Evaluación in vitro de tres controladores del hongo Sclerotium rolfsii

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1 Memoria de la Fundación La Salle de Ciencias Naturales 2007 ( 2006 ), 166: Evaluación in vitro de tres controladores del hongo Sclerotium rolfsii Yadira Flores, Yinny Mujica y Amado Rondón Resumen. Con el propósito de evaluar in vitro el efecto de tres controladores -biológico (Trichoderma sp.), químico (Vitavax-200), y natural (aceite de semillas del árbol Nim Azadirachta indica, Meliaceae)- sobre el crecimiento micelial y la formación de esclerocios de Sclerotium rolfsii Sacc., se realizaron con el biocontrolador pruebas de enfrentamiento con colonias de micelio y esclerocios del patógeno. En caso del fungicida se utilizó la técnica de Palazón y para el aceite de Nim se evaluaron dos dosis (2 y 3 ml). El diseño estadístico fue completamente aleatorizado con 10 tratamientos y 10 repeticiones, realizando las evaluaciones cada 24 horas para el crecimiento de las colonias y al cabo de ocho días la formación de esclerocios. Existen diferencias altamente significativas entre los tratamientos, donde Trichoderma ejerció un cierto control sobre el crecimiento micelial y la formación de esclerocios; el Vitavax controló de manera efectiva el crecimiento del hongo y la formación de esclerocios; el aceite de Nim no inhibió el crecimiento micelial pero si tuvo un buen efecto sobre la formación de esclerocios. Es necesario proseguir estos trabajos en condiciones de campo para llevar al productor una alternativa viable de control preventivo de ese importante patógeno dentro del Manejo Integrado de Plagas. Palabras clave. Sclerotium rolfsii. Aceite de Nim. Vitavax. Trichoderma. In vitro evaluation of three control agents of the fungal pathogen Sclerotium rolfsii Abstract. In order to evaluate the in vitro effect of three control agents - biological (Trichoderma sp.), chemical (Vitavax-200), and natural (oil from the seeds of the Neem Tree (Azadirachta indica, Meliaceae)) - on the mycelial growth and sclerotial formation of the soil-borne fungal pathogen Sclerotium rolfsii; tests were made of the effect of the biological control agent on colonies of mycelia and sclerotia. In case of the fungicide, the Palazón technique was used and for Neem Tree oil, two doses were evaluated (2 and 3 ml). The statistical design was completely randomised with 10 treatments and 10 repetitions, evaluations of the growth of the colonies being made every 24 hours and the formation of sclerotia being measured after 8 days. There are highly significant differences between treatments as follows: Trichoderma exerted a certain control on mycelial growth and the formation of sclerotia; Vitavax effectively controlled fungal growth and sclerotial formation; tand Neem Tree oil did not inhibit mycelial growth but did have a favourable effect on the formation of sclerotia. It is necessary to continue this line of investigation in the field in order to provide the farmer with a viable preventive control alternative of this important pathogen within an Integrated Pest Management framework. Key words. Sclerotium rolfsii. Neem oil. Vitavax. Trichoderma.

