Conteo celular en bajas concentraciones

Transcripción

1 Conteo celular en bajas concentraciones Cómo usar SimpleCounter en muestras con concentraciones bajas? Qué es el conteo celular? Desde un punto de vista estadístico, el conteo celular se basa en tomar una muestra de una población existente (la concentración original), mediante la extracción de una cantidad reducida de dicha población (la muestra), con el objetivo de estimar el tamaño original de la población. El problema subyacente en muestras con baja concentración es que la muestra es demasiado pequeña para determinar de una manera precisa el tamaño original de la concentración. Cuáles son las consecuencias de que la muestra sea tan pequeña? Si la muestra es muy pequeña, los resultados obtenidos diferirán en gran cantidad de la concentración real Fig. 1. Pequeña muestra (15 cells per count) Fig.2. Large Sample (150 cells per count) En la figura 1 podemos ver 10 conteos celulares realizados para una concentración original de 1 x 10 6 cels / ml, tomando 15 células por cada conteo. Qué podemos hacer entonces? Hay diversas maneras de obtener una medida fiable para muestras con baja concentración celular usando SimpleCounter. Algunas de ellas pueden ser aplicadas para conteos celulares de forma manual con cámara de Neubauer y un microscopio.

2 Solución Cambiar el objetivo del microscopio Contar más células en más campos Cámara más profunda Placa de 96 pocillos Min. Concentración cells / ml cells / ml cells / ml 250 cells / ml Solución #1: Cambiar el objetivo del microscopio (> cels / ml) Si usamos los objetivos de 10x o 4x podremos ver más amplitud de campo, pero sólo será útil si las células son los suficientemente grandes como para ser analizadas. El área verde vista a través de SimpleCounter con un objetivo de 4x es el equivalente a 1 de los 9 cuadrados grandes de la cámara de Neubauer (1mmx1mm), El volumen analizado en este caso será: Volumen = 1 mm x 1 mm x 0,1 mm = 0,1 mm 3 = 0,0001 ml = 10-4 ml = 0,1 µl (1 ml = mm 3 ) Concentración: 10 6 cells / ml Volumen: 0,1 µl Media de células: 100 Error estimado: 20% Contando en 1 cuadrado grande de la cámara de Neuabuer Puesto que nuestra concentración original es de 1 x 10 6 cels / ml, la media del total de células contadas será de: (1 x 10 6 ) x (10-4 ml) = 100 células El error estimado será del 20%, rozando el límite marcado por la mayoría de investigadores

3 Solución #2: Contar más células en más campos. (> cels / ml) Con una concentración de cels/ml, la media del total de células contadas seguría siendo 100 si tomásemos 4 de los grandes cuadrados de la cámara de Neubauer. Concentración : 2,5 x 10 5 cells / ml Volumem : 0,1 µl Media de células: 100 (25/cuadrado) Error estimado: 20% Contando 4 cuadrados grandes de la cámara de Neubauer SimpleCounter es el único contador celular que puede incrementar el número de campos de microscopio con el objetivo de incrementar la veracidad en muestras con bajas concentraciones SimpleCounter puede incrementar el número de campos con la misma cámara de Neuabuer. Asumamos que pasamos de 5 campos a 20 campos, manteniendo el número de células contadas en 100 para un error máximo del 20%. En este caso, podríamos llegar a una concentración de cels/ml. Contar más campos permite el conteo en muestras con baja concentración celular. Numéro de campos de microscopio Concentración mínima (cels/ml) Concentración celular mínima en cámara de Neubauer. SimpleCounter puede tomar muestras fuera de la rejilla, incrementando así la concentración mínima que puede ser medida usando una cámara de Neubauer (o cualquier otra: Thoma, Fuchs-Rosenthal, etc.)

4 El área de conteo total de una cámara de Neubauer es de 3 mm x 3 mm = 9 mm 2 9 mm 2 x 0,1 mm = 0,9 mm 3 = 0,0009 ml = 0,9 µl Manual counting Area Volume = 0,9µl Total counting area for Simple Counter = 10 µl El área de muestreo de SimpleCounter es 10 veces mayor respecto al conteo manual. Si queremos contar más células realizando el conteo de manera manual con cámara de Neuabuer, y toda la rejilla ya ha sido usada para contar, necesitaremos volver a cargar la cámara para continuar el conteo. Con SimpleCounter, el muestreo puede ser llevado a cabo fuera de la rejilla, ahorrando el tiempo destinado a cargar una nueva cámara. Sin embargo, para concentraciones inferiores a cels/ml, el número de campos capturados se incrementa demasiado, convirtiéndose en una solución contraproducente. En este caso, recomendamos seguir los pasos descritos en las soluciones 3 y 4. SimpleCounter incrementa en 10 veces el área de muestreo, ahorrando tiempo con respecto al conteo manual.

5 Solución #3: Cámara de recuento mas profunda ( > cells / ml) Si queremos contar en concentraciones muy bajas, la mejor solución consiste en usar cámaras con más profundidad. La lógica de este argumento reside en el hecho de que las cámaras con más profundidad pueden contener más volumen de muestra por área. Un citómetro de flujo puede ser viable para esta solución, dado el volumen de la muestra analizada. La cámara de Nageotte es una cámara de 0.5mm de profundidad. Pudiendo alcanzar concentraciones hasta 5 veces más pequeñas que con una cámara de Neubauer. IMPORTANTE La mayoría de contadores celulares no cuentan en cámaras profundas. SimpleCounter es el único contador que funciona para cualquier tipo de cámara de conteo. Número de campos Concentración/min (cells /ml) Concentración celular mínima para una cámara de Nageotte. Cámara de Nageotte

6 Solución #4: Cámara de 96 pocillos (> 250 cells /ml ) Para muy bajas concentraciones, las cámaras usuales de conteo celular no son suficientes. Para este caso, recomendaos usar una cámara de 96 pocillos junto con un microscopio invertido. Cámara de 96 pocillos En este caso, la profundidad suele ser de 10mm = 1cm. Por lo tanto, podemos alcanzar concentraciones hasta 20 veces más pequeñas que con una cámara de Nageotte. Número de campos en el microscopio Concentración mínima (cels/mil) Concentración celular mínima para una cámara de 96 pocillos

7 Para concentraciones incluso más bajas, se pueden usar cámaras de 96 pocillos con una profundidad de hasta 29mm. Cámaras de 96 pocillos con profundidad superior a 10mm. Para cualquier pregunta o sugerencia con respecto al contenido de este artículo, por favor pónganse en contacto con: scientific@celeromics..com BIOGRAFÍA Y REFERENCIAS. [1] A SIMPLIFIED METHOD OF PHYTOPLANKTON COUNTING, Eva Willen. Br. Phycol. J. 11: , September [2] CELEROMICS INTERNAL MARKET RESEARCH FOR SIMPLE COUNTER AND CULTURE COUNTER DEVICES, performed with 40 Spanish and French Biotechnology companies and Universities. [3] DIE REVISION EINIGER METHODEN ZUM FESTELLEN DER QUANTITÄT DES PHYTOPLANKTONS, P. Javornicky, Oddil faculty technologie paliv. a vody. Prague, 2: [4] THE INVERTED MICROSCOPE METHOD OF ESTIMATING ALGAL NUMBERS AND THE STATISTICAL BASIS OF THE ESTIMATIONS BY COUNTING, J.W.G, Lund, Hydrobiologia 11: