LORENA CURVELO GUTIERREZ JULIAN ALONSO ROJAS BARRETO

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1 REVISION PRELIMINAR DE MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS EN ESTUDIOS DE MICROORGANISMOS DE LOS PHYLUMS ASCOMYCETES, DEUTEROMYCETES Y OOMYCETES COMO AGENTES CAUSANTES DE ENFERMEDADES EN PLANTAS LORENA CURVELO GUTIERREZ JULIAN ALONSO ROJAS BARRETO PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL-MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA BOGOTÁ

2 REVISION PRELIMINAR DE MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS EN ESTUDIOS DE MICROORGANISMOS DE LOS PHYLUMS ASCOMYCETES, DEUTEROMYCETES Y OOMYCETES COMO AGENTES CAUSANTES DE ENFERMEDADES EN PLANTAS LORENA CURVELO GUTIERREZ JULIAN ALONSO ROJAS BARRETO TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar los títulos de Microbiólogo Agrícola y Veterinario y Microbiólogo Industrial DIRECTORA MARIA CLEMENCIA FORERO DE LA ROTTA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL-MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA BOGOTÁ

3 NOTA DE ADVERTENCIA La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia. Artículo 23 de la Resolución No. 13 de julio de

4 RECOPILACION DE MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS EN ESTUDIOS DE MICROORGANISMOS DE LOS PHYLUMS ASCOMYCETES, DEUTEROMYCETES, OOMYCETES COMO AGENTES CAUSANTES DE ENFERMEDADES EN PLANTAS LORENA CURVELO GUTIERREZ JULIAN ALONSO ROJAS BARRETO APROBADO Ma. Clemencia Forero de la Rotta, Ing. Agrónoma M.Sc. Fitopatologia Directora David Gómez Méndez Microbiólogo M.Sc. Jurado PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL-MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA BOGOTÁ

5 REVISION PRELIMINAR DE MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS EN ESTUDIOS DE MICROORGANISMOS DE LOS PHYLUMS ASCOMYCETES, DEUTEROMYCETES, OOMYCETES COMO AGENTES CAUSANTES DE ENFERMEDADES EN PLANTAS LORENA CURVELO GUTIERREZ JULIAN ALONSO ROJAS BARRETO APROBADO Ingrid Schuler García, Ph.D Decana Académica Facultad de Ciencias Janeth Arias Palacios, MSc. Directora Carreras de Microbiología PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL-MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA BOGOTÁ

6 TABLA DE CONTENIDO RESUMEN INTRODUCCION JUSTIFICACION MARCO TEORICO LOS HONGOS FITOPATOGENOS CARACTERISTICAS GENERALES NUTRICION Y CRECIMIENTO ESTRUCTURAS SOMATICAS REPRODUCCION CLASIFICACION TAXONOMICA CLASIFICACION DE LOS HONGOS FITOPATOGENOS HONGOS INFERIORES HONGOS SUPERIORES Características y estructuras de los hongos inferiores Phylums, Oomycetes y Zygomycetes Características y estructuras de los hongos superiores Subdivisión DEUTEROMYCOTINA Subdivisión ASCOMYCOTINA CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO OBJETIVOS Objetivo General Objetivos Específicos METODOLOGIA RESULTADOS MEDIOS PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS A PARTIR DE SEMILLAS MEDIOS PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS A PARTIR DE SUELO Y AGUA MEDIOS DE USO GENERAL MEDIOS SELECTIVOS PHYLUM Oomycetes PHYLUM Ascomycetes PHYLUM Deuteromycetes CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFIA

7 13. ANEXOS RESUMEN Como consecuencia del apoyo que se ha venido desarrollando a la investigación sobre fitopatología en Colombia se ha venido experimentando en los últimos años un acelerado crecimiento del interés por los hongos causantes de enfermedades en cultivos de importancia económica en Colombia. En este proceso, proyectos fomentados por varias instituciones como el ICA, CORPOICA, universidades entre otras instituciones han incrementado este interés y han aumentado el número de especies de hongos que hoy en día están siendo estudiadas. Para este proceso de investigación se han tenido en cuenta los diferentes aspectos que intervienen en el establecimiento de los cultivos, para convertirla en una actividad productiva, capaz de competir con las actividades productivas tradicionales. En este sentido en varios proyectos se consideran de importancia los esfuerzos hechos en el campo de la agricultura, con un estudio fitosanitario de varias especies de plantas. Algunos de ellos abarcaron el reconocimiento de plagas y enfermedades, presentes en los distintos estados del desarrollo de las plantas, desde la etapa de semillas y viveros hasta la fase productiva ya cadenas de comercialización. Estas investigaciones contemplan garantizar el éxito de las inversiones que se realizan en el establecimiento de los cultivos. Se ha sabido que a medida que aumenta las poblaciones de una especie en cultivo, también aumenta el riesgo de la presencia de plagas o enfermedades que interfieren en la actividad. Mediante diferentes observaciones e inquietudes planteadas en diferentes investigaciones en el campo fitopatológico se ha considerado necesario recopilar la información que se presenta sobre los medios de cultivo que se han empleado en estudios de microorganismos peretenecientes a los phylums Ascomycetes, Deuteromycetes y Oomycetes como agentes causantes de enfermedades en plantas, con el fin de facilitar al investigador el estudio de estos hongos; por otro lado se espera que a través del tiempo se puedan 7

8 recopilar, complementar y mantener actualizada la información sobre los diferentes medios de cultivo que son de uso común y específicos en estudios sobre los agentes causantes de enfermedades en las plantas. Se espera que este documento sea el punto partida para una herramienta de gran utilidad, tanto para el investigador, docente que se dedica al estudio de enfermedades de cultivos de importancia económica en Colombia quienes actúan como observadores para atender las necesidades del productor. 1. INTRODUCCION Los hongos son los mayores causantes de pérdidas en cultivos de interés económico en Colombia, por lo tanto de ahí se deriva la importancia del su estudio de su estudio, de manera que sea posible realizar aislamientos que permitan su óptimo crecimiento y conocer sus características fisiológicas y biológicas, utilizando no solamente medios que permitan su crecimiento micelial sino promover la formación de sus estructuras reproductivas que faciliten no solamente su identificación, sino también estudiar su comportamiento durante el proceso de interacción entre la planta y el ambiente, mediante el uso de medios específicos. Entre las causas principales de enfermedades en las plantas están los factores abióticos como la humedad, luz, temperatura, oxígeno, ph y nutrientes, y bióticos como bacterias, hongos, virus, protozoos, nematodos, insectos y otras plantas parasitas. Estos últimos factores causan daños en cualquier estructura de la planta (raíz, tallo, hojas, flores o fruto), ocasionando enfermedades como pudrición de la raíz, manchas foliares, tizones, royas, carbones y antracnosis, entre otras. 8