2 142 Controladores de Sclerotium rolfsii Introducción El hongo Sclerotium rolfsii Sacc. es un habitante del suelo, de amplia distribución en climas templado y subtropical, donde causa marchitamiento y muerte de plantas. El patógeno afecta más de 300 especies cultivadas pertenecientes a 64 diferentes familias botánicas (Adams y Ayers 1979). Este organismo produce estructuras de resistencia denominadas esclerocios, los cuales le permiten sobrevivir en el suelo durante largos períodos en condiciones climáticas adversas, pudiendo permanecer viables por lo menos 4 a 5 años. Cuando las condiciones del suelo le son favorables, germinan e infectan las plantas a nivel del suelo, y por tal motivo esas estructuras son de primordial importancia en la supervivencia y epidemiología del hongo (Castellano 2000). A pesar de su resistencia, investigaciones sobre agentes de biocontrol han demostrado que los esclerocios del fitopatógeno son vulnerables al ataque de muchos microorganismos, algunos de los cuales pueden ocasionarle la muerte (Cundom et al. 2000). Las estructuras de reproducción del hongo también son susceptibles a extractos vegetales de algunas plantas y, a nivel mundial, se han realizado varios trabajos que demuestran la acción antifúngica tanto a nivel foliar como a nivel del suelo (Bannett y Wallsgrove 1994, Bianchi et al. 1994, Bowers y Locke 2000). Alcalá et al. (2005) evaluaron in vitro el efecto de extractos acuosos y del aceite de Nim sobre Sclerotium rolfsii. Singh et al. (1980) observaron que el crecimiento del hongo fue inhibido completamente cuando se usó el aceite de Nim en concentraciones de 1500, 2000 y 5000 ppm. Cuando se usó el extracto de pulpa del fruto, la concentración requerida para inhibir el crecimiento fue de ppm y en el caso de extractos de hojas, la inhibición del crecimiento del hongo, de manera completa, se logró con la utilización de ppm. Sin embargo, los inconvenientes para obtener cultivares resistentes a S. rolfsii han propiciado el empleo de productos químicos y la aplicación de prácticas culturales, como las principales medidas adoptadas para reducir los daños causados por el hongo. De allí que el control del patógeno por medio de prácticas convencionales se haga difícil, debido a sus características epidemiológicas. Por otro lado, el uso de plaguicidas esta siendo cuestionado debido a los serios perjuicios que ocasionan al medio ambiente, y a la salud humana y animal. Por tales razones, los controles biológico y n a t u ral están recibiendo considerable atención, revelándose en pruebas de laboratorio, invernáculo y de campo como alternativas de comprobada eficiencia, principalmente en el control de hongos del suelo (Alcalá y Vargas 1999, Stauffer et al. 1996, Zapata et al. 2003). El objetivo de esta investigación, enmarcada en el Manejo Integrado de Plagas, fue evaluar in vitro la acción de tres controladores del hongo S. rolfsii. Para ello, se estimó el efecto de: a) dos dosis (2 y 3 ml) de aceite de semilla de Nim; b) del hongo Trichoderma sp.; y c) del producto químico Vitavax-200 sobre el crecimiento micelial y la formación de esclerocios del hongo.

3 Mem. Fund. La Salle de Cienc. Nat Materiales y Métodos Para la realización de la investigación, después de constatar visualmente la presencia e incidencia del hongo Sclerotium rolfsii en plantas de tomate (Lycopersicon esculentum L) de la variedad río Grande, ubicadas en terrenos experimentales de la Estación de Investigación Agropecuaria y de Extensión (EDIAGRO) de la Fundación La Salle de Ciencias Naturales en San Carlos, Estado Cojedes, se procedió a tomar muestras de plantas afectadas, las cuales fueron depositadas en bolsas de polietileno y llevadas al Laboratorio de Fitopatología de EDIAGRO. Se seleccionaron plantas con daños severos (plantas muertas), avanzados (plantas marchitas) y leves (plantas verdes con micelio escaso en el cuello de la raíz). Se procedió a realizar los aislamientos seleccionando tallos y raíces con manchas necróticas, las cuales fueron lavadas con agua corriente y destilada, desinfectadas con hipoclorito de sodio al 1% durante un minuto y lavadas dos veces con agua destilada. Con bisturí esterilizado se hicieron cortes transversales y longitudinales de los tejidos, a fin de extraer la parte interna afectada, la cual fue sembrada en cápsulas Petri conteniendo PDA (papa-dextrosa-agar). Una vez desarrollado el hongo se procedió a multiplicarlo en el mismo medio. El hongo antagonista Trichoderma sp., utilizado en el ensayo, fue adquirido en un laboratorio comercial. Se realizaron pruebas de enfrentamiento, para lo cual se tomaron del medio de cultivo con sacabocado esterilizado, círculos conteniendo micelio de 1.5 cm de diámetro, tanto del biocontrolador como del hongo S. rolfsii (T3), los cuales se colocaron enfrentados en los extremos de las cajas con PDA. Se procedió de igual modo con los esclerocios del patógeno que tenían ocho días de germinados (T7). Para el fungicida Vitavax-200, se utilizó la técnica de Palazón (1983), la cual consistió en disolver 1 g del principio activo del producto en 5 ml de acetona (95%), completando el volumen a 100 ml con agua destilada estéril, para obtener una suspensión de partes por millón. A partir de esta concentración patrón se hicieron diluciones en serie, para obtener concentraciones de 1.000, 100, 10 y 1 partes por millón. Luego se esterilizaron tubos de ensayo con 15 ml de PDA (autoclave durante 30 min a 15 lbs y 121 C), colocándolos en baño de maría a 45 ºC para mantenerlos en estado líquido y poder mezclar el fungicida a razón de 1 ml por tubo, agitando suavemente para homogeneizarlo y dispensarlo en cajas Petri. Una vez solidificado el medio se sembró la colonia o el esclerocio del hongo bajo estudio. Para el tratamiento con aceite de Nim (adquirido en una casa comercial) se usaron dos dosis (2 y 3 ml), los cuales fueron agregados en cápsulas de Petri contentivas de 15 ml de PDA y después de solidificado el medio, se sembraron colonias del micelio y esclerocios del patógeno. Los tratamientos usados con PDA fueron los siguientes: T1= Micelio de S. rolfsii + 2 ml de aceite de Nim T2= Micelio de S. rolfsii + 3 ml de aceite de Nim T3= Micelio de S. rolfsii + Trichoderma sp. T4= Micelio de S. rolfsii + Vitavax-200 T5= Esclerocios de S. rolfsii + 2 ml de aceite de Nim

