Automatización en hematología

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1 4 Automatización en hematología Nilda E. Fink Cátedra de Hematología, Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata. 47 y 115, 1990 La Plata, Argentina. fink@biol.unlp.edu.ar REVISIÓN Fecha de recepción: 1/3/05 Fecha de aceptación: 20/4/05 HEMATOLOGIA, Vol. 9 Nº 1: 4-16 Enero-Abril, 2005 RESUMEN Gran parte de la práctica del laboratorio hematológico se relaciona con observaciones que incluyen la identificación de tipos de células y la interpretación de la composición de las poblaciones celulares sanguíneas. Esta revisión describe la metodología empleada en los instrumentos automatizados para el estudio hematológico convencional, incluyendo la medición de Hb, recuento de glóbulos rojos e índices eritrocitarios, el recuento de plaquetas, el recuento total y diferencial de glóbulos blancos y reticulocitos. Se describen las diversas tecnologías utilizadas para realizar las mediciones, ejemplificando su uso en los contadores hematológicos automatizados modernos disponibles comercialmente. Palabras claves: Automatización, Hematología, Sistemas analíticos, Tecnología Muchas de las mediciones en el campo de la Hematología conciernen a variables continuas. Algunos ejemplos de este tipo de variables son la medición de concentraciones de hemoglobina (Hb) en la sangre y el hierro, así como su capacidad total de unión en suero. Por otra parte, gran parte de la práctica de la Hematología se relaciona con observaciones que incluyen la identificación de tipos de células y la interpretación de la composición de las poblaciones celulares sanguíneas 1. Los temas centrales que se abordarán a continuación se centrarán principalmente sobre estas determinaciones discontinuas. En relación con el recuento de células sanguíneas, los métodos manuales son la base de algunos métodos de referencia en el laboratorio hematológico, a los que aún es necesario recurrir cuando hay discrepancia con los métodos automatizados. Suelen también ser métodos de rutina en laboratorios pequeños de algunos países, pero dada la enorme cantidad de información disponible sobre los mismos 2, en este trabajo sólo nos referiremos a los métodos automatizados. FUNDAMENTOS TECNOLÓGICOS Y SISTEMAS ANALÍTICOS EN EL RECUENTO AUTOMATIZADO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS A continuación trataremos sobre la metodología empleada en los instrumentos automatizados para el estudio hematológico convencional, incluyendo el recuento de plaquetas y el recuento diferencial de glóbulos blancos. El recuento de reticulocitos también será considerado porque en la actualidad puede realizarse tanto en contadores automatizados que incluyen el recuento en forma directa, o mediante un procedimiento especial previo en otros tipos de contadores (semiautomatizados). En primer lugar, se describirán las diversas tecnologías utilizadas para realizar las mediciones, ejemplificando su uso en los contadores hematológicos automatizados disponibles comercialmente. Alguno de estos ejemplos han sido tomados de los fabricantes que abarcan los principales segmentos del mercado de laboratorio clínico, dato obtenido a partir de la estadística de los participantes en programas de evaluación externa de calidad (PEEC). Los fabricantes por lo general ofrecen un amplio rango de instrumentos, pero las descripciones serán limitadas, por razones de espacio, a los modelos más difundidos (Tabla 1). La mayoría de estos instrumentos son totalmente automatizados, es decir las mediciones se realizan a partir de sangre entera sin necesidad de que el operador la diluya en forma manual. En efecto, con el fin de garantizar un manejo seguro, la mayoría de los instrumentos cuenta con dispositivos que atraviesan la tapa del tubo de colecta de sangre, de modo que el operador no tiene que quitarla. También es común que los instrumentos mezclen las muestras de sangre antes de que las mismas sean incluídas en el análisis. Un esquema que resume las distintas etapas de estos sistemas se presenta en la Fig. 1 3.

2 AUTOMATIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA 5 TABLA 1 Algunas características de autoanalizadotes hematológicos modernos* Tipo Fabricante Instrumento Año de Instalados al aparición en US 2000 en US Recuento diferencial Abbott Cell-Dyn de leucocitos de Cell-Dyn 1700 y 1700CS regiones ABX Micros Bayer ADVIA BD Bio-sciences QBS Star 1999 Nd Beckman-Coulter Coulter A c -T series Coulter A c -T diff y diff Coulter Onyx/Onyx AL Roche KX K nd De alto volumen Abbott Cell-Dyn >700 Cell-Dyn >300 Cell-Dyn >350 ABX Pentra 60c Pentra 120 Retic Bayer ADVIA Beckman-Coulter Coulter GEN-S 1996 >1100 Coulter HmX 1999 >100 Coulter STKS 1989 >2600 Coulter MAXM 1991 >2100 Sysmex Sysmex SF3000-Alpha Sysmex SF3000-Alpha 1997 nd Sysmex SE9500/SE Sysmex SE9500 Alpha 2 nd nd Sysmex SE9500R/SE Sysmex XE2180/XL 2000 nd * College of American Pathology (13, 15) Fig. 1: Diagrama funcional simplificado de un sistema multiparamétrico de recuentos celulares. Los contadores de sangre automatizados, como cualquier otro instrumental de laboratorio, deben ser manejados de manera apropiada. Esto requiere que sean totalmente calibrados y que el desempeño sea monitoreado tanto por el control de calidad interno como por los PEEC. Por último, debido a que el mercado evoluciona muy rápido, es necesario entender cómo se evalúan los nuevos instrumentos o, al menos, entender críticamente las evaluaciones emprendidas por otros usuarios. Este aspecto no será tratado en esta revisión, pero el lector puede remitirse MA Fernández Alberti y col 4. El desarrollo automatizado del recuento y la medición del tamaño de las células sanguíneas parte de técnicas de recuento simple, que fueron descriptas en la segunda mitad del siglo XIX y que fueron usadas

