Sergio Crespo, Mariela Rivera, Idupulapati Rao, Jaime Eduardo Muñoz Florez y Ligia Carmenza Muñoz Florez

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Emilio Sosa Cabrera
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1 Sergio Crespo, Mariela Rivera, Idupulapati Rao, Jaime Eduardo Muñoz Florez y Ligia Carmenza Muñoz Florez

2 Introducción El fríjol tepari, P. acutifolius, es originario del norte de Mexico y el sur de Estados Unidos. Se considera una especie muy prometedora frente al cambio climático. Posee características de gran interés como resistencia a múltiples enfermedades, a insectos. Presenta altos niveles de tolerancia a estrés por sequía, a altas temperaturas y a la salinidad (Muñoz et al. 2006; Rao et al., 2013).

Se considera una especie muy prometedora frente al cambio climático.

3 Introducción El fríjol tépari presenta una baja diversidad genética, principalmente en las formas cultivadas (Muñoz et al., 2006; Jiménez G. y Acosta G. 2012) Se inició un programa de inducción de mutagénesis con metanosulfonato de etilo (EMS) en el marco del proyecto «Heat effects on tepary bean and relatives» financiado IAEA (Viena).

2012) Se inició un programa de inducción de mutagénesis con metanosulfonato de etilo

4 Introducción La polinización y la fecundación son características fundamentales para los procesos de fitomejoramiento y producción de cultivos (Frankel y Galun, 1977) Las fallas en la formación y desarrollo del polen son una causa primaria de inviabilidad de especies o híbridos (Lagos et al., 2005)

cultivos (Frankel y Galun, 1977) Las fallas en la formación y desarrollo

5 Objetivos Objetivo general Determinar si existen efectos de los tratamientos de riego/sequía e inóculos de rizobio en condiciones de alta temperatura en la viabilidad del polen de 6 genotipos mutantes M5 y dos parentales de P. acutifolius. Objetivos específicos Estimar el porcentaje de viabilidad y la densidad de polen como indicativo de la producción de polen. Correlacionar los resultados con los tratamientos del ensayo y con otras variables morfofisiológicas Estandarizar un método eficiente, preciso y confiable para la determinación de la viabilidad del polen mediante el uso del Software ImageJ

Objetivos específicos Estimar el porcentaje de viabilidad y la densidad de polen como indicativo de la producción de polen.

6 Materiales y métodos Este estudio se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira. Se evaluaron 6 genotipos mutantes de fríjol tepari * de la generación M5 (M53P2R2, M53P4R2, M118, M191, M205 y M304) y 2 parentales (G40068 y G40159) provenientes de un ensayo de resistencia a alta temperatura realizado en un invernadero del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) y que tenía un diseño de parcelas subdivididas con 3 repeticiones. * Mutagenesis: Metanosulfonato de etilo, EMS.

Se evaluaron 6 genotipos mutantes de fríjol tepari * de la generación M5 (M53P2R2, M53P4R2, M118, M191, M205 y M304) y 2 parentales

7 Materiales y métodos Tratamientos Parcela: Ambiente o Condición de humedad de suelo Sequía: Inducción a sequía 12 días después de la siembra, se mantuvo a 40% de capacidad de campo. Riego: Se mantuvo a 80% de capacidad de campo. Subparcela: Cepa de rizobios CIAT461: Bradyrhizobium sp. CIAT899: Rhizobium tropici Sin inóculo. Subsubparcela: Genotipos Mutantes M53P2R2, M53P4R2, M118, M191, M205 y M304 parentales G40068 y G40159

Riego: Se mantuvo a 80% de capacidad de campo. Subparcela: Cepa de rizobios CIAT461: Bradyrhizobium sp.

8 Materiales y métodos Figura 1. Ensayo de P. acutifolius mutantes M5 sembrados en los invernaderos del CIAT. Se colectó dos botones florales por planta, y se evaluaron 128 materiales.