9 A diferencia del trabajo con las bacterias, sólo mediante la observación directa de las características del hongo y su inoculación posterior en la planta sana, podemos identificar el agente causante de una enfermedad fungica. Los hongos fitopatogenos han sido observados haciendo raspados o cortes finos de los tejidos afectados, para la identificación y clasificación taxonómica muchas veces se hace necesario aislarlos y estudiarlos posteriormente en el laboratorio. Una de las tareas más importantes y necesarias para el investigador es lograr el cultivo puro de un hongo, ya sea para su diagnostico o para el estudio de patogenicidad generada en la planta, o para evaluar la resistencia varietal de un cultivo en cuestión. La tarea se dificulta por la abundancia de microorganismos que a menudo presentan requerimientos nutricionales similares. Al realizar el aislamiento de un hongo, aparecen frecuentemente muchos organismos no deseados que ejercen una actividad negativa sobre los aislamientos por competencias no deseadas para el organismo de interés, ya que otros organismos se desarrollan en los medios de aislamiento con mayor rapidez por ser menos exigentes en su alimentación, mientras que los patógenos no se desarrollan o lo hacen con dificultad. Para restringir el desarrollo de microorganismos no deseados, se han desarrollado inhibidores que permitan disminuir su actividad, tales como la modificación del ph y los niveles de sustancias nutritivas en el medio, o la adición de antibióticos, sustancias tóxicas entre otros. La ausencia de una guía que permita recopilar toda la información acerca de los medios de cultivo usados en la identificación de hongos patógenos, es el objetivo principal para la realización de esta revisión preliminar. Este 9

10 documento realiza una revisión bibliográfica de manera que logra compilar algunos medios de cultivo más importantes así como la composición, preparación y empleo orientado hacia el cultivo, aislamiento e identificación de los principales hongos patógenos que afectan cultivos de importancia económica en Colombia. El presente trabajo reúne y cita brevemente en la primera parte las características generales de los hongos patógenos como su nutrición y crecimiento, estructuras somáticas y reproducción, así como también su clasificación taxonómica. En la segunda parte se presentan las características de los medios de cultivo de uso común, algunos de los usados para el aislamiento de microorganismos que se encuentran en semillas, agua y en la tercera y última parte se incluyen los medios correspondientes para los principales patógenos que ocurren sobre cultivos especies cultivadas de importancia económica. A este manual se recurrirá para la consulta de medios generales y específicos de hongos fitopatógenos que puedan darnos precisión al diagnostico de las enfermedades de las plantas, así como para los procedimientos de preparación que se lleven a cabo en el laboratorio para el aislamiento y será un aporte para todas las personas interesadas en el área de la fitopatología. 2. JUSTIFICACION El diagnostico de laboratorio es esencial para la determinación de la enfermedad y necesario cuando se trata de establecer la identidad de un agente causal. Los medios de cultivo constituyen una parte importante en el 10

11 análisis, ya que permiten el aislamiento y el cultivo de los agentes causales de enfermedades. Actualmente en los laboratorios de investigación y de análisis de muestras no se cuenta con una recopilación general de recursos bibliográficos sobre los medios de cultivo de interés en el área de la fitopatología, es así como surge este compilación el cual colecciona toda la información acerca de los medios de cultivos específicamente de los microorganismos pertenecientes a los phylums Ascomycetes, Deuteromycetes y Oomycetes causantes de grandes pérdidas en cultivos de importancia económica en nuestro país. El presente trabajo pone a disposición de los profesionales, fitopatólogos, técnicos, estudiantes y entidades de apoyo un instrumento que sirva de orientación y que sea material de consulta sobre los medios de cultivo que existen y son utilizados para el aislamiento de hongos fitopatógenos de importancia en Colombia. 3. MARCO TEORICO 3.1. LOS HONGOS FITOPATOGENOS Los hongos y las bacterias son los dos principales grupos de organismos cuya forma de vida predominante es saprofita y que obtienen sus nutrientes por la secreción de enzimas extracelulares en el medio en que se desarrollan. En la mayoría de los casos, son incapaces de atacar a organismos vivos debido a la presencia de barreras físicas o químicas. Sin embargo, algunos han superado esas barreras y pueden atacar a plantas o animales vivos. Los hongos, con su amplia gama de enzimas degradadoras de carbohidratos, son más importantes 11

12 en las plantas, mientras que las bacterias, la mayoría de las cuales muestran una mayor efectividad en la degradación de las proteínas, son más importantes como patógenos de animales. Los hongos son quizá aún los fitopatógenos más importantes, aunque con el desarrollo de fungicidas eficientes y variedades resistentes están adquiriendo una importancia similar a los virus, que rara vez pueden controlarse mediante cualquier método, (Manners, 1996) CARACTERISTICAS GENERALES Los hongos constituyen un grupo de microorganismos carentes de clorofila, pero recuerdan a las plantas verdes ya que generalmente tienen una pared celular y son inmóviles, aunque algunos pueden presentar células reproductivas móviles, la mayoría de hongos se reproducen mediante esporas. Sin embargo, no poseen tallos, raíces ni hojas, ni presentan un sistema vascular desarrollado como tienen las plantas superiores. Los hongos son generalmente filamentosos y casi todos multicelulares, además sus núcleos pueden ser observados con facilidad. Sus estructuras somáticas, con algunas excepciones, tienen una ligera diferenciación y prácticamente no presentan división en sus funciones. (Manners, 1996). Los filamentos que constituyen el cuerpo de los hongos aumentan de tamaño por crecimiento apical, lo que los diferencia de las bacterias. Estos filamentos pueden ser septados o no y se les denomina hifas, las cuales al agruparse constituyen el micelio. La composición de la pared celular es muy variable en los diferentes hongos y algunas veces aun en el mismo individuo en diferentes fases de su ciclo vital. Los principales componentes de la pared son varios tipos de carbohidratos: 12

