EFECTO DE LA COMPOSICIÓN DEL DILUYENTE EN LA CONSERVACIÓN DEL SEMEN CAPRINO EN ESTADO FRESCO REFRIGERADO

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1 EFECTO DE LA COMPOSICIÓN DEL DILUYENTE EN LA CONSERVACIÓN DEL SEMEN CAPRINO EN ESTADO FRESCO REFRIGERADO Josefa Martínez, O. Duverger, Namibia Díaz, L. Interian, Yiliany Molina, C. Milanés y Dianelys González-Peña Centro de Investigación para el Mejoramiento Animal de la Ganadería Tropical. CIMAGT. km. 21½ Loma de Tierra. Cotorro, La Habana. Correo electrónica: RESUMEN Se estudió el comportamiento de 4 diluyoconservadores en la viabilidad espermática del semen caprino conservado hasta 96 h a 5 C. Se procesaron 11 eyaculados procedentes de 4 sementales caprinos de diferentes razas los cuales se encontraban situados en cubículos individuales con una alimentación controlada a base de concentrados a razón de 1½ kg. diario/ animal y forraje ad libitum. El semen se extrajo tres veces por semana mediante vagina artificial siempre en presencia de una hembra en celo. Inmediatamente después de la recolección se procedió a la valoración de los eyaculados y se deteraron el volumen (ml), la motilidad subjetiva (), la concentración espermática (x 1 6 /ml), el porcentaje de vivos y muertos y el porcentaje de patologías totales. Se trabajó con un pool de semen de aquellos eyaculados clasificados como aptos para ser procesados y se dividieron en 4 porciones. A cada porción se le añadió el diluyoconservador 1 (Tris-glucosa-Ac. cítrico-bsa), 2 (Trisglucosa-Ac. Cítrico-leche descremada), 3 (ODT) y 4 (ODT -leche descremada) en una tasa de dilución de 1 x 1 6 /.5 ml volumen total. Inmediatamente después se conservaron las muestras a 5 C, a las 24, 48, 72 y 96 h se tomó 1 ml de semen de cada muestra conservada en el refrigerador y se colocó en baño María para prueba de incubación, para deterar la motilidad, porcentaje de vivos y patologías totales a los. y 2 h de incubación. Para el procesamiento estadístico de los datos se utilizó el procedimiento GLM del sistema estadístico S.A.S. versión 6.2. Se concluye que los diluyentes 1 y 2 mostraron los mayores porcentajes de motilidad espermática (52.6 y 53.56) que los diluyentes 3 y 4 (48.23 y 47.95) para P <.1. En cuanto al porcentaje de espermatozoides vivos solo se obtuvieron diferencias significativas (P <.1) entre el diluyente 2 (59.4) con respecto al 3 y 4 (55.1 y 54.8) y el diluyente 1 (58.5) con respecto al diluyente 4. No se observaron diferencias significativas para los porcentajes de patologías totales entre los diluyentes evaluados. Palabras clave: semen caprino, diluyo conservador, refrigeración, motilidad, patologías espermáticas ABSTRACT DILUENT COMPOSITION ON GOAT SEMEN PRESERVATION UNDER FRESH REFRIGERATED CONDITIONS The performance of four preserving diluents on the spermatic viability of goat semen stored until 96 h at 5 o C, was studied. Eleven ejaculations from four bucks of different breeds were processed. Animals were housed in individual boxes and with a controlled feeding baset on concentrates at a rate of 1 1 / 2 kg daily/animal and ad libitum forage. Semen was extracted three times weekly through an artificial vagina, always in presence of a female in heat. Immediately after collection ejaculations were evaluated and the volume (ml) subjective motility (), spermatic concentration (x 1 6 /ml), live and dead percentages and the percentage of total pathologies, were detered. The study was conducted with a semen pool with those ejaculations classified as apt for processing and they were divided in 4 parts. A preserving diluent was added to each part: 1 (Tris-glucosecitric acid-bsa), 2 (Tris-glucose-citric acid-skim milk), 3 (ODT) and 4 (ODT-skim milk) at a dilution rate of 1 x 1 6 /.5 ml total volume. Immediately afterwards samples were stored at 5 o C. From each preserved sample 1 ml of semen was taken at 24, 48, 72 and 96 h of refrigeration and placed in a double boiler for the incubation test to detere the motility, live percentage and total pathologies at and 2 h of incubation. The statistical data processing was made by GLM of the SAS statistical system version 6.2. It is concluded that diluents 1 and 2 showed higher spermatic motility percentages (52.6 and 53.56) than diluents 3 and 4 (48.23 and 47.95) for P <.1. Regarding live spermatozoid percentage these were only significant (P <.1) differences between diluent 2 (59.4) respecting 3 and 4 (55.1 and 54.8) and diluent 1 (58.5) with respect to diluent 4. No significant differences for total pathology percentages among the evaluated diluents were found. Key words: goat semen, preserving diluent, refrigeration, motility, spermatic pathologies 15

