MANUAL DE PRÁCTICAS DE LOS LABORATORIOS DE ALIMENTOS

Transcripción

1 MANUAL DE PRÁCTICAS DE LOS LABORATORIOS DE ALIMENTOS MP-DAMR-LMI/R01

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3 DIRECTORIO UJAT DR. JOSÉ MANUEL PIÑA GUTIERREZ Rector DRA. DORA MARÍA FRÍAS MÁRQUEZ Secretaria de Servicios Académicos M.A. RUBICEL CRUZ ROMERO Secretario de Servicios Administrativos DIRECTORIO DAMR M.T.E. SANDRA AGUILAR HERNÁNDEZ Directora M.A. ALEJANDRO ALPUCHE PALMA Coordinador Administrativo L.I.A. MIGUEL ALEJO ALEJO Coordinador de Docencia

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5 COMISIÓN RESPONSABLE DE LA ELABORACIÓN DEL MANUAL DE PRÁCTICAS PARA LABORATORIOS DE ALIMENTOS: BROMATOLOGÍA M.C. FANNY PERALTA GONZÁLEZ M.C. EMILIO JESUS MALDONADO ENRÍQUEZ M.C. MARTHA ISABEL CENTENO ZUÑIGA

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7 ÍNDICE PRESENTACIÓN... 1 OBJETIVO... 3 NORMAS DE SEGURIDAD E HIGIENE EN EL LABORATORIO... 4 MEDIDAS EN CASO DE ACCIDENTE... 7 PRACTICA 1. PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVOS... 9 PRÁCTICA 2. PREPARACIÓN, FIJACIÓN Y COLORACIÓN SIMPLE DE FROTIS PRACTICA 3. MÉTODO PARA LA CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS PRACTICA 4. RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES PRACTICA 5. EFECTO DEL PH Y LA TEMPERATURA EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO PRÁCTICA 6. TÉCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS Y LEVADURAS... 34

8 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a 1 PRESENTACIÓN La División Académica Multidisciplinaria de los Ríos (DAMR) cuenta con una instalación especializada para atender la necesidad del Programa Educativo (PE) de la carrera de Ingeniería en Alimentos referente a la realización de prácticas de laboratorio y tecnologías de alimentos. Esta instalación cuenta, con cuatro laboratorios para análisis en alimentos (bromatología, instrumental, microbiología, sensorial) y tres talleres (cárnicos, frutas y hortalizas, lácteos). La realización de prácticas de laboratorio dentro del anterior PE, juega un papel primordial en la formación de recursos humanos capaces de aplicar metodologías convenientes para el análisis, evaluación, transformación y conservación de productos y subproductos alimenticios. Por tal motivo se han elaborado 7 manuales de prácticas (Cuadro 1), uno para cada laboratorio y taller, los cuales incluyen una serie de metodologías acordes al equipamiento con el que cuenta dicha División, además de una compilación de prácticas realizadas por los profesores que imparten las diferentes materias que involucran horas prácticas en su plan de estudio. Cada manual hace referencia a las medidas de seguridad e higiene ya sea en el laboratorio (BPL) o en el taller (BPM) y las medidas en caso de accidente. La estructuración de las prácticas contiene: objetivo; introducción; materiales, reactivos y equipos; procedimiento; resultados; cuestionamientos; bibliografía. En particular, el presente manual (MP-DAMR-LMI/R01) apoya a las asignaturas de microbiología, microbiología alimentaria, laboratorio de microbiología de alimentos, microbiología industrial, biotecnología de alimentos, inocuidad de alimentos y aseguramiento de la calidad. UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

9 2 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S Cuadro 1. Relación de Manuales de Prácticas para Laboratorios y Talleres de Alimentos LABORATORIO/ CLAVE NOMBRE DEL MANUAL TALLER Bromatología MP-DAMR-LBR/R01 Manual de Prácticas para Laboratorios de Alimentos: Bromatología Instrumental MP-DAMR-LIN/R01 Manual de Prácticas para Laboratorios de Alimentos: Instrumental Microbiología MP-DAMR-LMI/R01 Manual de Prácticas para Laboratorios de Alimentos: Microbiología Sensorial MP-DAMR-LSE/R01 Manual de Prácticas para Laboratorios de Alimentos: Sensorial Cárnicos MP-DAMR-TCA/R01 Manual de Prácticas para Talleres de Alimentos: Cárnicos Frutas y Hortalizas MP-DAMR-TFH/R01 Manual de Prácticas para Talleres de Alimentos: Frutas y Hortalizas Lácteos MP-DAMR-TLA/R01 Manual de Prácticas para Talleres de Alimentos: Lácteos MICROBIOLOGÍA

10 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a 3 OBJETIVO Contribuir a la formación de recursos humanos capaces de aplicar metodologías convenientes para el análisis, evaluación, transformación y conservación de productos y subproductos alimenticios, así como apoyar en los proyectos de investigación y proyectos productivos afines al área. UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

