Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro

Transcripción

1 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura Alexandra Perdomo Díaz Universidad Nacional de Colombia Facultad de Odontología, Especialidad en Endodoncia Bogotá, Colombia 2014

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3 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura Alexandra Perdomo Díaz Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de: Especialista en Endodoncia Director: Magíster en Ingeniería Biomédica, Javier Laureano Niño Codirectora: PhD Microbiología, Martha Raquel Fontanilla Asesor metodológico: PhD Salud pública, John Harold Estrada Montoya Línea de Investigación: Endodoncia regenerativa Grupo de Investigación: Invendo Universidad Nacional de Colombia Facultad de Odontología, Especialidad en Endodoncia Bogotá, Colombia 2014

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5 (Dedicatoria) A Dios por las oportunidades que me brinda, por ser mi guía y compañía en cada camino que recorro. A mis padres por su apoyo incondicional, ejemplo de superación, lucha y entrega en cada acto que realizan. Son mi motor, fuerza y motivación.

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7 Agradecimientos Expreso un sincero agradecimiento a la Doctora Martha Raquel Fontanilla Duque, PhD en microbiología, por su colaboración, continua asesoría, por compartir sus conocimientos en el área de la regeneración y en especial por su interés en la adecuada elaboración del proyecto y sus aportes durante el desarrollo del documento. Al Doctor John Harold Estrada Montoya, PhD en salud pública, por su aporte en la metodología e ideas innovadoras para la generación de este trabajo de grado. Al director del presente trabajo de grado por la revisión y correcciones que sugirió para el desarrollo del proyecto.

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9 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura IX Resumen La tendencia actual en la ingeniería de tejidos es el empleo de las células madre mesenquimales (MSCs) aisladas de tejidos adultos, hay un gran interés en el uso de células madre de la pulpa dental (DPSCs) para la regeneración del tejido dental. Por ello, el propósito de este estudio fue realizar una revisión narrativa de la literatura científica disponible para la obtención de muestra, aislamiento y caracterización in vitro de células madre (SCs) mesenquimales derivadas de la pulpa de dientes permanentes humanos. Se observa que a partir del tejido pulpar de dientes permanentes humanos es posible aislar y cultivar MSCs con características clonogénicas. Las DPSCs presentan expresión de marcadores de superficie de células madre mesenquimales como CD105, CD73 y CD90, propuestos por la sociedad internacional para la terapia celular (ISCT) como un estándar para definir MSCs humanas para procesos de investigación científica en laboratorio y para estudios preclínicos. No obstante, es necesario realizar estudios encaminados a la identificación de marcadores propios para DPSCs. Palabras clave: Células madre, pulpa dental, técnicas de cultivo celular, ingeniería de tejidos, revisión

10 X Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura Abstract The actual tendency to tissue engineering is make use of mesenchyme stem cells (MSCs) derivative from adult tissue and there is an increasing interest in the utility of dental pulp stem cells (DPSCs) for dental tissue regeneration. For this reason the purposes of this study were make a review of the scientist literature available about the obtaining for the sample, isolation and characterization in vitro of (MSCs) originating of the permanent teeth pulp human. One considers that the pulp tissue is appropriate to the isolation and culture of (MSCs) with clonogénicas characteristics. The DPSCs express mesenchyme stem cell surface markers CD105, CD73 and CD90, proposes for the Mesenchyme and Tissue Stem Cell Committee (ISCT) a set of standards to define human MSC for both laboratory-based scientific investigations and for pre-clinical studies. Nevertheless, there is a necessity to recognize own cell surface markers to DPSCs. Keywords: Stem cells, dental pulp, cell culture techniques, tissue engineering, review

11 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura XI Contenido Pág. Resumen IX Abstract..X Lista de figuras..xv Lista de tablas..xvii Lista de símbolos y abreviaturas... XVIII Introducción....1 Planteamiento del problema..4 Pregunta de investigación.7 Justificación...8 Objetivos...10 Diseño metodológico 11 Criterios de inclusión y exclusión.13 Descripción bibliométrica Desarrollo dental Evolución dental Etapas del desarrollo dental Estadío de iniciación Estadío de brote Estadío de casquete Estadío de campana Características de la pulpa dental Características anatómicas de la pulpa dental....23

12 XII Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura 2.2 Características histológicas de la pulpa dental Funciones de la pulpa dental Inductora Formativa Nutritiva Sensitiva Defensiva o reparadora Matriz extracelular de la pulpa dental Células de la pulpa dental Odontoblastos Fibroblastos Células mesenquimales indiferenciadas Células inmunes Patologías que afectan la integridad de la pulpa dental Tratamiento de las patologías de la pulpa dental Prevención del daño pulpar Tratamientos para patologías reversibles Recubrimiento pulpar indirecto Recubrimiento pulpar directo Tratamientos para patologías irreversibles Amputación pulpar Pulpectomía Tratamiento de conductos radiculares Cirugía apical Incisión y drenaje Resección dental Extracción con reimplantación Manejo de dientes con trauma Limitaciones de los tratamientos empleados para patologías pulpares.38

13 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura XIII 6. Regeneración y reparación Moléculas de señalización Scaffold o andamios Materiales de los andamios Células madre Potencialidad de células madre Clasificación de células madre Inmunofenotipo mesenquimal de células madre MSCs derivadas de los tejidos dentales Caracterización de MSCs derivadas de los tejidos dentales Aplicación de las células madre en la regeneración Aplicación de las células madre en la odontología Metodologías sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de MSCs obtenidas de la pulpa de dientes permanentes Obtención de la muestra de MSCs obtenidas de la pulpa de dientes permanentes Selección del paciente Características de los dientes empleados Método de extracción pulpar Aislamiento del tejido pulpar Cultivo in vitro de MSCs obtenidas de pulpa de dientes permanentes Medio de cultivo celular para DPSCs Pasajes o subcultivos Caracterización in vitro de MSCs obtenidas de la pulpa de dientes permanentes Propuesta de metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de MSCs obtenidas de la pulpa de dientes permanentes Propuesta para obtención de la muestra de MSCs obtenidas de la pulpa de dientes permanentes...92

14 XIV Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura Selección del paciente Características de los dientes empleados Método de extracción pulpar Aislamiento del tejido pulpar Propuesta para cultivo in vitro de MSCs obtenidas de pulpa de dientes permanentes Medio de cultivo celular para DPSCs Pasajes o subcultivos Propuesta para caracterización in vitro de MSCs obtenidas de pulpa de dientes permanentes Conclusiones y recomendaciones Conclusiones Recomendaciones A. Anexo. Matriz de metodologías empleadas desde el año 2000 para obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de MSCs obtenidas de la pulpa de dientes permanentes B. Anexo. Folleto informativo para pacientes que serán incluidos en futuros estudios experimentales para obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de MSCs obtenidas de la pulpa de dientes permanentes Bibliografía

15 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura XV Lista de figuras Figura A Descripción bibliométrica 14 Figura 1.1 Estadíos del desarrollo dental (22).22 Figura 2.1 Características anatómicas de la pulpa dental (22) 24 Figura 2.2 Zonas histológicas de la pulpa dental (25) Figura 5.1 Número de errores de tratamiento endodóntico en fases pre, intra y postoperatoria (9)..39 Figura 6.1 Reparación y regeneración de las heridas (28) Figura 6. 2 Los tres elementos clave para la ingeniería de tejidos (16)..42 Figura 6. 3 Reportes de células madre en orden cronológico (33).47 Figura 6.4 Cito-arquitectura de DPSCs humanas (17)...48 Figura 6.5 Ubicación de SCs de origen dental (16) Figura 6.6 SCs de origen dental (33). 50 Figura 6.7 Papila apical (21)...51 Figura 6.8 Ligamento periodontal (21)..53 Figura 6.9 Regeneración pulpar por medio de la técnica de homing celular (29)..59 Figura 6.10 Empleo de SCs dentales en regeneración dental (8)..61 Figura 7.1 Tercer molar superior e inferior (70)..66 Pág

16 XVI Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura Figura 7.2 Estudio radiográfico mínimo para proceso de exodoncia (65)...69 Figura 7.3 Número de DPSCs x 10 6 después de 14 días (64)..75 Figura 7.4 Método de extracción pulpar por medio de corte a nivel CEJ (48)...77 Figura 7.5 Método de extracción pulpar por medio de corte a nivel CEJ (50) 78 Figura 7.6 Corte longitudinal de molar (72). 78 Figura 7.7 Método de extracción pulpar de diente 21 y 22 (62)...79 Figura 7.8 Número de células x 10 4, con método de digestión enzimática y crecimiento de explante (50) Figura 7.9 Aislamiento de DPSCs empleando suero animal y suero humano (73)...85 Figura 7.10 Inmunofluorescencia de DPSCs (43)...91

17 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura XVII Lista de tablas Pág Tabla A. Tipo de referencias bibliográficas..15 Tabla B. Empleo de referencias bibliográficas en el texto.15 Tabla C. Distribución por año para referencias de las metodologías...15 Tabla D. Distribución por tipo de estudio para referencias de las metodologías 15 Tabla 3.1 Desarrollo de necrosis pulpar en los diferentes tipos de trauma dental (16).32 Tabla 6.1 Factores de crecimiento y sus aplicaciones (29)...43 Tabla 6.2 Perfil de expresión de proteínas o genes de diferentes poblaciones de células madre mesenquimales in vitro (36). 56 Tabla 6.3 Expresión de marcadores de células madre dentales. DPSCs; SHED, PDLSC; DFPC, SCAP, GSC (33) Tabla 7.1 Expresión de marcadores de DPSCs

