BIOTECNOLOGÍA APLICADA

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1 CURSO DE BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª Edición DIRECCIÓN DEL CURSO Este curso es posible gracias a una aportación educacional de 7º Curso de DR. JUAN BUEREN Y DR. JOSÉ LUIS MOTELLÓN Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III Madrid, de febrero de 2007

2 Grupo saned SANED 2007 Reservados todo los derechos. Ninguna parte de esta publicación podrá ser reproducida, almacenada o transmitida en cualquier forma ni por cualquier procedimiento electrónico, mecánico, de fotocopia, de registro o de otro tipo, sin el permiso de los editores. Sanidad y Ediciones, S.L. Capitán Haya, Madrid. Tel: Fax: saned@medynet.com Ramon Turró, 91-4.ª planta Barcelona. Tel: Fax: sanedb@medynet.com D.L.: M Soporte Válido: 1702-L-CM Composición, Fotomecánica e Impresión: dgb.

3 Índice ÍNDICE Introducción Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes Miguel A. Piris. Programa de Patología Molecular. CNIO. Madrid Proteómica y Medicina Fernando Vivanco. Departamento de Inmunología. Fundación Jiménez Díaz Inmunoterapia humoral Dr. Manuel Hidalgo. The Johns Hopkins University Introducción a la inmunoterapia celular José R. Regueiro. Departamento de Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid Eduardo Martínez Navas. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid Células embrionarias pluripotentes Miguel Torres. Científico titular del Departamento de Inmunología y Oncología. Centro Nacional de Biotecnología. CSIC-Pfizer Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre Felipe Prósper. Servicio de Hematología y Área de Terapia Celular. Clínica Universitaria. Universidad de Navarra Avances en terapia regenerativa María Dolores Herreros Marcos, Isabel Pascual Migueláñez, Jacobo Trébol López, Damián García Olmo Cátedra UAM-CELLERIX de Terapia Celular y Medicina Regenerativa Unidad de Terapia Celular del Hospital Universitario La Paz. Madrid Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas Laura M. Lechuga. Grupo de Biosensores. Centro Nacional de Microelectrónica (IMM-CNM). CSIC Vectores de transferencia en terapia génica Jesús M. Fominaya. Centro Nacional de Investigaciones oncológicas 1

4 Curso de 7ª edición Índice Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer Juan A. Bueren 1 y Antonio Bernad 2 1 División de Hematopoyesis y Terapia Génica. CIEMAT 2 Departamento de Inmunología y Oncología Centro Nacional de Biotecnología. CSIC Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología Alfonso Domínguez-Gil Hurlé. Servicio de Farmacia. Hospital Universitario de Salamanca Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica humana Fernando Ponz. Departamento de Biotecnología. INIA, Madrid Innovación tecnológica y nuevas terapias: obtención de anticuerpos monoclonales totalmente humanos: panitumumab José Luis Motellón. Amgen S.A. Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la Agencia Europea de Medicamentos (EMEA). BWP (Grupo de Biológicos) y CHMP (Comité de Medicamentos de uso Humano) Sol Ruiz y Gonzalo Calvo. Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimised pharmacotherapy Arnold G. Vulto PharmD PhD and Monique J. Bijl MPharm. Department of Hospital Pharmacy, Erasmus University Medical Centre Rotterdam. The Netherlands 2

5 Introducción INTRODUCCIÓN Un año más nos complace presentar una nueva edición del curso de Biotecnología Aplicada. La buena acogida y el entusiasmo de ponentes y asistentes en cursos previos nos ha servido de incentivo para trabajar en esta sexta edición. El rápido avance que durante los últimos años han experimentado nuestros conocimientos en los múltiples campos de la Biología y la Medicina ha puesto a nuestro alcance una información abundante y crítica que crece de manera exponencial. Nunca anteriormente habíamos podido observar, desde una perspectiva tan múltiple y diversa, el complejo escenario existente en la investigación y el desarrollo de nuevos tratamientos. Nuevos problemas necesitan nuevas soluciones y, ahora más que nunca, la innovación terapéutica se presenta como la clave para la consecución de nuevos tratamientos eficaces y seguros. La búsqueda de nuevas aproximaciones en investigación y desarrollo se ha beneficiado de las aportaciones de nuevas y revolucionarias herramientas, entre las que la Biotecnología brilla con luz propia. Ella nos ha permitido, por primera vez en la historia, ser capaces de producir mediante manipulación genética los compuestos deseados y crear o modificar nuevos fármacos, siguiendo un diseño determinado para mejorar sus propiedades terapéuticas. Los productos biotecnológicos han pasado de ser una parte minoritaria en el arsenal terapéutico, a ser cada vez más indispensables en el tratamiento de millones de pacientes. Gracias a esta incorporación de la Biotecnología a la práctica clínica habitual, enfermedades graves pueden ser hoy día tratadas con éxito, y pacientes con una deteriorada calidad de vida pueden realizar ahora sus tareas cotidianas. La Biotecnología alcanza hoy múltiples campos de la investigación médica, en los que hemos asistido gracias a ella a notables avances. Así ha ocurrido por ejemplo en el campo del diagnóstico, en el descubrimiento de nuevas dianas celulares, en la potenciación de proteínas naturales y en la mejora de tratamientos previos biotecnológicos que permiten aumentar su eficacia y tolerabili- 3