13 celulosa, pectosa, callosa, quitina, etc. los cuales pueden presentarse solos o mezclados entre ellos o con otras sustancias. La presencia de celulosa, la cual predomina en los hongos inferiores, puede ser detectada por tratamiento con cloroioduro de zinc, pero algunas veces la reacción queda encubierta porque tienen ciertos depósitos de lípidos en la parte exterior de la célula, los cuales deben disolverse primero, como sucede en Monoblepharia. (Manners, 1996). En los hongos Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes, y los más evolucionados de Ficomycetes, no se detecta celulosa en la pared celular pues esta ha sido reemplazada por otros carbohidratos, principalmente quitina, que la cual se encuentra acompañada de otros componentes formando así la pared celular. Además, pueden presentarse otras sustancias como carbonato de calcio y otras sales. (Manners, 1996) NUTRICION Y CRECIMIENTO Los hongos obtienen sus alimentos propagándose en organismos vivos, como parásitos, o descomponiendo la materia orgánica como saprofitos. La mayoría de los hongos conocidos, sean estos parásitos o no, son capaces de vivir sobre materia orgánica muerta, como lo muestra el hecho de que pueden ser cultivados artificialmente sobre medios sintéticos. Los hongos que viven sobre materia orgánica muerta y que son incapaces de infectar tejidos vivos se denominan saprofitos obligados. Aquellos capaces de causar enfermedades o de vivir sobre materia orgánica muerta, de acuerdo con las circunstancias, se denominan parásitos facultativos o saprofitos facultativos, 13

14 según prevalezca un estado u otro, y los que solo pueden vivir de protoplasma vivo, parásitos obligados. (Manners, 1996). El organismo infectado por un parasito es conocido como hospedante. Es probable que cuando se sepa más acerca de la fisiología de los hongos seremos capaces de idear medios sintéticos sobre los cuales crezcan los llamados parásitos obligados. Los hongos difieren de las plantas verdes en que requieren alimentos elaborados para vivir y son incapaces de fabricarlos ellos mismos. Los diferentes hongos tienen distintos requerimientos de alimentos. Algunos son omnívoros y pueden subsistir sobre cualquier cuerpo que contenga materia orgánica; otros son más estrictos en su dieta y unos pocos los parásitos obligados- no solo requieren protoplasma vivo para alimentarse sino que son altamente especializados para las especies plantadas y aun para las variedades del hospedante que parasitan. (Manners, 1996). Las superficies de las hojas y otras partes de las plantas portan trazas de nutrientes exudados de las células epidérmicas. Cuando los saprofitos son capaces de crecer sobre estas porciones se dice que son epifilos, los cuales producen trastornos al vegetal o reducen el porcentaje de luz aprovechable por este para la fotosíntesis y dificultan el intercambio gaseoso, como sucede con el género Capnodium. (Manners, 1996). A veces resulta una intima asociación entre el hongo y la planta, beneficiándose ambos; esta condición se llama simbiosis o parasitismo controlado. Ejemplo de esto son los líquenes y las micorrizas. (Mayea y Padrón, 1983). 14

15 Un gran número de plantas en condiciones naturales presenta esta última asociación, a la cual el hongo brinda una mayor capacidad para extraer sustancias minerales deficitarias en el suelo con más eficacia que las raíces de la propia planta. Si realizamos un corte a una de estas estructuras, podremos ver muchas hifas intercelulares y micelios externos bien desarrollados que son las micorrizas exotróficas. En otras pueden observarse las hifas sólo en el interior de las células como por ejemplo, Rhizoctonia sp. en las orquídeas, cuyas micorrizas se denominan entonces, endotroficas. Cuando se forman masas muy ramificadas con vesículas en las células corticales más viejas tenemos la micorriza arbuscular-vesicular. (Mayea y Padrón, 1983). El equilibrio entre la condición de enfermedad o el mutuo beneficio es controlado por condiciones externas. Se han hallado micorrizas aun en las Pteridophytas fósiles, (Mayea y Padrón, 1983) ESTRUCTURAS SOMATICAS El talo de los hongos consiste típicamente en hilos o filamentos microscópicos, los cuales se ramifican en todas las direcciones. Cada uno de estos filamentos es conocido como hifa, la cual es tubular y esta hecha de una pared fina, transparente a partir de una capa de protoplasma que varía en grosor. Dependiendo de las especies, el protoplasma puede ser continuo o puede ser interrumpido a intervalos irregulares por paredes trasversales, las cuales dividen la hifa en células. Las paredes trasversales son llamadas septos. En las formas septadas, los protoplasmas de cada lado de un septo están conectados por medio de un poro central. Las hifas que no tienen septos son llamadas aseptadas, cenocíticas o continuas. Comúnmente se encuentran vacuolas, 15

16 gotitas de grasa y otras inclusiones en el citoplasma. La masa de hifas que constituye el talo de un hongo es llamado micelio. El micelio de algunos hongos superiores puede dar lugar a cuerdas gruesas, los rizomorfos, donde las hifas pierden su individualidad y forman tejidos complejos que exhiben una división del trabajo. Esta masa en forma de cuerda, tiene una corteza gruesa, dura y un extremo de crecimiento cuya estructura recuerda el ápice de una raíz. (Manners, 1996). Los rizomorfos son resistentes a condiciones adversas y permanecen latentes hasta que vuelven las condiciones normales. El crecimiento se reanuda entonces y el rizomorfo alcanza una gran longitud dentro del hospedante desarrollándose entre las células (intercelular) o penetrando en ellas (intracelular). Las hifas intracelulares de muchos hongos, especialmente de los parásitos obligados de plantas, obtienen nutrientes a través de haustorios, órganos de absorción especializados, que el hongo introduce en las células de la planta hospedante a través de un pequeño poro abierto en la pared celular. Los haustorios son excrecencias de las hifas somáticas y pueden adoptar la forma de nudo, de lanza o ser ramificados. (Manners, 1996). Las hifas de los hongos saprófitos se ponen en íntimo contacto con el sustrato y obtienen los alimentos por difusión directa a través de las paredes hifales, y causan la desintegración de la materia orgánica que utilizan para su nutrición. El micelio de un hongo comienza generalmente como un tubo germinativo corto que emerge de una espora en germinación. Las esporas son pequeñas unidades de propagación producidas por muchos hongos, y sirven para la perpetuación de la especie. (Manners, 1996). 16