18 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura XVIII Lista de Símbolos y abreviaturas Símbolos con letras griegas Símbolo α β Término Alfa Beta Abreviaturas Abreviatura Término Ag Antígeno de superficie ADN Acido desoxirribonucleico ASCs Células madres adultas BM Médula ósea BMP Proteína morfogenética ósea BMSCs Células madre de médula ósea BMSSC Células madre estromales de médula ósea CO 2 Dióxido de carbono CD Clúster de diferenciación CFU-F Unidadad formadora de colonias fibroblásticas CFU Unidades formadoras de colonias DPSCs Células madres de la pulpa dental DMEM Medio Eagle modificado Dulbecco DFPCs Células progenitoras del folículo dental DPBS Solución salina de fosfato tamponada de Dulbecco ESCs Células madres embrionarias EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EGF Factor de crecimiento epidermal FACS Separador celular activado por fluorescencia FCS Suero de ternera fetal FBS Suero bovino fetal FGF Factor de crecimiento fibroblástico HBSS Solución salina balanceada de hank HSCs Células madre hematopoyéticas HTS Hipotermosol IGF-1 Factor de crecimiento insulínico 1 ISCT Sociedad internacional para la terapia celular ITS Medio suplementado con insulina, transferrina y selenio MEM Medio esencial mínimo

19 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura XIX MSCs PDLSCs PBS PCR PDGF RT-PCR SCAPs SHED TGF VEGF Células madres mesenquimales Células madres del ligamento periodontal Solución salina de fosfato tamponada Reacción en cadena de la polimerasa Factor de crecimiento derivado de plaquetas Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa Células madre de la papila apical Células madre de dientes deciduos exfoliados Factor de crecimiento transformante Factor de crecimiento del endotelio vascular

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21 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura INTRODUCCIÓN Durante la etapa del desarrollo embrionario, interacciones epitelio mesénquima determinan la formación de todos los componentes dentales incluyendo la pulpa (1-4). La compleja estructura dental provee dureza y protección, pero a su vez es vulnerable a lesiones causadas por agentes microbianos, trauma mecánico y/o químico, defectos congénitos, entre otros (5). Infortunadamente los componentes dentales no poseen la capacidad para regenerarse después que una lesión genera daños estructurales, pero se ha observado que pueden presentar procesos reparativos limitados como la formación de dentina terciaria, la cual es una matriz mineralizada que sirve como barrera protectora de la pulpa dental cuando las lesiones no han generado daño irreversible en dicho tejido (2). Diversos tratamientos se han empleado para el manejo de las patologías pulpares: recubrimientos directos, amputación parcial de la pulpa, instrumentación y obturación del conducto radicular, cirugías apicales, entre otros. Estos tratamientos han evolucionado con el tiempo por la creación de nuevos materiales, instrumentos y advenimiento de técnicas (6) presentando una tasa de éxito relativamente alta (73 98% aproximadamente) (7, 8), pero desafortunadamente durante su práctica se pueden presentar errores y accidentes de procedimiento como fracturas de instrumentos, perforaciones, fractura radicular por la instrumentación exagerada, susceptibilidad a que la presencia de caries pase inadvertida y progrese por la imposibilidad de respuesta celular por parte del complejo pulpo-dentinal, llevando a la necesidad de retratamientos, procedimientos quirúrgicos e incluso exodoncia del diente que ha sido tratado(8, 9). Debido a los riesgos que se presentan durante el tratamiento endodóntico y gracias a los avances científicos se han generado terapias para la regeneración de las estructuras dentales lesionadas, las cuales hacen parte de la ingeniería de tejidos que ha sido definida como un campo interdisciplinario que aplica los principios de las ciencias de la vida y de la ingeniería para desarrollar sustitutos biológicos que restauren, mantengan, o mejoren la función de tejidos y/u órganos lesionados (10, 11).

22 2 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura Uno de los elementos claves para la ingeniería de tejidos son las células madre o stem cell (SC) en inglés, definidas como células con la capacidad de dividirse continuamente para auto-replicarse o producir células especializadas que pueden diferenciarse en otros tipos de células o tejidos (diferenciación multilinaje) (3, 5, 10-13). Basadas en su origen pueden categorizarse en dos tipos: células madre embrionarias (ESCs) y células madre postnatales, adultas o somáticas (ASCs) (3, 5, 11-13). Las ASCs a su vez se clasifican según su origen en células madre hematopoyéticas (HSCs) obtenidas del cordón umbilical o de la sangre periférica y en células madre mesenquimales (MSCs) que residen en una variedad de tejidos como la médula ósea, dermis, hígado, pulpa dental, mucosa bucal, entre otras (5, 13). Actualmente se contempla la aplicación de terapias que promuevan la regeneración y mejoren la reparación de los tejidos dentales, a partir de la identificación y aislamiento de células progenitoras odontogénicas de la pulpa de dientes permanentes llevada a cabo en un inicio por Gronthos y colaboradores (3, 5, 10, 11, 13, 14). Al determinar el tipo de célula madre a usar, las células madre de la pulpa dental tienen ventajas sobre otro tipo de MSCs o HSCs (derivadas de médula ósea, tejido adiposo, sangre periférica o sangre de cordón umbilical), ya que su fuente son los dientes extraídos por indicación terapéutica (generalmente dientes permanentes como terceros molares incluidos o premolares por indicación ortodóntica), lo cual involucra muy baja morbilidad y pocas implicaciones éticas (15). Para la odontología moderna es importante realizar una descripción de la metodología disponible para obtención de muestra, cultivo y caracterización de MSCs humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes, en el que se establezcan las principales características de las etapas y métodos empleados ya que los estudios presentan discrepancias que pueden deberse al año de realización, la disponibilidad de insumos, reactivos y equipos en los laboratorios donde se generaron, experiencia de las personas a cargo e incluso el presupuesto con el que se contaba para la realización de cada estudio. Por tanto el objetivo de este trabajo de grado fue indagar por las etapas y métodos para la obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de MSCs humanas obtenidas