3 6 TABLA 2 Recuento de células sanguíneas en los primeros instrumentos Características Apertura-impedancia Dispersión de luz Descripción del prototipo Coulter, 1956 Crosland-Taylor, 1953 Ingreso de las células a la zona Pasaje a través de un orificio estrecho Pasaje por una corriente estrecha por sensora flujo hidrodinámico Definición de la zona sensora Medición de impedancia a través del Haz de luz que atraviesa la corriente orificio de células Impulsos usados para contar las Cambios en la impedancia contados Cambios en la salida de un fotómetro, células que atraviesan la zona electrónicamente contados electrónicamente sensora durante mucho tiempo. Estas eran muy inexactas y, hasta la década de 1950, se habían hecho pocos avances tecnológicos 5. Se hicieron intentos iniciales y complejos para automatizar el recuento de células en cámaras cuentaglóbulos, pero aún con técnicas que fueron perfeccionadas, todavía era difícil automatizar la dilución de la sangre y la carga de la cámara. También resultaba imposible contar las células con exactitud mediante los métodos de estudio de las propiedades eléctricas u ópticas de las células en suspensión. Para permitir que el recuento celular fuera automatizado, tuvieron que diseñarse métodos de dilución de la sangre e ingresar cantidades relativamente pequeñas de células dentro y fuera de una zona conocida como zona sensora. Así, las células podían ser contadas con exactitud a medida que pasaban a través de esa zona sensible, siempre y cuando la misma fuera lo suficientemente pequeña como para hacer factible el recuento 2, 6. Los primeros contadores hematológicos fueron semiautomatizados; esto era así porque la preparación de una dilución adecuada era una operación manual y el instrumento entonces, aspiraba la dilución ya preparada. Sin embargo, a fines de la década del 60 se dispuso de instrumentos totalmente automatizados, que aspiraban muestras de sangre entera y llevaban a cabo los pasos necesarios para diluir y aislar las células a ser contadas. Nos ocuparemos en el presente trabajo sólo de los instrumentos totalmente automatizados. Los instrumentos semiautomatizados, si bien se fabrican todavía, se utilizan casi con exclusividad en laboratorios pequeños porque la preparación de diluciones manuales a partir de una gran cantidad de muestras sanguíneas, demanda mucho tiempo además de ser poco precisa. Los primeros contadores fueron descriptos por Coulter 7 y Crosland-Taylor 8, quienes adoptaron diferentes enfoques para limitar el volumen en la zona sensora y realizar el recuento (Tabla 2). Fig. 2: Contadores de apertura-impedancia. La impedancia se mide entre un electrodo negativo dentro del tubo con orificio y el electrodo positivo en la dilución de las células de la sangre. El área delimitada por línea de puntos muestra la zona sensora por donde pasan las células. ρ: resistividad del electrolito, ρm: resistividad del electrolito modificada por la partícula. En el instrumento descripto por Coulter 7, las células son conducidas a través de un estrecho orificio, detectándose los cambios de impedancia (Fig. 2). La impedancia es efectivamente medida en la zona sensora situada entre los electrodos colocados a ambos lados del orificio. Así, las células funcionan como aislantes frente a los diluyentes salinos, de modo que la impedancia aumenta transitoriamente a medida que las células pasan a través de la zona sensora. Los cambios de impedancia transitorios producen impulsos eléctricos que pueden ser contados. Estos instrumentos han sido llamados contadores de apertura-impedancia. El instrumento descripto por Crosland-Taylor 8 se basaba en hacer que las células pasen a través de un delgado haz de luz. La zona sensora estaba restringida parcialmente por la estrechez del haz de luz y por el pasaje de células en una corriente de líquido muy delgada. A medida que las células pasan a través de la zona sensora, interceptan el haz de luz que se dispersa, pudiendo ser colecta-

4 AUTOMATIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA 7 Fig. 3: Contadores por dispersión de luz. La luz de la fuente láser se dirige hacia un foco y luego se dispersa. Una barrera impide la llegada de luz al fotodetector. Cuando una célula entra en el foco, dispersa la luz, que así pasa por fuera de la barrera, e impacta en el detector. Fig. 4: Diagrama de volúmenes en el recuento de plaquetas. Sirve para discriminar plaquetas pequeñas de ruido (A), plaquetas grandes de glóbulos rojos pequeños (B). C representa el área bajo la curva usada para la estimación teórica del número de plaquetas. da por un sistema óptico adecuado y medida por un fotómetro (Fig. 3). Los aumentos transitorios en la luz dispersada crean impulsos desde el fotómetro, que luego pueden ser contados electrónicamente, por ello estos sistemas son llamados contadores de dispersión de luz. Los impulsos contados en los primeros instrumentos de apertura-impedancia y de dispersión de luz también se utilizaron para determinar el tamaño celular, dado que el tamaño del impulso es aproximadamente proporcional al tamaño de la célula. Por lo tanto, el tamaño del impulso puede usarse para discriminar entre la célula de interés y otras células, restos o ruido electrónico. Este proceso lleva a la definición de un umbral (Fig. 4). Además de las diferentes tecnologías de detección, había importantes diferencias en cómo las células ingresan a la zona sensible en los dos tipos de instrumentos. Debido a que la geometría tiene que ser perfecta, en los sistemas de dispersión de luz, las células tienen que estar en una corriente muy estrecha que interactúe perfectamente con el haz de luz. Esa corriente se logra por una técnica donde se emplea un flujo laminar envolvente. El flujo del líquido se ajusta a través de un capilar delgado para crear un efecto de enfoque hidrodinámico que fuerza a la suspensión celular a permanecer en la corriente estrecha a medida que pasa por el centro de la zona sensible. Aunque este sistema fue descripto originalmente para sistemas de dispersión de luz, también se puede aplicar a los sistemas de apertura-impedancia y tiene particular valor al potenciar la capacidad de los sistemas de apertura-impedancia para medir el tamaño celular, así como para mejorar el recuento celular. Las mejoras en la capacidad de medir el tamaño también significa que es más fácil discriminar entre diferentes tipos de células, por ejemplo las plaquetas grandes pueden ser discriminadas más fácilmente de los eritrocitos pequeños. En la práctica, para hacer el recuento celular tanto los sistemas de apertura-impedancia como los de dispersión de luz son adecuados para contar eritrocitos, plaquetas o leucocitos totales. Sin embargo, es necesario tener en cuenta cuáles son los requerimientos básicos para un recuento exacto de cualquier tipo de célula 5 : - La sangre entera debe ser homogeneizada, medida y diluida con exactitud. - Debe pasarse un volumen conocido de esa dilución