6 Curso de 7ª edición Introducción dad. Un buen ejemplo de ello son las nuevas tecnologías que han permitido desarrollar anticuerpos totalmente humanizados, o pequeñas moléculas de síntesis química que actúan sobre múltiples dianas terapéuticas. La Biotecnología ha recorrido un largo camino, pero las posibilidades que puede brindar en el futuro son enormes. La interdependencia absoluta entre todas las partes implicadas hace de la buena combinación de esfuerzos y sinergias entre todas estas partes el factor, probablemente, más importante para seguir avanzando. El reto está en potenciar la innovación y la defensa de la calidad de los productos biotecnológicos. Sólo a través de la continua y estrecha interacción entre los diferentes sectores de la investigación, tanto públicos como privados, con profesionales del ámbito clínico, será posible encontrar nuevos horizontes en este campo. Para que nuestro país logre ser puntero en este sector, todo ello deberá estar potenciado por un ambiente de apoyo a la innovación dentro del marco macroeconómico. En el marco de esta colaboración, el Curso de Biotecnología Aplicada en su 7ª edición que ahora se presenta ofrece de nuevo la oportunidad de que profesionales de diversos sectores: centros de investigación, farmacia hospitalaria, clínicos y la industria biofarmacéutica se reúnan en una plataforma de formación sobre los aspectos más relevantes ligados con la investigación biotecnológica, especialmente desde el punto de vista más básico y técnico en busca de nuevas perspectivas y aplicaciones prácticas de la investigación biotecnológica, y explorar las nuevas líneas de trabajo que han de arrojar, en breve plazo, nuevas opciones terapéuticas de relevancia científica y clínica. Agradecemos su interés por esta nueva edición del curso y esperamos que encuentren esta iniciativa útil y provechosa. José Luis Motellón Juan Bueren Roncero 4

7 Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes TÉCNICAS DE ANÁLISIS MASIVO DE LA EXPRESIÓN DE GENES Miguel A. Piris. Programa de Patología Molecular. CNIO. Madrid Los conocimientos sobre el genoma humano hacen posible la utilización de tecnologías en Genómica y Proteómica, capaces de analizar la diversidad y complejidad de cada tipo de cáncer, enfocadas hacia el diagnóstico molecular de tumores, adecuando la terapia a cada paciente y contribuyendo a la identificación de genes relevantes en cáncer esporádico y familiar 1. De interés particular es la aplicación de los sistemas de análisis molecular masivo a la predicción de respuesta a tratamientos individuales. Numerosos estudios han demostrado la capacidad de generar estos modelos predictivos aplicados a supervivencia, metástasis, respuesta a tratamientos concretos 2-5. Todos ellos, en mayor o menor grado, adolecen del mismo defecto, la insuficiente reproducibilidad de los resultados generados, cuando son aplicados en un contexto distinto; es decir, en otros centros, por otros especialistas, o usando una tecnología diferente 4,6. SISTEMAS DE ANÁLISIS MOLECULAR MASIVO Matrices tisulares (tissue arrays) Permiten utilizar en bloques parafinados sistemas de análisis masivo. Para ello crean un nuevo bloque de parafina en el que se insertan en posiciones predefinidas hasta 800 cilindros de 600 a 1000µ, procedentes de biopsias de aguja efectuadas sobre bloques de parafina preexistentes. Es un sistema adaptado para investigar un marcador o un panel de marcadores relacionados en una serie amplia de muestras, útil en IHQ, FISH, HIS, 5

8 Curso de 7ª edición Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes complementario a microarrays de cdna. Indicaciones típicas de esta técnica son control de calidad, análisis de nuevos anticuerpos, estudio molecular de cánceres de pequeño tamaño, establecimiento de modelos predictivos basados en expresión de proteínas. La posibilidad de digitalizar el resultado de las inmunotinciones, así como de cuantificar la expresión de una marcador preciso, abre el camino de un uso más ambicioso de las matrices tisulares (MTA) 7,8. SNPs Variaciones naturales de la secuencia entre dos copias del genoma debidas a sustituciones de una base. Hay actualmente descritos por encima de tres millones en todo el genoma -SNP Consortium (TSC) & Human Genome Project (HGP)-, con una densidad mínima de 1 SNP/1.9 kb. De ellos, hay SNPs en exones, lo que refleja una mayor densidad de los mismos en regiones exónicas, más investigadas, hasta una densidad de 1 SNIP/1.08 kb. El numero de polimorfismos existente está en el rango de 10 a 15 millones por individuo 9,10. El análisis de SNPs permite realizar estudios de genética de poblaciones, estudio de genes candidatos para asociación con enfermedades precisas, análisis de resistencia a fármacos, sensibilidad/toxicidad a drogas, así como informar de la predisposición individual a contraer enfermedades complejas, multigénicas 9,10. Así, la mejora en las posibilidades de detección masiva de polimorfismos abre el camino a estudios que relacionen variabilidad genética con riesgo a formas precisas de cáncer y sensibilidad individual a drogas. CGH-Arrays 6 Hay diferentes opciones para arrays de CGH, esencialmente BACs u oligonucleótidos. BACs son cromosomas artificiales humanos conteniendo secuencias de DNA de longitud variable entre 100 a 200 kb. Hay actualmente clones disponibles para todo el genoma, que cubren el genoma con una alta densidad. Su uso permite el diagnóstico preciso de deleciones, duplicaciones, inserciones y reordenamientos. La disponibilidad de miles de BACs ha permitido el desarrollo de chips de BACs (CGH-arrays), que permiten detectar duplicaciones y deleciones con una sensibilidad de 100 Kb 11. Para