9 Materiales y métodos Esquema general del método de estimación de la viabilidad polínica en mutantes de P. acutifolius Colecta de botones florales Montaje de placas Fotografía de placas Conteo de polen en Imagej Análisis de resultados

acutifolius Colecta de botones florales Montaje de placas

10 Materiales y métodos Colecta de botones florales Los botones se colectaron entre los 25 y 35 días después de la siembra. Los botones fueron almacenados a 4 C en frascos plásticos con una solución 3:1 de etanol/ácido acético.

11 Materiales y métodos Figura 2. Vista estereoscópica de Un botón floral de P. acutifolius. (entre 5 y 9mm de longitud).

12 Materiales y métodos Figura 3. El proceso de montaje de placas para la evaluación: 1. Disección del botón floral 2. Macerado y tinción con carmín acético al 2% 3. Adición de 75µl de agua para generar una suspensión de polen 4. Aplicación de la muestra con micropipeta y secado 5. Sellado de las placas permanentes con resina.

Disección del botón floral 2. Macerado y tinción con carmín acético al 2% 3.

13 Materiales y métodos Figura 4. Microscopio Axio Lab A1 con cámara AxioCam Cr1 de Carl Zeiss donde se tomaron las fotos de las muestras de polen, con ayuda del software ZEN.

14 Materiales y métodos Determinación de la viabilidad Figura 5. Método secuencial en que se obtuvo las fotografías de campos ópticos sin repetición. Con el objetivo de 5x, cada fotografía abarca un área de 5mm 2

15 Figura 5.1. Nueve microfotografías de polen (5x, Ph1), del ID1 correspondiente a un M53P4R2 con cepa CIAT461 y tratamiento sequía. 2mm

16 Figura 6. Microfotografía individual de polen (10x, Ph1). Se distingue el polen viable bien teñido con el carmín acético (2%) y no viable no teñido (flechas rojas). ID24. M53P4R2, CIAT899, Sequía

17 Materiales y métodos a b c Figura 7. Microfotografías de a. Polen no viable (40X) del ID1 (M53P4R2,CIAT461, Sequía) b. Polen viable (40X) del ID136 (G40159,Sin inóculo, Riego) y c. Polen no viable (100X) ID165 de la generación M2.

18 Materiales y métodos Figura 8. Conteo manual en el software ImageJ con el plugin Cell Counter. Los datos de número de polen viable y polen no viable aparecen en el cuadro rojo. El conteo mínimo fue de 500 granos de polen por botón floral.

19 Materiales y métodos Variables A partir del conteo se obtuvo dos variables para el análisis de viabilidad: -Porcentaje de viabilidad %viabilidad = No. granos de polen viable No. total de granos de polen 100 -Densidad (No. granos de polen/mm 2 ) Densidad = No. total de granos polen (No. de campos Área de campo)

granos de polen viable No. total de granos de polen 100 -Densidad (No.

20 Resultados y discusión a b Figura 9. Diagrama de cajas de distribución del porcentaje de viabilidad de acuerdo a: a. cepa x condición de humedad y b. genotipo. En ambos casos se puede observar que el porcentaje de viabilidad se mantuvo por encima del 90%

de acuerdo a: a. cepa x condición de humedad y b. genotipo.

21 Resultados y discusión a b c Figura 10. Diagrama de barras del porcentaje de viabilidad de los 8 genotipos evaluados en riego (negro) y sequía (rojo) con la cepa a. CIAT461 b. CIAT899 y c. sin inóculo.

22 Resultados y discusión a b Figura 11. Diagrama de cajas de distribución de la densidad de polen (No. polen/mm 2 ) de acuerdo a: a. cepa x condición de humedad y b. genotipo. Se observan que la mayor densidad de polen aparece en el tratamiento sin inóculo y en condición de riego y en el genotipo G40068

23 Resultados y discusión a b c Figura 12. Diagrama de barras de la densidad de polen en los 8 genotipos evaluados en riego (negro) y sequía (rojo) con la cepa a. CIAT461 b. CIAT899 y c. sin inóculo.