11 4 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S NORMAS DE SEGURIDAD E HIGIENE EN EL LABORATORIO Estimado usuario, te recomendamos que antes de iniciar con tus actividades dentro de los laboratorios y talleres conozcas el Lineamiento Interno para el Uso y Mantenimiento de los Laboratorios y Talleres del Programa Educativo de Ingeniería en Alimentos el cuál te guiará sobre las actitudes, responsabilidades y procedimientos que deberás seguir antes, durante y al finalizar tus actividades en el laboratorio. De igual forma te sugerimos tomes en cuenta las precauciones o medidas generales que te presentamos a continuación con objeto de que adquieras una actitud de prudencia frente a riesgos que puedan presentarse en el laboratorio: A) Organización del laboratorio, debe ser adecuada para mantener un buen nivel preventivo. 1. Una persona nunca debe trabajar sola en el laboratorio, especialmente fuera de horas habituales y en actividades con riesgo. 2. Cuando se requiera realizar una actividad con riesgo se debe informar incluso a las personas que no intervengan en las mismas. 3. Siempre que se manipulen productos tóxicos o inflamables, se trabajará en la campana de extracción de humos verificando su correcto funcionamiento. 4. No se debe eliminar por el desagüe, aunque sea en pequeñas cantidades, productos tales como: los que reaccionan violentamente con el agua, sean tóxicos, pestilentes, lacrimógenos, no biodegradables y cancerígenos. B) Hábitos personales del trabajador, se refiere al comportamiento desarrollado durante el trabajo. 1. Mantener en todo momento las batas y vestidos abrochados. 2. No abandonar objetos personales en mesas de trabajo. 3. No comer ni beber en los laboratorios. 4. No guardar alimentos ni bebidas en el refrigerador del laboratorio. MICROBIOLOGÍA

12 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a 5 5. No fumar en los laboratorios. 6. Las batas no deben llevarse a lugares de uso común: bibliotecas, cafeterías, comedores, baño, etc. 7. Se recomienda usar gafas de seguridad cuando se manipulen productos químicos o líquidos en ebullición. 8. No utilizar lentes de contacto en el laboratorio. 9. No se aconseja guardar la ropa de calle en el laboratorio. 10. Lavarse las manos antes de abandonar el laboratorio, al quitarse los guantes protectores y siempre que se haya estado en contacto con material irritante, cáustico, tóxico o infeccioso. C) Hábitos adquiridos durante el trabajo en el laboratorio. 1. No se debe manipular un producto químico sin conocer sus características físico-químicas y toxicológicas. 2. Antes de utilizar un reactivo, se debe asegurar que sea el correcto. 3. Se deberán conocer como mínimo las frases R y S de los productos, incluidos en la etiqueta del envase. 4. Exigir las fichas de datos de seguridad. 5. No llenar los tubos de ensayo más de dos o tres cm. 6. Calentar los tubos de ensayo de lado y utilizando pinzas. 7. Nunca dirigir la boca del recipiente en el cual se está efectuando una reacción, hacia los compañeros. 8. Al vaciar un líquido hacerlo por el lado contrario de la etiqueta o rótulo. 9. No llevar tubos de ensayo ni productos en los bolsillos de las batas. 10. Utilizar en todo momento gradillas y soportes. 11. Transportar los productos en bandejas o recipientes para evitar derrames en caso de roturas. 12. No tocar con las manos ni probar los productos químicos. 13. No trabajar separado de la mesa. 14. No efectuar pipeteos con la boca. UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

13 6 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S 15. Se debe asegurar el enfriamiento de los materiales antes de aplicar directamente las manos para tomarlos. 16. Al terminar el trabajo, se debe asegurar la desconexión de aparatos, agua, gases, etc. 17. Los mecheros no deben dejarse encendidos sin vigilancia. 18. Al finalizar una tarea u operación, se deben recoger materiales, reactivos, equipos, etc., evitando acumulaciones innecesarias. 19. No se deben calentar solventes volátiles (éteres, benceno, etanol, etc.) con mechero de gas. Hacerlo en un baño de agua caliente o en parrilla eléctrica. 20. Muchos de los reactivos que se manipulan son tóxicos, se debe evitar el contacto con la piel, ojos y mucosa, evitar inhalarlos o pipetearlos directamente si son líquidos. 21. Nunca se debe agregar agua a un ácido concentrado, diluir el ácido adicionándolo lentamente al agua con agitación constante; las bases deben ser diluidas de forma análoga. MICROBIOLOGÍA

14 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a 7 MEDIDAS EN CASO DE ACCIDENTE Las intoxicaciones pueden ser producidas al respirar gases, vapores, polvos o aerosoles tóxicos; al entrar la piel en contacto con estas sustancias; y al ser ingeridas. De esta manera, los productos químicos que resultan un peligro agudo de intoxicación se caracterizan en la etiqueta del recipiente por las siguientes indicaciones de riesgo: 1. Tóxico por inhalación. 2. Tóxico por contacto con la piel. 3. Tóxico por ingestión. 4. Muy tóxico por inhalación. 5. Muy tóxico por contacto con la piel. 6. Muy tóxico por ingestión. 7. Peligroso por efectos irreversibles muy graves. 8. Riesgos de efectos muy graves para la salud en caso de exposición prolongada. Además, en la etiqueta de los recipientes que contienen productos químicos, se especifica el procedimiento de emergencia y primeros auxilios. En caso de intoxicación con algún producto químico se deberá seguir las recomendaciones del fabricante. Cuando la medida a tomar en caso de intoxicación oral consista en provocar el vómito, se sugiere ingerir una solución tibia de sal común (3 a 4 cucharadas de sal común en un vaso de agua) y tocar la pared interior de la garganta (con el dedo en la boca). No se debe provocar el vómito si el intoxicado ha perdido el conocimiento o si la intoxicación fue provocada por solventes, ácidos o bases. Intoxicación con hidróxido de sodio (NaOH). Si se ingiere, no se debe provocar el vómito; si la persona está consiente, se debe ingerir agua en abundancia. Después se recomienda tomar vinagre diluido, jugo de frutas o claras de huevo batidas con agua. Si se inhala, se debe llevar a la persona al aire fresco; si no respira, se le debe administrar respiración artificial. En caso de contacto con la piel, lavar de inmediato la UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

15 8 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S zona afectada con agua en abundancia por lo menos durante 15 minutos, quitando al mismo tiempo la ropa y el calzado contaminado. Antes de volver a utilizar la ropa se recomienda lavarla. En caso de contacto con los ojos, lavar inmediatamente con abundante agua por lo menos durante 15 minutos. Intoxicación con ácido sulfúrico (H2SO4). Si se ingiere, no se debe provocar el vómito; se recomienda que la persona se enjuague la boca con agua; si la persona está consciente, debe tomar abundante agua. Si se inhala, se debe llevar a la persona al aire fresco y mantenerla en reposo; si no respira, se le debe administrar respiración artificial. En caso de contacto con los ojos, se procede a lavar inmediatamente con abundante agua por lo menos durante 15 minutos abriendo ocasionalmente los parpados. En caso de contacto con la piel, remover inmediatamente la ropa y el calzado contaminado; se debe absorber el material de la piel con papel o un trapo y lavar la zona afectada con agua corriente durante 15 minutos. Intoxicación con ácido clorhídrico (HCl). Si se ingiere, no se debe provocar el vómito; se recomienda que la persona se enjuague la boca con agua; si la persona está consciente, debe tomar agua, leche o leche de magnesia. Si se inhala, se debe llevar a la persona al aire fresco y mantenerla en reposo; si no respira se le debe administrar respiración artificial. En caso de contacto con la piel, remover inmediatamente la ropa y calzado contaminados; lavar la zona afectada con agua corriente durante 15 minutos. En caso de contacto con los ojos, se procede a lavar inmediatamente con abundante agua por lo menos durante 15 minutos abriendo ocasionalmente los parpados. Quemaduras y escaldamientos. Quitar rápidamente la ropa que está impregnada con líquidos calientes o enfriarla con agua. Introducir rápidamente en agua fría los miembros dañados o mantenerlos debajo de agua corriente, hasta atenuación de dolor. No utilizar harina, talco, pomadas, aceites, leche, etc., en el área afectada. MICROBIOLOGÍA

16 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a 9 PRACTICA 1. PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVOS INTRODUCCIÓN Los microorganismos son susceptibles a los cambios de condiciones ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo físico- químico. OBJETIVO Que el alumno conozca los principios generales de las técnicas de esterilización de los materiales y medios de cultivos. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS 7 tubos de cultivo de 16 x 150mm con tapón de baquelita 3 tubos de cultivo de 16 x 150mm sin tapón de baquelita 9 cajas de Petri de vidrio 3 pipetas de 1 a 2 ml 1 pipeta de Pasteur 3 matraces Erlenmeyer de 250 ml 1 parrilla con calentamiento y agitación 1 autoclave 1 potenciómetro 1 horno de calor seco 1 mechero Fisher 1 incubadora a 35 C UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

17 10 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S 1 hisopo, algodón y gasa Papel manila o estraza para envolver Detergente Escobillón Caldo nutritivo Medio agar nutritivo Medio agar papa dextrosa Medio mínimo de sales Soluciones amortiguadora ph 4 y 7 PROCEDIMIENTO Preparación del material de vidrio y medios de cultivos: 1. Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con escobillón y detergente. Enjaguar con abundante agua corriente. 2. Escurrir el exceso de agua y enjaguar con agua destilada con una piseta por las paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una toalla. 3. Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de Petri y pipetas con papel de estraza. Para los tubos y matraces se elaborarán tapones de algodón y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los que finalmente se les colocará un capuchón de papel. 4.Preparar 20 ml de caldo nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y ajustar el ph a en un potenciómetro, agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solución de HCI 0.1 M o solución de NaOH 0.1 M, en caso de que el ph sea más alcalino o ácido respectivamente. Vaciar 5 ml en cuatro tubos de cultivo con tapón de baquelita que deberán cerrar sin llegar al tope. 5. Preparar 120 ml de agar nutritivo (AN), calentar la mezcla en una parrilla con agitación constante hasta ebullición, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte) y vaciar enseguida 5 ml de medio en tres tubos con tapón de rosca. Enjuagar inmediatamente la pipeta para evitar que se solidifique el agar. El resto se esteriliza en la autoclave. MICROBIOLOGÍA

18 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a Preparar 120 ml de medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, ajustar el ph del medio a Colocar un magneto de agitación y calentar hasta ebullición durante 1 minuto; cuidando de que no se proyecte o derrame. Posteriormente vaciar 7 ml de medio en tres tubos que se taparán con tapón de algodón y gasa. El resto se esteriliza en la autoclave. 7. Preparar 120 ml de medio de cultivo Mínimo de sales (MM) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Esterilización de materiales y medios de cultivo: 1. Las cajas de Petri y pipetas envueltas se colocaran en horno a 150 C durante 2 horas. Después de sacarlas, dejarlas enfriar y abrir los paquetes únicamente en área aséptica. 2. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo a las siguientes instrucciones: a. Revisar que el nivel de agua coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario añadir agua destilada. b. Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto. Acomodar los medios y materiales en la canasta de la autoclave y colocarla dentro. c. Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a que salga el vapor de agua por el orificio de purgado. Después cerrar este orificio con la válvula de seguridad. d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121 C o 15 Ibs de presión revisando continuamente la escala del manómetro. Una vez alcanzada esta temperatura deberá bajarse el nivel de calentamiento moviendo la perilla de control al nivel medio o bajo. e. Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos f. Apagar la autoclave y dejar que baje la presión al valor de "0". Quitar la válvula de seguridad y con la ayuda de guantes de asbesto o una jerga húmeda abrir UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

19 12 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S cuidadosamente la puerta, de adelante hacia atrás para evitar quemaduras por la salida del vapor. Preparación del material de vidrio y medios de cultivo: 1. Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con escobillón y detergente. Enjuagar con abundante agua corriente. 2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una piceta, por las paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningún otro medio. 3. Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de Petri y pipetas con papel de estraza. Para los tubos y matraces se elaborarán tapones de algodón y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los que finalmente se les colocará un capuchón de papel. 4. Preparar 20 ml de Caldo Nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y ajustar el ph a en un potenciómetro, agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solución de HCI 0.1 M o solución de NaOH 0.1 M, en caso de que el ph sea más alcalino o ácido respectivamente. Vaciar 5 ml en cuatro tubos de cultivo con tapón de baquelita que deberán cerrar sin llegar al tope. Preparación de las cajas de Petri y tubos con medios de cultivo: 1. Los tubos con medios de cultivo con agar, se deberán colocar en una superficie inclinada de tal forma que el medio se solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo. 2. Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de la autoclave se enfríen a una temperatura aproximada de C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin sentir un calor excesivo. MICROBIOLOGÍA

20 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a Cerca del mechero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con PDA y 3 con MM. Los medios de cultivo se vacían en las cajas de Petri (aproximadamente ml) en zona aséptica cerca del mechero o en campana de flujo laminar. 4. Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos) y posteriormente envolver las cajas cuidadosamente con papel estraza o acomodarlas en forma invertida en bolsa de plástico limpias. 5. Guardarlas en refrigeración hasta 24 horas antes de utilizarlas. Prueba de esterilidad de materiales: 1. Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de Petri en forma invertida en una estufa de incubación ajustada a 30 C durante horas. 2. Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición de turbidez, nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos con medio líquido; así como la formación de colonias microbianas en la superficie de medios sólidos. 3. Si no hay contaminación de los medios, se abrirá una de las cajas de Petri de cada medio durante 1 minuto en el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiquetará como al aire". 4. La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se etiquetará "en área aséptica". 5. La tercera caja se conservará sin abrir y se etiqueta como "control". RESULTADOS A. Hacer la descripción morfológica de las colonias obtenidas en las cajas con diferentes medios de cultivo (AN, PDA y MM) y con los distintos tratamientos en relación a la caja control. B. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante. UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

21 14 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S C. Discuta los resultados y determine si la esterilización en el autoclave y horno fue adecuada, así como el manejo de los materiales. Figura 1. Descripción morfológica de microorganismos en cajas de Petri con diferentes medios de cultivo. MEDIO DE CULTIVO AGAR NUTRITIVO MINIMO DE SALES PAPA DEXTROSA AGAR CUESTIONARIO 1. Cuáles son los métodos de esterilización más utilizados en Microbiología? En qué tipo de materiales se aplica cada uno? 2. Explique cuáles son las diferencias entre los procesos de esterilización, desinfección y asepsia. Cómo se relacionan estos procedimientos con la pasteurización? MICROBIOLOGÍA

22 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a 15 UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

23 16 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S PRÁCTICA 2. PREPARACIÓN, FIJACIÓN Y COLORACIÓN SIMPLE DE FROTIS INTRODUCCIÓN Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos, se requiere de un microscopio óptico, ya sea de campo claro o de campo oscuro para hacer la descripción morfológica de éstos. El microscopio de uso más común es el de campo claro, en el que la observación de células vivas es limitada debido a que las células son incoloras y permiten el paso de una gran cantidad de luz. La observación de frotis teñidos es más recomendable. El frotis se prepara haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual se fijan y tiñen los microorganismos. De acuerdo al número de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son: simple, diferencial, negativa y selectiva. Los frotis de cultivos líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar residuos del medio, que al quemarse darán interferencias en las observaciones y los de colonias de medios sólidos se fijan generalmente con calor. Después de la fijación, los frotis son teñidos con diferentes colorantes sintéticos derivados de anilina. Los colorantes más utilizados son sales formadas por iones coloridos cargados conocidos como cromóforos. Por ejemplo: Cloruro de Azul de metileno Azul de metileno* + Cl (cromóforo). OBJETIVOS Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, de fijación y coloración más utilizadas en el estudio microscópico de cultivos bacterianos, obtenidos de medios sólidos y líquidos. Que identifique las principales formas bacterianas y la importancia de las tinciones simples en la caracterización morfológica de estos microorganismos. MICROBIOLOGÍA

24 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a 17 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS 1 Probeta de 100 ml 1 Vaso de precipitados de 100 ml 1 mechero 1 asa de siembra 5 Portaobjetos Piceta con agua destilada Microscopio compuesto de campo claro Azul de metileno alcalino Alcohol etílico al 70% Fenol al 2% Aceite de inmersión PROCEDIMIENTO El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de: Escherichla coli, Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Badllus subtilis, Klebsi'ella sp. y Pseudomonas fluorescens. El estudiante preparará frotis de cada cepa obtenida de cultivo sólido y otros de cultivo líquido, los cuales fijará y teñirá con azul de metileno. El profesor explicará los principios de manejo del microscopio y la forma de ajustar la iluminación. Preparación de frotis: 1. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos (Figura 1). 2. Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo. 3. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Después acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapón y flamear rápidamente la boca del mismo. Introducir el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra. UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

25 18 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S 4. Para el caso de cultivos líquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en un área circular de 2 cm. de diámetro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis al aire y repetir los procedimientos 3 y 4 por 2-3 veces más. 5. Si el cultivo es de medio sólido, previamente se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del paso 3. Extenderla suavemente y dejar secar al aire. Fijación del frotis: 1. Fijar los frotis de cultivos líquidos con dos gotas de metanol o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en zonas alejadas al mechero). 2. Los frotis de cultivos sólidos, completamente secos se fijarán con calor. Para esto se pasaría el frotis rápidamente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero. 3. Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no hubo sobrecalentamiento. Tinción simple: 1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto. 2. Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de la piceta con agua destilada. 3. Dejar secar el aire. Observación al microscopio: 1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda. 2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación, siguiendo las indicaciones del profesor. MICROBIOLOGÍA

26 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para la observación con el objetivo de 100X, colocar previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación. 4. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas. RESULTADOS 1. Reportar las observaciones de forma, agrupación y tamaño relativo de cada uno de los microorganismos en el cuadro de resultados. 2. Comparar sus observaciones con las reportadas en la literatura. UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

27 20 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S PRACTICA 3. MÉTODO PARA LA CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS INTRODUCCIÓN Los mohos y levaduras están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se pueden encontrar formando parte de la flora normal de un alimento, o como agentes contaminantes y en los equipos sanitizados inadecuadamente, provocando el deterioro fisicoquímico de éstos, debido a la utilización en su metabolismo de los carbohidratos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos originando mal olor, alterando el sabor y el color en la superficie de los productos contaminados. Además los mohos y levaduras pueden sintetizar metabolitos tóxicos termoresistentes, capaces de soportar algunas sustancias químicas, así como la irradiación y presentan capacidad para alterar sustratos desfavorables, permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas. Es de gran importancia cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos, puesto que al establecer la cuenta de estos microorganismos, permite su utilización como un indicador de prácticas sanitarias inadecuadas durante la producción y el almacenamiento de los productos, así como el uso de materia prima inadecuada. OBJETIVO Determinar el número de mohos y levaduras viables presentes en productos destinados al consumo humano por medio de la cuenta en placa a 25 ± 1 C. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS Agar papa - dextrosa, comercialmente disponible en forma deshidratada. Agua destilada Fosfato de potasio monobásico 34 g Acido tartárico 10 g MICROBIOLOGÍA

28 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a 21 Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170 C. Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25 ± 1.0 C provista con termómetro calibrado. Autoclave que alcance una temperatura mínima de 121 ± 1.0 C. Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de 0.1 C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1.0 C. Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador. Registrador mecánico o electrónico. Microscopio óptico. Potenciómetro con una escala mínima de 0.1 unidades de ph a 25 C. Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 1 ml y 2 ml), con tapón de algodón. Pueden utilizarse pipetas graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total. Cajas Petri. Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca. Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca. Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc. IMPORTANTE: Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio, deben esterilizarse mediante horno, durante 2 h de 170 a 175 C o por 1h a 180 C o autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0 C. PROCEDIMIENTO Preparación de soluciones: a) Solución fosfato de potasio. UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

29 22 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S 1. Disolver 34 g de fosfato en 500 ml de agua y ajustar el ph a 7.2 con hidróxido de sodio 1 N. 2. Llevar a 1 L de agua. 3. Esterilizar a 121 C durante 15 minutos. 4. Conservar en refrigeración (solución concentrada). 5. Tomar 1.25 ml de la solución concentrada y llevar a 1 L con agua (solución de trabajo). 6. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera. 7. Esterilizar a 121 ± 1 C durante 15 minutos. b) Solución estéril de ácido tartárico al 10%. 1. Disolver 10 g de ácido tartárico en 100 ml de agua destilada y esterilizar a 121 ± 1 C por 15 minutos o por filtración a través de membrana de 0.45 µm. Preparación del medio de cultivo: Seguir instrucciones del fabricante y después de esterilizar, enfriar en baño de agua a 45 ± 1 C, acidificar a un ph de 3,5 ± 0,1 con ácido tartárico estéril al 10% (aproximadamente 1,4 ml de ácido tartárico por 100 ml de medio). Después de adicionar la solución, mezclar y medir el ph con potenciómetro. Dejar solidificar una porción del medio. Hacer esto en cada lote de medio preparado. A fin de preservar las propiedades gelificantes del medio, no calentar después de agregar el ácido tartárico. Preparación de la muestra: La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-110- SSA Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. MICROBIOLOGÍA

30 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a Colocar por duplicado en cajas Petri 1 ml de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, utilizando para tal propósito una pipeta estéril. 2. Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución. 3. Verter de 15 a 20 ml de agar papa dextrosa acidificado, fundido y mantenido a 45 ± 1 C en un baño de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que es vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos. 4. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa. Permitir que la mezcla se solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría. 5. Preparar una caja control con 15 ml de medio, para verificar la esterilidad. 6. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 ± 1 C. 7. Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5 días, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, considerar los conteos de 4 días de incubación y aún de 3 días. En este caso, informar el periodo de incubación de 3 o 4 días en los resultados del análisis. 8. Si es necesario, cuando la morfología colonial no sea suficiente, examinar microscópicamente para distinguir las colonias de levaduras y mohos de las bacterias. RESULTADOS Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe. Multiplicar por el inverso de la dilución, tomando en consideración los criterios de la NOM-092-SSA Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa, para la expresión de resultados. UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

31 24 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S Informe de la prueba: Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de mohos en agar papa - dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1 C durante 5 días. Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de levaduras en agar papa-dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1 C durante 5 días. MICROBIOLOGÍA

32 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a 25 PRACTICA 4. RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES INTRODUCCIÓN El grupo coliforme abarca aquellos géneros de bacterias Gram negativas, oxidasa negativa, catalasa positiva, que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas. Incluye los géneros Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella y Escherichia, los tres primeros son denominados coliformes totales, debido a que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a 35 C. El género Escherichia es capaz de fermentar la lactosa con formación de ácido y gas a 44.5 C, razón por la que se denomina coliforme fecal. Pero, algunos géneros, incluidos Enterobacter y Klebsiella, pueden dar falsos positivos en esta prueba, por esa razón, en la actualidad se tiende a identificar directamente la presencia de Escherichia coli, el indicador prototípico de contaminación fecal. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS Muestra Matraz Erlenmeyer con 225 ml APE 0.1 % Tubos con 9 ml APE 0.1 % Papel para pesar estéril Bolsas estériles para homogeneizar Fosfato monopotásico 34 g Agua destilada 2 L Peptona 1 g NaCl 8.5 g Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 11 y 2 ml), con tapón de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total. Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca. Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca. UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

33 26 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc. Cajas Petri. Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170 C. Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas. Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de 0.1 C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1.0 C. Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador peristáltico (Stomacher). Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico. Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1.0 C, provista con termómetro calibrado. Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador. Registrador mecánico o electrónico. Microscopio óptico. Potenciómetro con una escala mínima de 0.1 unidades de ph a 25 C. IMPORTANTE: Los reactivos que se mencionan, deben ser grado analítico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada. Después de la esterilización, los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5 C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición. MICROBIOLOGÍA

34 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a 27 Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante: horno, durante 2 h a C, o 1 h a 180 C; o en autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1.0 C. El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste debe ser químicamente inerte. PROCEDIMIENTO Preparación de soluciones diluyentes: a) Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada). Disolver 34 g de fosfato monopotásico en 500 ml de agua y ajustar el ph a 7.2 con solución de hidróxido de sodio 1 N. Llevar con agua destilada a un litro. Esterilizar a 121± 1.0 C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración (solución concentrada). Tomar 1.25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo). Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera. Esterilizar durante 15 minutos a 121± 1.0 C. Después de la esterilización, el ph y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales. b) Agua peptonada. Disolver 1 g de peptona y 8.5 g NaCl en un litro de agua destilada. Ajustar el ph a 7 con hidróxido de sodio 1 N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1.0 C. UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

35 28 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S Preparación del medio de cultivo: a) Agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (RVBA) Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos. Mezclar perfectamente y ajustar el ph a 7.4 con ácido clorhídrico 0.1 N o con hidróxido de sodio 0.1 N a 25 C, de forma que después del calentamiento se mantenga en este valor. Calentar con agitación constante y hervir durante 2 minutos. Enfriar inmediatamente el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45 C. Evitar el sobrecalentamiento del medio. No debe esterilizarse en autoclave. Usar el medio dentro de las tres primeras horas después de su preparación. En el caso de utilizar medio de cultivo deshidratado, seguir las instrucciones del fabricante. Preparación de la muestra: La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA "Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico". Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, utilizando para tal propósito una pipeta estéril. Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución. Vertir de 15 a 20 ml del medio RVBA fundido y mantenido a 45 ± 1.0 C en baño de agua. En el caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vierte de 10 a 15 ml del medio. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos. MICROBIOLOGÍA

36 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a 29 Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría. Preparar una caja control con 15 ml de medio para verificar la esterilidad. Después de que está el medio completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente 4 ml del medio RVBA a 45 ± 1.0 C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique. Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35 C, durante 24 ± 2 horas. Después del periodo especificado para la incubación, contar las colonias con el contador de colonias. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0.5 a 2.0 mm. RESULTADOS a) Placas que contienen entre 15 y 150 colonias características: separar las placas que contienen el número antes mencionado de colonias características en dos diluciones consecutivas. Contar las colonias presentes. Calcular el número de coliformes por mililitro o por gramo de producto, multiplicando el número de colonias por el inverso de la dilución correspondiente, tomando los criterios de la NOM-092-SSA Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. b) Placas que contienen menos de 15 colonias características: si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias características, reportar el número obtenido seguido de la dilución correspondiente. UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

37 30 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S c) Placas con colonias no características: si en las placas no hay colonias características, reportar el resultado como: menos de un coliforme por 1/d por gramo, en donde d es el factor de dilución. Informe de la prueba: UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35 C durante 24 ± 2 h. En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar utilizando como referencia la dilución más baja utilizada, por ejemplo dilución En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no desarrollo de coliformes por ml". MICROBIOLOGÍA

38 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a 31 PRACTICA 5. EFECTO DEL PH Y LA TEMPERATURA EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO INTRODUCCIÓN Los microorganismos están continuamente afectados por su ambiente, ya que éste ejerce una influencia profunda en su desarrollo al igual que sobre las demás formas de vida. Los factores del medio se pueden clasificar en tres grupos: a) Físicos: temperatura, presiones externas, humedad. b) Químicos: ph, disponibilidad de nutrimentos, presencia de productos tóxicos. c) Biológicos: las interacciones microbianas entre las especies coexistentes. Algunos microorganismos están especialmente adaptados a los hábitats extremos, donde otros no pueden sobrevivir y que incluso tienen propiedades fisiológicas que restringen su crecimiento a tales sitios. En otros hábitat menos rigurosos, las fuentes de nutrimentos y las interacciones entre poblaciones adquieren mayor importancia en la selección de las poblaciones que se encontrarán. Los factores ambientales que se controlan en condiciones de laboratorio con mayor frecuencia, además de los nutrimentales son los fisicoquímicos como: la temperatura y ph. Todos los organismos tienen una temperatura óptima de crecimiento que los caracteriza; en la cual muestran las tasas más elevadas de crecimiento. También hay límites de temperatura, la temperatura mínima en las que son metabólicamente inactivos y una temperatura arriba de la cual el crecimiento ya no es posible llamada temperatura máxima. OBJETIVO Que el estudiante conozca el efecto del ph y la temperatura como parámetros de control del crecimiento microbiano. Que el alumno comprenda la importancia de estos factores fisicoquímicos en la selección de poblaciones UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