9 Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes ello se realiza hibridación comparativa entre DNA de un paciente/dna sujeto sano, o DNA tumoral/dna constitucional. Un ejemplo de ello es la reciente publicación de un array de BACs especifico para la LLC-B, desarrollado por P Lichter 12. Existen también microarrays comerciales de CGH basados en oligonucleótidos, con resolución más fina que los basados en BACs y un alto potencial en investigación y diagnóstico 13. Matrices de cdna (Oncochip) u oligonucleótidos Un microarray de DNA es un sistema miniaturizado en el que fragmentos de DNA se inmovilizan en soportes sólidos. Desde un punto de vista de longitud de la sonda usada, hay 2 tipos de microarrays de DNA: microarrays de cd- NA que presenta sondas de cientos de bases y arrays de oligonucleótidos con sondas de bases o Estos chip o microarrays consisten en un soporte sólido, por ejemplo un portaobjetos, sobre el que un robot ha impreso de manera ordenada miles de cdnas específicos (u oligonucleótidos) representantes de otros tantos genes. Por analogía con el término chip micro-electrónico (dispositivo con una alta densidad de circuitos electrónicos), en biología molecular también se ha utilizado el término de biochip de expresión para denominar a los arrays de DNA, ya que son dispositivos de pequeño tamaño (chip) en los que se alcanza una gran densidad de material biológico (bio) inmovilizado sobre una superficie sólida. Un chip puede ser hibridado simultáneamente con dos sondas de cdna marcadas diferencialmente (por ejemplo con los fluorocromos Cy3 y Cy5) generadas a partir del RNA mensajero de las muestras a comparar (por ejemplo, tejido normal versus tejido tumoral), o bien ser marcado con un único fluorocromo. Después de la hibridación, y utilizando un scanner, puede medirse para cada spot de cdna la intensidad de cada uno de los fluoróforos, siendo el nivel de señal detectado proporcional al número de copias de mrna en la muestra; de modo que el cociente de la intensidad de fluorescencia (Cy3/Cy5) constituye una medida de la expresión génica diferencial relativa al cdna representado en el chip ("ratios" de expresión). El alto grado de integración del array permite, en un solo ensayo, obtener multitud de valores de expresión génica relativa para distintas condicio- 7

10 Curso de 7ª edición Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes nes biológicas, lo que convierte a esta técnica en una herramienta de alto rendimiento para trabajos en el área de la genómica funcional. El gran volumen de datos generados debe ser tratado con herramientas y métodos bioinformáticos 14,15. ANÁLISIS DE RESULTADOS DE MICROARRAYS Los datos generados en estos experimentos precisan de análisis bioinformático, que esencialmente pretenden: Agrupar muestras o genes expresados de forma sincronizada. Identificar genes cuya expresión se asocia a eventos específicos. Asignar función biológica a los genes resultado del experimento. Identificar cambios tiempo-dependientes, ordenados a lo largo del tiempo. Simplificar series de genes al mínimo numero de datos posible. Asignar riesgos específicos derivados de la expresión de genes concretos. Diversas herramientas informáticas están disponibles para este objetivo, entre otras las desarrolladas en el CNIO (GEPAS) y alojadas en la pagina web: LIMITACIONES DE LOS MICROARRAYS DE DNA 8 Como otras técnicas usadas en investigación, los microarrays tienen limitaciones, como: 1. Secuencias no verificadas. Hay un proceso constante de reasignación y edición de las secuencias inicialmente descritas. No obstante, las últimas versiones de los sistemas más comercializados contienen muy escasos errores de asignación. 2. Dificultad de trasladar datos cuantitativos a estados funcionales. Niveles altos de expresión de ARN o proteína no necesariamente implican activacion funcional del gen preciso, y de hecho ocasionalmente implican secuestro o anulación funcional. En este sentido, conclusiones elaboradas a partir de datos generados por estudios de microarrays deben de ser entendidos como hipótesis necesitadas de verificación experimental. 3. Ruido biológico. Sistemas celulares críticos están caracterizados por una alta redundancia. En parte, la variabilidad Inter.-experimental es depen-

11 Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes diente de fenómenos azarosos, u oscilaciones cíclicas, no relacionadas con el objeto del experimento. 4. Falta de estandarización de técnicas de análisis. La mayoría de las plataformas usadas para análisis genómico han alcanzado un alto gado de robustez, pero aún adolecen de una reproducibilidad subóptima, cuando los resultados obtenidos con diversas plataformas son comparados entre sí. El imprescindible gold standard en validación de datos sigue exigiendo comprobar el valor de los datos obtenidos en una nueva población de casos. PCR CUANTITATIVA Aunque sobre un número menor de genes, existen actualmente plataformas comerciales que permiten investigar un numero limitado de genes en sistemas de PCR a tiempo real, dotados de una alta sensibilidad y reproducibilidad. Adicionalmente, datos cada vez mas numerosos muestran que esta técnica es aplicable, en determinadas condiciones, a RNA extraído de material parafinado. El carácter multigénico de alguno de estos análisis (realizados sobre plataformas o tarjetas de hasta 384 pocillos) ha llevado a su denominación como chips de baja densidad. La alta reproducibilidad de estos experimentos facilita la expansión de esta tecnología y su uso en la aplicación clínica de datos surgidos de análisis realizados con microarrays de alta densidad. Así, existen en la actualidad diversos ensayos clínicos enfocados a la predicción de respuesta a terapia basada en datos de expresión obtenidos con PCR en tiempo real, por ejemplo en carcinoma de mama. DETECCIÓN DE PROTEÍNAS COMO MARCADORES SÉRICOS Múltiples grupos de investigación coinciden en el objetivo de identificar marcadores séricos informativos de riesgo de contraer enfermedades específicas, o adecuados para el seguimiento de enfermedad residual mínima 16. La idea no necesita apenas justificación, el análisis de suero es una técnica mínimamente invasiva, que permite monitorizar con frecuencia cambios previos al diagnóstico clínico o a lo largo de la enfermedad. Resultados iniciales obtenidos en cáncer de ovario, páncreas o próstata alentaron esta línea de trabajo, 9