23 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 3 humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura de la pulpa de dientes permanentes reportado en la literatura científica que se encuentra disponible desde el año Esto se llevó a cabo mediante una revisión bibliográfica detallada en diferentes buscadores como Cochrane Library, PubMed, Medline, Scielo y EMBASE, se obtuvo artículos científicos de revistas desde diciembre del año 2000 a mayo del Para ampliar conceptos importantes se emplearon artículos científicos disponibles de diversas fechas de publicación. Todos los idiomas se incluyeron en la búsqueda siempre y cuando el abstrac se presentará en inglés, utilizando las palabras claves seleccionadas desde MeSH (stem cells, dental pulp, cell culture techniques, tissue engineering, review) los cuales soportaron el desarrollo de la investigación. Se seleccionaron los artículos y se realizó la lectura completa de estos. Una vez obtenidos los artículos electrónicamente se realizó una búsqueda manual de artículos adicionales en los journals que no se revisaron y finalmente se ejecutó la descripción y comparación de la información. Al finalizar la revisión se realizó una propuesta de la metodología sobre la obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de MSCs humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes basado en la literatura científica disponible. El producto final de este trabajo puede ser empleado en futuros estudios experimentales de la Universidad Nacional de Colombia y llevar a la generación de un banco de dichas células que permita a la comunidad universitaria realizar proyectos en el campo de las ciencias biomédicas e ingeniería de tejidos.

24 4 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura Planteamiento del problema El complejo pulpodentinal tiene dos funciones esenciales para la conservación de los dientes: 1. la microcirculación que proporciona la nutrición, oxigenación, transporte de desechos metabólicos y regulación de la inflamación, 2. la inervación que contribuye a la angiogénesis y extravasación de células inmunes para regular la inflamación. El componente celular de la pulpa está conformado por células especializadas como los odontoblastos y células del sistema inmune, perivascularmente la pulpa posee células madre (DPSCs) y fibroblastos que participan en la respuesta a la agresión física, química o microbiológica a través de la interacción de mecanismos de defensa celular, molecular y tisular que conducen a la destrucción del antígeno y a la formación de matrices biomineralizadas de dentina reparativa o reaccionaria, que aíslan al agente agresor y contribuyen a mantener la vitalidad del tejido pulpar. Por todo esto se considera que el complejo dentinopulpar tiene un papel fundamental en la homeostasis de los dientes y es esencial para su longevidad (15). La caries dental y las lesiones dentales traumáticas exhiben alta prevalencia en la población mundial y originan patologías pulpares y periapicales que pueden conducir a la pérdida temprana de los dientes (5, 15, 16). Aunque la tasa de éxito del tratamiento endodóntico convencional es relativamente alta (73 98%) (7, 8), durante este se pueden presentar fractura de instrumentos, perforaciones, fractura radicular por la instrumentación exagerada. Además, estos dientes son susceptibles a que la presencia de caries pase inadvertida y progrese por la imposibilidad de respuesta celular por parte del complejo pulpo-dentinal (8, 9).

25 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 5 humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura La odontología moderna ha descrito un enfoque prometedor basado en la aplicación de células madre para regenerar el complejo pulpo-dentinal y restaurar las funciones comprometidas por lesiones de la pulpa (15). La célula madre (SC) es definida como una célula progenitora, autorrenovable que tiene la capacidad de diferenciación (3, 5, 10, 13). Existen dos categorías básicas de células madre: las células madre embrionarias (ESCs) y las células madre adultas, también llamadas células madre postnatales o células madre somáticas (ASCs), estas últimas se subdividen en HSCs y MSCs. Las células madre pueden ser totipotentes, pluripotentes, multipotentes o unipotentes; es decir, son capaces de formar un ser completo, diferenciarse en varios tipos de tejido o un tipo de tejido respectivamente. El proceso por el cual las células madre se derivan de un tipo de tejido y se diferencian en otros tipos de tejido se denomina plasticidad o transdiferenciación y eestudios recientes indican que las MSCs pueden generar tipos de células de un tejido completamente diferente al que residen (3, 5, 13). Al determinar el tipo de SC a usar, las células madre de la pulpa dental (DPSCs) tienen ventajas sobre otro tipo de MSCs o HSCs (derivadas de la médula ósea, tejido adiposo, sangre periférica o sangre de cordón umbilical), ya que su fuente son los dientes extraídos por indicación terapéutica, lo cual involucra muy baja morbilidad y pocas implicaciones éticas (15). Las DPSCs se encuentran en la '' zona rica en células ''. El origen embrionario de la pulpa dental es la cresta neural, lo cual explica su multipotencia. Actualmente se encuentra en estudio el uso de DPSCs para la regeneración del tejido dental, y para facilitar la reparación de los tejidos dentales y huesos observado en investigaciones in vitro e in vivo. Además, se ha reportado que estas células pueden ser fácilmente criopreservadas durante largos periodos de tiempo y conservan su multipotencia y capacidad de producir hueso (17). La odontología moderna está contemplando la aplicación de terapias que promuevan la regeneración y mejoren la reparación de los tejidos dentales, a partir de la identificación y aislamiento de células progenitoras odontogénicos de la pulpa de dientes permanentes