a través de la zona sensora. - Las células de interés deben contarse una vez y sólo una vez y ninguna otra célula, resto celular o ruido electrónico debe contribuir al recuento. El primer requisito es fácil de alcanzar, procurando que la sangre esté bien mezclada antes del análisis. En la actualidad, la mayoría de los instrumentos hacen esto en forma automática y luego hacen las diluciones con exactitud, generalmente por medio de sistemas basados en jeringas calibradas. El segundo requerimiento es más difícil de lograr en un instrumento automatizado. La mayoría de los fabricantes han elegido medir los recuentos por unidad de tiempo en lugar de la unidad de volumen de dilución. Por lo tanto, tales sistemas tienen que ser calibrados para convertir los recuentos por unidad de tiempo a recuentos por unidad de volumen. El tercer requerimiento es de dificultad intermedia. Puede parecer excesivo afirmar que las células deben ser contadas una vez, pero el problema es que

5 8 flujo laminar, las células podrían recircular dentro del orificio. Esas células recirculantes pueden hacer una contribución mínima al recuento aún cuando ellas tienden a producir impulsos más pequeños que las células que pasan a través del orificio. Sin embargo, los eritrocitos que recirculan en esta forma causan señales en el rango de plaquetas y dificultan los recuentos de plaquetas, a menos que haya sistemas de flujo de barrido ubicados en la parte posterior del orificio que prevengan la recirculación Fig. 5. Relación entre el recuento celular y la concentración de células. A concentraciones altas comienza a producirse un plateau como consecuencia del fenómeno de coincidencia. en el recuento pueden subestimarse si van a través de la zona sensora, casi al mismo tiempo, que otra célula. Este problema, que se denomina coincidencia (Fig. 5), surge del tiempo muerto en la electrónica del instrumento y por lo general puede ser corregido con un algoritmo matemático adecuado, construido dentro del microprocesador del contador hematológico. Decir que las células deben contarse sólo una vez parece igualmente excesivo, pero el problema es que en los contadores de apertura-impedancia simple sin MÉTODOLOGÍA EMPLEADA EN LAS DETERMINACIONES DE UN ESTUDIO SANGUÍNEO BÁSICO (HEMOGRAMA) Concentración de Hb Es él método más uniforme en todos los instrumentos y presenta dos opciones de uso común (Tabla 3). La primera es convertir la hemoglobina en cianmetahemoglobina (HiCN) y luego medir la absorbancia alrededor de 540 nm. En la práctica, sin embargo, el tiempo del ciclo de los instrumentos disponibles en el mercado es tan corto que puede impedir que la conversión total se produzca por completo y que los derivados intermedios sean medidos. La conversión a HiCN requiere el uso de un reactivo TABLA 3 Fundamento de varias determinaciones hematológicas en autoanalizadores de uso frecuente. Instrumentos Analito Abbott Bayer Beckman Sysmex Coulter Hemoglobina: - Método automatizado HiCN HiCN con Hb HiCN LSS-meta-Hb celular directa - Método de detección Absorción a 546 nm Absorción a 546 nm Absorción a 525 nm Absorción a 555 nm Leucocitos totales Dispersión óptica/ Citometría de flujo Impedancia Corriente directa fluorescencia Leucocitos: diferencial Dispersión óptica/ Peroxidasa y Tecnología VCS de Corriente directa y fluoresencia densidad nuclear Coulter 3-D frecuencia de radio Leucocitos: linealidad ,9 0-99, ,9 (10 9 /L) Plaquetas Recuento inmuno- Optico Umbral fijo de Impedancia plaquetario de óptica/ impedancia impedancia Plaquetas: discriminación Recuento inmuno- Indices óptico y Exactitud de Umbrales no fijos con eventos no plaquetarios plaquetario de óptica/ refractario que umbrales fijos en que permiten la impedancia permiten la la detección por discriminación discriminación parámetro único Plaquetas: linealidad (10 9 /L) ,

6 AUTOMATIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA 9 tipo Drabkin, que contiene cianuro de potasio y ferrocianuro de potasio, por lo tanto el efluente residual del instrumento puede no cumplir con los estándares ambientales en algunos países. Los métodos alternativos -libres de cianuro- para la medición de la Hb, que usan laurilsulfato de sodio (LSS), han sido introducidos en algunos instrumentos. Los resultados parecen compararse bien con los métodos de HiCN 9. Estos métodos no cianamidas, además de ser más seguros, son también promisorios en cuanto a futuras mejoras en la calibración y validación de nuevas mediciones de Hb. El método de LSS introducido por Sysmex, parece ser de iguales características a las del método de referencia y es un avance significativo para bajar la turbidez y permitir un rápido análisis automatizado 10. Eritrocitos Por lo general, el recuento de eritrocitos se realiza sobre diluciones de sangre entera con un umbral adecuado para discriminar entre grandes plaquetas y pequeños eritrocitos (Fig. 4). Muchos sistemas no tienen un umbral superior para discriminar grandes eritrocitos de pequeños leucocitos, pero los números relativos de los dos tipos de células indican que esto no suele ser un problema. Indices eritrocitarios Aunque todos los contadores hematológicos automatizados miden el volumen corpuscular medio (VCM), hay otros factores importantes que afectan las mediciones, según sean hechas por los instrumentos de apertura-impedancia o por los de dispersión de luz. Debido a que ninguna tecnología es perfecta, varios fabricantes han intentado resolver los problemas, pero lo han hecho, con frecuencia, en diferente forma. La dificultad fundamental, que ya ha sido mencionada, es que el impulso producido por cualquier célula es sólo una aproximación proporcional al volumen de la célula. Los impulsos aberrantes, que no representan verdaderamente el tamaño de la célula, pueden ocurrir en cualquier contador, pero con frecuencia estos impulsos tienen una característica inusual que les permite ser identificados por circuitos electrónicos adecuados y procesados de modo que no afecten la magnitud del impulso promedio que se utiliza como medición de VCM. En los contadores de apertura-impedancia sin flujo laminar, hay una necesidad adicional de tratar los impulsos, ya que en tales instrumentos las células que pasan cerca del borde del orificio deben ser ignoradas porque producen impulsos más grandes que las células que pasan en el centro del orificio. Afortunadamente, esas células