12 Curso de 7ª edición Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes usando SELDI-TOF-MS. Sin embargo, estos estudios han demostrado una baja reproducibilidad y una elevada tasa de falsos positivos, lo que prejuzga su uso como técnica de análisis rutinario en análisis de poblaciones a riesgo de contraer enfermedades específicas 17,18. DETECCIÓN DE FOSFOPROTEÍNAS EN CÉLULAS INDIVIDUALES Recientes datos experimentales coinciden en que tanto el mecanismo de acción de drogas, como la sensibilidad a las mismas, es desvelado con mayor precisión recurriendo a análisis de proteínas inducidas por la acción de estas drogas, bien en modelos o pacientes. Así, agentes que dañan el DNA inducen fosforilación de sensores de daño a DNA, mientras que agentes cuya diana está constituida por rutas de traducción de señal inducen cambios en el estado de fosforilación de proteínas críticas en estas rutas. La disponibilidad de anticuerpos contra diferentes estados funcionales de estas proteínas permite usar la citometría de flujo como técnica de análisis de estos cambios, con la ventaja de que esto nos permite reconocer la existencia de cambios sutiles en subpoblaciones celulares minoritarias APLICACIONES EN FARMACOGENÓMICA 10 Las matrices de cdna permiten también establecer el llamado perfil genómico de un fármaco, o firma molecular del mismo, además de establecer firmas moleculares predictivas de sensibilidad/resistencia. Aunque desde un punto de vista clínico tiene mayor interés identificar marcadores iniciales, al diagnóstico, de sensibilidad a drogas precisas, alcanzar este objetivo tropieza con los mecanismos de acción múltiples de la mayoría de las drogas en uso, así como con la existencia de múltiples sistemas redundantes de promoción de la supervivencia de las células neoplásicas. En la práctica, se ha demostrado que los cambios inducidos por drogas son más informativos que alteraciones moleculares al diagnóstico 3. Estos cambios pueden ser analizados in vitro -células tumorales expuestas a la acción de drogas precisas- o in vivo - cambios en el tiempo en células leucémicas tras tratamiento-. De hecho, el tratamiento con un fármaco concreto de una línea celular específica permite identificar el conjunto de genes inducidos en respuesta a ese

13 Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes fármaco. Estos genes muestran variabilidad en función de la droga, estirpe celular, alteraciones génicas precisas e intervalo de tiempo transcurrido hasta el análisis. Su conocimiento permite proponer mecanismos de acción de una droga precisa. Uno de los objetivos en análisis farmacogenómico es la identificación de pacientes sensibles o resistentes a drogas concretas. La resistencia a una droga depende de múltiples factores, incluyendo sobreexpresión de genes de resistencia a drogas, incremento en la reparación de DNA, o alteraciones en la sensibilidad celular a quimioterapia, afectando a múltiples rutas. Marcadores de resistencia o sensibilidad identificados en modelos experimentales en el laboratorio o en pacientes aislados pueden perder interés cuando se estudian sobre series largas de pacientes. Consecuentemente, es preciso analizar la relevancia clínica de los genes así identificados en series de pacientes tratados de forma randomizada. Una aplicación extremadamente relevante de estos estudios es la identificación de dianas terapéuticas y el análisis de rutas. Esencialmente, la información derivada de estos estudios brinda la oportunidad de proponer nuevas dianas que, después de validación experimental, permitan el desarrollo de drogas racionalmente dirigidas. FUTURO EN LA APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE GENÓMICA Y PROTEÓMICA El alto potencial aplicado a investigación y diagnóstico de estas técnicas aún precisa de numerosos estudios adicionales, previamente a su aplicación clínica masiva. Este carácter novedoso y el alto nivel de complejidad de estos experimentos queda subrayado por el hecho de que aún se publican muchas más revisiones o comentarios editoriales sobre técnicas de genómica y proteómica que resultados originales. No obstante, cabe esperar que la aplicación clínica de estas técnicas siga en incremento, cubriendo primero una etapa de identificación de marcadores diagnósticos y, posteriormente, propuesta y validación de dianas terapéuticas. El desarrollo de estas técnicas de análisis molecular masivo, al mismo tiempo, está ofreciendo un reto para el desarrollo de sistemas de análisis estadístico de múltiples variables y validación de datos. 11

14 Curso de 7ª edición Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes BIBLIOGRAFÍA Ponder BA. Cancer genetics. Nature. 2001;411: Bittner M, Meltzer P, Chen Y, et al. Molecular classification of cutaneous malignant melanoma by gene expression profiling. Nature. 2000;406: Golub TR. Toward a functional taxonomy of cancer. Cancer Cell. 2004;6: Tracey L, Villuendas R, Dotor AM, et al. Mycosis fungoides shows concurrent deregulation of multiple genes involved in the TNF signaling pathway: an expression profile study. Blood. 2003;102: Staunton JE, Slonim DK, Coller HA, et al. Chemosensitivity prediction by transcriptional profiling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98: Strausberg RL, Simpson AJ, Old LJ, Riggins GJ. Oncogenomics and the development of new cancer therapies. Nature. 2004;429: Garcia JF, Camacho FI, Morente M, et al. Hodgkin and Reed-Sternberg cells harbor alterations in the major tumor suppressor pathways and cell-cycle checkpoints: analyses using tissue microarrays. Blood. 2003;101: Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 1998;4: Erichsen HC, Chanock SJ. SNPs in cancer research and treatment. Br J Cancer. 2004;90: Nebert DW. Pharmacogenetics and pharmacogenomics: why is this relevant to the clinical geneticist? Clin Genet. 1999;56: Ishkanian AS, Malloff CA, Watson SK, et al. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nat Genet. 2004;36: Schwaenen C, Nessling M, Wessendorf S, et al. Automated array-based genomic profiling in chronic lymphocytic leukemia: development of a clinical tool and discovery of recurrent genomic alterations. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101: Barrett MT, Scheffer A, Ben-Dor A, et al. Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101: Zhang H, Yu CY, Singer B, Xiong M. Recursive partitioning for tumor classification with gene expression microarray data. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98: Vaquerizas JM, Conde L, Yankilevich P, et al. GEPAS, an experiment-oriented pipeline for the analysis of microarray gene expression data. Nucleic Acids Res. 2005;33:W Hanash S. Disease proteomics. Nature. 2003;422: Ransohoff DF. Lessons from controversy: ovarian cancer screening and serum proteomics. J Natl Cancer Inst. 2005;97:

15 Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes 18. Baggerly KA, Morris JS, Edmonson SR, Coombes KR. Signal in noise: evaluating reported reproducibility of serum proteomic tests for ovarian cancer. J Natl Cancer Inst. 2005;97: Lesinski GB, Kondadasula SV, Crespin T, et al. Multiparametric Flow Cytometric Analysis of Inter-Patient Variation in STAT1 Phosphorylation Following Interferon Alfa Immunotherapy. J Natl Cancer Inst. 2004;96: Jacobberger JW, Sramkoski RM, Frisa PS, et al. Immunoreactivity of Stat5 phosphorylated on tyrosine as a cell-based measure of Bcr/Abl kinase activity. Cytometry A. 2003;54: Irish JM, Hovland R, Krutzik PO, et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 2004;118:

16 Proteómica y Medicina PROTEÓMICA Y MEDICINA Fernando Vivanco. Departamento de Inmunología. Fundación Jiménez Díaz La medicina molecular se está desplazando muy rápidamente de la genómica a la proteómica ya que, al permitir el estudio de tejidos, células y líquidos biológicos, las alteraciones en las proteínas constituyen auténticas firmas moleculares de los procesos patológicos. Aunque todavía está en desarrollo en muchas áreas, la proteómica ya está madura para empezar a ser trasladada a la clínica. La proteómica clínica favorece la detección precoz de la enfermedad, su monitorización, el uso de terapias más efectivas y un entendimiento más profundo y global de la patogénesis. La utilización de perfiles proteicos diagnósticos y pronósticos, de suero y de tejidos, constituye una auténtica revolución que puede cambiar el panorama de la analítica clínica, acercándose a la medicina personalizada. Además, es un atajo para la detección de biomarcadores (hay mas de 500 nuevas proteínas con interés clínico identificadas por proteómica, frente a las 150 proteínas actualmente utilizadas como marcadores clínicos) y dianas diagnósticas y terapéuticas, en un mercado claramente en expansión. Los perfiles proteicos de muestras tratadas con fármacos permiten, además, identificar posibles efectos secundarios desconocidos, ya que permite detectar todas las proteínas que el fármaco altera. La proteómica clínica es ya una realidad de la Medicina del siglo XXI. En España es un área sin desarrollar, que debería ir implantándose en todos los grandes hospitales y centros de investigación biomédica. INTRODUCCIÓN Una de las consecuencias más beneficiosas derivadas del conocimiento del Genoma Humano ha sido el gran impulso que se ha producido en el desarrollo 15

17 Curso de 7ª edición Proteómica y Medicina 16 de la Proteómica. La descripción del genoma de los organismos (Genómica) aporta un conocimiento esencial para el estudio de cualquier proceso biológico. Sin embargo, tal conocimiento es tan necesario como insuficiente, porque las funciones celulares dependen en última instancia de los productos finales de los genes: las proteínas y sus interacciones, asociaciones macromoleculares, vías de señalización, etc. De esta forma, la era post-genómica de la medicina molecular se está desplazando rápidamente de los listados de genes, la transcriptómica y la genómica funcional, a la proteómica. Ésta ha dejado de ser (como en sus inicios) la producción de listas de proteínas que incrementan o decrecen su expresión como causa o consecuencia de diversas condiciones o alguna patología. Actualmente, la proteómica implica el conocimiento global de las proteínas, su estructura y funciones, interacciones y modificaciones postraduccionales, rutas de señalización, localización intra e intercelular, etc., para generar el mapa celular que permita entender los procesos biológicos en condiciones normales y patológicas (lo que ha venido a denominarse la biología de sistemas). En suma, la proteómica es una actividad científica lo suficientemente madura, como para ser aplicada a la clínica humana con notables beneficios. Figura 1. Esquema de las relaciones entre genoma y El proteoma comprende el conjunto de todas las proteínas que proteoma. Mientras que el resultan de la expresión del genoma de las células, tejidos u organismos. No es algo estático como el genoma (relativamente) sino una genoma es comun a todas las células y colección dinámica de proteínas que refleja tanto el programa genético propio de la célula como el efecto de su entorno (Figura 1). relativamente estático, el proteoma está cambiando Comparado con el genoma, el proteoma proporciona una visión más constantemente en realista del status biológico y se espera, por tanto, que tenga una respuesta a las condiciones de cada mayor utilidad que el análisis genómico, para evaluar y conocer la momento. enfermedad, su progresión y la respuesta al tratamiento farmacológico. Así, la proteómica es el puente entre la mera descripción de la secuencia de los genes y el comportamiento celular. Cada gen puede producir varias formas moleculares de una(s) proteína(s) que posteriormente son modificadas post-traduccionalmente. Se han descrito más de 200 tipos de tales modificaciones químicas (glicosilación, prenilación, fosforilación, acetilación, etc.), pudiéndose dar varias en una misma