26 6 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura llevada a cabo por Gronthos y colaboradores (3, 5, 10, 11, 13, 14). En éste trabajo se identificó como DPSCs de dientes permanentes a aquellas con capacidades clonogénicas, alta tasa de proliferación y capacidad de formar tejidos biomineralizados tanto in vitro como in vivo (3, 11, 13, 18-20). Los procedimientos de obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre de la pulpa descritos en la literatura proponen diferentes métodos. De ahí, la importancia de realizar una revisión narrativa de la literatura con el fin de identificar aproximaciones comunes que permitan proponer un método que se pueda aplicar a los procesos de laboratorio, con la infraestructura y equipos disponibles en la Universidad Nacional de Colombia. Éste proyecto, propone realizar una revisión bibliográfica que permita establecer una metodología local de obtención de muestra, cultivo y caracterización de éstas células.

27 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 7 humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura Pregunta de investigación Cuáles son las etapas y métodos descritos en la literatura científica disponible sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes?

28 8 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura Justificación Los tratamientos endodónticos actuales presentan una tasa de éxito relativamente alta (73 98%) (7, 8), pero durante este se pueden presentar fractura de instrumentos, perforaciones, fractura radicular por la instrumentación exagerada. Además, estos dientes son susceptibles a que la presencia de caries pase inadvertida y progrese por la imposibilidad de respuesta celular por parte del complejo dentino-pulpar (8, 9). Es por eso que en los últimos años se ha desarrollado un nuevo campo del conocimiento muy promisorio para el tratamiento de las patologías pulpares, conocido como Endodoncia Regenerativa que se ha definido como ''el conjunto de procedimientos biológicos diseñados para reemplazar las estructuras lesionadas, incluyendo la dentina, pulpa, cemento, tejido conectivo y óseo perirradicular''. El concepto de regeneración del tejido pulpar fue promulgado por los estudios clásicos de Nygaard-Ostby desde 1961, quienes evaluaron los efectos del sangrado generado por la sobreinstrumentación del sistema de conductos radiculares en perros y humanos. Desafortunadamente, el análisis histológico reveló la reparación de los tejidos, más no la regeneración (16). Los procesos regenerativos en odontología buscan aplicar los conceptos de la ingeniería de tejidos para el manejo de los tejidos orales perdidos utilizando tres componentes: células madre, moléculas de señalización y matrices tridimensionales o andamios (11, 13). Con el desarrollo de la línea de investigación Endodoncia regenerativa en la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional de Colombia, se realizó una comparación de la metodología basado en la revisión de la literatura científica disponible para la toma de muestra, cultivo y caracterización in vitro de MSCs humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes.

29 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 9 humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura Este estudio propone una metodología basada en la literatura científica disponible para la toma de muestra, cultivo y caracterización in vitro de MSCs humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes, que le servirá a la Universidad Nacional de Colombia, ya que en un futuro se puede implementar y posteriormente contar con un cultivo y banco de este tipo de células.

30 10 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura Objetivos Objetivo general 1. Indagar por las etapas y métodos sobre la obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes reportado en la literatura científica Objetivos específicos 1. Describir los métodos sobre la obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes basado en la revisión de la literatura científica disponible 2. Establecer las diferencias y similitudes relevantes encontradas en la literatura científica disponible 3. Describir las ventajas de la utilización de algunos métodos reportados en la literatura científica disponible 4. Proponer las etapas y métodos basado en la revisión de la literatura científica para la obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes

31 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 11 humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura Diseño metodológico Tipo de estudio Revisión narrativa de la literatura Revisión y análisis de la literatura Se realizó la revisión bibliográfica en diferentes buscadores como Cochrane Library, Scielo, PubMed, Medline y EMBASE, para obtener artículos científicos de revistas, se tiene en cuenta publicaciones desde enero de 2000 a agosto de Para ampliar conceptos importantes se emplearon artículos científicos disponibles de diversas fechas de publicación. Todos los idiomas son incluidos siempre y cuando tengan el abstrac en inglés, utilizando las palabras claves seleccionadas desde MeSH (stem cells, dental pulp, cell culture techniques, tissue engineering, review) los cuales soportaron el desarrollo de la investigación Selección de artículos Se seleccionaron los artículos y se realizó la lectura completa de estos. Una vez obtenidos los artículos electrónicamente se implementó una búsqueda manual de artículos y capítulos de libros adicionales en los journals y páginas que no se revisaron. Se realizó una comparación de la literatura científica disponible en cada una de las etapas (obtención de la muestra, cultivo y caracterización) de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes por medio de