tienen un tiempo de pasaje más largo a través del orificio, debido a que el flujo es más lento en el borde. Los impulsos que ellas producen son por lo tanto tan largos que deben y pueden ser procesados. Dos células que atraviesan juntas también producen un pulso sobredimensionado, pero de igual modo es tan largo, que puede ser procesado. En relación a los eritrocitos, el aspecto más serio, de corrección más dificultosa, es que el VCM tiende a ser subestimado cuando la concentración de Hb corpuscular media (CHCM) real, medida manualmente, es reducida. Los fabricantes han adoptado diferentes técnicas para obviar el problema. Estas han servido para reducir la magnitud del efecto aunque en ninguna instancia ha sido eliminado totalmente. Debido a que los índices eritrocitarios se relacionan entre sí de acuerdo con lo siguiente: HCM CHCM = VCM Puede observarse que un VCM subestimado causará una CHCM sobrestimada. Por esto, con los modernos contadores sanguíneos, rara vez se observa que la CHCM descienda marcadamente en la deficiencia de hierro severa, como sucede cuando las mediciones de Hb y hematocrito son hechas en forma manual y la CHCM se calcula usando la fórmula: CHCM = Hemoglobina Hematocrito centrifugado Con los sistemas de apertura-impedancia hay una explicación simple para la subestimación del VCM, cuando la CHCM es baja y está relacionado con el hecho de que la CHCM determina la viscosidad interna del eritrocito y, como consecuencia, a su forma, cuando pasa a través del orificio del contador. Las fuerzas de corte del fluido en el orificio son tales que el eritrocito adopta una forma de cigarro, pero cuando la viscosidad interna se reduce, la forma del eritrocito se vuelve similar a un cigarro más largo y delgado y crea un impulso más pequeño de lo que debiera (subestimación del volumen). Esto es conocido como el efecto del factor forma 5. A excepción de los equipos de Bayer, todos los demás calculan los índices en función de la medición del tamaño celular de las células por apertura-impedancia luego de diluirlas en un medio isotónico. Con el fin de minimizar estos efectos, hay sistemas de dispersión de luz en los que se trata el eritrocito para que tome la forma esférica y las células son fijadas antes de su entrada a la zona sensora. Tal es el caso

7 10 de los equipos de Bayer que llevan a la esfericidad las células con un volumen constante y luego miden el volumen celular a partir de la lectura mediante un sistema de dispersión de luz, donde la misma incide con dos ángulos diferentes. Después, proceden a transformar esas señales mediante un algoritmo especial basado en la dispersión óptica de partículas esféricas dieléctricas 10. En estos casos suele aplicarse la teoría de Mie que relaciona la dispersión de luz con el volumen y el índice de refracción interno 11. El uso práctico de la teoría de Mie proviene de observar la dispersión de luz en cada célula individual, con un ángulo pequeño (2º-3º) y uno grande (5º-15º). La dispersión con un ángulo pequeño está afectada primariamente por el volumen y la dispersión con un ángulo grande, por el índice de refracción interno, aunque cada uno está afectado por ambos. Sin embargo, si ambos ángulos de dispersión son ploteados uno contra el otro, la posición de cualquier impulso puede ser derivada para medir el volumen y la concentración de Hb de la célula. Promediando las mediciones sobre muchas células, se pueden derivar los valores medios que equivalen al VCM y la CHCM 5. Como mencionamos antes, los cambios de forma de los eritrocios deformados anormalmente en los analizadores por apertura-impedancia, afectan la estimación del VCM, la CHCM y el hematocrito. La introducción de la focalización hidrodinámica en los equipos de apertura-impedancia, tales como el Sysmex SE9500, parece reducir el efecto del cambio de forma y de deformabilidad. En ese sentido, los equipos de Beckman Coulter, particularmente para CHCM, parecen estar afectados por no poseer esa adaptación 10. Reticulocitos Los recuentos de reticulocitos teñidos con varios colorantes pueden realizarse en un instrumento automatizado, diseñado para ese propósito, tal como el Sysmex R3000, o en un citómetro de flujo convencional. Recientemente otros contadores hematológicos han incorporado una opción de recuento de reticulocitos, en los que éstos deben ser coloreados de modo independiente y luego son introducidos dentro del contador para su análisis. En el caso de mediciones hechas con colorantes fluorescentes, de acuerdo con la intensidad de fluorescencia, los reticulocitos se pueden dividir en tres sectores que representan estadios diferentes de maduración. El estadio más joven, muy fluorescente, es un indicador temprano de recuperación, que aparece antes de un recuento de reticulocitos total elevado. Un alto recuento de elementos muy fluorescentes es un indicador de recuperación medular después de, por ejemplo, un transplante de médula ósea (TMO) o de la administración de eritropoyetina exógena. Actualmente, se pueden hacer los recuentos sin necesidad de coloración manual, ya que están totalmente automatizados. Sysmex fue el primero en introducir un colorante fluorescente (Automune-O) detectado por citometría de flujo, en tanto que otros como Beckman Coulter usan el nuevo azul de metileno. Este último método es menos preciso porque es más dificultoso estandarizar la coloración y porque los cuerpos de Howell-Jolly pueden interferir. Bayer usa la oxazina-750 en el canal de luz láser de helio-neón y esta determinación se integra con las determinaciones del ancho de la distribución del volumen eritrocitario (RDW) y el contenido de Hb, con lo cual se obtienen los índices celulares reticulocitarios. Estos parámetros de inmadurez reticulocitaria, que actualmente tienen un uso limitado, pueden ser usados para estimar la reducción de la vida media eritrocitaria y mejorar el tratamiento de una variedad de anemias, en la recuperación posquimioterapia y en el TMO. Plaquetas Estas células pueden contarse sobre la misma dilución de sangre entera usada para el recuento de eritrocitos. Hay, por lo general, un umbral superior para eliminar pequeños eritrocitos y un umbral inferior para discriminar del ruido electrónico y los restos celulares (Fig. 4). Estos umbrales simples son adecuados, siempre y cuando el instrumento tenga flujo laminar, y vale tanto si se usa apertura-impedancia como