18 Proteómica y Medicina proteína de manera permanente o transitoria. Tales modificaciones afectan a su estructura y propiedades funcionales, vida media, localización intra y extracelular, interacciones proteína-proteína, etc. El proteoma viene definido, por tanto, en términos de secuencia, estructura, abundancia, localización, modificación, interacción y función de las proteínas y constituye el fenotipo característico de cada célula o tejido. Esta información no puede obtenerse del genoma ni del transcriptoma (conjunto de ARN mensajeros transcritos), por lo que el estudio de los proteomas es imprescindible y complementario de los datos genómicos. Entre las muestras biológicas más importantes cuyo conocimiento del proteoma es esencial se encuentran los líquidos fisiológicos (suero), ya que no tienen ácidos nucleicos. Por otra parte, las proteínas son la diana de más del 90% de los fármacos, por lo que su estudio cobra mayor relevancia. La proteómica se define habitualmente como el análisis del conjunto de las proteínas que componen las células y se lleva a cabo mediante tres tipos fundamentales de estudios: A) Identificación y catalogación de las proteínas (y sus modificaciones post-traduccionales) que constituyen los distintos proteomas, cuya información, almacenada en bases de datos, es un elemento esencial para el resto de estudios proteómicos. B) Proteómica de expresión diferencial, cuya finalidad es el estudio comparativo de una célula (o muestra biológica) en dos condiciones distintas (un control sano frente al patológico, o tratado y sin tratar con un fármaco, etc.) para detectar las proteínas que sufren modificaciones químicas o alteraciones en sus niveles de expresión. Permite identificar proteínas que puedan representar biomarcadores pronósticos, diagnósticos y de seguimiento de una enfermedad y que, con frecuencia, pueden ser nuevas dianas terapéuticas. C) Proteómica del mapa celular, cuyo objetivo es el estudio de las interacciones proteína-proteína, asociaciones macromoleculares, rutas de señalización, etc. Pretende construir un mapa físico de las interacciones existentes entre las proteínas celulares, haciendo uso de técnicas estructurales (rayos X, resonancia magnética nuclear) y cinéticas y de herramientas bioinformáticas. Una de las áreas con mayor actividad actualmente en proteómica es la identificación de nuevos biomarcadores para el diagnóstico y la prevención de las enfermedades prevalentes, cáncer, cardiovasculares, neurológicas, etc. Los 17

19 Curso de 7ª edición Proteómica y Medicina 18 avances en las estrategias diagnosticas convencionales (técnicas de imagen, RMN, PET), están suponiendo una notable mejora, pero no poseen ni la sensibilidad ni la especificidad requerida para detectar estados preclínicos, y además su coste es muy elevado. Es bien conocido que mas del 50% de los infartos agudos de miocardio ocurren sin síntomas previos y que más del 60% de los pacientes con cáncer de mama, pulmón, colon y ovario, presentan ya metástasis cuando son diagnosticados, y en ese estadio, las terapéuticas convencionales tienen un éxito muy limitado. Hay, por tanto, una necesidad urgente de identificar nuevos biomarcadores que eviten estas situaciones. Un marcador biológico (biomarcador) es una molécula o característica, que puede ser medido objetivamente y evaluado como un indicador de un proceso biológico normal o patológico, o de la respuesta farmacológica a una Figura 2. Esquema del funcionamiento de la intervención terapéutica. La búsqueda de biomarcadores puede llevarse a cabo en tejidos, en células (circulantes) o en líquidos fisioló- microdisección mediada por láser. Parte izquierda: gicos (fundamentalmente plasma o suero). En el caso de los tejidos observación al microscopio (biopsias por ejemplo) uno de los mayores obstáculos es la heterogeneidad celular, que puede complicar mucho el diseño y sobre todo del corte de tejido y selección de la zona de interés. Centro: disparo del los resultados de los análisis proteómicos, al no tratarse de poblaciones celulares homogéneas. Sin embargo, recientemente se ha desa- láser sobre la zona seleccionada que catapulta rrollado una técnica muy útil para la obtención y purificación de estirpes celulares puras a partir de cortes de tejidos, denominada a las células al tubo de recogida. Parte derecha: microdisección, mediante captura con láser que se ilustra en la Figura 2. Las preparaciones celulares homogéneas así obtenidas son muy ampliación de la figura del centro donde se observa el apropiadas para el análisis proteómico. Sin embargo, el tipo de grupo de células que son selectivamente extraídas muestra idóneo para los estudios clínicos es el plasma o el suero, del del tejido. que puede obtenerse un perfil o patrón del conjunto de las proteínas (y/o péptidos) presentes en cada momento y que puede contener biomarcadores que reflejen el estado patológico y que posean valor diagnóstico y/o pronóstico. Sin embargo, el estudio de los proteomas o de los perfiles proteicos de los líquidos biológicos (ver más adelante), presenta un grado de complejidad considerable que no existe en los estudios genómicos, debido fundamentalmente a las siguientes causas:

20 Proteómica y Medicina a) El amplísimo rango dinámico de la concentración de proteínas en tejidos y especialmente en el plasma humano. Entre la concentración de albúmina (milimolar; 50 mg/ml) y algunas interleuquinas (picomolar; 1-5 pg/ml) hay una diferencia de más de 10 logs. Ninguna técnica analítica ni proteómica abarca mas de 4-5 órdenes de magnitud. Además, 20 proteínas representan el 99% del contenido total de las proteínas plasmáticas, lo que dificulta enormemente el análisis de las proteínas presentes a baja concentración, donde con frecuencia se encuentran los potenciales biomarcadores. Para el análisis de Figura 3. Depleción de las plasma es necesario deplecionar de estas proteínas mayoritarias (Figura 3). seis proteínas mayoritarias del plasma utilizando un b) La presencia de diferentes formas moleculares de cada proteína e isoformas. Muchos genes producen múltiples mr- (FPLC) y una columna de cromatógrafo líquido NAs, mediante diversos mecanismos (splicing alternativo, afinidad que posee mrna editing, modificaciones co- y post traduccionales). anticuerpos específicos frente a las 6 proteínas. Al En promedio, en humanos, se estima que un gen genera al aplicar el plasma sobre la menos 3-4 proteínas, por lo que considerando genes, columna la mayoría de las pueden esperarse un mínimo de proteínas. Obviamente no todas las proteínas estarán presentes en todas retenidas ("low abundant proteínas fluyen sin ser las células, tejidos, etc., pero el plasma contiene una gran representación de muchas de ellas. posteriormente las proteins") y proteínas mayoritarias son c) Diversidad estructural. Dada su presencia en distintos entornos (solubles, membranas, matriz, etc.) las proteínas son de eluidas ("high abundant proteins"). En la parte naturaleza muy diversa. Solo en tamaño pueden variar desde inferior se muestra el 50 aminoácidos (hay anotados en el Swiss-Prot) hasta análisis mediante 2-DE de casi aminoácidos, como la Nesprina 1 (8746 aa). ambas fracciones. Además, hay que considerar la presencia de múltiples modificaciones postraduccionales que afectan a la función, localización, etc., de las proteínas. d) Una gran mayoría de las proteínas no actúan solas sino en asociación con otras, creando por un lado, asociaciones macromoleculares, y por otro, participando en multitud de ru- 19