39 32 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S microbianas en los diferentes ambientes en que se encuentran y los mecanismos de adaptación a niveles celulares y metabólicos que han desarrollado. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS 2 Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar ( ajustado a ph 7.0) 2 Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar ajusta- 0 do a ph Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar ajustado a ph Tubos con 7 ml de caldo microinoculación (Bioxon) ajustado a ph 7.0 sin amortiguar 4 Tubos con 7 ml de caldo microinoculación ajustado a ph 5.0 sin amortiguar 4 Tubos con 7 ml de caldo microinoculación ajustado a ph 9.0 sin amortiguador 4 Tubos con 7 ml de caldo microinoculación ajustado a ph con amortiguador (Anexos 1.1, 2.19) 4 Tubos con 7 ml de caldo microinoculación ajustado a ph 5.0 con amortiguador 4 Tubos con 7 ml de caldo microinoculación ajustado a ph 9.0 con amortiguador 1 Asa de inoculación 3 pipetas de 1.0 ml. estériles 1 mechero Fisher Espectrofotómetro Microscopio estereoscópico Soluciones amortiguadoras de ph 4, 7 y 10 PROCEDIMIENTO El profesor proporcionará cultivos líquidos, una suspensión de esporas de Aspergillus nigery, Penicillium roqueforti. Cada uno de los tubos y cajas deberán etiquetarse con el nombre del microorganismo que se inoculará. MICROBIOLOGÍA

40 D I V I S I Ó N A C A D É M I C A M U L T I D I S C I P L I N A R I A D E L O S R Í O S P á g i n a 33 Efecto de la Temperatura: 1. En tres cajas de Petri con PDA divididas en dos secciones, inocular 0.1 ml. de la suspensión de esporas de hongos en cada sección. 2. Incubar una caja de Petri a 15 C, otra a 30 C y la última a 45 C en forma invertida durante 72 horas y hacer las observaciones macroscópicas. 3. Incubar nuevamente las cajas y realizar observaciones en microscopio estereoscópico después de una semana. 4. En seis tubos de caldo microinoculación ajustado a ph 7.0, inocular dos con cada una de las cepas bacterianas. 5. Incubar dos tubos en estufa a 15 C, otros dos a 30 C y los dos últimos a 45 C durante horas. Medir la D.O. Efecto del ph: 1. Preparar tres series de cuatro tubos de caldo de microinoculación ajustados a 3 diferentes valores de ph (5.0, 7.0 y 9.0) con solución de HC11.0 M o NaOH 1.0 M. 2. Preparar otra serie de cuatro tubos ajustados a los mismos valores de ph del punto anterior pero utilizando soluciones amortiguadoras. 3. Inocular 0.1 ml de cada una de las cepas bacterianas en la serie de seis tubos de caldo microinoculación ajustados a diferentes ph con amortiguador y sin amortiguador, dejando uno sin inocular como testigo. 4. Incubar los tubos a 35 C durante horas y medir la D.O. 5. Inocular tres cajas de Petri con medio PDA ajustado a tres ph diferentes con cada una de las cepas de hongos. 6. Incubar las cajas de Petri a 30 C durante horas y hacer observaciones macroscópicas. 7. Después de una semana observar las cajas en microscopio estereoscópico. UNIVERSIDAD JUÁREZ AUTÓNOMA DE TABASCO

41 34 P á g i n a M A N U A L D E P R Á C T I C A S D E L O S L A B O R A T O R I O S D E A L I M E N T O S RESULTADOS A. Reportar los resultados en los cuadros 8, 9 y 10 de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-), crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++). B. Comparar sus resultados con los reportados en la bibliografía de cada una de las cepas. PRÁCTICA 6. TÉCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS Y LEVADURAS INTRODUCCIÓN El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del conocimiento de técnicas de siembra o inoculación y de aislamiento para transferirlos de un medio a otro, o mantener su crecimiento y actividad. Es indispensable para realizar diversos estudios morfológicos, de identificación, bioquímicos, de patogenicidad y ecológicos, entre otros. Existen diferentes técnicas de siembra: por suspensión de la muestra en medios líquidos; extensión de diluciones de un cultivo en superficie de medios en caja de Petri; por estría en caja de Petri y tubos con medios solidificados en forma inclinada; por piquete o picadura en tubos con medios sólidos o semisólidos. Con la aplicación de cada técnica se obtiene información de importancia para el estudio básico o aplicado de los microorganismos de interés. En la naturaleza, los microorganismos generalmente se encuentran en poblaciones, formando parte de comunidades de gran complejidad, por lo que uno de los objetivos de estudio más importantes en microbiología es aislarlos. El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayoría de los casos, mediante la MICROBIOLOGÍA