dispersión de luz para su detección. Sin embargo, si no se usa flujo laminar opcional para los contadores de apertura-impedancia y obligatorio para contadores de dispersión de luz hay demasiado solapamiento entre las señales de ruido o los residuos y la de los eritrocitos pequeños para que el recuento sea efectivo, entre los umbrales inferior y superior. Bajo estas circunstancias es necesario ajustar una curva de distribución teórica al histograma de volumen de plaquetas y extrapolar el recuento de plaquetas a partir del área bajo la distribución teórica 5 (Fig. 4, C). Recientemente, se han ampliado los diferentes tipos de métodos empleados por los distintos fabricantes. Estos nuevos sistemas han sido importantes porque se sabe que el recuento de plaquetas con un solo parámetro tal como la impedancia, tiene una tendencia a sobreestimar el recuento verdadero de plaquetas, que es importante en las trombocitopatías y en el manejo de pacientes trombocitopénicos.

8 AUTOMATIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA 11 Por otra parte, esto es importante en el caso de tener que hacer recuentos elevados de plaquetas, en pacientes con trombocitosis y en el control de calidad. Una limitación actual es la imposibildad de distinguir plaquetas de fragmentos celulares y restos celulares. Es importante también la capacidad de reconocer plaquetas de mayor tamaño, que suelen estar excluidas de los algoritmos de recuentos de plaquetas. Los fabricantes trataron de resolver esto de diferentes formas (Tabla 3). Algunos fabricantes resuelven esto con métodos ópticos y por impedancia y si no hay concordancia tiene la alternativa de usar un método inmunológico automatizado con un anticuerpo monoclonal contra la glicopropteína gpiiia, que es una gp presente sólo en plaquetas (Abbott). Otros usan un método de impedancia sin umbral fijo y los resultados correlacionan bien con el método de referencia, pero con menor frecuencia de alarmas con relación a otros contadores que tienen umbrales fijos (Sysmex). También se desarrolló un sistema de medida bidimensional en el cual se mide tanto el volumen como el índice de refracción de cada una de las células (Bayer). Esto tiene una gran capacidad de discriminación entre plaquetas, eritrocitos y partículas contaminantes. Esta tecnología altamente novedosa es, a la vez, muy confiable. Además brinda otros parámetros como el VPM, el ancho de la distribución del volumen plaquetario (PDW), el plaquetocrito y el componente plaquetario medio (CPM), mediciones éstas cuyo valor clínico aún está en discusión 10. Recuento total y diferencial de glóbulos blancos El examen mediante microscopía óptica de un frotis teñido de sangre periférica para evaluar la morfología de eritrocitos y trombocitos (plaquetas) y la generación del recuento diferencial de leucocitos aún hoy resultan cruciales para el diagnóstico de enfermedades hematológicas 1. Estos procedimientos, además de la determinación de recuentos celulares en la sangre, tradicionalmente han sido las funciones principales de un laboratorio de Hematología. Sin embargo, el recuento diferencial visual se reconoce como una de las tareas de labor más intensa en el laboratorio. Para lograr buena ejecución se requiere un personal bien preparado y muy motivado. A pesar de su honroso papel en el diagnóstico de enfermedades hematológicas, estas mediciones están plagadas de errores. La confiabilidad del procedimiento debe supervisarse regularmente por encargados especializados e intercambiando extendidos con otros laboratorios. Siempre que sea posible se recomienda que los principiantes muestren a los supervisores todas las anomalías importantes, tales como leucocitosis primaria o reactivas, trombocitopenia o cambios notorios en los eritrocitos. Una forma de estimular el interés y aumentar el conocimiento de los responsables en la evaluación correcta de preparaciones sanguíneas y frotis de médula ósea es la discusión periódica de extendidos de interés especial. Un análisis cuidadoso de frotis sanguíneo es una herramienta muy útil para la evaluación clínica. Por otro lado, la triada de factores formada por la importancia, el gasto y el error aleatorio llevó a los directores de laboratorios y a los ingenieros industriales a la conclusión de que la automatización del recuento diferencial proporcionaría información más exacta, además de reducir los costos y los errores. En relación al almacenamiento de muestras de sangre para hacer los frotis preparados con sangre anticoagulada por EDTA, conservados durante no más de 60 minutos a temperatura ambiente, muestran pocos cambios comparados con los que se preparan inmediatamente después de obtener la sangre. Se pueden discernir cambios tres horas después, y entre 6 y 8 horas posteriores a la extracción, los cambios son notorios. Los leucocitos se vacuolan y muchos muestran cambios nucleares degenerativos, mientras que las concentraciones de leucocitos y de plaquetas disminuyen. Todo esto ocurre a mayor velocidad si la temperatura ambiente es más alta y se retrasa si la sangre se mantiene a 4ºC 1. Para el recuento diferencial visual de leucocitos, las células individuales se clasifican adecuadamente cuando se estudian en las etapas más maduras. Sin embargo, es difícil medirlas adecuadamente en frotis sanguíneos debido a la gran variación en las fracciones numéricas de poblaciones celulares. Los recuentos diferenciales visuales se realizan de modo rutinario en células nucleadas. El coeficiente de variación al contar los leucocitos más frecuentes (es decir, linfocitos y neutrófilos) puede ser mayor al 25%, pero el de las células que ocurren en fracciones numéricas menores al 10% (es decir, eosinófilos y monocitos) puede ser de hasta del 100%. La obtención de resultados exactos de células que se presentan en fracciones numéricas menores al 1% (es decir, eritrocitos nucleados o basófilos) es prácticamente imposible ya que el total de células evaluadas es de (Tabla 4). A pesar de estas limitaciones, el recuento diferencial visual constituye el estándar para comparar resultados obtenidos con analizadores hematológicos automatizados. El papel del examen visual de frotis sanguíneos sigue siendo importante en el laboratorio clínico, ya que los analizadores hematológicos automáticos pueden rechazar un alto porcentaje de muestras consideradas como anormales que deben evaluarse visualmente 1.