21 Curso de 7ª edición Proteómica y Medicina tas de señalización, metabólicas, etc. El conocimiento de las interacciones proteicas y la descripción del mapa celular es esencial para entender la fisiopatología de cualquier sistema biológico. Sin embargo, el conocimiento de los proteomas ofrece la visión óptima de lo que ocurre en la célula, tejido, líquido fisiológico, etc., por lo que es necesario su determinación. PROTEÓMICA CLÍNICA 20 A pesar de la complejidad antes citada, el rápido y notable desarrollo de la Proteómica en los últimos años, ha conducido a su aplicación a los procesos patológicos o Proteómica Clínica. La proteómica está especialmente "capacitada" para el estudio de la enfermedad porque se puede aplicar a las células, tejidos y líquidos biológicos. La aplicación clínica de la proteómica implica el uso de las tecnologías proteómicas para todos aquellos aspectos que puedan beneficiar a los pacientes: desde la búsqueda de nuevos marcadores de enfermedad o de perfiles proteicos diagnósticos, hasta la descripción de factores predictivos y preventivos que permitan un tratamiento y seguimiento terapéutico personalizado. La Proteómica Clínica se ocupa de la identificación sistemática y exhaustiva, a gran escala, de patrones proteicos de enfermedad y la aplicación de esos datos a los pacientes (estudio de la enfermedad, susceptibilidad, prevención, selección de terapias, seguimiento de los tratamientos, etc.). Dada la complejidad de los procesos patológicos, la integración de las nuevas tecnologías proteómicas con las bases de datos clínicas y las técnicas analíticas clásicas, sería altamente beneficioso para la comprensión y el tratamiento de la enfermedad. Entender, por ejemplo, las alteraciones tempranas en diversas enfermedades (típicamente en cáncer o en los síndromes coronarios agudos), produce una notable mejora en la prevención e identificación de pacientes con riesgo y/o en estado preclínico. La Proteómica Clínica pretende definir patrones de proteínas que puedan generar información de valor clínico acerca de la susceptibilidad, diagnóstico, pronóstico y terapia de la enfermedad. Testar hipótesis clínicas relevantes, frente a conjuntos de datos (masivos) derivados de medidas procedentes de técnicas de alto rendimiento como las proteómicas, y poblaciones humanas fenotipadas correctamente, es una función esencial de la proteómica

22 Proteómica y Medicina clínica. Para que la proteómica clínica impacte de manera real en la mejora de la salud debe descubrir y seleccionar patrones proteicos, validarlos en estudios poblacionales muy amplios y trasladarlos a la práctica clínica. Aunque no se describe aquí, no debe olvidarse que el aprovechamiento óptimo de la relación entre patrones proteicos y enfermedad, depende a su vez de la integración con la información sobre la variación genética y la expresión génica (arrays de DNA, genotipado, SNPs, etc.). OBJETIVOS DE LA PROTEÓMICA CLÍNICA La finalidad de la Proteómica Clínica está, actualmente, centrada en al menos los siguientes tipos de actividades: Identificación de biomarcadores La búsqueda e identificación de biomarcadores individuales se lleva a cabo siguiendo la metodología proteómica clásica de separación de proteínas (2-DE, DIGE, cromatografía multidimensional y electroforesis capilar) y su identificación por espectrometría de masas (MS; MAL- Figura 4. Esquema del análisis proteómico DI-TOF, ESI-Q-TOF o ESI-Trap, MALDI-TOF/TOF). Su estrategia fundamental es el análisis de la expresión diferencial de diferencial. La comparación de los geles proteínas entre controles y muestras patológicas (Figura 4), de 2-D permite identificar las proteomas completos (lisados celulares) o subproteomas específicos (mitocondrias, membranas, etc.). Recientemente se está utili- diferencialmente proteínas zando la cromatografía líquida (en una o varias dimensiones) aplicando diversos métodos de proteómica expresadas. cuantitativa que permiten la comparación de los perfiles proteicos de varias muestras simultáneamente (itraq, SILAC, etc.). Un aspecto fundamental es la determinación de las modificaciones postraduccionales y su potencial implicación en patología. En muchos casos los biomarcadores se convierten simultáneamente en nuevas dianas terapéuticas. 21

23 Curso de 7ª edición Proteómica y Medicina Obtención de perfiles proteicos Consiste en el estudio sistemático, a gran escala, de las proteínas de una muestra para la identificación de patrones o perfiles proteicos (huellas dactilares proteicas), con carácter diagnóstico (discriminatorio) y/o pronóstico. Los escasos biomarcadores identificados, y aprobados (por la FDA) en los últimos años, son un reflejo de la estrategia habitual de testar una proteína individual, o llevar a cabo análisis en pequeña escala, etc. Aunque existen excepciones (paraproteínas de los mielomas, déficit de α1-antitripsina) es muy posible que no existan marcadores únicos de las enfermedades complejas, por lo que la estrategia proteómica de estudiar paneles proteicos supone un paso cualitativo de gran trascendencia. Este estudio se puede llevar a cabo mediante al menos tres estrategias: 22 Figura 5. Diferentes formas de representar el resultado del análisis mediante SELDI-TOF de una muestra de suero. En el panel superior se muestra el resultado experimental y en los dos inferiores tras su procesamiento informático. Sólo se muestra la sección correspondiente a las masas (m/z) comprendidas entre 3000 y 7000 m/z. A) Perfiles proteicos de plasma o suero Se lleva a cabo analizando el suero/plasma de los pacientes con la patología objeto de estudio (cardiovascular, neurodegenerativa, infecciosas, cáncer, etc.) y alternativamente en otros líquidos fisiológicos (lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquído, orina). Se utiliza la técnica denominada SELDI-TOF (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization-Time of Flight) para la generación de los perfiles proteicos, que combina la retención de las proteínas del suero en biochips con la determinación de sus masas moleculares mediante MS, permitiendo generar gráficos donde se representa la abundancia frente a la masa molecular de las proteínas, a modo de código de barras proteicos constituidos por miles de líneas que caracterizan el suero de cada individuo (Figura 5). La comparación de los perfiles normales (individuos sanos) con los obtenidos del suero de pacientes con distintas patologías (se está utilizando en cáncer y en patologías cardiovasculares, neurodegenerativas, osteoarticulares, respiratorias, infecciosas...) permite obtener perfiles pronósticos, diagnósticos, de seguimiento, de tratamiento farmacológico, etc. Su poder

