INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIA APLICADA Y TECNOLOGÍA AVANZADA Unidad Querétaro POSGRADO EN TECNOLOGÍA AVANZADA DETERMINACIÓN DE LAS CONSTANTES DE IONIZACIÓN DE LAS BASES HETEROCÍCLICAS DEL ADN EN AMBIENTE ALCALINO TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN TECNOLOGÍA AVANZADA PRESENTA: ING. JOSÉ MARTÍNEZ REYES DIRECTOR: DR. REYNALDO CARLOS PLESS ELLING Santiago de Querétaro, Qro. Marzo de 2007

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4 AGRADECIMIENTOS A Dios por permitirme alcanzar esta meta. A mi esposa Dolores Jovita Pérez por su apoyo total. A mi tío Julio Reyes por su paternal apoyo y a mi tía Antonia Contreras por su impulso y aliento. A mi madre Herlinda Reyes que medio el ser. Al Instituto Politécnico Nacional (I.P.N.), mi alma mater, por las becas y apoyos atorgados. Al Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología Avanzada del I.P.N. (CICATA-IPN) Unidad Querétaro. Al Centro de Estudios Académicos en Contaminación Ambiental (CEACA) de la Facultad de Química de la Universidad Autónoma de Querétaro (U.A.Q.). Al Dr. Reynaldo C. Pless Elling por la dirección de mi tesis y su extraordinario apoyo. A la Dra. Eva González Jaso por su gran apoyo en la etapa final. A la dirección interina del CICATA-IPN Unidad Querétaro, en funciones durante la realización del proyecto y a la actual dirección del Centro. A mis revisores de tesis. Y a todos, quienes contribuyeron..gracias.

5 RESUMEN El objetivo del presente proyecto de investigación fue determinar los valores de pk a (constantes de ionización), en el intervalo básico, de la base heterocíclica guanina en el entorno del ADN, usando como compuestos modelo oligonucleótidos que contienen sólo una guanina ionizable dentro de un entorno de bases no ionizables, por ejemplo el oligonucleótido d-aaagaaa. Lo anterior permitió que los cambios físicos observados que acompañan la variación del ph (cambios en el espectro de absorción de la luz ultravioleta) se puedan interpretar directamente como reflexión de los cambios sufridos por la solitaria base guanina dentro del oligonucleótido. Para determinar los valores de pk a, los compuestos modelo de ADN se sometieron en solución acuosa con diferentes concentraciones de NaCl, a titulación con solución de NaOH, evaluada mediante espectrofotometría en el intervalo de luz ultravioleta, para luego graficar ciertas razones de absorbancia (por ejemplo: A 275nm /A 260nm, A 270nm /A 260nm, A 255nm /A 260nm, etc. ) en función de los respectivos valores de ph medidos. La determinación de los correspondientes valores de pk a se realizó en la parte media de la curva sigmoidal de transición entre la forma no ionizada a la ionizada (Clauwaert y Stockx, 1968; Acharya y col., 2002; 2003; Airoldi y col., 2003) de la base heterocíclica en el ADN, obteniéndose valores de pk a para el oligonucleótido d-aaagaaa a varias concentraciones de NaCl en la solución acuosa. También se realizaron experimentos en presencia de una solución amortiguadora de ph de bicarbonato de sodio al 0.05 M, para la obtención de valores del pk a de este oligonucleótido d-aaagaaa en presencia de varias concentraciones de NaCl en la solución amortiguadora. Además se determinaron valores de pk a para el mismo compuesto a diferentes condiciones, sales y mezclas de alcohol-agua como solvente. Para oligonucleótidos conteniendo dos y tres guaninas en serie también se determinaron valores de pk a y por último también se titularon las moléculas d-cccgccc y d-aagaa para determinar sus valores de pk a. Los valores de pk a obtenidos varían entre 9 y 12, de acuerdo a las condiciones experimentales mencionadas. Entre estos resultados se puede mencionar un valor de pk a determinado para d-aaagaaa en solución acuosa sin sal de a 25 C, así como también el valor de pk a de a 25 C para el mismo oligonucleótido d-aaagaaa en solución acuosa de bicarbonato de sodio al 0.05M como amortiguador de ph, sin otra sal añadida. Los resultados obtenidos son un aporte al conocimiento de las propiedades físicas de los oligo y polinucleótidos, que inciden en forma importante no sólo en técnicas centrales de la biología molecular, por ejemplo en ensayos de hibridación en membranas y microplantillas, sino también en protocolos de ensamblado planeado de estructuras a nanoescala basadas en ADN.