17 Durante ciertos estados del ciclo de vida de muchos hongos, el micelio se organiza en tejidos flojos o compactamente trenzados, que se distinguen de las hifas sueltas que ordinariamente componen el talo. Se usa el término plecténquima para designar todos los tejidos fungosos y, dentro de él, existen dos tipos generales: prosénquima flojamente entrelazado, en el que las hifas componentes quedan más o menos paralelas y sus células típicamente alargadas se distinguen fácilmente como tales y el pseudoparénquima, que consiste en un tejido formado por células más o menos isodiamétricas u ovales, agrupadas estrechamente, que recuerdan las células del parénquima de las plantas superiores. En este tipo de tejidos fungosos las hifas han perdido su individualidad, y no son fácilmente distinguibles como tales. (Agrios, 2005) El prosénquima y el pseudoparénquima componen varios tipos de estructuras somáticas y reproductivas que aparecen en muchos hongos: el estroma y el esclerocio. Un estroma es una estructura somática compacta y similar a un colchón sobre la cual se forman usualmente las fructificaciones, y el esclerocio un cuerpo de reposo, resistente a condiciones desfavorables, que pueden permanecer latente por largos periodos y germinar cuando se reanuden las condiciones favorables, (Mayea et al, 1983 y Agrios, 2005) REPRODUCCION Los hongos se reproducen principalmente mediante esporas. Las esporas son estructuras reproductoras o especializadas para la propagación del hongo, que constan de una o varias células. Estas estructuras pueden formarse asexualmente (mediante la separación de pequeños fragmentos del micelio en esporas) o ser el resultado de un proceso sexual. (Agrios, 2005) 17

18 En los hongos inferiores, las esporas asexuales se forman en el interior de un saco denominado esporangio y son diseminadas en el momento en que se rompe esta estructura o a través de una abertura que posee. Algunas de esas esporas se mueven mediante flagelos y se les denomina zoosporas; otras esporas asexuales denominadas conidios se desprenden de las células terminales o laterales de hifas especializadas denominadas conidióforos. En algunos hongos, las células intercalares o terminales de una hifa se alargan, están rodeadas por una pared densa y se separan para formar clamidosporas. En otros grupos de hongos, las esporas asexuales (conidios) se forman en el interior de estructuras de pared gruesa denominadas picnidios. (Agrios, 2005) La reproducción sexual, o los procesos que se asemejan a ella, se presentan en la mayoría de los grupos de hongos. En algunos de ellos, un par de células (gametos) de tamaño y forma semejante se fusionan y producen un cigoto, denominado zigospora. En otros grupos, los gametos son de tamaño distinto y al cigoto que forman se denomina oospora; algunos hongos, no se forman gametos definidos, y en lugar de ello un micelio se fusiona con otro micelio compatible. La Phylum Ascomycetes produce habitualmente ocho esporas sexuales en el interior del cigoto (el asca) y a esas esporas se les denomina ascosporas. Los hongos de la Phylum Basidiomycetes forman sus esporas fuera del cigoto (denominada basidio) y a esas esporas se les denomina basidiosporas. (Agrios, 2005) Hasta la fecha no se sabe que los hongos imperfectos (Phylum Fungi Imperfecti) se reproduzcan sexualmente, debido a que este fenómeno no se presenta en este amplio grupo de hongos o a que aun no se ha podido descubrir en ellos. 18

19 La fusión de los núcleos sexuales del cigoto genera un núcleo diploide (2N), las primeras divisiones de este núcleo son de tipo meióticas, de ahí que el hongo contenga núcleos haploides (1N) durante todo su ciclo de vida, excepto en el momento en que se han fusionado los núcleos gaméticos. Sin embargo, en algunos grupos de hongos, en particular en los basidiomycetes y en menor grado en los ascomycetes, las células de todo el micelio o de ciertas partes de él contienen un par de núcleos haploides, los cuales se mantienen separados en el interior de la célula. A dicho micelio se le denomina dicariótico, pero se comporta de manera bastante semejante a como lo hace un micelio diploide (en que ambos núcleos se mantienen fusionados). (Agrios, 2005) En la mayoría de los hongos, los gametos masculino y femenino se forman en un mismo micelio (como es el caso de los hongos hermafroditas). Cuando los gametos masculinos fecundan a los femeninos del mismo micelio, al hongo se le denomina homotálico. Sin embargo, en la mayoría de los casos, los gametos masculinos fecundan únicamente a los gametos femeninos de otro micelio sexualmente compatible por lo que se dice que el hongo es heterotálico, (Agrios, 2005) CLASIFICACION TAXONOMICA La clasificación de los hongos presenta innumerables dificultades, pero el estudiante principiante no necesita, por el momento, hacerse cargo de ellas. Es bueno aclarar que no todo esta establecido en micología, y que las diferencias de opinión entre los micólogos sobre la clasificación son tan numerosas y, a menudo, tan grandes, que en la literatura especializada se encontraran serias discrepancias. Tales diferencias de clasificación son originadas por las distintas 19

20 interpretaciones de los datos fragmentarios de que se dispone sobre la estructura, desarrollo y fisiología de los hongos, y habrá de continuar existiendo hasta que se cubran los claros de nuestro conocimiento. La taxonomía tiene un doble propósito: primero, nombrar los organismos de acuerdo con algún sistema internacionalmente aceptado, de manera que, del modo menos confuso, los micólogos puedan intercambiar sus observaciones sobre determinados hongos; segundo, indicar, tanto como sea posible, las mutuas relaciones de los hongos y también sus relaciones con otros organismos. A medida que aumenta el conocimiento, nuestra clasificación va cambiando; los nombres de los organismos permanecen no permanecen estables, ya que a medida que conocemos nuevos hechos acerca de los mismos, se hace necesario ir modificando nuestros conceptos sobre sus relaciones, lo que ha su vez demanda la reclasificación y el cambio de nombre, (Alexopoulos, 1996) CLASIFICACION DE LOS HONGOS FITOPATOGENOS Los hongos y Chromystas que producen enfermedades en las plantas constituyen un grupo diverso debido a su abundancia y diversidad, aquí solo se presentará una clasificación de algunos de los géneros, que son considerados en esta recopilación preliminar, sin tener en cuenta los biotrofos o parásitos obligados. patógenos mas importantes HONGOS INFERIORES Phylum: OOMYCETES. (Mohos acuáticos). Tienen un micelio alargado. Producen zoosporas en zoosporangios. Las oosporas se forman por la fusión de gametos morfológicamente distintos. (Alexopoulos, 1996). 20

21 Familia: Pythiaceae Géneros: Pythium produce el ahogamiento de las plántulas, pudrición de semillas y raíces y el tizón algodonoso de los céspedes. Phytophthora. P. infestans produce el tizón tardío o gota de la papa y otras especies que producen además de las pudriciones de la raíz, pudriciones en el tercio inferior de numerosas plantas y en algunos frutos. Phylum: ZYGOMYCETES. (Mohos del pan). Hongos terrestres. Producen esporas asexuales no móviles en esporangios. No forman zoosporas. Orden: Mucorales. Producen zigosporas. Las esporas asexuales no móviles se forman en esporangios terminales. Géneros: Rhizopus sp. produce la pudrición blanda de los frutos y hortalizas. Choanephora. C cucurbitarum produce la pudrición blanda de la calabaza (Alexopoulos, 1996) HONGOS SUPERIORES Phylum: ASCOMYCETES (Hongos de saco). Producen grupos de ocho esporas asexuales, denominadas ascosporas, en el interior de un saco denominado asca. SubPhylum: EUASCOMYCETES. Las ascas se forman en ascocarpos. Serie: PYRENOMYCETES (Hongos periteciales). Las ascas se forman en cuerpos fructíferos que presentan una abertura denominada ostiolo (peritecios). Orden: Sphaeriales sp. los peritecios poseen paredes firmes y colores oscuros. Géneros: Ceratocystis. C. ulmi produce la enfermedad del olmo Holandés. Diaporthe sp. produce el tizón de la vaina del frijol, la melanosis de los cítricos y la pudrición del fruto de la berenjena. Endothia. E. parasítica produce el tizón del castaño. Glomerella. G. cingulata produce manchas antracnosis y la pudrición amarga del manzano. Gnomonia sp. produce la antracnosis o mancha foliar de varias plantas. Rosellinia sp. produce las enfermedades de la raíz de la vid y de los árboles frutales. 21

22 Orden: Hypocreales. Los peritecios son de colores claros, rojos o azules. Géneros: Claviceps. C. purpurea produce el cornezuelo del centeno. Gibberella sp. ocasiona la pudrición del pie o tallo del maíz y de pequeños granos. Nectria sp. produce el cáncer del tallo y rama de los arboles. (Alexopoulos, 1996). Serie: PSEUDOSPHAEROMYCETES. (Hongos ascostromáticos). Presentan estromas en forma de peritecio que presentan ascas en cavidades separadas o en grandes cavidades. Orden: Myriangiales. Con cavidades dispuestas a varios niveles y que contienen ascas individuales. Género: Elsinoe sp. produce las antracnosis de la vid y de la frambuesa y la sarna de los cítricos. Orden: Dothideales sp.. Con cavidades dispuestas en una capa basal, las cuales contienen muchas ascas. Los peritecios carecen de pseudoparafisas. Géneros: Dibotryon. D. morbosum produce la modulación negra de las ramas en cerezos y ciruelos. Dothidella. D. ulei ocasiona la mancha foliar de los arboles del caucho. Guignardia. G. bidwellii produce la pudrición negra de las uvas. Mycosphaerella sp. produce las manchas foliares de muchas plantas. Orden: Pleosporales. Con cavidades dispuestas en una capa basal, las cuales contienen muchas ascas. Los peritecios presentan pseudoparafisas. Géneros: Ophiobolus. O. graminis produce la enfermedad del pie del trigo. Physalospora. P. obtusa produce la pudrición negra de las manzanas. Venturia. V. inaequalis ocasiona la roña de la manzana. Serie: DISCOMYCETES (Hongos de copa). Las ascas se forman en la superficie de apotecios carnosos en forma de copa o de plato. Orden: Helotiales. Las ascas liberan sus esporas a través de una perforación apical y circular. (Alexopoulos, 1996). Géneros: Coccomyces. C. hiemalis produce la mancha foliar del cerezo. Diplocarpon. D. rosae produce las manchas negras de las rosas. 22

23 Lophodermium sp. produce el tizón de las agujas del pino. Monilinia. M. fructicola produce la mancha parda de los frutos de hueso. Rhytisma. R. acerium produce la mancha alquitranada de las hojas de arce. Sclerotinia. S. sclerotiorum produce la pudrición blanda aguanosa de las hortalizas. Orden: Pezizales. Las ascosporas se liberan a través de una estructura en forma de tapa o cápsula que se localiza en la punta del asca. Género: Pseudopeziza. P. medicaginis produce la mancha foliar de la alfalfa. Phylum: FUNGI IMPERFECTI O DEUTEROMYCETES. (Hongos asexuales). Carecen de estructuras o reproducción sexual o no se sabe que las presenten. Orden: Sphaeropsidales. Las esporas asexuales se forman en picnidios. Géneros: Ascochyta. A. pisi produce el tizón del chícharo. Coniothyrium sp. produce el tizón del tallo de la frambuesa. Cytospora sp. ocasiona el cáncer del durazno y otros arboles (Valsa representa su etapa sexual). Diplodia. D. zeae produce la pudrición del tallo y la mazorca del maíz. Phoma. P. lingam ocasiona la pierna negra de las crucíferas. Phomopsis sp. produce el tizón y el cáncer del tallo de varios arboles. Phyllosticta sp. produce las manchas foliares de muchas plantas. Septoria. S. apii produde el tizón tardío del apio. Orden: Melanconiales. Las esporas asexuales se forman en un acervulo. Géneros: Colletotrichum ocasiona la antracnosis de muchas plantas de cultivo. Coryneum. C. beijerincki produce el tizón de los frutos de hueso. Cylindrosporium sp. produce manchas foliares en muchas Phylums de plantas. Gloeosporium sp. muy parecido a Colletotrichum sp.; produce antracnosis en muchas plantas. Marssonina sp. ocasiona el tizón de las ramas y hojas del álamo, la quemadura de las hojas de fresa y la antracnosis de los nogales. Melanconium. M. fuligenum poduce la pudrición amarga de la vid. 23

