AVANCES EN BIOTECNOLOGÍAS REPRODUCTIVAS EN YEGUAS

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1 AVANCES EN BIOTECNOLOGÍAS REPRODUCTIVAS EN YEGUAS Luis Losinno, MV, PhD Laboratorio de Reproducción Equina, Cátedra de Producción Equina, Departamento de Producción Animal, Facultad de Agronomía y Veterinaria, Universidad Nacional de Río Cuarto, (5800) Río Cuarto, Argentina; llosinno@gmail.com Las herramientas y/o procesos tecnológicos que el hombre aplica de manera directa o indirecta a la reproducción, en este caso animal, se conocen como Biotecnologías Reproductivas. Los reportes anecdóticos de estas herramientas de manejo reproductivo en equinos son muy antiguos (s.xvi) pero el verdadero auge ocurre durante el siglo pasado con la expansión de la inseminación artificial (IA) como la de mayor impacto sobre los sistemas productivos. Desde la segunda mitad del siglo XX la aplicación masiva ha de estas tecnologías ha crecido exponencialmente en la industria equina mundial en especial la IA y la transferencia embrionaria (TE) (Squires, 2006). El objetivo de esta presentación es realizar una breve descripción conceptual de las últimas biotecnologías reproductivas desarrolladas y sus aplicaciones potenciales en la clínica reproductiva y la producción equina, considerando la inseminación artificial; criopreservación embrionaria; superovulacion; inyección intracitoplasmatica de espermatozoide (ICSI); transferencia intraoviductal de gametas (GIFT) y clonación y excluyendo la transferencia embrionaria que será tratada en un tópico aparte. Inseminación Artificial (IA) Desde mediados de los años 80 hasta el presente, el crecimiento de esta biotecnología en los sistemas de producción de caballos en el mundo en general y Argentina en particular ha sido exponencial dado que en este periodo la mayoría de las asociaciones de criadores de caballos de razas puras ha aceptado y reglamentado la IA en sus diferentes variantes y otras biotecnologías, en especial la Transferencia Embrionaria dentro de sus estatutos. En la actualidad en el mundo hay muy pocas asociaciones que no acepten el uso de biotecnologías reproductivas, entre ellas una de las razas de mayor impacto económico mundial en la cría de caballos como la Sangre Pura de Carrera. Una de las barreras para la inclusión de biotecnologías, aun las más elementales y antiguas, dentro de los programas de reproducción ha sido la desinformación y el consecuente dogmatismo tanto de los profesionales involucrados como de las dirigencias de las razas. En los últimos 10 años debido entre otros factores al recambio generacional de profesionales y al mayor acceso a información técnica y de divulgación, al menos desde mi perspectiva de docente/investigador y formador de recursos humanos, esto ha cambiado radicalmente. Es verdad que la inclusión de estas herramientas debe estar inserta en un marco productivo que las haga económicamente aplicables, algo que al menos en los últimos años y en especial en algunas razas deportivas como la de polo es particularmente importante. Dado que el objetivo de esta presentación es la de focalizar solo en los avances, y no realizar una sustitución de las recomendadas lecturas técnicas, algunas de las cuales se mencionan en la bibliografía, son tres los que creo que son remarcables con respecto a la IA: 1) IA con semen refrigerado. La criopreservacion del semen diluido a 5ºC por periodos de hasta hs en contenedores de diseño simple, económicos, transportables, aun descartables, resistentes a malos tratos y a temperaturas externas elevadas junto a la difusión del uso de diferentes tipos de diluyentes de alta eficiencia, ha contribuido al crecimiento de este sistema que esencialmente disminuye los costos operativos al evitar 1