9 12 TABLA 4 Error de muestreo y variabilidad estadística de recuentos porcentuales en los recuentos diferenciales proporcionales* Nº total de Porcentaje observado de células células contadas * * Rango 95% Fig. 6: Recuento diferencial leucocitario, usando dispersión de luz (vertical) y tinción de peroxidasa (horizontal). Los basófilos se estiman independientemente porque se superponen con los monocitos. Los glóbulos blancos totales no pueden contarse en diluciones simples de sangre entera porque el número proporcionalmente elevado de eritrocitos los enmascararían. Deben agregarse, por lo tanto, reactivos adecuados para lisar los eritrocitos de modo que los leucocitos remanentes puedan ser discriminados de cualquier resto de eritrocitos. En los sistemas de dispersión de luz también puede ser necesario añadir compuestos para filtrar el resto, causante de interferencia óptica. Con los primeros sistemas, se usaban agentes líticos muy fuertes, que removían la mayoría del citoplasma del leucocito, de modo que en realidad lo que se evaluaba eran los núcleos. Más recientemente, sin embargo, se utiliza una lisis más suave para proteger tanto como sea posible la arquitectura celular, de modo que pueda ser usada como base para el recuento diferencial de leucocitos 5. En el caso del recuento diferencial, los primeros sistemas se basaban en diferencias en el volumen de leucocitos medido por apertura-impedancia 12. Sin embargo, tales sistemas no son los más adecuados para discriminar entre células mono y polinucleares, particularmente entre linfocitos y granulocitos. Los intentos para clasificar otros tipos celulares en tres poblaciones diferenciales son menos satisfactorios. La dispersión de luz sola no es de valor para el recuento diferencial de leucocitos. Resulta interesante que el índice de refracción interna de los leucocitos, que está determinado por sus gránulos, sea tan importante como el volumen, cuando se determina por dispersión de luz, el volumen aparente de leucocitos. De este modo, debido a sus gránulos, los neutrófilos aparecen más grandes que los eosinófilos aunque realmente tienen el mismo volumen cuando son medidos por apertura-impedancia 13. A pesar de la limitada utilidad de la dispersión de luz sola para el recuento diferencial de leucocitos, puede usarse en conjunto con la absorción de luz, cuando se estudian los leucocitos teñidos en suspensión. Los primeros trabajos fueron hechos con leucocitos teñidos por su actividad de peroxidasa y cuando la dispersión y la absorción de luz se midieron simultáneamente célula por célula se hizo posible discriminar con exactitud cuatro clases de leucocitos, es decir neutrófilos, linfocitos, monocitos y eosinófilos junto con una categoría conocida como células grandes no coloreadas (Fig. 6). Esta propuesta se describió como medición multiparamétrica simultánea, es decir los dos parámetros de dispersión y absorción resueltos en un único canal. El término canal en este contexto, se refería al sistema para dilución de sangre, lisante de eritrocitos, donde se hacía la reacción de peroxidasa y luego se medía la dispersión y la absorción de luz. El empleo de un canal de peroxidasa hizo una contribución mayor al recuento diferencial leucocitario, pero no resultó adecuado para el recuento diferencial de basófilos. Por lo tanto, los fabricantes tuvieron que agregar un canal adicional para contar estas células. Tales instrumentos multicanales de recuento diferencial de leucocitos han sido desarrollados y tienen actualmente un uso difundido. Otro aspecto es que se incluyen parámetros como los blastos, eritrocitos nucleados y granulocitos inmaduros aunque todavía existen algunas discrepancias en la identificación de los polimorfonucleares (PMN) en bandas. En paralelo con el desarrollo de los instrumentos multicanales, también ha habido una tendencia a realizar más y más mediciones simultáneas, usando con frecuencia un único canal. Por ejemplo, los sistemas de apertura-impedancia pueden ser mejorados para proporcionar información sobre la com-

10 AUTOMATIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA 13 posición interna de los leucocitos, mediante el uso de una sonda electromagnética de alta frecuencia al mismo tiempo que se medía el volumen. Los sistemas de dispersión de luz también pueden ser enriquecidos examinando la dispersión en diferentes ángulos. Finalmente, ahora es posible combinar tanto la tecnología de apertura-impedancia como la dispersión de luz, con sus varios refinamientos, dentro de un canal único 5. A modo de resumen, en la Tabla 3 se indican las distintas características del recuento total de blancos y distintos aspectos del diferencial leucocitario, que tradicionalmente fue hecho en forma manual por revisión microscópica de extendidos. Las ventajas del método automatizado son: - Disminución del error aleatorio por el gran número de células contadas. - Disminución del tiempo de retorno por la velocidad con que el instrumento hace la cuantificación. Para el recuento diferencial de leucocitos automático, el análisis de imágenes tiene una aplicación muy limitada y de comercialización reducida. En principio, el análisis de imagen automatiza y reproduce el recuento diferencial visual. Los frotis sanguíneos se analizan con óptica de alta velocidad en una plataforma controlada por computadora. Se simulan los criterios del diferencial visual con algoritmos, enumerando las subpoblaciones celulares en forma más reproducible y cuantitativa. Varios contadores de leucocitos por análisis de imagen fueron producidos durante los años 70 y al principio de los 80 (Lara de Corning Medical Instruments, Hematrak de Geometric Data, Dic 4 de Coulter Electronics, ADC-500 de Abbott Diagnostics). Fueron desplazados del mercado por contadores más rápidos y completos 1. En los sistemas comerciales disponibles actualmente, se hacen recuentos de células sanguíneas