen normal y polen 2n Formación de triadas (orientación tripolar) y tétradas Fig.16: Formación de díadas por husos paralelos-polen 2n y formación de triadas en Telofase II, los husos adoptan una configuración tripolar. 13

28 Capítulo 4. Observación de polen y determinación de su fertilidad El término viabilidad o fértil se refiere a la capacidad de los granos de polen de germinar en el estigma, este conocimiento es uno de los más importantes aspectos para una eficiente reproducción sexual. Granos de polen funcional (viables o fértiles) se observan claramente redondos con el citoplasma teñido uniformemente de rojo, con morfología normal, son considerados potencialmente funcionales, mientras los granos abortivos, no viables o estériles, no se tiñen, o son poco coloreados, con el citoplasma granular y permanecen encogidos, con citoplasma retraído (eclipse de esterilidad), deformes. Figs. 17, 18, 19, 20 y Colectar las flores próximas a la dehiscencia. 2. Colocar una o dos gotas de colorante gelatina aceto-carmín glicerol, en el centro de un porta-objeto, y sobre ella colocar una pequeña cantidad de polen que puede ser obtenido de una o más anteras con la ayuda de un vibrador o dando golpecitos a las anteras con una aguja de disección para hacer caer directamente el polen sobre la lámina porta-objeto. Si el polen ha sido colectado en cápsulas de gelatina, una cantidad suficiente es colocada de la misma manera con la punta de una aguja o con mondadientes. 3. Mover ligeramente con una aguja de disección o con el mismo mondadientes para asegurar una distribución uniforme y luego cubrir con un cubre-objeto, dejar por lo menos 24 horas para que los granos de polen se tiñan. Colocar las muestran en una mesa o tablero, evitando colocarlas verticalmente hasta después de unos días en que hayan sellado y luego colocar en cajas porta-objetos para guardarlas en refrigeración a 4 C. Otro test de viabilidad es el X-Gal test, donde el polen es incubado por 30 minutos en la oscuridad a 37 C en un medio (Singh et al., 1985) de 1 mg X-Gal (5-bromo-4-cloro-3- indoyle-β-galactoside) disuelto en 50 μl de N, N dimethyl formamide y 1 ml del buffer acetato (50 mmol, ph 4.8). Este test es recomendado por Trognitz, 1991 por su alta reproducibilidad. El grano de polen es considerado viable si se torna azul y si se muestra con un citoplasma teñido uniformemente. Figs. 22 y 23. Preparación de gelatina aceto-carmín glicerol Preparar una solución de 45% de ácido acético con agua destilada y calentar hasta llegar a ebullición, luego agregar 2 g de carmín hasta que el carmín esté completamente disuelto y quede aproximadamente 60 ml. Dejar enfriar y filtrar, finalmente agregar igual volumen de glicerina. Todo el proceso se realiza bajo campana extractora y constante agitación. (Marks, 1954). 4.1 Cultivo de polen in vitro La observación del desarrollo del tubo polínico al cultivar el polen en un medio adecuado, nos permite distinguir el polen no viable de las incompatibilidades que pueden ocurrir a nivel del estilo. Varios investigadores han reportado el uso de medios de cultivo para la germinación y crecimiento del tubo polínico. Mortenson y col (1964) reportaron que una solución de 20 % de sucrosa + 50 ppm de ácido bórico fue el medio más adecuado para la 14

29 Observación de polen y determinación de su fertilidad Colección de polen Polen colectado en cápsula de gelatina La muestra es colocada en 2-3 gotas de colorante Materiales Fig. 17: Procedimiento para la toma de muestra, coloración del polen. Fig. 18: Muestras fijadas de polen para su observación. i

30 COLORANTE: Gelatina Aceto-carmín Glicerol COLORACIÓN + polen bien formado= VIABILIDAD Polen normal (n) + polen estéril no coloreado Polen estéril (n) coloreado y no coloreado Polen doble, coloreado y no coloreado Fig. 19: Diferentes calidades de polen, normal (n), estéril, polen 2n, polen doble. Eclipse de esterilidad Polen anómalo Tétradas estériles Fig. 20: Polen anómalo: Con eclipse de esterilidad, malformado y tétradas estériles. j

31 Polen n y 2n coloreados Polen n y 2n estériles Fig. 21: Polen (n), polen 2n coloreados (viables) y estériles. A B C D Fig. 22: A. Polen normal (n), B. Polen n y 2n, C. Polen normal y estéril, D. Polen estéril. Coloración X-Gal. k

32 A B C D Fig. 23: A. Polen con 3 poros germinativos, B. Polen doble, C. Polen con 2 poros germinativos, D. Polen estéril. Coloración X-Gal. l

33 Cultivo de polen in vitro Materiales y medio de sucrosa al 20% + ácido bórico 200 ppm + Tween 20 (0.2%) Siembra del polen en el medio de cultivo Polen ya sembrado bajo cámara húmeda Fig. 24: Procedimiento para el cultivo de polen in vitro en medio de sucrosa, ácido bórico y Tween 20 bajo condiciones de cámara húmeda. A B C D Fig. 25: A y B. Polen germinado y con buen crecimiento en el medio de cultivo. C. Polen con mediana germinación D. Polen con escasa germinación. m

34 A B C D Fig. 26: A. Polen no germinado, B. Sólo uno de los granos del polen doble germinando, C. Escaso polen germinado, D. Polen soltando su contenido. n

35 germinación in vitro de polen de Solanum, mientras que Bamberg y Hanneman (1991) encuentran que el medio de 20% de lactosa + 50 ppm de ácido bórico fue superior al medio con sucrosa, así Trognitz (1991) encuentra una respuesta altamente variable para este mismo medio. Gonzáles y col (2002) usando un medio compuesto por sacarosa 12%, Nitrato de Calcio (CaNO 3 ) 300 ppm, Sulfato de Magnesio (MgSO 4 ) 200 ppm, Nitrato de Potasio (KNO 3 ) 100ppm, Acido Bórico (H 3 BO 4 ) 100 ppm en solución acuosa ph=6, refieren que les reportó resultados confiables Preparación del medio 1. Reactivos Sucrosa (sacarosa), concentración en la solución al 20% Acido Bórico (H 3 BO 4 ) 100 ppm (Solución madre 200 mg en 100 ml) Tween 20, 0.2 % 2. Preparación del Medio de cultivo Se prepara con 5 ml de la solución madre de ácido bórico a 200 ppm y se agrega 20 g de sucrosa y Tween 20, 0.2% en un cilindro graduado (Vaso de 100 cc) y se completa el volumen a 100 cc, agitar bien. 3. Procedimiento para la Germinación Colocar 4 gotas (aproximadamente 15 μl de medio/gota), en una placa Petri con la ayuda de una aguja, o con palillo de dientes colocar pequeñísimas cantidades de polen sobre cada gota, la tapa de la placa Petri a la cual se ha colocado un papel filtro humedecido va a contribuir a formar una pequeña cámara húmeda. Las placas Petri se colocan a C. Después de 24 horas se coloca una gota de lugol, o de colorantes como orceína acética, carmin propiónico, lacto propiónico orceina y se cubre con un cubre-objeto de 22 x 40 mm y se procede a la observación bajo el microscópio óptico. Se cuenta como granos germinados aquellos que por lo menos el tubo del polen ha crecido de igual tamaño o mayor al diámetro del grano de polen. Para registrar los datos se cuentan en unos 10 sitios el número de granos de polen que muestran el tubo de germinación. Figs. 24, 25 y 26. Polinización y fertilización Cuando las anteras se tornan dehiscentes, los granos de polen son transferidos al estigma(s) por los insectos o la mano del hombre. Una vez en contacto con el estigma, los granos de polen germinan formando el tubo polínico. En cada una de las microsporas haploides formadas durante la meiosis, el núcleo se divide por mitosis y desarrolla un grano de polen bicelular (gametofito masculino inmaduro). Una de las células se divide posteriormente otra vez habitualmente después del desarrollo del tubo polínico, dando como resultado tres células haploides por grano de polen: dos gametos masculinos masculinos (núcleo germinativo y núcleo espermático).y la célula generadora del tubo polínico. El tubo continúa creciendo y entra al óvulo a través del micrópilo. Los dos gametos son entonces liberados dentro de la sinérgida. El saco embrionario contiene 8 núcleos y cada uno con una dotación haploide de cromosomas. Los dos núcleos cerca al centro del saco embrionario son referidos como núcleos polares; la célula huevo u oosfera está situada cerca al micrópilo. Finalmente un núcleo espermático entra en la célula huevo y el otro se une a los dos núcleos polares, este acontecimiento es llamado doble fertilización, entonces se forma un cigoto diploide, que luego desarrolla en embrión y la unión del otro núcleo espermático con 15

36 dos núcleos polares, llamado fusión triple resulta en la formación del tejido nutritivo llamado endospermo (3n). Se conoce a este proceso como doble fertilización, este es un proceso complejo, el embrión pasa por sus primeras etapas de desarrollo mientras se encuentra dentro del ovario de la flor, los integumentos se desarrollan en la cubierta de la semilla y el ovario mismo madura y se transforma en fruto. Las polinizaciones o fertilizaciones, deben realizarse usualmente en la mañana antes de las 10 a m, si los días son calurosos es posible hacerlos al final de la tarde. El probable éxito del cruzamiento es apreciado por un pedicelo sostenido y ligeramente curvado, unos 2-4 días después de la polinización con un posterior desarrollo de frutos (bayas), los cuales serán cosechados cerca de días dependiendo de las especies. Normalmente los frutos son protegidos durante su desarrollo con una malla de fina gasa. Después de la cosecha, (25-40 días), se colocarán en bolsas de papel hasta su maduración a temperatura ambiente, esperando hasta que se tornen suaves lo cual permite que el proceso de extracción sea más fácil, la extracción que se hace en un recipiente con agua donde son separadas las semillas de las otras partes del fruto. Las semillas viables tienden a irse hacia el fondo, mientras las semillas llamadas vanas flotan. Las semillas obtenidas así deberán ser secadas, colocadas en papel de platina especial y selladas para guardar en cámara de refrigeración a 4 C. Fig. 27. Polinización y fertilización Colecta de polen Emasculación de las anteras Polinización Identificación del cruzamiento Guardar el polen en cápsulas de gelatina Fig. 27: Procedimiento para efectuar las polinizaciones en un bloque de cruzamientos. 16