24 Sphaceloma sp. produce la antracnosis de la vid y de la frambuesa. Orden: Moniliales. Las esporas asexuales de forman sobre las hifas (o en su interior) del hongo que se encuentran expuestas libremente a la atmosfera. Géneros: Alternaria sp. produce manchas foliares y tizones en muchas plantas. (Alexopoulos, 1996). Aspergillus sp. produce la pudrición de las semillas almacenadas. Botrytis. B. cinérea produce el moho gris y los tizones de muchas plantas. Cercospora sp. una especie de este género produce el tizón temprano del apio. Cladosporium. C. fulvum produce el moho de las hojas del tomate. Fusarium sp. produce el marchitamiento y la pudrición de la raíz de muchas plantas anuales, así como el cáncer de arboles forestales. Fusicladium sp. produce la roña de la manzana (Venturia representa su etapa sexual). Graphium. G. ulmi produce la enfermedad del olmo holandés (Ceratocystis representa su etapa sexual). Helminthosporium sp. produce el tizón de los cereales y enfermedades de los céspedes. Penicillium sp. produce la pudrición de los frutos y otros órganos carnosos debido a los mohos azules. Pyricularia sp. produce el tizón del arroz y la mancha gris foliar de los céspedes. Thielaviopsis. T. basicola produce la pudrición negra de la raíz del tabaco. Verticillium produce la marchitez de muchas plantas anuales y perennes. Orden: Mycelia Sterilla. No se ha observado o es muy poco frecuente la formación de esporas asexuales o sexuales en este grupo de hongos. Géneros: Rhizoctonia sp. produce las pudriciones de la raíz de la corona de las plantas anuales y mancha parda de los céspedes (su etapa perfecta corresponde a Thanatephorus). Sclerotium sp. produce las pudriciones de la raíz y del tallo de muchas plantas (su etapa perfecta corresponde a Pellicularia sp.). 24

25 3.3. Características y estructuras de los hongos inferiores Phylums, Oomycetes y Zygomycetes Los hongos de la Phylum Oomycetes poseen un micelio cenocítico, alargado, producen zoosporangios con zoosporas que pueden ser piriformes o reniformes dependiendo del orden a que pertenezcan, y presentan dos flagelos de dos tipos, uno tipo látigo y el otro tipo pincel. Las esporas sexuales de reposo u Oosporas se forman por la fusión de dos gametos morfológicamente distintos, (Saldarriaga, 2001). Los hongos de la Phylum Zygomycetes tienen micelio cenocítico, muy ramificado compuesto por hifas alimentadoras e hifas reproductoras. La reproducción asexual se realiza mediante esporas no móviles producidas por esporangios, (Pérez, 1993). Su espora de resistencia es la Zygospora formada por la unión de dos gametos morfológicamente idénticos, (Agrios, 1995) Características y estructuras de los hongos superiores Subdivisión DEUTEROMYCOTINA La subdivisión Deuteromycotina comprende aquellos hongos que carecen de estructuras o reproducción sexual. Son considerados estados conidiales de la subdivisión Ascomycotina y raramente de la subdivisión Basidiomycotina, (Gonzalez, 1989). Poseen micelio septado, ramificado y frecuentemente abundante. Presentan varios tipos de cuerpos fructíferos como Acérvulos, Picnidios, Esporodoquio, Sinema formado por la unión de conidióforos, y también presenta conidióforos libres, (Barnett, 1972). Dentro de esta subdivisión se presenta la Phylum Agonomycetos o micelia esterilia cuyos 25

26 hongos no presentan conidias, ellos son Rhizoctonia y Sclerotium. El tipo de cuerpo fructífero es una de las características utilizadas para la clasificación taxonómica, (Finch y Finch, 1974) Subdivisión ASCOMYCOTINA La subdivisión Ascomycotina posee micelio septado, ramificado. Produce esporas en estructuras llamadas ASCAS. Presentan varios tipos de cuerpos fructíferos como Peritecios, Apotecios, Cleistotecios y Ascostromas, en ellos se encuentran las ascas con ascosporas generalmente en número de ocho. Una excepción a esto es el hongo Taphrina deformas que no forma cuerpo fructífero y las ascas se encuentran desnudas, (Hanlin, 1990) MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo son mezclas de sustancias que se usan para el aislamiento y desarrollo de hongos, bacterias y otros microorganismos. La mayoría de los hongos fitopatógenos se pueden cultivar de manera relativamente sencilla en medios adecuados. Sin embargo existen grupos de patógenos denominados parásitos obligados cuyo cultivo aún no se ha logrado a menos que se inoculen en plantas vivas. (Ríos, et.al 2008) CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo requieren de ciertas características mínimas para lograr exitosamente el desarrollo de los hongos y entre las más importantes se encuentran: 1. El medio deberá contener elementos nutritivos tales como: fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio, cobre y molibdeno. 26

27 También pueden ser necesarias algunas vitaminas y otras sustancias que se hallan presentes en los materiales naturales o artificiales que componen los medios. (Ríos, et.al 2008) 2. El medio no deberá deshidratarse fácilmente, por que se evita manejándolo en recipientes adecuados que además permitan su manejo en condiciones estériles es decir, evitando contaminaciones. El oxigeno es necesario en todos los casos por lo que deberá permitirse la aireación. Ya sea en las cajas de Petri o en tubos de cultivo. (Ríos, et.al 2008) 3. La mayoría de los medios de cultivo para hongos requieren esterilización antes de usarse, lo que generalmente se logra mediante calor húmedo usando autoclave. 4. La mayoría de los hongos crecen bien a temperatura de 20 a 35 o C, pero existe mucha variación entre grupos o especies. La temperatura óptima para el desarrollo de la enfermedad que causen puede servir como punto de referencia para la temperatura de incubación del hongo en el medio de cultivo. 5. La mayoría de los hongos crecen bien a ph de 5 a 6, pero hay excepciones. La temperatura y/o ph óptimo para la esporulación puede ser distinto que para el crecimiento del micelio. En ocasiones es conveniente agregar pequeñas cantidades de ácido láctico para eliminar bacterias contaminantes en el medio, pues estas generalmente no toleran la acidez, permitiendo el crecimiento fungico. 6. El crecimiento del micelio y sobre todo la esporulación de los hongos en el medio, esta muy influido por la luz. Muchos hongos esporulan 27

28 fácilmente sin necesidad de luz artificial o aun en plena oscuridad, pero otros requieren condiciones especiales de calidad y de luz. Este factor puede ser clave cuando se requieren altas cantidades de esporas con fines de investigación o para identificar alguna especie en particular. El medio de cultivo sustituye parcialmente las propiedades nutricionales del hospedante o sustrato natural del hongo a cultivar. La utilidad del medio es proporcionar energía al microorganismo, para que desarrolle en la forma más normal posible. (Ríos, et.al 2008) Por su composición nutritiva los medios de cultivo pueden ser: 1. Medios naturales. Están compuestos por materiales enteramente naturales, tales como partes de plantas, malta, levadura etc se requieren en forma de extractos o simplemente esterilizando las partes vegetales con calor u otro método. Aunque se usan poco, pueden ser superiores a otros medios sobre todo en el caso de hongos de difícil esporulación. 2. Medios semisintéticos. Están compuestos parcialmente por materiales naturales y sintéticos, el ejemplo mas común es el de agar papa dextrosa, agar V8, agar harina de maíz, son los más usados. 3. Medios sintéticos. Se conoce perfectamente su composición, ejemplo medio de Komada, para Fusarium oxisporum, por su consistencia los medios de cultivo pueden ser: 28

29 a) Sólidos. Contienen agentes solidificantes principalmente el agar, proporción de 1 a 3%, el agar esta compuesto por una mezcla de carbohidratos complejos y se obtiene a partir de algas. b) Semisólidos. Aunque generalmente se usan poco en micología, estos se obtienen bajando la concentración del agar o usando gelatina como agente solidificante. c) Líquidos. Se preparan sin agente solidificante. Se usan principalmente para obtener altas concentraciones de esporas, ejemplo: papadextrosa. (Ríos, et.al 2008) 4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo General Elaborar una recopilación de medios de cultivo de interés en la identificación de hongos fitopatógenos mediante revisión de literatura en el área de la fitopatología Objetivos Específicos Realizar la selección de los hongos fitopatógenos de importancia en Colombia teniendo en cuenta su clasificación taxonómica. Seleccionar los medios de cultivo de uso más común como también de medios específicos dentro de la práctica en el reconocimiento de hongos causantes de enfermedades. 29

30 Determinar la composición, preparación y empleo de cada uno de los medios seleccionados para el estudio fitopatológico. 5. METODOLOGIA Como fuente inicial de consulta se revisaron algunos manuales de medios de cultivo de varios autores, que recopilan composiciones, para diferentes microorganismos de acción patogénica, en referencias extraídas de revistas internacionales; estos manuales actualmente se usan en los Laboratorios de la Clínica de Plantas, de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, Laboratorio de Cuarentena Vegetal del Instituto Colombiano Agropecuario, ICA, el Laboratorio de Fitopatología de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, CORPOICA y algunos de los que se encuentran en las bibliotecas institucionales y particulares; el manual usado como guía fue el publicado por Tuite en 1989, que incluye gran parte de los medios que se encuentran en numeral 7 de esta revisión. En el caso de aquellos medios que se encontraron para géneros y especies de microorganismos, se organizaron taxonómicamente de acuerdo con la clasificación propuesta por Alexopolus (1996) en su libro de Micología y en el texto Phytopathology de Agrios (2005). Para seleccionar los medios específicos en el aislamiento de patógenos que se presentan con frecuencia en los cultivos de importancia económica en el país (Buriticá, 1998) como flores, frutales, hortalizas, arroz, palma africana, caña de azúcar, entre otros (Ver anexo 2), se reviso el Directorio de enfermedades en Colombia del fitopatólogo Pablo Buriticá Céspedes, publicado en el año 1999, además de artículos sobre investigación fitopatólogia en Colombia. 30

31 6. RESULTADOS A continuación se presentan algunos de los principales medios de cultivo explorados, organizados de la siguiente manera: los de uso común en aislamiento de microorganismos de acción patogénica que se encuentran en suelo y cascarilla, los empleados en el aislamiento a partir de semillas, los de uso general en los laboratorios dedicados a estudios fitopatológicos y varios de los medios selectivos, usados en investigaciones sobre enfermedades y patógenos específicos. 7. MEDIOS PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS A PARTIR DE SEMILLAS Estos medios son usados para el aislamiento de hongos fitopatogenos a partir de semillas, los cuales proveen un soporte nutricional para garantizar la viabilidad de hongo y así lograr su aislamiento. AGAR PDTA Papa-Dextosa Tergitol Neomicina Agar-Agar Agua Destilada 100 g 200 ppm 30 ppm 10 g 1 L Preparación: Disolver la papa dextrosa y el agar-agar en el agua destilada calentar hasta disolver completamente, autoclavar a 121 C 15 min 15 lbs de presión agregar los demás componentes y servir. 31

32 AGAR TCV Usado para la deteccion de Septoria spp. en semillas Agar PDA Metil Tiofanato Vancomicina Tween 1 L 0.02 g 0.1 g 2 ml Preparación: Autoclavar 1 l de Agar PDA y dejarlo enfriar hasta alcanzar una temperatura de 60 C y agregar 5 ml de la solucion de metil tiofanato, vancomicina y 4 gotas de Tween. AGAR GUAYACOL Medio para detectar Bipolaris (Helminthosporium) oryzae y Alternaria en semillas de arroz. COMPONENTES Guaiacol Estreptomicina Agar-agar 125 g 5.0 g Agua 1 L Preparación: Disolver el guaiacol y el agar en un litro de agua destilada, mezclar bien, esterilizar en autoclave, posteriormente adicionar la estreptomicina, servir (Kamal,2009). 8. MEDIOS PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS A PARTIR DE SUELO Y AGUA Los medios que se presentan a continuación son usados para el aislamiento de hongos fitopatogenos a partir de muestras de suelo y agua. AGAR CLORURO DE SODIO - GLUCOSA - DICLORAN 32