2 INTRODUCCIÓN Una de las biotecnologías de gran relevancia que se viene desarrollando desde hace varios años y que permite un rápido avance genético, con el mejor aprovechamiento de los sementales de características productivas superiores, es la inseación artificial (IA), y depende en gran medida del desarrollo de diluyentes que garanticen incrementar el volumen del eyaculado, proteger a los espermatozoides durante el enfriamiento y prolongar su vida con un mínimo efecto en la fertilidad. La búsqueda de nuevas formulaciones que prolonguen cada vez más el tiempo de conservación, del esperma constituye una meta constante para los especialistas e investigadores dedicados al estudio de esta temática (Martínez et al. 27). Al respecto numerosos diluyoconservadores se han diseñado con la finalidad de reducir las reacciones metabólicas que se producen en el eyaculado diluido durante la conservación sin afectar la motilidad espermática (Abd Elhakeam 2). El diluyo conservador que debe utilizarse estará en dependencia del tiempo que se desee conservar una calidad seal tal, que garantice la fecundación en la hembra. En tal sentido, nos propusimos evaluar el comportamiento de 4 diluyoconservadores en la viabilidad espermática del semen caprino conservado hasta 96 horas a 5 C así como realizar una evaluación comparativa con el ODT (Duverger et al. 1988) convencional. MATERIALES Y METODOS Se procesaron 11 eyaculados procedentes de 4 sementales caprinos de diferentes razas los cuales se encontraban alojados en cubículos individuales y alimentados con concentrados a h 16 razón de 1.5 Kg. diario/ animal y forraje ad libitum. El semen se extrajo tres veces por semana mediante vagina artificial siempre en presencia de una hembra en celo. Inmediatamente después de la recolección se procedió a la valoración de los eyaculados y se deteró el volumen (ml), la motilidad subjetiva (), la concentración espermática (x 1 6 /ml), el porcentaje de espermatozoides vivos y muertos y el porcentaje de patologías totales. Los eyaculados clasificados como aptos para ser procesados fueron mezclados en una sola muestra la cual se dividió en 4 porciones, a cada porción se le añadió uno de los siguientes diluyoconservadores: 1 (Tris-glucosa-ac. Cítrico- BSA), 2 (Tris-glucosa-ac. Cítrico-leche descremada), 3 (Glucosa-citrato de sodio-edtabromuro de potasio-bicarbonato de sodio-cloruro de potasio) según Duverger et al. 1988) y 4 (Glucosa-citrato de sodio-edta-bromuro de potasio-bicarbonato de sodio-cloruro de potasio - leche descremada) en una tasa de dilución de 1 x 1 6 /.5 ml volumen total. Inmediatamente después se conservaron las muestras a 5 C. A las 24, 48, 72 y 96 h se tomó 1 ml de semen de cada muestra conservada en el refrigerador y se colocó en baño María para prueba de incubación, para deterar la motilidad, porcentaje de vivos y patologías totales a los y 2 h de incubación. RESULTADOS En la Figura 1 aparecen los porcentajes de motilidad espermática para los medios 1, 2, 3 y 4 desde las h de conservación. Los mayores porcentajes (52.6 y 53.5) se corresponden con los diluyentes 1 y 2, al compararlos con el 3 y 4 (48.2 y 47.9) con diferencias significativas para P <.1. Figura 1. Porcentajes de motilidad del semen caprino conservado durante 96 h en diferentes diluyo-conservadores

3 En la Figura 2 aparecen los porcentajes de espermatozoides vivos para los medios 1, 2, 3 y 4 desde las h de conservación, solo se obtuvieron diferencias significativas (P<.1) entre el diluyente 2 (59.4) con respecto al 3 y 4 (55.1 y 54.8) y el diluyente 1 (58.5) con respecto al diluyente h Figura 2. Porcentajes de espermatozoides vivos del semen caprino conservado durante 96 h en diferentes diluyo-conservadores En la Figura 3 aparecen los porcentajes de patologías totales para los medios 1, 2, 3 y 4 desde las h de conservación pudiendo apreciarse en el caso de los medios 2 valores por debajo del 25 de patologías totales durante todo el experimento. No se encontraron diferencias significativas para este indicador