2 transportar animales valiosos, sin disminución en los índices de preñez por ciclo si los procedimientos se realizan correctamente y los animales no tienen problemas de fertilidad aditivos. La implementación en Argentina y otros países de América Latina ha encontrado una dificultad logística referida a los sistemas de transporte públicos y en algunos casos a la falta de entrenamiento idóneo por parte de los veterinarios involucrados. Los problemas mas frecuentes en la utilización e implementación de esta tecnología están relacionados con: Sementales cuyos espermatozoides tienen una baja tolerancia a las bajas temperaturas (y frecuentemente buenos índices de preñez por ciclo con semen fresco) y NO son testeados críticamente previo al programa de envíos. Contaminación de las muestras de semen por malas condiciones de higiene y falta de entrenamiento formal de los Veterinarios que realizan las maniobras. Envío de dosis marginales o sub-optimas en términos de cantidad total de espermatozoides con motilidad progresiva. Fallas en la logística de los envíos (que demoren mas tiempo de lo esperado o tolerable, alterando las condiciones del semen) Envíos a destiempo en relación a la ovulación de la yegua a inseminar. Contenedores inadecuados no testeados críticamente Diluyente seminal preparado en condiciones sub-óptimas, no controladas (ph, osmolaridad, antibióticos) y no testeado con el semen a enviar en particular. De cualquier manera es uno de los sistemas mas utilizados como complemento de la TE en Colombia y Brasil con resultados comparativos considerados desde aceptables a muy buenos. 2) IA con semen congelado. Los avances en la investigación de nuevos criopreservadores como las amidas, diluyentes sin componentes de origen animal como la yema de huevo, leche, albúmina, etc, diferentes curvas de descenso térmico, la evidencia que no hay un patrón standard de respuesta de los espermatozoides a la injuria térmica, inclusive variando dentro de cada padrillo en diferentes eyaculados, época del año, etc. y la presión del mercado y los criadores respecto a implementar protocolos eficientes y comercialmente aceptables, ha llevado a esta técnica a índices de preñez comparables a los de semen refrigerado y en muchos casos a los de semen fresco. En razas deportivas, en especial de salto (pero extendiéndose rápidamente a las demás), el semen de la mayoría de los padrillos importantes se comercializa congelado lo que permite preservar su genética aun después de muerto por tiempo indefinido y la difusión internacional de la misma en pequeños contenedores. En Argentina, hay registro de mas de 250 padrillos a los que se les ha congelado semen comercialmente y en la actualidad la demanda de este servicio ha crecido exponencialmente (Squires, 2006, Miragaya MH, 2007). Los problemas más frecuentes se relacionan a: Falta de entrenamiento formal de los Veterinarios que realizan la técnica, lo que repercute en la calidad y consistencia de las dosis congeladas Manejo del semen durante el proceso de congelación (contaminación, shock termino, shock osmótico) Manejo del semen post-descongelado (shock térmico) Momento de la inseminación Dosis inseminante 3) IA con baja dosis. Descripta inicialmente para ser utilizada en padrillos con baja fertilidad y a través de una histeroscopia, esta técnica propone utilizar dosis inseminantes de hasta 1/10 de la recomendada para IA tradicional colocando el semen sobre la unión útero-tubarica (papila). El desarrollo de la técnica y su traslado a sistemas de campo utilizando una pipeta de IA mas larga y flexible, guiada trasrectalmente permite depositar el semen sobre la papila disminuyendo la dosis 2

3 (tanto de semen fresco, refrigerado y congelado) y aumentar la eficiencia en términos de dosis/eyaculado, bajando los costos con resultados en muchos casos superiores a las técnicas convencionales. En mi opinión esta es una de las técnicas de mayor impacto en términos de usuarios que la adoptaron rápidamente y con ello mejoraron su performance de IA a un costo ínfimo en relación al beneficio. Vitrificación de embriones La vitrificación es un proceso físico de criopreservación donde una solución líquida es transformada en un sólido particular amorfo y estable, llamado vítreo, cuando se congela a bajas temperaturas (criogénicas) utilizando altas concentraciones de crioprotectores. Como resultado, los fluidos intra y extracelulares se tornan más viscosos a medida que el medio se enfría, evitando la unión de moléculas de agua y consecuentemente la formación de cristales de hielo. Para lograr esto, el enfriamiento debe ser muy rápido obteniendo un estado vítreo, de manera casi inmediata. Este estado tiene la distribución