24 Resultados y discusión Tabla 1. Análisis de Varianza (Significancia) para %Viabilidad, Densidad de polen (No granos/mm 2 ), Peso de semillas (g/pl) y temperatura hoja ( C) Parámetros Viabilidad Densidad Peso Temperatura GL Polen Polen Semilla Hojas Rep (R ) 2 Ambiente (A ) 1 * * ** R A 2 Cepa (C ) 2 * *** A C 2 *** R C (A ) 8 Genotipo (G ) 7 ** A G 7 C G 14 A C G 14 * *, **, *** Niveles de significancia al 0.05, 0.01, respectivamente

25 Resultados y discusión Tabla 2. Coeficientes de correlación (Pearson) entre viabilidad, densidad de polen y peso de semillas con otras variables morfofisiológicas. Parámetros Viabilidad polen (%) Densidad polen Peso de semillas % No granos/mm 2 Gramos/pl Riego Sequía Riego Sequía Riego Sequía Peso Semillas /Pl No Vainas /Pl * 0.79*** 0.78*** No Semillas /Pl *** 0.92*** No Semillas /Vainas *** 0.47*** Peso 100 Semillas *** -0.48*** Peso Vainas /Pl 0.26* *** 0.67*** No Nódulos /Pl * 0.31* Peso Nódulos /Pl * Peso Tallos /Pl *** 0.35** Peso Raíces /Pl Clorofila (SPAD) ** Conductancia estomática (mmol/m 2 /s) Temperatura Hojas ( o C) -0.24* -0.22* 0.32* *** -0.29* Densidad de polen (No/mm 2 ) 0.33** *, **, *** Niveles de significancia al 0.05, 0.01, respectivamente

26 Conclusiones El porcentaje de viabilidad del polen del fríjol tepari se mantuvo en general por encima del 90% lo que indica una alta viabilidad Hubo una ligera reducción en la densidad de polen en los mutantes respecto a sus parentales G4068 y G40159 (Fig.11). El porcentaje de viabilidad se vió afectado por la condición de humedad, mientras que la densidad del polen estaba más relacionada con la cepa del inóculo (Tabla 1). La cepa CIAT899 generó en algunos casos mayor densidad que la cepa CIAT461 y sin inóculo (Fig.12).

27 Conclusiones Probablemente en los genotipos evaluados la respuesta al estrés de la viabilidad del polen, esté dada en mayor medida por una la baja producción de granos de polen, y no en la disminución del porcentaje de viabilidad. La evaluación de la modificación al método montaje de placas y conteo mediante ImageJ lo caracteriza como una alternativa eficiente y precisa para la evaluación de la viabilidad del polen.

28 Bibliografía Frankel R and Galun E Pollination mechanisms, reproductionand plant breeding. Springer-Verlag, New York. 281 p. Jiménez Galindo JC and Acosta Gallegos JA Characterization of creole genotypes of tepary bean (Phaseolus acutifolius A. Gray ) and common (Phaseolus vulgaris L.) under rainfed. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas, 3(8), Lagos TC, Caetano CM, Vallejo FA, Muñoz JE, Criollo H and Olaya C Caracterización palinológica y viabilidad polínica de Physalis peruviana L. y Physalis philadelphica Lam. Agronomía Colombiana. 23(1) Muñoz LC, Duque MC, Debouck DG and Blair MW Taxonomy of Tepary Bean and Wild Relatives as Determined by Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) Markers. Crop Science, 46(4), Rao IM, Beebe S, Ricaurte J, Cajiao C, García R and Rivera M Can Tepary bean be a Model for improvement of Drought Resistance in Common bean?. African Crop Science Journal. Vol 21, No 4, pp

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