4 144 Controladores de Sclerotium rolfsii T6= Esclerocios de S. rolfsii + 3 ml de aceite de Nim T7= Esclerocios de S. rolfsii + Trichoderma sp. T8= Esclerocios de S. rolfsii + Vitavax-200 T9= Testigo de esclerocios de S. rolfsii T10= Testigo de micelio de S. rolfsii En estas pruebas se usó un diseño experimental completamente aleatorizado con 10 tratamientos y 10 repeticiones. Para la recopilación de los datos, se hicieron observaciones y mediciones con una regla graduada del crecimiento de la colonia del hongo en centímetros lineales cada 24 horas, por un lapso de 96 horas. Los contajes de esclerocios se hicieron a los 8 días. El análisis estadístico empleado para determinar el crecimiento micelial y la formación de esclerocios del hongo fue ANDEVA (Kruskal- Wallis) y la prueba de comparación de medias de rango (no paramétrica). Se utilizo el paquete estadístico Statistix 7.0. Resultados y Discusión La tabla 1 refleja las diferencias estadísticas altamente significativas entre los diversos tratamientos que contempla el crecimiento micelial del hongo S. rolfsii cada 24 hs hasta 96 hs y la formación de esclerocios después de estar creciendo ocho días en medio agarificado (PDA). Tabla 1. Resumen de ANDEVA (Kruskal-Wallis) para crecimiento del micelio y formación de esclerocios del hongo S. rolfsii. Valor de F y significación F de V C24 C48 C72 C96 P8 Tratamientos ** ** ** ** 50.38** Error 90 Total 99 NS= 0.01 ** = Altamente significativa En la tabla 2 se observa que los T1 y T2 presentaron un comportamiento semejante entre sí, en cuanto al crecimiento del hongo, pero el T3 después de las 24 h o ras evidenció una disminución notable del cre c i m i e n to en relación con los a n te ri o res; por consiguiente, aún cuando las dife rencias esta d í sticas no son significativas, hubo un efecto depresivo del hongo Trichoderma sp. sobre la tasa de crecimiento. Cuando estos tres tratamientos son comparados con el testigo (T10), se nota que estadísticamente no son iguales ya que este último experimentó un mayor crecimiento desde el inicio hasta la culminación del ensayo. El T4 también resultó significativamente diferente a todos los demás tratamientos, por cuanto hubo completa inhibición del crecimiento micelial del hongo (Figura 1).

5 Mem. Fund. La Salle de Cienc. Nat Tabla 2. Resumen de pruebas de comparación de Medias de Rango (no paramétrica) para crecimiento del micelio de Sclerotium rolfsii. (Letras iguales tienen igual significado). Promedios y letras Tratamientos C24 C48 C72 C96 T1 0,27 d 2,53 a 2,40 c 2,26 b T2 0,28 d 2,25 c 2,27 c 2,15 b T3 0,38 b 0,70 e 0,93 f 0,66 c T4 0,00 e 0,00 f 0,00 h 0,00 d T10 0,72 b 2,45 b 2,79 a 3,37 a Figura 1. Crecimiento del micelio procedente del micelio de Sclerotium rolfsii bajo tratamientos: T1 (2ml aceite de Nim), T2 (3ml aceite de Nim), T3 ( Trichoderma sp.), T4 (Vitavax 200), y T10 (S. rolfsii ). En relación con el crecimiento del micelio procedente de esclerocios, en la tabla 3 se observa que durante las primeras 24 horas, los tratamientos T6, T7 y T9 tuvieron un comportamiento similar, solamente difirieron del T5 y T8 pues en este último no hubo crecimiento del hongo. Desde las 48 horas el T7 inhibió en cierto grado el crecimiento micelial, aún cuando siendo menor a las 72 y 96 horas presentó diferencias significativas con T5 y T6, ya que estos dos últimos se comportaron de manera similar durante las 48 y 96 horas. En el tratamiento T8, no se evidenció crecimiento del patógeno durante las 96 horas y el testigo T9, presentó el mayor crecimiento micelial a partir de las 48 horas y se comportó estadísticamente diferente a partir de ese tiempo. Estos resultados se pueden evidenciar en la figura 2.