6 SUMMARY The present research project was undertaken to determine pk a values, in the basic range, for the heterocyclic base guanine in a DNA environment, using as model compounds oligonucleotides that contain guanine as the only ionizable base in a background of nonionizable bases, for example, the oligonucleotide d-aaagaaa. This allows to interpret physical changes (e.g. changes in the UV absorption spectrum) attendant on ph shifts to be interpreted directly as reflecting the changes undergone by the sole guanine base in the oligonucleotide. To determine the pk a values, the model compounds of DNA, dissolved in aquous solutions containing different concentrations of NaCl, were titrated with NaOH, the guanine deprotonation transition being monitored by UV absorption spectroscopy. Graphs of various absorbance ratios (e.g. A 275 /A 260, A 270 /A 260, A 255 /A 260, etc.) versus the measured ph were drawn, and the pk a was read off at the midpoint of the sigmoidal transition curve (Clauwaert and Stockx, 1968; Acharya et al., 2002; Acharya et al., & 2003; Airoldi et al., 2003). pk a values for the guanine moiety in the oligonucleotide d-aaagaaa were obtained for several different NaCl concentrations in the aqueous solution. Similarly, experiments for the determination of the pk a for this oligomer were conducted in aqueous solutions buffered with 0.05 M NaHCO 3, at various concentrations of NaCl. pk a determinations for the same compound were also performed at various temperatures and in the presence of different salts, as well as in ethanol/water mixtures of different proportions. pk a determinations were also conducted for oligonucleotides containing two and three guanines in series. Similarly, the molecules d-cccgccc and d-aagaa were also titrated to determine their pk a values. In the experimental conditions examined, the pk a values determined vary in the range from 9 to 12. Among the results we obtained we can cite the pk a value for d-aaagaaa in aqueous solution at 25 C, without added salt, as well as the pk a value of at 25 C found for the same oligonucleotide in aqeouos solution buffered with 0.05 M sodium bicarbonate, without any further added salt. The results obtained in these experiments contribute to our knowledge of the physical properties of the oligo and polynucleotides, which are fundamental materials not only for key techniques in molecular biology, such as hybridization assays on membranes or on microchips, but also in protocols for the directed assembly of nanostructures based on DNA.

7 ÍNDICE ÍNDICE GENERAL.i ÍNDICE DE FIGURAS...v ÍNDICE DE CUADROS.vi ÍNDICE DE GRÁFICAS...viii I. INTRODUCCIÓN..1 II. FUNDAMENTOS TEÓRICOS Biopolímeros Proteínas Polisacáridos Ácidos nucleicos Ácido Desoxirribonucleico (ADN) Propiedades biológicas del ADN Estructura del ADN Oligonucleótidos Nucleótidos Funciones Metabólicas de los Nucleótidos Química de los Nucleótidos Síntesis de Nucleótidos Propiedades de los Oligonucleótidos 16 i

8 2.3.6 Usos de los oligonucleótidos Ionización de las Bases Heterocíclicas Antecedentes III. JUSTIFICACIÓN...22 IV. OBJETIVOS V. MATERIALES Y MÉTODOS Equipos Materiales Reactivos Determinación de las constantes de ionización Determinación del pk a de la base guanina en el oligonucléotido d-aaagaaa en dependencia de la fuerza iónica En solución acuosa sin amortiguador de ph En solución amortiguadora de ph de carbonato/bicarbonato de sodio Mediciones de ph Estudio del efecto de diferentes temperaturas sobre el pk a de la base guanina incorporada en el oligonucléotido d-a 3 GA Estudio del efecto de diferente sales sobre el pk a de la base guanina incorporada en el oligonucléotido d-a 3 GA Determinación del efecto del solvente sobre el pk a de la base guanina incorporada en el oligonucleótido d-a 3 GA Estudio del efecto de hacinamiento de bases de guanina sobre el pk a promediado de las mismas cuando están incorporadas en serie en el oligonucléotido 32 ii

9 5.4.6 Estudio del efecto de la longitud total del oligonucleótido sobre el pka de la base guanina incorporada en el oligonucleótido Estudio del efecto de bases diferentes de adenina como entorno de la guanina incorporada en el oligonucleótido Estudio del comportamiento térmico de los heptámeros d-aaaaaaa, d-aaagaaa y d-cccgccc en solución acuosa a ph Preparación de solución amortiguadora 0.05 M de cacodilato de sodio/hcl, ph Determinación y optimización de la metodología para la evaluación de los datos espectrofotométricos en términos de pk a Seguimiento de ph a lo largo de la titulación.51 VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Determinación de las constantes de ionización Determinación del pk a del grupo guanina en el oligonucleótido d-aaagaaa, en dependencia de la fuerza iónica En solución acuosa sin de amortiguador de ph En solución amortiguadora de ph de carbonato/bicarbonato de sodio Experimentos de control Estudio del efecto de diferentes temperaturas sobre el pk a de la base guanina incorporada en el oligonucléotido d-a 3 GA Estudio del efecto de diferentes sales sobre el pk a de la base guanina incorporada en el oligonucleótido d-a 3 GA Determinación del efecto del solvente sobre el pka de la base guanina incorporada en el oligonucleótido d-a 3 GA 3.65 iii

10 6.1.5 Estudio del efecto de hacinamiento de bases de guanina sobre el pk a promediado de las mismas cuando están incorporadas en serie en el oligonucléotido Estudio del efecto de bases diferentes de adenina como entorno de la guanina incorporada en el oligonucleótido Estudio del comportamiento térmico de los heptámeros d-aaaaaaa, d-aaagaaa y d-cccgccc en solución acuosa a ph Estudio del efecto de la longitud total del oligonucleótido sobre el pka de la base guanina incorporada en el oligonucleótido..72 VII. CONCLUSIONES.74 VIII. PERSPECTIVAS.75 IX. GLOSARIO 76 X. BIBLIOGRAFÍA...81 XI. ANEXOS 85 iv