24 Proteómica y Medicina discriminatorio es muy superior al de marcadores únicos con los que se han comparado (por ejemplo, PSA en cáncer de próstata, proteína C reactiva en infección e inflamación). Como el análisis mediante SELDI-TOF utiliza muy poca muestra (1 µl) y, además, es muy rápido (se pueden analizar cientos de muestras al día) y automatizado, su potencial en clínica analítica es enorme y puede ir sustituyendo muchas de las técnicas habituales de los laboratorios de bioquímica clínica (enzimo-inmunoanálisis), que son más lentos, más caros (utilizan anticuerpos fluorescentes), usan mayor cantidad de muestra y sólo informan de un único marcador, frente a los miles que proporciona el SELDI- TOF. A pesar de sus indudables ventajas, el sistema SELDI-TOF decrece su sensibilidad y exactitud en la determinación de la masa para proteínas mayores de 70 kda, lo que es el caso de muchas de las proteínas plasmáticas humanas (se conocen más de actualmente). Por otra parte, su reproducibilidad no es bien conocida, dado el todavía reducido número de investigadores que utilizan esta plataforma; además, en muestras tan complejas como el plasma humano, el sistema de fraccionamiento inicial en los chips de retención necesita estandarizarse mejor, por lo que se están definiendo actualmente unos estándares cuantitativos de referencia. Sin embargo, el número de potenciales biomarcadores de enfermedad, identificados mediante SELDI-TOF, no deja de aumentar de manera constante. Algunas de las críticas al sistema SELDI-TOF tienen un origen más económico que científico, dado el enorme mercado por el que compite, el de la bioquímica clínica. B) Perfiles proteicos de tejidos: MS-Imaging En tejidos, pueden obtenerse perfiles o imágenes (mapas) bidimensionales de proteínas (MS-Imaging), aplicando directamente la MS sobre cortes histológicos del tejido (cortes habituales sobre portaobjetos para microscopia óptica, de 5-20 m de grosor), utilizando el MALDI-TOF o el MALDI-TOF/TOF. El mapa bidimensional se obtiene haciendo incidir el láser (que "barre" la superficie de la muestra) del espectrómetro sobre los cortes histológicos recubiertos de matriz (compuestos orgánicos que cristalizan atrapando las proteínas en el cristal y absorben la energía del láser, siendo el conjunto sublimado) y analizando las proteínas que son vaporizadas. Típicamente se obtienen señales de proteínas individuales en cada punto del tejido, con masas entre 2-70 kda. De esta forma se obtiene la masa (m/z) de las moléculas (péptidos, 23

25 Curso de 7ª edición Proteómica y Medicina 24 proteínas) presentes en cada zona del tejido. Seleccionando una masa dada (m/z) en los distintos espectros de las diferentes zonas, se genera un mapa bidimensional de la distribución de esa proteína (esa m/z) a lo largo del corte de tejido (a modo de cartografía proteica). Se pueden obtener dos tipos de datos: Perfiles proteicos (mediante una aplicación puntual de matriz y adquisición de datos de cada punto) e Imágenes (recubriendo todo el tejido y haciendo un barrido del Figura 6. Representación mismo con el láser) (Figura 6). esquemática de los fundamentos del MS- Las imágenes son generadas mediante un software específico Imaging. Sobre el corte de que clasifica y agrupa las proteínas y compara diversas muestras, tejido recubierto de permitiendo obtener imágenes tridimensionales de la distribución de matriz, se hace incidir un las proteínas del tejido. Este software también puede integrarse con láser que va recorriendo la software de análisis histológico, permitiendo la cuantificación de superficies e intensidades, así como la superposición con imágenes de superficie del tejido y logra vaporizar las proteínas microscopia (histoquímica e inmunohistoquímica). Esta tecnología presentes en cada punto de la superficie, obteniéndose implica un tipo de información totalmente nuevo para la descripción, un espectro de masas de clasificación y caracterización de muestras histológicas, que está cada punto. Seleccionando permitiendo la identificación de biomarcadores, la localización de una masa (m/z) dada (que proteínas específicas y en el campo de la oncología, por ejemplo, la corresponderá a una reclasificación de tumores. La técnica es compatible con los métodos de tinción clásicos, lo que permite la integración de ambos tipos proteína particular) a lo largo del tejido (en sus correspondientes de datos. El MS-Imaging puede aplicarse a preparaciones homogéneas de células, obtenidas del propio corte histológico mediante mi- espectros), puede reconstruirse una imagen o crodisección por captura con láser, incrementando así su resolución. mapa bidimensional de la Esta tecnología puede complementar, o sustituir, muchas de las técnicas manuales actuales (microscopia óptica, fluorescencia) en los presencia de dicha proteína. departamentos de anatomía patológica de los hospitales. Una técnica muy similar (SIMS-TOF; secondary ion mass spectrometry) permite el análisis (identificación y caracterización) de moléculas de bajo peso molecular presentes en la superficie de una muestra (determinación del metaboloma). Hasta hace pocos años no se utilizaba con muestras biológicas debido a la alta fragmentación que producía sobre los componentes biológicos. Sin