iónica y molecular de un líquido, por eso se evitan los efectos nocivos (mecánicos y químicos) de los cristales de hielo que se forman durante la criopreservación convencional. La técnica de vitrificación posee varias ventajas: es simple, puede realizarse en poco tiempo y no necesita equipos costosos. Sin embargo también presenta algunas desventajas: la alta concentración de crioprotectores utilizados puede ser tóxica para las células. Un problema severo es la remoción de las altas concentraciones intracelulares del crioprotector luego del descongelamiento. Las exigencias de las competencias en los diferentes deportes hípicos dificultan que las yeguas gesten o permanezcan en un centro de TE durante su etapa reproductiva o deportiva. La criopreservación permite el transporte de los embriones desde la yegua donante hacia la receptora sin necesidad de mantener la misma sincronizada, reduciendo los costos de mantenimiento y por otra parte posibilitando que completen su temporada deportiva. Una de las ventajas más importantes de criopreservar embriones es que éstos, a diferencia de las gametas, contienen el genoma completo de un nuevo individuo y esta listo para ser transferido a una madre sustituta. Además de las ventajas mencionadas, la criopreservación permite conservar material genético de animales superiores, seleccionados por su desempeño atlético o por sus características raciales o productivas. A diferencia de los bovinos y otras especies domesticas, una de las limitaciones en los equinos es la dificultad, hasta el momento, de superovular yeguas consistentemente, por lo tanto la cantidad de embriones obtenidos por yegua por ciclo es comparativamente muy baja. Como resultado, los embriones disponibles para investigaciones en esta área de la biotecnología se encuentran muy acotados. De hecho es una de las especies de mamíferos domésticos en la que menos se ha avanzado en este campo, donde solamente se reportan alrededor de 50 potrillos nacidos en el mundo producto de embriones criopreservados, a diferencia de decenas de miles de bovinos. Hasta principios de los `80 los resultados obtenidos con embriones equinos utilizando técnicas de congelamiento estándar fueron desalentadores a diferencia de lo que ocurría con embriones de otras especies, en gran medida debido a que la presencia de cápsula en los blastocistos equinos dificulta la difusión de los crioprotectores intracelulares. El primer potrillo nacido de una preñez lograda por medio de esta técnica fue reportado por Yamamoto en Desde entonces varios intentos de congelar embriones equinos se han publicado con resultados variables y en general desalentadores en términos de tasas de preñez post-descongelación. La primera preñez con embriones vitrificados de ratones fue obtenida por Rall, (1987) y en vacas por Massip (1986). Recién en 1994, Hochi y col. publicaron por primera vez una preñez a partir de un embrión equino vitrificado (Hochi et al., 1994). 3

4 El proceso de vitrificación de embriones equinos es un proceso sencillo que se realiza en poco tiempo (3-4 minutos por embrión) y no requiere de equipamiento complejo. Una vez vitrificado el embrión este se puede mantener por tiempo indefinido dentro del termo de nitrógeno líquido. Para transferir el embrión vitrificado debemos contar con receptoras entre día 5 a 6 post ovulación. Los resultados iniciales reportados en cuanto a preñeces de embriones equinos fueron muy alentadores. Carnevale et al. (2004) y Eldridge-Panuska et al. (2005), reportaron tasas de preñez significativamente altas en relación a datos preliminares experimentales. En 2006, Carnevale reporto una tasa comparativa de preñez post transferencia entre embriones refrigerados que son luego vitrificados y embriones únicamente vitrificados de 65% y 75% respectivamente (Carnevale, et al. 2006). Desafortunadamente, los resultados obtenidos por Investigadores y Veterinarios utilizando el mismo protocolo descrito en las publicaciones y los mismos kits comerciales, incluyendo a nuestro Laboratorio, no han logrado resultados que superen el 50% de los valores reportados, es decir, no superiores a 35% de preñez (Allen, 2008, Samper, 2008, Losinno, 2008), por lo que en mi opinión, hasta el