32 12 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura una matriz con información de los artículos revisados, describiendo las características que cada uno presenta Sugerencia de metodología basada en la literatura científica disponible Se sugiere una metodología basada en la literatura científica disponible después de describir los métodos, dicha metodología es viable con relación a resultados, costos, equipos de laboratorio requeridos y eficiencia para ser utilizado en futuros estudios experimentales en la Universidad Nacional de Colombia

33 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 13 humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura Criterios de inclusión y exclusión Criterios de inclusión Población/muestra: Protocolos in vitro con dientes humanos Publicaciones: Artículos de revistas indexadas, libros de texto, año de publicación de enero 2000 a agosto del 2014 (Para las metodologías). Artículos que reporten resultados basados en evidencia Pulpa dental: Estudios que involucren pulpa dental de dientes permanentes Criterios de exclusión Población/muestra: Protocolos realizados con dientes de animales Publicaciones: Publicaciones anteriores al año 2000 (Para las metodologías). Estudios que no informen conclusiones basadas en los resultados encontrados Pulpa dental: Estudios que involucren únicamente la pulpa dental de dientes temporales o células madre del ligamento periodontal

34 14 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura Descripción bibliométrica Se realizó una revisión de la literatura científica en los buscadores como Cochrane Library, Scielo, PubMed, Medline y EMBASE, empleando diversas combinaciones de las palabras clave seleccionadas desde MeSH (stem cells, dental pulp, cell culture techniques, tissue engineering, review), de los cuales se obtiene un total de 126 artículos, se excluyen 45 artículos por su título y abstract, ya que describen ser estudios en animales y/o no especifican el aislamiento de células madre de la pulpa dental, al realizar la lectura completa de los 81 artículos, 6 no describen conclusiones basadas en resultados encontrados. De los 75 artículos obtenidos, 28 son empleados para realizar la matriz de las metodologías empleadas desde el año 2000 para obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de MSCs obtenidas de la pulpa de dientes permanentes y 47 artículos son empleados para la elaboración del marco teórico y perfeccionar la información de las diversas etapas para obtener células madre mesénquimales humanas de la pulpa dental de dientes permanentes. Figura A. Descripción bibliométrica 126 ar'culos Buscadores y MeSH 75 ar'culos obtenidos 45 ar'culos (Título y abstract) 6 ar'culos (Lectura completa) 47 Complementos 28 Metodología s Estudios en animales No especifican aislamiento DPSCs No describen conclusiones basadas en resultados obtenidos

35 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 15 humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura Tabla A. Tipo de referencias bibliográficas Referencias bibliográficas Tipo de referencia Cantidad Journal 70 artículos Libros de texto 5 capítulos Total 75 referencias Tabla B. Empleo de referencias bibliográficas en el texto Referencias bibliográficas empleadas Empleo en el texto Cantidad Metodologías 28 referencias Complementos 47 referencias Total 75 referencias Tabla C. Distribución por año para referencias de las metodologías Distribución por año para referencias de metodologías Año Año 2000 Año 2005 Año 2006 Año 2007 Año 2008 Año 2009 Año 2010 Año 2011 Año 2012 Año 2013 Año 2014 Cantidad 1 referencia 1 referencia 2 referencias 3 referencias 1 referencia 3 referencias 5 referencias 2 referencias 3 referencias 4 referencias 3 referencias Total 28 referencias Tabla D. Distribución por tipo de estudio para referencias de las metodologías Distribución por tipo de estudio para las referencias de metodologías Tipo de estudio Experimental in vitro Experimental in vitro e in vivo Cantidad 24 referencias 4 referenciass Total 28 referencias

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37 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura 1. DESARROLLO DENTAL Las interacciones entre células y tejidos constituyen un mecanismo central, por lo general en el desarrollo de organismos multicelulares. A nivel molecular, estas interacciones involucran una señalización que se compone de señales, receptores y sistemas de control trascripcional. Dichos elementos son utilizados en la regulación de múltiples tejidos y órganos de un individuo, incluso a lo largo del desarrollo y evolución del mismo. Se cree que la evolución de los dientes está asociada con la presencia de la cresta neural. La mayoría de los cartílagos y huesos cráneo-faciales son formados por células mesénquimales derivadas de la cresta neural (1). El diente está compuesto de esmalte, dentina y pulpa, el cual se desarrolla a través de interacciones epitelio-mesénquima, el periodonto se conforma por el ligamento periodontal, cemento y hueso alveolar que se encargan del soporte del diente (21). 1.1 Evolución dental Con el fin de lograr una adecuada taxonomía para la embriología dental es necesario comparar las características equivalentes a lo largo de las especies existentes y extintas. Los estudios histológicos de los órganos dentales comenzaron a surgir en el siglo XIX según Louise J. Baume en su trabajo titulado la biología de la pulpa y la dentina en 1980, este expone que las estructuras tubulares en la dentina se encontraron entre los años Mientras que el reconocimiento de la relación pulpa/dentina se dio entre , la dentina peritubular y las estructuras nerviosas se descubrieron entre Los aspectos ontogénicos y filogénicos de la dentina se observaron entre Los dientes fósiles aportaron pruebas para comparar la relación entre los grupos existentes y extintos, y se estableció la filogenia de los mamíferos. Como apéndices muy mineralizados encontramos a la entrada del canal alimenticio a los dientes, con funciones como el procesamiento de los alimentos, articulación fonética y defensa. El hecho que las