11 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Dogma central de la biología molecular..4 Figura 2. Tramo de cadena sencilla de ADN con la secuencia local TACG.5 Figura 3. Estructuras de algunas bases menos comunes que se presentan en el ADN...6 Figura 4: Descripción detallada del apareamiento de bases heterocíclicas del ADN.7 Figura 5: Esqueletos azúcar-fosfato y escalones de pares de bases de la doble hélice de ADN... 8 Figura 6: Modelo simplificado de la estructura helicoidal del ADN..9 Figura 7: Modelo de replicación del ADN propuesto por Watson y Crick..10 Figura 8: Reacción de replicación del ADN...11 Figura 9: Reacción de elongación de la cadena catalizada por las polimerasas de ADN.11 Figura 10: Inicio de la síntesis de ADN con un cebador de ARN 12 Figura 11 Estructuras de la adenina y la guanina..14 Figura 12. Nucleósidos derivados de la adenina...15 Figura 13: Bases pirimidínicas.. 15 Figura 14: Nucleósidos derivados de las pirimidinas...15 Figura 15: Nucleótidos del uracilo...16 v

12 ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1: Valores de pk a de los desoxirribonucleósidos. 18 Cuadro 2: Valores de pk a obtenidos por Clauwaert y Stockx (1968)...19 Cuadro 3 Valores de pk a obtenidos por Acharya y col. (2002) 19 Cuadro 4 Valores de pk a obtenidos por Acharya y col. (2003) 19 Cuadro 5 Valores de pk a obtenidos por Airoldi y col. (2003) para poli(da-dt).20 Cuadro 6: Ejemplo de cálculos de ph y de volumen total 28 Cuadro 7: Estimados de los valores de los coeficientes de absorción a diferentes longitudes de onda para el heptámero d-aaagaaa, en ambiente neutral (ph 7)...37 Cuadro 8: Estimados de los valores de los coeficientes de absorción a diferentes longitudes de onda para el heptámero d-aaagaaa, en ambiente alcalino (ph 11.3).37 Cuadro 9: Estimados de los cambios porcentuales en los valores de ε del heptámero d-aaagaaa asociados al cambio de solución neutral a alcalina 38 Cuadro 10: Cálculo de las absorbancias corregidas y de las razones entre absorbancias corregidas, en función del ph calculado de la solución de titulación alcalina de d-aaagaaa con NaOH a 25 C, en presencia de NaCl al 1 M..40 Cuadro 11: Cambios porcentuales experimentales y calculados de razones de absorbancias de ph 7 a ph Cuadro 12: Valores de pk a determinados para d-aaagaaa en solución acuosa sin amortiguador de ph...58 Cuadro 13: Valores de pk a determinados para d-aaagaaa en solución acuosa con NaHCO 3 (0.05 M) como amortiguador de ph...59 Cuadro 14: Valores de pk a determinados para varios compuestos empleando NaHCO 3 (0.05 M) como solución amortiguadora.60 Cuadro 15: Valores de pk a determinados para d-aaagaaa en solución de NaHCO 3 al 0.05 M como solución amortiguadora, a diferentes temperaturas.64 vi

13 Cuadro 16: Valores de pk a determinados para d-aaagaaa en presencia de diferentes sales, a 25ºC...65 Cuadro 17: Valores de pk a determinados para d-aaagaaa en presencia de alcohol etílico a diferentes concentraciones, a 25ºC...66 Cuadro 18: Valores de pk a determinados para varios oligonucleótidos de la forma d-aaag n AAA en solución acuosa de NaHCO 3 al 0.05 M, a 25ºC..68 Cuadro 19: Valores de pk a determinados para oligonucleótidos de la forma d-x 3 GX 3 en solución acuosa sin sal, a 25ºC..70 Cuadro 20: Valores de pk a determinados para oligonucleótidos de la forma d-a n GA n en solución acuosa sin sal a 25ºC...73 vii

14 ÍNDICE DE GRÁFICAS Gráfica 1: Diagrama de bloques descriptivosdel proyecto de investigación 25 Gráfica 2: Datos crudos de titulación de d-aaagaaa con NaOH a 25 C, en presencia de NaCl al 1 M 34 Gráfica 3: Datos de titulación de d-aaagaaa con NaOH a 25 C, en presencia de NaCl al 1 M, corregidos con respecto a A Gráfica 4: Datos de titulación de d-aaagaaa con NaOH a 25 C, en presencia de NaCl al 1 M, corregidos con respecto a A 310 y al volumen.36 Gráfica 5: Valores de absorbancia corregidos para A 310 y para volumen de la solución a diferentes longitudes de onda, a lo largo de la titulación alcalina de d-aaagaaa con NaOH a 25 C, en presencia de NaCl al 1 M...39 Gráfica 6: Razones de absorbancias A 235 */A 260 *, A 240 */A 260 * y A 245 */A 260 * contra ph calculado para el oligonucleótido d-aaagaaa titulado con NaOH a 25 C, en presencia de NaCl al 1 M 44 Gráfica 7: Razones de absorbancias A 250 */A 260 *, A 255 */A 260 * y A 265 */A 260 * contra ph calculado para el oligonucleótido d-aaagaaa titulado con NaOH a 25 C, en presencia de NaCl al 1 M 45 Gráfica 8: Razones de absorbancias A 270 */A 260 *, A 275 */A 260 * y A 280 */A 260 * contra ph calculado para el oligonucleótido d-aaagaaa titulado con NaOH a 25 C, en presencia de NaCl al 1 M 46 Gráfica 9: Razones de absorbancias A 285 */A 260 *, A 290 */A 260 * y A 295 */A 260 * contra ph calculado para el oligonucleótido d-aaagaaa titulado con NaOH a 25 C, en presencia de NaCl al 1 M 47 Gráfica 10: Razón de absorbancias A 270 */A 250 * contra ph calculado para el oligonucleótido d-aaagaaa titulado con NaOH a 25 C, en presencia de NaCl al 1 M...49 Gráfica 11: Correlación entre ph calculado y ph medido potenciometricamente, para solución acuosa de NaCl al 0.01 M, titulada a 25ºC con NaOH 53 Gráfica 12: Método gráfico para la evaluación del pk a basado en la curva de transición determinada por los datos expectrofotométricos...55 Gráfica 13: Valores de pk a determinados para d-aaagaaa en solución acuosa a 25 C, sin amortiguador de ph.58 viii