momento no hay un protocolo con resultados de estudios multicentricos, independientes, consistentes que demuestren resultados satisfactorios y repetibles como para poder recomendar su utilización en sistemas comerciales. Inyección intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) Esta técnica de alta complejidad fue desarrollada como alternativa para el tratamiento de casos específicos de infertilidad masculina. En equinos, los resultados hasta el momento demuestran que es mas eficiente que la de FIV para la producción in vitro de embriones y es ofrecida comercialmente desde el año 2003 para el tratamiento de determinados casos de infertilidad de padrillos. La técnica de ICSI consiste en seleccionar e inyectar un espermatozoide mediante un micromanipulador en el citoplasma de un ovocito en MII, es decir necesita de un ovocito maduro, que puede ser obtenido mediante punción folicular (in vivo) o post mortem (ex vivo). Se puede utilizar semen fresco, refrigerado, congelado o liofilizado (desecado). El procesamiento del semen consiste en colocar los espermatozoides en un gradiente de percoll para disminuir el número de espermatozoides muertos, luego es centrifugado y colocado en un medio de alta densidad (PVP). Este medio permite disminuir la velocidad del movimiento de los espermatozoides, seleccionar uno, fijarlo mediante la aguja del micromanipulador y aspirarlo desde la cola. El siguiente paso consiste en inyectar el ovocito con el espermatozoide seleccionado. Luego el ovocito inyectado puede ser cultivado in vitro o transferido directamente al oviducto de una receptora previamente acondicionada. El primer reporte de un potrillo nacido por esta técnica fue hecho por Squires y col (1996). Si bien hay pocos grupos trabajando en el desarrollo de la técnica en aspectos específicos para las gametas y embriones equinos, esta ha tenido un gran impulso en los últimos años. Con el objetivo de trabajar sobre el desarrollo in vivo de embriones producidos in vitro, nuestro grupo ha realizado transferencias quirúrgicas experimentales de cigotos obtenidos por ICSI a oviductos de yeguas, ovejas y conejas (Herrera, 2006). Debido a las dificultades en el cultivo embrionario equino in vitro, hasta el momento la técnica de GIFT ha resultado mas eficiente en términos de producción de preñeces, excepto en casos extremos de oligospermia u otras patologías espermáticas que sean incompatibles con técnicas de inseminación artificial (Galli et al., 2007). Recientemente hemos reportado la producción de embriones por ICSI utilizando espermatozoides de epidídimo criopreservados y espermatozoides desecados (Herrera et al., 2006; Alonso et al., 2007, Alonso et al, 2008) 4

5 Actualmente un grupo de trabajo lo ofrece comercialmente como servicio reproductivo en Argentina. Transferencia intraoviductal de gametas (GIFT) Consiste en transferir quirúrgicamente al oviducto de una yegua receptora sincronizada e inseminada, uno o más ovocitos de una donante. Los ovocitos pueden ser obtenidos mediante punción folicular (in vivo) o post mortem (ex vivo) y madurados in vitro. Esta técnica presenta menos dificultades técnicas y mayores aplicaciones clínicas que las descriptas anteriormente dado que en resumen solo necesita que de la donante un ovocito viable y puede ser aplicada en casos de endometritis persistentes, fallas ovulatorias, desgarros cervicales, o en algunos casos de infertilidad idiopática. En ambos casos (ICSI y GIFT) es en general necesario realizar la aspiración folicular guiada por ultrasonido (OPU). Actualmente los resultados de tasas de aspiración en programas comerciales pueden ser en promedio de 50-70% /ciclo lo que claramente justifica su aplicación comercial (Alonso et al, 2007). Los reportes de programas clínicos comerciales documentan resultados de 37 % de preñez promedio y obtención de preñeces en el 70 % de las yeguas donantes con problemas de subfertilidad (Hinrichs, 2005). También es ofrecido comercialmente en Argentina. Clonación Es una técnica que permite producir un individuo genéticamente idéntico a partir de una célula somática (embrionaria, fetal o adulta). Se obtiene un individuo con la misma carga genética que otro/s, pero sujeto a variaciones