entre los diluyentes analizados h DISCUSIÓN Figura 3. Porcentajes de patologías totales del semen caprino conservado durante 96 h en diferentes diluyoconservadores Al analizar el comportamiento de la motilidad espermática en los diferentes diluyoconservadores, podemos constatar que los mayores porcentajes (52.6 y 53.5) se corresponden con los diluyentes 1 y 2 al compararlos con el 3 y 4 (48.2 y 47.9) con diferencias significativas para P <.1. Referente al porcentaje de espermatozoides 17 vivos, sólo se obtuvieron diferencias significativas (P <.1) entre el diluyente 2 (59.4) con respecto al 3 y 4 (55.1 y 54.8) y el diluyente 1 (58.5) con el diluyente 4. Esto puede estar relacionado con la composición de estos medios, al parecer el tris y el ácido cítrico actúan como controladores del ph, la BSA además de garantizar una importante fuente de energía también actúa como agente surfactante que protege a la membrana espermática contra el

4 choque frío y garantiza una mejor supervivencia espermática y la leche descremada también ejerce su efecto protector a los espermatozoides contra el choque frío, debido a la caseína presente en la leche (Paloo et al. 21). Keskintepe et al. (1998) recomiendan el uso de la BSA en el medio de conservación para semen caprino, resultados similares fueron obtenidos por Martínez et al. (27) quienes observaron un mejor comportamiento para la motilidad espermática, porcentaje de espermatozoides vivos y porcentaje de patologías totales en un medio compuesto por Tris-ac. cítrico-bsa (54.5, 6.5 y 28) al compararlo con un medio compuesto por Tris-ac. cítrico-yema de huevo (46.5, y 5.5). Huang et al. (1997) reportan en machos caprinos de raza Taiwán, resultados óptimos de motilidad espermática (64.3), cuando se utiliza un medio a base de leche descremada. Con respecto a los diluyoconservadores 3 y 4, la glucosa constituye la principal fuente de energía y garantiza además como segunda condición la protección de la membrana espermática contra bajas temperaturas en este caso durante la conservación a 5 C; un papel no menos importante desempeña esta azúcar además, en la regulación de la presión osmótica. La leche descremada entra con la caseína a formar parte de la base proteica donde desempeña un papel de estabilizador en la estructura de las macromoléculas de la membrana espermática, también tiene una función importante como neutralizador por su efecto tampón. El citrato de sodio está en cantidades suficientes para mantener el medio en su ph óptimo ( ). La oscilación que se experimenta cuando se realiza la dilución está a cargo del E.D.T.A. y el bicarbonato de sodio, ellos son los principales responsables del mecanismo de mantención de los niveles óptimos del potencial de hidrógeno y de los hidróxilos. Finalmente, el bromuro de potasio se comporta como una sal activante y el cloruro de potasio como un depresor para mantener la activación espermática a niveles normales (Duverger 23). Una característica común en todos los eyaculados diluidos es la presencia del plasma seal, ya que no se lavó el semen antes de la dilución, se conoce que el plasma seal contiene fundamentalmente compuestos 18 inorgánicos, aoácidos, péptidos y proteínas de bajo y alto peso molecular, lo que varía de acuerdo con la especie (Catt et al. 1997), los hallazgos de estos autores sugieren que los metabolitos más simples y los compuestos inorgánicos, podrían tener en el plasma seal un mayor efecto en la viabilidad de la célula espermática que los compuestos proteicos. Debido a esto Mann y Lutwak-Mann (1981), indicaron que el efecto de dilución en los espermatozoides se puede reducir mediante el uso de medios isotónicos que contienen un balance de sales y de fuentes energéticas con adecuada capacidad buferante. Al respecto Pellicer et al. (1997) sugieren que se adicione inhibidores específicos de la lipasa a los medios a base de leche, para mejorar la supervivencia espermática, en lugar de lavar el semen para eliar el plasma seal, ya que este contiene factores favorables para los espermatozoides. Sin embargo, Sias et al. (25) recomiendan eliar el plasma seal antes de la dilución cuando se utilizan medios que contienen leche descremada, porque es deletéreo para la supervivencia espermática. Estos resultados difieren de los nuestros, ya que precisamente los mejores resultados de motilidad espermática