38 18 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura estructuras dérmicas son el origen de los dientes en los vertebrados tiene muchas implicaciones en la biología dental. La reducción del número de dientes y generaciones, y el aumento de la complejidad morfológica de los dientes (de homodonto a heterodonto) representan factores importantes para la diversificación de los mamíferos (Koussoulakou et al. 2009; Salazar y Jernvall, 2010). La reaparición de algunos dientes, que fueron perdidos en el tiempo en las aves es un interesante concepto evolutivo (Chen et al. 2000). Uno de los principios evolutivos centrales conocidos como ley de Dollo indica que un organismo es incapaz de volver, aunque sea parcialmente, a una etapa anterior ya realizada en las filas de sus antepasados (Tomic y Meyer-Rochow, 2011). Obviamente, en condiciones adecuadas, la capacidad odontogénica perdida del ectomesénquima aviar puede ser recuperada (Louchart y Viriot, 2011). Las posibles explicaciones para esto son la capacidad odontogénica conservada en el epitelio oral o un mecanismo de salvaguardia como redundancia genética. Por otra parte, esas mutaciones no pueden prevenir la formación de la lámina dental, que puede ser observada en las aves, aunque sus dientes se perdieron hace más de 60 millones de años (Chen et al. 2000; Koussoulakou et al. 2009). La comprensión de las normas que rigen la readquisición de las propiedades perdidas proporcionará una amplia gama de aplicaciones clínicas y biológicas de dientes lesionados o perdidos (Koussoulakou et al. 2009) (22). Durante la evolución una variedad de modificaciones en el diente han sido observadas. El desarrollo básico de la anatomía dental (morfogénesis) se ha conservado en un alto grado, sin embargo los cambios generados dependen de las diferentes especies y las funciones que los dientes tienen en un individuo, el número de dientes varía dependiendo de la función masticatoria, la cual es necesaria para la supervivencia (8). La dentición de los mamíferos consiste en los dientes que se forman como unidades separadas, y la disposición lineal de los dientes en los márgenes de los maxilares muestra repetición espacial. Se planteó una hipótesis de que un campo morfogenético determina las formas de los dientes (Butler, 1967). Este concepto fue adaptado para la dentición humana por Dahlberg (1965), quien propuso que había un campo de

39 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 19 humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura funcionamiento en cada una de las clases del diente, es decir, incisivos, caninos, premolares y molares (22). Las diferencias morfológicas también se pueden deber a mecanismos regulatorios moleculares y a las concentraciones de químicos morfógenos como el ácido retinoico que permiten regular la morfogénesis (8). 1.2 Etapas del desarrollo dental Los dientes son el típico ejemplo de órganos epitelio-mesénquima, se desarrollan a partir del estomodeo y las células mesénquimales de la cresta neural. La primera señal morfológica para el desarrollo dental es un engrosamiento del epitelio oral (brote) en una capa de mesénquima. Las células mesénquimales se condensan alrededor del brote y durante las siguientes etapas, el epitelio interviene en la morfogénesis (1, 23, 24). Durante la sexta semana de embriogénesis, después de la migración de las células de la cresta neural en el mesénquima de la cabeza y cuello, el ectodermo que cubre el estomodeo comienza a proliferar emergiendo la lámina dental (17, 20), posteriormente se generan interacciones ecto-mesodermicas, las células de la cresta neural se diferencian en órgano, papila y folículo dental que favorecen a la formación de estructuras dentales y periodontales. Por lo tanto la pulpa dental está conformada por un componente ectodérmico y uno mesenquimal. Dichas células de la cresta neural favorecen su capacidad multipotencial y de plasticidad (20). Estas interacciones resultan en la formación de una capa externa de esmalte formada por la actividad de células derivadas del epitelio oral conocidas como ameloblastos y una capa interna de matriz orgánica de dentina biomineralizada sintetizada por los odontoblastos, los cuales son derivados de la papila dental. La cámara central del diente está compuesta de un tejido pulpar fibroso también derivado de la papila dental. La pulpa dental posee vasos sanguíneos y fibras nerviosas que emergen del foramen apical. La compleja estructura dental está rodeada de tejido óseo y un estrato fibro-celular del ligamento periodontal (LP) derivado del folículo dental, el cual también es de origen ectomesenquimal (2).

40 20 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura En el desarrollo dental los odontoblastos secretan matriz colágena extracelular que posteriormente se mineraliza en dentina (con una dureza similar al hueso). Los ameloblastos depositan la matriz del esmalte la cual se mineraliza directamente formando el tejido más duro del cuerpo. Después de la morfogénesis coronal, las raíces de los dientes se desarrollan mientras el diente erupciona en la cavidad oral. Mientras las raíces de los dientes se desarrollan, el folículo induce a los cementoblastos a depositar cemento dental y las fibras de la membrana periodontal conectan dichas raíces al hueso alveolar. La iniciación de una morfogénesis dental temprana ocurre antes que inicie la formación ósea en los maxilares, el desarrollo del diente y hueso adyacente es posteriormente coordinado, teniendo en cuenta que los dientes después de su nacimiento tienen un rol central en regular la extensión y dirección del crecimiento proceso alveolar del maxilar o la mandíbula (1). Después de la mineralización de la corona, el germen de la pulpa dental permanece atrapado al interior de una estructura que lo protege de estímulos de diferenciación en el medio. Una vez hace erupción la corona, la pulpa dental permanece en el interior de la cámara pulpar, que actúa como una especie de nicho sellado y esto puede explicar porque es posible encontrar en su interior un gran número de células madre, incluso en un tejido adulto (20). Los dientes pasan por cuatro fases morfológicas: iniciación, brote, casquete y campana Estadío de iniciación La iniciación del diente comienza durante la sexta semana de gestación humana. Un engrosamiento localizado o placodas dentro de las bandas epiteliales primarias, inician el desarrollo de diente. En una subdivisión de la banda epitelial primaria, la lámina dental, con actividad proliferativa localizada conduce a crecimientos epiteliales en el ectomesénquima. Puesto que el ectomesénquima es más activo que las células epiteliales, estas células ectomesenquimales acumulan los crecimientos epiteliales poco después. Figura 1. 1

41 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 21 humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura Estadío de brote Esta etapa se produce entre las 7 y 9 semanas de gestación humana. Está representado por la invaginación epitelial en el ectomesénquima oral. La parte interna de la raíz del diente tiene forma de estrella, contiene glucosaminoglicanos que sintetizan las células del retículo estrellado. El potencial odontogénico cambia del epitelio al ectomesénquima durante la etapa de brote. Muchos órganos ectodérmicos tales como glándulas exocrinas, folículos pilosos y dientes comparten similitud morfológica en la fase de brote. Figura Estadío de casquete La raíz dental se transforma en un casquete por proliferación diferencial. A medida que proliferan las células epiteliales del brote, las células del ectomesénquima se condensan y comienzan las diferencias morfológicas entre los gérmenes del diente durante la etapa de casquete (morfogénesis). La masa epitelial histológica, llamada nodo del esmalte, es inducida por proteína morfogénica ósea (BMP4). Las células del nodo del esmalte no muestran división celular y una vez finalizado su papel organizador transitorio, llegan a apoptosis al final de la etapa de campana. La histodiferenciación comienza en la etapa de casquete y en la etapa de campana las células de la corona (ameloblastos y odontoblastos) se distinguen. La capa de células cilíndricas, que rodean la papila dental y residen dentro del casquete, se llama epitelio dental interno (EDI). La parte exterior del casquete está cubierta por el epitelio dental externo (EDE). Mientras que el crecimiento epitelial en forma de casquete es ampliamente conocido como órgano del esmalte, las células ectomesenquimales condensadas se denominan papila dentaria. El folículo dental cubre el exterior de estas dos sustancias. El órgano del esmalte, la papila dentaria y folículo dental constituyen el germen del diente. La papila dental está separada del órgano del esmalte por una lámina basal y se encuentra entre EDI y las células mesenquimales no diferenciadas de la papila. Figura Estadío de campana Se da la citodiferenciación terminal de ameloblastos del EDI y los odontoblastos de las células ecto-mesenquimales de la papila dentaria y la formación de dos principales tejidos duros de los dientes, esmalte y dentina, iniciada durante la etapa de campana. La

42 22 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura diferenciación de los ameloblastos y odontoblastos está regulada por las interacciones entre el epitelio y ecto-mesénquima (D'Souza 2002; Nanci 2008). La papila dental es el origen de la futura pulpa dental, el folículo dental da lugar a fibroblastos, osteoblastos y cementoblastos. En conclusión, las células de la cresta neural dan lugar a la producción cementoblastos que cubren la dentina radicular, osteoblastos que participan en la formación de alvéolos dentales y fibroblastos que sintetizan el colágeno del ligamento periodontal. Figura 1. 1 (22). Figura 1. 1 Estadíos del desarrollo dental Se muestra una vista frontal esquemática de la cabeza de embrión con un recuadro punteado para indicar el sitio donde se formará el molar inferior (mandíbula). A continuación, las etapas del desarrollo de diente se establecen desde los primeros signos de engrosamiento hasta la erupción del diente. El germen del diente está formado por el epitelio oral y mesénquima derivado de la cresta neural. En la etapa de campana se desarrollan, los ameloblastos y odontoblastos en capas adyacentes en el sitio de interacción entre el epitelio y mesénquima. Reproducida de Dental Pulp Stem Cells, Sibel Yildirim (22).