6 146 Controladores de Sclerotium rolfsii Tabla 3. Resumen de pruebas de comparación de Medias de Rango (no paramétrica) para crecimiento micelial, procedente de esclerocios de S. rolfsii. (Letras iguales tienen igual significado). Promedios y letras Tratamientos C24 C48 C72 C96 T5 0,31 c 0,97d 1,92 d 2,25 b T6 0,37 b 0,94 d 1,76 e 2,45 b T7 0,41 b 0,28 f 0,29 g 0,24 c T8 0,00 e 0,00 f 0,00 h 0,00 d T9 0,34 b 2,11 c 2,48 b 2,81 a Figura 2. C re c i m i e n to del micelio pro c e d e n te de esclerocios de S c l e rotium ro l fs i i b ajo los tratamientos: T5 (2ml aceite de Nim), T6 (3ml aceite de Nim), T7 (Trichoderma sp.), T8 (Vitavax 200) y T9 (S. rolfsii ). En cuanto a la formación de esclerocios en la tabla 4 se evidencia que los tratamientos T1, T2 y T3 se comportaron estadísticamente de manera similar, pues hubo inhibición importante del número de esclerocios, ya que en promedio se observaron siete, en comparación con los 1017 y 1095 que se manifestaron en los testigos T9 y T10, provenientes de esclerocios o de micelio respectivamente. Tampoco se notó formación

7 Mem. Fund. La Salle de Cienc. Nat de esas estructuras de resistencia en los tratamientos T4 y T8, cuando el medio fue tratado con el fungicida Vitavax-200, el cual resultó ser el tratamiento más efectivo en el ensayo. Igualmente, las dos dosis de aceite de Nim (T1 y T2), ejercieron una aceptable inhibición en la formación de esclerocios pero no así en el crecimiento micelial. El biocontrolador Trichoderma sp. (T3 y T7), controló el crecimiento del hongo de forma más efectiva que las dosis de Nim y además exhibió adecuado control en la formación de esclerocios. Tabla 4. Número promedio de esclerocios procedentes de micelio y esclerocios de S. rolfsii, formados a los ocho días en cada uno de los diez tratamientos aplicados. Se indica, con letras entre paréntesis, diferencias estadísticamente significativas de acuerdo a prueba no-paramétrica de comparación de medias de rango (letras iguales indican diferencias no significativas, letras diferentes indican diferencias significativas). Tratamientos N promedio de esclerocios T1= Micelio S. rolfsii + 2ml. aceite Nim 7 c T2= Micelio S. rolfsii + 3ml. aceite Nim 8 c T3= Micelio S. rolfsii + Trichoderma sp. 10 c T4= Micelio S. rolfsii + Vitavax g T5= Esclerocios S.rolfsii + 2ml. aceite Nim 7 d T6= Esclerocios S.rolfsii + 3 ml.aceite Nim 7 d T7= Esclerocios S.rolfsii + Trichoderma sp. 3 f T8= Esclerocios S. rolfsii + Vitavax g T9= Testigo de esclerocios de S. rolfsii 1017 b T10= Testigo de micelio de S. rolfsii 1095 a Estos resultados coinciden con los obtenidos por Alcala y Vargas (1999) y Staufffer et al. (1996) quienes evaluaron semillas del árbol Nim sobre el crecimiento de S. rolfsii, donde el Nim inhibió la formación de esclerocios pero no el crecimiento micelial. Así mismo, Zavaleta-Mejía y Gómez (1994), Flores et al. (1999) y Valery y Acevedo (1999), sugieren en los resultados de sus investigaciones que el control del patógeno debe realizarse de una forma integral con la utilización del control biológico, químico y natural. Referente al Vitavax-200 los resultados encontrados son similares a los de Rondón et al. ( 1995) quienes señalan que este agro químico inhibe comp l eta m e n te el crecimiento del patógeno. Es importante señalar en relación con los testigos (T9 y T10), que hubo diferencias notables en cuanto al número de esclerocios producidos, ya que los mismos se incrementaban cuando su origen era micelial. Sin embargo, en ambos casos, se obtuvo un elevado número, lo cual indica que el organismo tiene la posibilidad de multiplicarse y permanecer en el suelo aún bajo condiciones adversas, hecho que le confiere un alto poder patogénico así como la posibilidad de infectar y matar el hospedero.

8 148 Controladores de Sclerotium rolfsii Conclusiones y Recomendaciones Las dosis de aceite de Nim no ejercieron control efectivo sobre el crecimiento del micelio pero si inhibieron la formación de esclerocios. El biocontrolador Trichoderma sp. inhibió en cierto grado el crecimiento micelial así como la formación de esclerocios. El fungicida Vitavax-200 resulto efectivo ya que no permitió el crecimiento micelial ni la formación de esclerocios. Se deben constatar los resultados obtenidos a nivel de campo. Finalmente es importante resaltar la utilidad de estos controladores en la lucha práctica contra el hongo Sclerotim rolfsii en el Estado Cojedes, Venezuela, ya que al ser aplicados racionalmente contribuyen de manera efectiva al control oportuno de la enfermedad. Bibliografía. ADAMS, P. Y W. AYERS Ecology of Sclerotinia sp. Phytopathology 69(8): ALCALÁ, D. Y N. VARGAS Efectos de extractos vegetales y fungicidas sobre el crecimiento micelial de S. rolfsii y Thielaviopsis bassicola in vitro. En: Memorias del XVI Congreso Venezolano de Fitopatología. Lara Venezuela noviembre1999. p.72. ALCALÁ, D., N. VARGAS Y A. PIRE Efectos de extractos vegetales y funguicidas sintéticos sobre el crecimiento micelial in vitro de S. rolfsii y Thielaviopsis bassicola. Revista de la Facultad de Agronomía 1(4): 22. CASTELLANO, M Cátedra de Fitopatología. Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE), Sargento Cabral, 2131 (3400), Corrientes, Argentina. CUNDOM, M., G. MAZZA Y M. SILVA Selección de extractos vegetales con efecto fungicida y/o bactericida. Revista de Ciencia y Tecnología 1(2): BENNETT, R. N. Y R. M. WALLSGROVE Secondary metabolites in plant defense mechanisms. New Phytopathology, Philadelphia 127(4): BIANCHI, A., A. ZAMBONELLI, D. ZECHINI Y F. BELLESIA Ultrastructural studies of the effects of Allium sativum on phytopathogenic fungi in vitro. Plant Disease 81: BOWERS, J. Y J. LOCKE Effect of botanical extracts on the populations density of Fusarium oxysporum in soil and control of fusarium wilt in greenhouse. Plant Disease 84: FLORES, Y. Y Y. MÚJICA Evaluación de la actividad antagónica de dos especies del género Trichoderma sobre Sclerotium rolfsii Sacc aislado del tomate (Licopersicon esculentum (L) Miller) in vitro. En: Compendio de resúmenes del XVI Congreso Venezolano de Fitopatología. Lara, Venezuela Noviembre, p. 66. PA LA Z Ó N, I P rimer Curso Inte rnacional sobre la Protección Fi to s a n i ta ria en Plantaciones Frutales. CRIDA, Zaragoza, España. 16 pp. RONDÓN, A., Y. FLORES, E. SOTO Y Y. MÚJICA Control químico in vitro y en umbráculo del hongo causante de la pudrición blanca. Revista Universidad del Zulia (LUZ) 12(1): SINGH, U. P., H. B. SINGH Y R. B. SINGH The fungicidal effect of neem (Azadirachta indica) extracts on some soil-borne pathogens of gram (Cicer arretinum). Micology 72: STAUFFER, A., A. ORREGO Y A. AQUINO Evaluación de extractos vegetales para el control de patógenos. Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Protección Vegetal, Div. Fitopatología, Universidad Nacional de Asunción, Paraguay.

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