15 Gráfica 14: Valores de pk a determinados para d-aaagaaa en solución acuosa a 25 C, con NaHCO 3 (0.05 M) como amortiguador de ph...59 Gráfica 15: Valores de pk a determinados para varios compuestos empleando NaHCO 3 al 0.05 M como solución amortiguadora...61 Gráfica 16: Razones de absorbancias A 300 */A 260 *, A 280 */A 260 * y A 275 */A 260 * graficadas contra el ph estandarizado para el oligonucleótido d-aaaaaaa...62 Gráfica 17: Razones de absorbancias A 270 */A 260 *, A 265 */A 260 * y A 255 */A 260 * graficadas contra el ph estandarizado para el oligonucleótido d-aaaaaaa...63 Gráfica 18: Valores de pk a determinados para d-aaagaaa en NaHCO 3 al 0.05 M como solución amortiguadora, aq diferentes temperaturas...64 Gráfica 19: Concentración de NaOH requerida para alcanzar 50% de desprotonación del d-aaagaaa en función de la composición del solvente etanol-agua a 25 C.66 Gráfica 20: Valores de pk a determinados para varios oligonucleótidos de la forma d-aaag n AAA en solución acuosa de NaHCO 3 al 0.05 M, a 25 C.68 Gráfica 21: Titulación alcalina de d-cccgccc mostrando mostrando su gráfica de Hill.70 Gráfica 22: Estudio térmico de d-aaaaaaa y de d-aaagaaa, entre 10ºC y 50ºC..71 Gráfica 23: Estudio térmico de d-cccgccc, entre 10ºC y 50ºC...71 Gráfica 24: Titulación alcalina de d-aagaa mostrando su gráfica de Hill 72 ix

16 1 I. INTRODUCCIÓN Dentro del campo de estudio de las macromoléculas biológicas (biopolímeros), su estructura, cambios e interacciones fisicoquímicas responsables de las funciones biológicas, se ha desarrollado la biofísica molecular. La ciencia de la biofísica se desarrolló después de la Segunda Guerra Mundial, favorecida por la aplicación de la física nuclear a los sistemas biológicos, incluyendo la investigación de los efectos de la radiación sobre la materia viva. En el curso de estos estudios los físicos colaboraron con biólogos y abordaron problemas de la biología, lo que determinó el desarrollo de la biofísica como un nuevo campo científico. El área más importante de estudio de la biofísica abarca el análisis detallado de la estructura de los biopolímeros en los sistemas vivos. El descubrimiento más conocido a este respecto es el modelo del ácido desoxirribonucleico (ADN). Este modelo, que se formuló a partir de los datos de la cristalografía con rayos-x, constituye la base del mayor logro de la biología molecular y de la genética en los últimos años. Técnicas cristalográficas similares han demostrado ser de gran valor en la determinación de las estructuras de la mioglobina y la hemoglobina, pigmentos almacenadores y transportadores, respectivamente, y de enzimas como la lisozima y la ribonucleasa. En la actualidad, el dominio de la biofísica abarca subsistemas biológicos tan reducidos que se estudian mejor con las técnicas de la mecánica cuántica. La biofísica puede ser aplicada también a sistemas biológicos más grandes y a sus interacciones, como las existentes entre varios órganos corporales. Esta ciencia estudia las propiedades fisicoquímicas de las macromoléculas biológicas, principalmente los ácidos nucleicos y las proteínas, centrándose en los arreglos de estas macromoléculas, y se ocupa de la descripción de la forma, estructura, cambios conformacionales, dinámica e interacciones de estos sistemas, con el propósito de descubrir los mecanismos fisicoquímicos responsables de la funcionalidad biológica. Dentro de este marco histórico-científico se llevó a cabo el presente proyecto de investigación: Determinación de las Constantes de Ionización de las Bases Heterocíclicas del ADN en Ambiente Alcalino. Dentro de este campo de la biofísica entendemos que algunos compuestos químicos al disolverse pueden ionizarse, formando cationes y aniones. Pudiendo ser por disociación y/o por asociación, por ejemplo con átomos de hidrógeno con carga positiva: protones (protonación o desprotonación). Cuando el proceso es reversible, se puede calcular un valor característico de cada sustancia llamado constante de ionización (K a ), a determinadas condiciones de temperatura, presión, concentración, etc. (Baeza, 1997) y al calcular el logaritmo decimal del inverso de la K a, se obtiene la constante llamada potencial de la constante de ionización (pk a ). Para la determinación de los mencionados pk a s se aumenta sucesivamente la alcalinidad de la solución y se monitorea la transición de protonación-desprotonación por algún método idóneo (por ejemplo, por espectrofotometría de UV, si la molécula o el grupo involucrado en la protonación-desprotonación absorben en el intervalo de UV y si el espectro de absorción cambia según el estado de protonación-desprotonación).

17 Los compuestos químicos estudiados en el presente trabajo son oligonucleótidos (es decir cadenas cortas de nucleótidos, o sea tramos cortos de ADN) que contienen uno o varios grupos guanina ionizables en medio alcalino, mientras que las demás bases del oligonucleótido (adenina o citosina) no son ionizables en estas condiciones (Bevilacqua, 2003). La presente tesis teniendo como principales capítulos: INTRODUCCIÓN, FUNDAMENTOS TEÓRICOS, OBJETIVOS, JUSTIFICACIÓN, MÉTODOS Y MATERIALES, RESULTADOS Y DISCUSIÓN, CONCLUSIONES, PERSPECTIVAS, GLOSARIO, BIBLIOGRAFÍA y ANEXOS, contiene el desarrollo del proyecto de investigación. 2

18 3 II. FUNDAMENTOS TEÓRICOS En el presente capítulo se exponen los conceptos necesarios para abordar el desarrollo del proyecto de investigación, partiendo desde el tema general de biopolímeros y describiendo los tipos más importantes, centrando la atención en los ácidos nucleicos y los monómeros que los constituyen: los nucleótidos, así como en sus asociaciones moleculares objetos de este proyecto de investigación: los oligonucleótidos, con atención especial en la ionización alcalina de los mismos. 2.1 Biopolímeros Dentro del contexto de la biofísica molecular, podemos poner nuestra atención en los biopolímeros, macromoléculas compuestas de estructuras repetitivas llamadas unidades monoméricas. Toda forma de vida se basa en un sistema de biopolímeros, principalmente ácidos nucleicos, proteínas y polisacáridos. Los biopolímeros de los organismos se hallan ordenados en una jerarquía de creciente complejidad molecular Proteínas Las proteínas son polipéptidos (biopolímeros) formados por polimerización de aminoácidos (monómeros), son esenciales para el funcionamiento, crecimiento y la reparación de los tejidos. Las proteínas son las unidades de trabajo de la célula, actuando como enzimas, hormonas y anticuerpos. La proteína promedio está compuesta por unos 300 aminoácidos. Con 20 aminoácidos disponibles en la naturaleza, tan sólo para polipéptidos de una longitud total de exactamente 300 aminoácidos, existen posibles variedades de moléculas proteínicas Polisacáridos Los polisacáridos son biopolímeros producto de la polimerización de las unidades monoméricas llamadas monosacáridos. A estos últimos se les llama también azúcares. Tanto polisacáridos como monosacáridos también se denominan carbohidratos, este último nombre debido a su aparente composición como hidratos de carbono. Las funciones biológicas principales de los polisacáridos son el almacenamiento de energía (almidón, glucógeno)y, en plantas, la formación de extensas estructuras estáticas como son tallos, troncos y follaje (celulosa) Ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos, el Ácido Ribonucleico (ARN) y el Ácido Desoxirribonucleico (ADN), se forman por polimerización de precursores que se llaman nucleótidos. El ácido nucleico ADN guarda el código genético del organismo (almacenando la información y pasándola a sus descendientes), y la posibilidad de mutaciones en estos polímeros es la base de la evolución. Los ácidos nucleicos dirigen también la formación de proteínas. El ácido nucleico también tiene una variedad de posibles combinaciones diferentes. Los nucleótidos que componen el ARN y el ADN están compuestos por azúcares, fosfatos y bases nitrogenadas (que también se apodan bases heterocíclicas), las bases son conocidas por sus

19 4 iniciales: A (adenina), C (citosina), G (guanina), T (timina) y U (uracilo). Tres de estas bases (A, C y G) se encuentran tanto en el ADN como en el ARN. Sin embargo, T se encuentra casi solamente en el ADN y U se encuentra casi únicamente en el ARN. Mientras que los dos tipos de ácidos nucleicos utilizan cada uno de ellos cuatro tipos de bases, los ácidos nucleicos que se encuentran en el mundo biológico abarcan un enorme intervalo en cuanto a su longitud: los más pequeños, como los ARNs de transferencia, contienen algunas decenas de unidades nucleotídicas o bases (por ejemplo el RNAt para fenilalanina de la levadura, con una longitud de 76 bases), mientras que los más grandes tienen longitudes que se cuentan por centenares de millones de unidades nucleotídicas (por ejemplo, el cromosoma 1 humano, con 245,522,847 pares de base). Así, cada molécula de ácido nucléico tiene un enorme número de combinaciones posibles de bases. Una característica de la molécula genética universal, el ADN, es una alta densidad lineal de carga negativa, ya que cada una de las unidades nucleotídicas que la componen lleva una carga eléctrica negativa en el grupo fosfato. De ahí su alto grado de solubilidad en solventes altamente polares, como el agua, y la posibilidad de precipitar el ADN en solventes de menor polaridad, como el etanol. La alta densidad lineal de carga negativa del ADN es importante para la afinidad de proteínas que se ligan al ADN, puesto que generalmente contienen numerosos grupos con carga positiva (Record y col., 1977; Winter y von Hippel, 1981; Ballin y col., 2004); también explica la repulsión electrostática mutua que existe entre las dos hebras antiparalelas del ADN de doble hélice, repulsión que causa la desnaturalización de la doble hélice en soluciones acuosas de baja fuerza iónica. 2.2 Ácido Desoxirribonucleico (ADN) Propiedades biológicas del ADN Una de las características más llamativas del ADN es que es capaz de codificar una cantidad enorme de información biológica. Una célula fetal de mamífero no diferenciada contiene solamente unos cuantos picogramos (10-12 g) de ADN. No obstante, esta diminuta cantidad de material es suficiente para dirigir la síntesis de un número enorme de proteínas diferentes que determinan la forma y comportamiento bioquímico de una gran variedad de tejidos diferenciados en el animal adulto. El ADN es la macromolécula que en último término controla, principalmente a través de la síntesis de las proteínas, cada aspecto de la función celular. El ADN ejerce este control de acuerdo la figura 1: Figura 1. Dogma central de la biología molecular ( Griffiths, 1986) Esta secuencia del traspaso de información es generalmente conocida como el dogma central de la biología molecular. Para que esta transferencia de información se produzca fielmente, cada molécula antecesora actúa de plantilla para la síntesis del producto siguiente de la secuencia.

20 5 Por tanto, las propiedades biológicas del ADN son, en primer lugar, la determinación final de las propiedades de la célula viva al regular la expresión de la información biológica, principalmente mediante el control de la síntesis proteica. En segundo lugar, aunque no menos importante, el ADN transfiere la información biológica desde una generación a la siguiente, es decir, es esencial para la transmisión de la información genética ( Griffiths, 1986; Bloomfield y col., 2000) Estructura del ADN Estructuralmente, las moléculas de ADN son polinucleótidos, es decir, productos resultantes de la condensación de nucleótidos, de la misma forma que las proteínas se producen por la polimerización de aminoácidos. La estructura covalente de la hebra sencilla consiste de una larga serie de grupos fosfato y grupos de 2-desoxirribosa en estricta alternancia, formando un tallo extendido, donde cada desoxirribosa además está covalentemente enlazada con una de cuatro bases nitrogenadas, a saber, adenina, guanina, timina y citosina. Esto da pie a una extensa estructura esencialmente lineal, que contiene una secuencia específica de bases a lo largo del tallo de la molécula. Localmente, la estructura se presenta como en el ejemplo ilustrado en la Figura 2, que muestra un corto tramo de ADN, con la secuencia TACG. HACIA LA TERMINAL 5 TIMINA ADENINA CITOSINA GUANINA HACIA LA TERMINAL 3 Figura 2: Tramo de cadena sencilla de ADN con la secuencia local TACG (adaptado de Sinden, 1994)

21 6 Los enlaces fosfodiéster entre grupos sucesivos de desoxirribosa siempre conjuntan una funcionalidad hidroxílica 3 de una desoxirribosa con una funcionalidad hidroxílica 5 de la otra desoxirribosa. Este hecho le imparte una direccionalidad definida al tallo del ADN, tanto en un sentido local como en un sentido total, para la hebra entera, la cual, en el caso lineal (es decir, si no está circularmente cerrada sobre sí) tiene claramente definidos un término 5 y un término 3. Esta direccionalidad debe ser claramente entendida cuando se indica una secuencia de bases: en el ejemplo arriba citado, la secuencia es TACG, que se entiende como una secuencia que va (de izquierda a derecha) del término 5 al término 3 ; es netamente diferente de la secuencia GCAT. En la Figura 2, la direccionalidad 5 3 apunta, de manera convencional, desde arriba hacia abajo. Se ha observado que, además de las cuatro bases (adenina, guanina, timina y citosina) comúnmente presentes en el ADN, en algunas especies de mamíferos, en vegetales y en microorganismos, éste puede contener derivados metilados de las bases, como se muestran en la Figura 3: 5-HIDROXIMETILCITOSINA 1-METILCITOSINA Figura 3: Estructuras de bases menos comunes en el ADN (Devlin, 1984) Los polímeros largos de los nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster generalmente reciben la denominación de polinucleótidos, mientras que el término oligonucleótido se usa para los polímeros que contienen pocos nucleótidos (Devlin, 1984; Bloomfield y col., 2000). No existe una longitud definida que separe los campos de aplicabilidad de estos dos términos, y en parte se traslapa el uso de estos dos vocablos. Generalmente, los productos sintéticos rutinariamente usados en el trabajo de biología molecular como cebadores para la secuenciación del ADN por el método de Sanger o para la reacción en cadena de la polimerasa (reacción PCR), que tienen una longitud de alrededor de 20 bases, se denominan oligonucleótidos. La estructura para el ADN que diseñaron Watson y Crick es una doble hélice, parecida a dos muelles entrelazados, donde los muelles son dos estructuras lineales polinucleotídicas que en la literatura científica se designan como hebras. La coherencia entre las dos hebras se da exclusivamente a través de puentes de hidrógeno, que en todos los casos unen una base adenina de una hebra con una base timina contenida en la otra hebra, o una base guanina en una hebra con una base citosina en la otra. Debido a que la unión se da por múltiples enlaces de hidrógeno, en estos pares de base (A:T y G:C) todos los átomos se encuentran prácticamente dentro de un mismo plano; por ende estos pares de base se pueden representar con gran fidelidad en una simple imagen bidimensional. Los detalles, a nivel atómico, de estos pares de base, derivados por el grupo de Arnott y col. (1969) de estudios minuciosos por cristalografía de rayos X, se presentan en la Figura 4:

22 7 Figura 4: Descripción detallada del apareamiento de bases heterocíclicas del ADN, mostrando los pares de bases A:T (arriba) y G:C (abajo) (Arnott y col., 1969) Los dos polidesoxirribonucleótidos involucrados en la formación de la doble hélice se asocian de manera aproximadamente paralela, pero con sus direcciones 5 3 mutuamente opuestas, por lo que se describe a los dos polinucleótidos como antiparalelos en su relación mutua. Las dos hebras no son estrictamente paralelas, ya que sus trayectorias no permanecen dentro de un dado plano, sino que se retuercen en el espacio tridimensional, formando cada una de las hebras una hélice con sentido torsional de mano derecha. Las dos hélices que conforman la doble hélice se enrollan una sobre la otra, por lo que están topológicamente entrelazadas, un hecho que, en le caso de ADN de longitud considerable, puede dificultar la separación completa de las dos hebras, aún en condiciones desnaturalizantes. Una consideración más importante, tanto del punto de vista de la estructura exacta de la doble hélice como de la funcionalidad biológica del ADN, es que, en

23 8 condiciones nativas (ph de la solución acuosa cercano al punto de neutralidad, fuerza iónica considerable, temperatura baja o mediana), las dos hebras del ADN están estrechamente unidas y alineadas mediante puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas de una hebra y las bases nitrogenadas de la otra. La distribución geométrica de los donadores y aceptores de enlaces de hidrógeno en las diferentes bases nitrogenadas del ADN hace que, dentro de la estructura general de la doble hélice, una base adenina de una hebra siempre se enlaza por puentes de hidrógeno con una base timina en la hebra opuesta, y de la misma manera una base guanina se empareja con una base citosina. Figura 5: Esqueletos azúcar-fosfato y escalones de pares de bases de la doble hélice de ADN (Griffiths, 1986) La Figura 5 muestra las dos hebras en su disposición antiparalela, con las bases nitrogenadas de una y otra hebra emparejándose a través de puentes de hidrógeno en el espacio entre las dos hebras, formándose siempre pares de base del tipo A:T o G:C.

24 9 Figura 6: Modelo simplificado de la estructura helicoidal del ADN (Griffiths, 1986) La estructura del ADN de doble hélice (mostrada en la Figura 6), postulada por Watson y Crick (1953a, 1953b) y finalmente confirmada por el trabajo de cristalografía de rayos X del dodecámero autocomplementario d-cgcgaattcgcg (Wing y col., 1980, Drew y col., 1981), provocó una gran excitación entre los genetistas, y en todas las áreas de la Biología, por tres razones fundamentales: 1. La estructura sugería una forma obvia por la que la molécula puede ser duplicada, o replicada, ya que cada base determina a su complementaria mediante puentes de hidrógeno. Hasta entonces, esta propiedad esencial de la molécula genética había sido un misterio. 2. La estructura sugiere una base para la reparación local del ADN, en caso de ocurrir una lesión puntual (por fotones de luz ultravioleta o ataque por algún agente químico), ya que si la lesión ocurre en una de las hebras, la hebra opuesta aún conserva la información genética correcta.

25 10 3. La estructura hace pensar que quizá la secuencia de pares de nucleótidos en el ADN es la que determina la secuencia de aminoácidos de la proteína dictada por un gen. En otras palabras, algún tipo de código genético podría situarse en la secuencia de pares de nucleótidos que lógicamente se debería traducir en la estructura proteica. La figura 7 muestra un diagrama del mecanismo de replicación. Debido a la estricta restricción de emparejamientos impuesta por la estructura del ADN, cada base expuesta se emparejará sólo con su complementaria. Dada esta complementariedad de bases, cada una de las cadenas actuará como molde, o plantilla, y empezará a reproducir una hélice doble idéntica a la que se abrió ( Griffiths, 1986; Bloomfield y col., 2000). Figura 7: Modelo de replicación del ADN propuesto por Watson y Crick (Griffiths, 1986)

26 11 En la célula viva, esta replicación del ADN que se requiere para la formación de nuevas células se da mediante sistemas enzimáticos, de acuerdo a la figura 8: Figura 8: Reacción de replicación del ADN (Griffiths, 1986) Esta reacción requiere como precursores monoméricos la forma trifosfato de los nucleótidos (como el trifosfato de desoxiadenosina o datp). En la figura 9 se ilustra la reacción de elongación de la cadena catalizada por las polimerasas de ADN (Griffiths, 1986; Bloomfield y col., 2000). Figura 9: Reacción de elongación de la cadena catalizada por las polimerasas de ADN (Griffiths, 1986)