epigeneticas, ambientales y con el agregado del ADN mitocondrial del ovocito receptor, por lo que estrictamente un clon animal no es exactamente igual a otro (Hinrichs, 2006; Vajda, 2006). En junio del 2003 se reporto en la Universidad de Idaho EEUU el nacimiento del primer équido clonado del mundo, una mula llamada Idaho Gem (Woods 2003). Dos meses más tarde se comunico el nacimiento de Prometea, el primer caballo clonado, en la Universidad de Cremona, Italia. (Galli 2003). Hasta el momento hay entre aproximadamente 21 clones equinos nacidos reportados. De acuerdo a los datos disponibles, hasta el momento solo un grupo en Argentina (Halitus/Bioteq SA) actualmente ofrece comercialmente el servicio de clonación equina en América Latina con un nacimiento y una preñez en curso en Los aspectos más relevantes y actuales de la clonación en equinos pueden consultarse en la excelente revisión de Hinrichs (2006). Conclusión La inserción de biotecnologías reproductivas en equinos es una realidad en cualquier sistema de producción de caballos de mediana a alta complejidad, comenzando por la utilización masiva de la ultrasonografia reproductiva hasta la transferencia embrionaria. Las técnicas de reproducción asistida de mayor complejidad como ICSI GIFT y clonación, de muy baja eficiencia y alto costo operativo, actualmente dirigidas a una elite de individuos de alto valor genético, económico o afectivo ofrecen hoy herramientas para solucionar problemas de infertilidad puntuales e indudablemente sus resultados mejoraran con el incremento de experimentos controlados trasladables a sistemas reales. 5

6 Biotecnologia Complejidad Costo Eficiencia TE + X 35% GIFT ++ 2X 25% ICSI +++ 3X 15% Clonacion X 1-5% Bibliografía 1. Alonso A, Miragaya MH, Losinno L, Herrera C. Intracytoplasmic sperm injection of equine oocytes using air-dried sperm or sperm stored in a high osmolarity medium. Reproduction, Fertility and Development 19(301), Allen, WR. Comunicacion personal, Caracciolo di Brienza V, Carnevale EM, Seidel GE Jr. Establishment of pregnancies after vitrification of equine embryos of various developmental stages. Reprod. Fertil Dev 16, 252 (2004). 4. Carnevale E. M., Eldridge-Panusca W.D., Caracciolo di Brienza V. How to Collect and Vitrify Equine Embryos for Direct Transfer. 50 th Annual Convention of AAEP. Internet Publisher: ( (2004). 5. Eldridge-Panuska W, Caracciolo di Brienza V, Seidel GE Jr. Development of equine embryos in vivo post vitrification and recovery rates of embryos 6.5 days after ovulation. Theriogenology 63,5, (2005). 6. Galli C, Colleoni S, Duchi R, Lagutina I, Lazzari G. Developmental competence of equine oocytes and ambryos obtained by in vitro procedures ranging from in vitro maturation and ICSI to embryo culture, cryopreservation and somatic cell nuclear transfer. Animal Reproduction Science 98:39-55, Galli C, Lagutina I, Crotti G et al. A cloned horse born to its dam twin. Nature 424:635, Herrera C, Miragaya HM, Losinno L. Intracytoplasmic sperm injection for in vitro equine embryo production. Acta Scientiae Veterinaria 34(1) , Herrera C., Miragaya H.M., Conde P., Hynes V., Losinno L., Quintans C., Pasqualini R.S. Intracytoplasmic injection of in vitro matured equine oocytes with frozen-thawed epididymal sperm. Anim. Reprod. Sci. 94: , Hinrichs K. A review of cloning in the horse. Proc Am Ass Equine Pract , Hinrichs K. Update on equine ICSI and cloning. Theriogenology 64: , Hochi S., Fujimoto T., Braun J., Oguri N. Pregnancies following transfer of equine embryos cryopreserved by vitrification. Theriogenology, 42, (1994). 13. Losinno L, Alvarenga M. Critical factors on equine embryo transfer programs. Acta Scientiae Veterinaria,34(1), 39-49, Samper, JC. Comunicacion personal, Miragaya MH. Comunicacion personal, Squires EL, McCue P. Superovulation in mares. Animal Reproduction Science 17. Squires EL. Integration of future biotechnologies into the equine industry. Animal Reproduction Science 89: , Stout TAE. Equine embryo transfer: review of developing potential. Equine Veterinary Journal 38(5) , Woods GL, White KL, Vanderwall DK. A mule cloned from fetal cells by nuclear transfer. Science 301:1063,

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