33 Usado como medio selectivo para el aislamiento de Aspergillus flavus de suelo. Peptona KH 2 PO 4 NaCl Glucosa MgSO 4 x 7 H 2 O Agar - agar 5 g 1 g 30 g 10 g 20 g Agua destilada 1L Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a 121 C/15 Lbs de presión, después agregar 50 mg de estreptomicina y servir. AGAR DEXTROSA-PEPTONA-EXTRACTO DE LEVADURA (DPYA) Para aislamiento y enumeración de hongos del suelo. COMPOSICIÓN Dextrosa KH 2 PO 4 Peptona MgSO 4 x 7 H 2 O NH 4 NO 3 Extracto de Levadura Propionato de Sodio Agar-Agar 5 g 1 g 1 g 0,5 g 1 g 2 g 1 g 20 g Preparación: Disolver todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a 121 C/15 Lbs de presión, después agregar 30 mg de estreptomicina y servir. AGAR KRIGSVOLD Y GRIFFIN 33

34 Medio de cultivo semiselectivo para aislamientos de Cylindrocladium spp. del suelo. Sucrosa 10 g KH2PO4 1 g MgSO4.7H2O Bacto oxgall Peptona Sulfato de estreptomicina Tetraciclina HCl Quintozene (PCNB) Agar 1.0 g 15.0 g 50.0 mg 50.0 mg 75.0 mg 20.0 g Agua destilada 1 L Preparación: Disolver la sucrosa, el oxgall, la peptona, las sales y el agar en un litro de agua destilada. Mezclar bien, esterilizar en autoclave, posteriormente adicionar el sulfato de estreptomicina, la tetraciclina HCI y el quintozene y servir (Plant Dis. Rep. 59:543). AGAR EXTRACTO DE SUELO - ACIDO POLIGALACTURONICO Usado para el aislamiento de Colletotrichum sp. del suelo. K 2 HPO 4 Extracto de suelo KH 2 PO 4 Acido poligalacturonico Agua destilada Agar - agar 4 g 25 ml 1.5 g 10 g 1L 17 g Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a 121 C/15 Lbs de presión, después agregar 30 mg de estreptomicina y servir. (Sugar, 2006) 34

35 AGAR MARTIN Usado para el aislamiento de hongos de muestras de suelo y agua. RB - O RB - M1 COMPONENTES Agua destilada 1000 ml 1000 ml Agar - agar 20 g 18 g KH 2 PO 4 1 g 0,5 g K 2 HPO 4 0,5 g MgSO 4 x 7H 2 O 0,5 g 0,5 g Peptona 5 g 5 g Dextrosa 10 g 10 g Extracto de levadura 0,5 g Rosa bengala 0,033 g 0,05 g sulfato de estreptomicina 0,03 g 0,03 g Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a 121 C/15 Lbs de presión, después agregar la estreptomicina y servir. AGAR OAES Usado para el aislamiento y recuento de hongos a partir de muestras de suelo. Glucosa Extracto de levadura NaNO 3 MgSO 4 x 7 H 2 O KH 2 PO 4 Propionato de sodio Agar - agar 5 g 2 g 1 g 1 g 1 g 20 g 35

36 Agua destilada 1000 ml Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a 121 C/15 Lbs de presión y servir. AGAR PCNB Aislamiento de Fusarium spp. a partir de muestras de suelo. COMPONENTES Peptona KH 2 PO 4 MgSO4 x 7H2O Terraclor Agar - agar Clorotetraciclina HCL Sulfato de estreptomicina ES 15 g 1,0 g 0,5 g 0,5 g 20 g 50 mg 100 mg Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a 121 C/15 Lbs de presión, después agregar la estreptomicina y servir. AGAR PEPTONA - ROSA BENGALA Usado para aislamiento y recuento de hongos a partir de muestras de suelo. Peptona Dextrosa KH 2 PO 4 MgSO 4 x 7 H 2 O Rosa bengala Agar - agar Agua destilada 5 g 10 g 20 g 1 g 10 g 1000 ml Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a 121 C/15 Lbs de presión, después agregar 30 mg de estreptomicina y servir. 36

37 AGAR SUCROSA - PEPTONA - DICLORAN Usado para el aislamiento y recuento de Aspergillus flavus del suelo. K 2 HPO 4 Peptona Sucrosa Estreptomicina MgSO 4 x 7 H O Extracto de levadura Rosa bengala Agar - agar Agua destilada 20 g 50 mg 0.5 mg 0.5 mg 25 mg 17 g 1000 ml Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo llevar a autoclavar por 15 min a 121 C/15 Lbs de presión, después agregar la estreptomicina y servir. Ajustar el ph 5.5 usando HCl 1 N o NaOH 1 N. CALDO FRIES Usado para aislamiento de hongos a partir de muestras de suelo COMPONENTES Tartrato NH 4 5 g NH 4 NO 3 MgSO 4 x 7 H 2 O KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 Sucrosa Extracto de levadura Solucion Stock elementos traza Agua destilada 1 g 0,5 g 1,3 g 2,6 g 30 g 1 g 2 ml 1000 ml Solucion Stock de elementos traza 37

38 Li Cl CuCl 2 x H2O H 2 MoO 2 MnCl 2 x 4H 2 O CoCl 2 x 4H 2 O Agua destilada 167 mg 107 mg 34 mg 72 mg 80 mg 1000 ml Preparación: Agregar todos los componentes en agua destilada y calentar suavemente hasta disolverlos por completo, luego agregar la solución de elementos traza disolver, llevar a autoclavar por 15 min a 121 C/15 Lbs de presión y servir. AGAR RB-M2 Usado para aislamiento de Thielaviopsis basicola de suelo. Este medio de cultivo se siembra casi siempre por el método de estrías en superficie, a partir de muestras de material vegetal o muestras de suelo contaminado. Glucosa Extracto de levadura KH 2 PO 4 Peptona K 2 HPO 4 MgSO 4. 7 H 2 O Sulfato de estreptomicina Quintozene Nistatina Agar-agar 10.0 g 30.0 mg mg 30.0 g 20.0 g Agua destilada 1 L Preparación: Disolver la peptona, la glucosa, el extracto de levadura, las sales y el agar en un litro de agua destilada. Mezclar bien, esterilizar en autoclave, luego añadir el sulfato de estreptomicina, el quintozene y la nistatina, ajustar el ph 7.4 y servir (Phytophatology, 54, 1475). 9. MEDIOS DE USO GENERAL 38