se obtuvieron con el diluyente 2 que tuvo presente este elemento en su composición. D'Alessandro et al. (21) reportan diferencias significativas para P<.1 al utilizar medios compuestos por Tris vs leche descremada con respecto a la motilidad espermática y acrosomas intactos en la prueba de incubación para semen caprino. No obstante nuestros resultados corroboran los hallazgos de Paulenz et al. (23) quienes observaron buenos resultados para la motilidad espermática del semen caprino en medios compuestos por tris y leche descremada (67.1 vs 63.3). Paloo et al. (21) al utilizar medios a base de leche descremada, encontraron resultados para la motilidad espermática superiores al 6 a las 96 h posdilución cuando conservaron semen caprino a 4 C al compararlos con semen conservado a temperatura ambiente, donde solo mantuvo estos valores hasta las 48 h. No solo la composición del medio es un aspecto importante a la hora de conservar el eyaculado por períodos prolongados, también la temperatura de conservación desempeña un importante papel, se conoce que la disución

5 de la temperatura reduce las reacciones químicas y prolonga la vida de las células espermáticas, al reducir su motilidad y reacciones metabólicas, además de limitar la multiplicación de la flora microbiana de aparición secundaria. Con respecto al porcentaje de patologías totales no se encontraron diferencias significativas entre los medios estudiados. CONCLUSIONES Según nuestros resultados podemos concluir que: Los medios 1 y 2 constituyen la mejor alternativa para la conservación del semen caprino refrigerado a 5 C hasta las 96 h al mostrar los mayores porcentajes de motilidad espermática y espermatozoides vivos, así como los menores porcentajes de patologías totales, no obstante recomendamos evaluar la fertilidad a nivel de campo de todos los medios evaluados para corroborar estos resultados. REFERENCIAS 19 Abd Elhakeam, A.A. Effect of extension technique of goat semen on sperm storageability: A cold extension method for improving storage ability. Minia J. of Agric Res. Develop. 2:497, 2. Catt, S.L., O Brien, J.K., Maxwell, W.M.C., Evans, G. Assessment of ram and boar spermatozoa during cell-sorting by flow citometry. Reprod. Dom. Anim.32:251, D'Alessandro, A.G., Martemucci, A.G., Colonna, M.A., Bellitti, A. Post-thaw survival of ram spermatozoa and fertility after inseation as affected by prefreezing sperm concentration and extender composition. Theriogenology 55:1159, 21. Duverger, O. Método para usar semen fresco porcino conservado a una temperatura de 8-1 C utilizando el medio de dilución. Carta Técnica. Empresa de Inseación artificial. MINAGRI, 23. Duverger, O., Moya, A., Barba, F., Hernández, J.J. Nuevos diluyentes y descongelantes para semen bovino. Rev. Cub. Cienc Vet. 19:19, Huang, H., Rong, Y.J., Chun, H.R. Effects of diluents and cryoprotectants on cryopreservation of semen and embryos in Taiwan Black goats. Journal of Taiwan Livestock Research, :371, Keskintepe, L., Simplicio, A.A., Brackett, B.G. Caprine blastocyst development after in vitro fertilization with spermatozoa frozen in different extenders. Theriogenology 49:1265, Mann, T., Lutwak-Mann, C. Male reproductive function and semen.. New York : Spriger- Verlag, p. Martínez, Josefa., Molina, Yiliany, Valdés, Maylin, Interian, L. Un nuevo diluyente para la conservación del semen caprino en estado fresco refrigerado. Ciencia y Tecnología. Ganadera 1:127, 27. Paloo, Lily, Camacho, J., Wilfredo, S., Huanta, L. Falcón, N.P. Conservación de semen caprino en los dilutores citrato-yema y leche-descremada yema. Rev. Inv. Vet. Perú 12(1):13, 21. Paulenz, H., Soderquist, L., Adnoy, T., Fossen, O.H., Berg, K.A.. Effect of milk and TRISbased extenders on the fertility of sheep inseated vaginally once or twice with liquid semen. Theriogenology 6:759, 23. Pellicer-Rubio, M.T., Magallon, T., Combarnous, Y. Deterioration of goat sperm viability in milk extenders is due to a bulbourethral 6- kilodalton glycoprotein with triglyceride lipase activity. Biology of Reproduction 57:123, Sias, B., Ferrato, F., Pellicer-Rubio, M.T., Forgerit, Y., Guillouet, P., Leboeuf, B., Carriere, F. Cloning and seasonal secretion of the pancreatic lipase-related protein 2 present in goat seal plasma. Biochim. Biophys Acta, :169, 25. Recibido 5 de diciembre de 28 Aceptado 17 de marzo de 29