automáticos incluyendo al menos un recuento diferencial de blancos de cinco subclases. Estos analizadores usan tecnología sofisticada y constituyen un equipamiento de última generación que se integra a los laboratorios de rutina. Las muestras sanguíneas son procesadas en sistemas de muestreo cerrados, usan sistemas automáticos de lectura para la identificación por código de barras y tienen interfases con el sistema de información del laboratorio para introducir las pruebas requeridas, los datos identificatorios del paciente y la obtención de resultados. Procesan grandes cantidades de muestras (más de 100 por hora), se pueden seleccionar variantes que cubren un rango amplio de opciones informatizadas como es el establecimiento de alarmas, acumulación de datos de control interno y producción de resultados gráficos de materiales de control interno y de muestras de pacientes. En relación con los aspectos tecnológicos, es importante conocer qué información brindan los diferentes sistemas y qué tecnología usan de acuerdo con los distintos métodos descriptos por los fabricantes. La capacidad y confiabilidad de los instrumentos para recuentos diferenciales evoluciona continuamente. Actualmente, luego de que se ha usado el recuento diferencial por más de 25 años, la confiabilidad y la exactitud del instrumental automatizado ha alcanzado niveles muy altos. Por ello, donde se dispone de los mismos no es conveniente reemplazarlos por el recuento manual basado en la revisión de solo 100 células. Cada laboratorio debe establecer criterios para revisar los extendidos, basado en las alarmas del instrumento, pero por lo general la revisión está más relacionada con la observación de la morfología de eritrocitos o de plaquetas que a un problema en el recuento diferencial leucocitario. Pero a pesar de estos avances, aún hay necesidad de examinar el extendido sanguíneo para determinar la naturaleza de un recuento anormal de poblaciones leucocitarias y de la morfología de plaquetas y de eritrocitos. En 1994 se recomendó, luego de un estudio definitivo, no informar discriminadamente los neutrófilos en banda de los neutrófilos totales y que era aconsejable usar el número absoluto de neutrófilos para detectar una infección. Hay dos indicaciones para la revisión de un extendido en caso de recuentos leucocitarios normales, como el caso de un neonato con fiebre y pacientes con sospecha de fiebre tifoidea. La detección de un recuento alto de neutrófilos en banda, asociado a un recuento de neutrófilos normal, tiene un valor clínico significativo 14. Una adición interesante a la artillería diagnóstica de los nuevos contadores es la inclusión del dispositivo para hacer extendidos como el incluído en el Coulter GEN-S. El instrumento puede ser programado para producir extendidos centinela automáticamente cuando aparece cualquier alarma para eritrocitos, plaquetas y glóbulos blancos con datos identificatorios incluídos 15. Otro dato interesante es la graficación de eritrocitos no lisados como en los Sysmex NE 8000 que permite detectar células resistentes a la lisis como es el caso de las células en diana 15. Otra consecuencia del mejoramiento continuo del instrumental es que se ha podido ampliar el uso de las alarmas. Por ejemplo si no hay células inmaduras o blastos, no hay necesidad de revisar el extendido para buscar anormalidades en los neutrófilos a menos que el porcentaje de neutrófilos exceda el 90%. Así, a comienzos de los años 90 en un centro asistencial de agudos se hacían 100 revisiones manuales y esta cifra bajó a 13%

11 14 Células madres o troncales La concentración de las células madres o troncales (stem cells) es alta en médula ósea, en tanto que en sangre periférica es baja y pueden ser recolectadas después de tratar al paciente con quimioterapia seguida de factores de crecimiento, para aumentar su concentración. Cuando se las recolecta por aféresis es necesario cuantificar la cantidad en sangre periférica. Esto se hace por inmunofluorescencia usando anticuerpo monoclonal anti-cd34 FITC. Esta prueba requiere tiempo y a veces no está disponible. Como estas células (stem cells) contienen pocos lípidos y son resistentes a la lisis por detergentes, pueden ser medidas usando impedancia y radiofrecuencia tal como ha sido desarrollado recientemente 10. Esta prueba requiere poco tiempo comparado con las 2-3 h de la citometría de flujo. Ancho de la distribución del volumen y de la concentración de hemoglobina eritrocitaria Además de estimar VCM es posible producir histogramas que muestren el ancho de la distribución del volumen de eritrocitos (RDW). Tales histogramas son útiles para medir la anisocitosis y para caracterizar situaciones en las que dos poblaciones eritrocitarias estén presentes, por ejemplo en la deficiencia de hierro que responde al tratamiento. Si se utiliza una dispersión de luz de ángulo dual es posible medir la concentración de hemoglobina individual de un eritrocito y construir histogramas que muestren el ancho de la distribución de la concentración celular de hemoglobina (HDW). Ancho de distribución del volumen plaquetario (PDW) Este parámetro puede ser usado para determinar el recuento de plaquetas así como para medir el volumen medio de la plaqueta y la anisocitosis plaquetaria. Así, los contadores hematológicos automatizados ofrecen un rango de los llamados nuevos parámetros, tales como anisocitosis eritrocitaria y plaquetaria, volumen medio de plaquetas y otros más que reflejan otras características de los eritrocitos, plaquetas y leucocitos. Desafortunadamente, la mayoría de estos parámetros tienden a ser específicos de un instrumento y la comparación de los parámetros del mismo nombre puede resultar pobre entre diferentes instrumentos, aún del mismo fabricante. Es probable que por esta razón hayan encontrado poca aplicación en la hematología diagnóstica. Se han publicado muchos estudios interesantes que muestran diferencias entre diversos trastornos, por ejemplo la anisocitosis plaquetaria en la trombocitosis secundaria y la trombocitemia. Sin embargo, estas diferencias con frecuencia no son suficientes o no están suficientemente establecidas para convertirse en criterios firmes de diagnóstico, aunque pueden arrojar alguna luz interesante sobre la fisiopatología subyacente. Sin embargo, los nuevos parámetros disponibles tienen un rol importante dentro del laboratorio, aún si no son informados, debido a que constituyen una guía útil sobre cómo y cuando debe examinarse un extendido de sangre. Alarmas e indicaciones para examinar un extendido de sangre Todos los instrumentos producen alarmas diseñadas para alertar al operador sobre circunstancias en las cuales las mediciones pueden no ser confiables o en las que puede haber células anormales como los blastos o eritrocitos nucleados en sangre periférica. Las alarmas deben ser consideradas, en conjunto con los nuevos parámetros, con todos los diagramas producidos por el instrumento, con los últimos resultados del recuento sanguíneo, con cualquier cambio de los resultados previos y los detalles clínicos, al considerar si un extendido de sangre debe ser examinado o no 17. En términos generales, se espera que los contadores automatizados modernos de células sanguíneas brinden los siguientes servicios: - Identificar la muestra por código de barras - Homogeneizar la muestra - Perforar la tapa del tubo de colecta de sangre y aspirar la muestra - Distribuir la muestra en canales para mediciones separadas, es decir canales de: - Recuento y medición del tamaño de eritrocitos y plaquetas - Recuento total y diferencial de leucocitos (puede haber uno o más canales, dependiendo del instrumento) - Recuento de reticulocitos - Hemoglobinometría - Dentro de cada canal, deben hacerse las diluciones relevantes, agregar reactivos y esperar hasta que la dilución esté lista para la medición. - Hacer las mediciones de cada uno de los canales especificados arriba. - Alertar sobre cualquier anomalía y facilitar la visualización en forma adecuada por el operador

12 AUTOMATIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA 15 - Verificar el control de calidad usando controles adecuados o valores medios del paciente - Trasmitir los datos en línea al sistema de computación del laboratorio - Ser compatible con sistemas robotizados para la automatización total del laboratorio. Todos los instrumentos de última generación tienen buena conformidad con los requerimientos generales listados arriba y tienen relativamente pocas características distintivas. Al seleccionar un contador uno puede requerir desde un equipo que haga un bajo número de muestras por hora a un instrumento que resuelva un gran número en el mismo lapso. Los comentarios siguientes tienen que ver con los equipos que procesan un gran número de especímenes. Si se va a trabajar con una población anormal de pacientes, el número de alarmas para el recuento manual es crítico si se quiere reducir la intensa labor de revisión manual de extendidos de sangre periférica. Hay equipos que tradicionalmente tienen muchas alarmas tanto para datos normales como anormales, en particular para recuentos plaquetarios y para leucocitos inmaduros. Para ello se introdujeron nuevas tecnologías y la posibilidad de contar con los cut off puestos por el usuario. Dependiendo de los equipos, la revisión de los extendidos es cada vez menos requerida. También para reducir el trabajo, hay equipamientos que hacen marcado de extendidos automáticamente. Por otra parte, los hay para el escaneo automático de extendidos, análisis de imágenes y proyección en monitor a color y de alta resolución que hacen que la microscopía sea una actividad cada vez más lejana, en los laboratorios que poseen esa tecnología. Se le han agregado otras funciones a los contadores automáticos como el estudio de antígenos de diferenciación en la superficie celular o marcadores linfocitarios o el análisis diferencial de células de médula ósea. Es de remarcar que estos estudios conviene hacerlos con un citómetro de flujo destinado a tal fin, con personal especializado. De todas formas si se dispone de ese instrumental, esos estudios tienen un valor importante para el médico. Hay argumentos a favor de que agregar mucha información confunde al clínico y debe ser así ya que hay parámetros como el VCM y RDW que aún hoy resultan poco familiares. A partir de los años 90, particularmente en Japón, se generaron sistemas de laboratorio de tercera generación que estaban basados en dos conceptos claves como la consolidación y la integración que permitieron combinar distintas teconologías o estrategias analíticas e integrar instrumental con dispositivos pre y postanalíticos, de modo de reducir complicaciones como algunas relacionadas a la bioseguridad. Inicialmente, la mayor parte (2/3) de los sistemas de laboratorio de tercera generación fue instalada en el laboratorio hematológico, con lo cual se vislumbra que a futuro los mayores avances serán en esa dirección 18. ABSTRACT Most of the practices in the laboratory of hematology are related with observations that include the identification of cells and the interpretation of the composition of blood cell populations. In this work, the methodology used in automated instruments for the conventional blood examination is reviewed, including the measurement of hemoglobin, erythrocyte count and erithrocyte indexes, platelets count, total and differential leukocyte count, and reticulocytes. Different technologies used for those measurements are described, with examples of automated hematology analyzers used, available in the market. Key words: Automation, Hematology, Analytical systems, Technology REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Castillo de Sánchez ML, Fonseca Yerena ME, eds. 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