27 12 Las enzimas que catalizan estas reacciones se denominan ADN polimerasas dependientes de ADN, ya que en su ensayo in vitro requieren de una hebra de ADN que funja como plantilla o patrón ( template en inglés). La primera enzima de este tipo a ser identificada fue la Polimerasa I de Escherichia coli, una proteína simple de una cadena polipeptídica con un peso molecular de 109 kdal aislada por el grupo de Arthur Kornberg a finales de los años 1950 (Lehman y col., 1958, Bessman y col., 1958). Las polimerasas de ADN pueden alargar una cadena, pero no pueden iniciar una cadena. Por tanto, las síntesis del ADN debe ser iniciada con un cebador, un oligonucleótido que genera un segmento de ADN de doble cadena. La participación del cebador en la replicación del ADN queda esquematizada en la figura 10: Figura 10: Inicio de la síntesis de ADN con un cebador de ARN (Griffiths, 1986)

28 13 Este funcionamiento de las ADN polimerasas se ha usurpado de su contexto biológico natural de replicación o reparación del ADN dentro de la célula viva, para utilizarlo como elemento central en varias técnicas de importancia trascendental para la biología molecular moderna. Tanto la secuenciación del ADN por el método de terminadores (Sanger y col., 1977) como la amplificación de tramos selectos de ADN por la reacción de polimerasa en cadena (PCR, polymerase chain reaction) se basan en el uso de ADN polimerasas (por cierto, una polimerasa termoestable en el segundo caso) que arrancan de cebadores de secuencia determinada (un cebador único en el caso de secuenciación, un par de cebadores determinados en el caso de PCR) para iniciar un proceso de elongación in vitro desde posiciones precisamente definidas sobre la plantilla de ADN de interés. 2.3 Oligonucleótidos Como se mencionó anteriormente los oligonucleótidos son moléculas con secuencias cortas de ribonucleótidos en el caso del ARN y desoxirribonucleótidos en el caso del ADN. Estos nucleótidos como unidades monoméricas se constituyen por un fosfato, el azúcar desoxirribosa en el caso del ADN o ribosa en el caso del ARN, así como la base purínica o pirimidínica, de la manera también ya descrita. Cuando el nucleótido no tiene en su estructura al fosfato se le llama simplemente nucleósido Nucleótidos Los cromosomas son las moléculas que contienen la información genética. Esta información está codificada en las bases nitrogenadas que forman parte de los nucleótidos que son moléculas más complejas al estar formadas también de fosfato y un azúcar como la ribosa o la desoxirribosa. Los nucleótidos purínicos y pirimidínicos son metabolitos extremadamente importantes que participan en muchas funciones celulares. Estas funciones comprenden su actuación como precursores de los ácidos nucleicos, como almacenes de energía, agentes de transferencia de grupos, así como mediadores de la acción hormonal y neurotransmisora. Los nucleótidos se forman de novo en la célula a partir de aminoácidos, ribosa, fosfato y CO 2. La ruta de novo para la síntesis de los nucleótidos requiere un suministro relativamente elevado de energía. Para compensar esto, muchas células tienen rutas muy eficientes de recuperación mediante las que se pueden reutilizar las bases purínicas o pirimidínicas preformadas. Debido a la forma en que se sintetizan o recuperan los nucleótidos, las purinas y las pirimidinas se encuentran en la célula principalmente en forma de nucleótidos. En condiciones normales, las concentraciones de bases o nucleósidos libres son extremadamente pequeñas. Los niveles de nucleótidos en la célula están regulados muy finamente mediante una serie de enzimas controlados alostéricamente en la ruta. Los nucleótidos son los reguladores de estas reacciones (Devlin, T.M. 1984; Bloomfield et al, 2000).

29 Funciones Metabólicas de los Nucleótidos Todos los tipos de células (de mamíferos, bacterianas y vegetales) contienen una gran variedad de nucleótidos y sus derivados. Sus principales funciones son: 1. Papel en el metabolismo energético: El ATP se genera en las células mediante la fosforilación oxidativa y la fosforilación a nivel de sustrato. El ATP se utiliza para impulsar las reacciones metabólicas, como un agente fosforilante, y está implicado en procesos como la contracción muscular, transporte activo y mantenimiento de la integridad de la membrana celular. En su acción como agente fosforilante, el ATP es un dador de fosfato para la generación de los otros nucleósido 5 -trifosfatos (por ej. GTP, UTP, CTP). 2. Unidades monoméricas de los ácidos nucleicos: En las reacciones en las que se sintetizan los ácidos nucleicos, los nucleósido 5 -trifosfatos son los sustratos que se unen al polímero a través de enlaces fosfodiéster 3-5, con liberación de pirofosfato. 3. Mediadores fisiológicos: El AMPc actúa como segundo mensajero en el control de la glucogenólisis y gluconeogénesis mediado por la adrenalina y el glucagón. 4. Componentes de coenzimas: Coenzimas tales como el NAD, FAD y coenzima A son constituyentes metabólicos importantes de las células que están implicados en muchas rutas metabólicas. 5. Intermediarios activados: Los nucleótidos también sirven de portadores de intermediarios activados necesarios para diversas reacciones. Un compuesto tal como la UDP-glucosa es un intermediario clave en la síntesis del glucógeno y de las glucoproteínas. La GDPmanosa, la GDP-fucosa, la UDP-galactosa y el CMP-ácido siálico son intermediarios clave de reacciones en las que las porciones azúcar son transferidas para la síntesis de glucoproteínas. El CTP se utiliza para generar CDP-colina, CDP-etanolamina y CDPdiacilgliceroles los cuales están involucrados en el metabolismo de fosfolípidos (Devlin, T.M., 1984; Bloomfield y col., 2000) Química de los Nucleótidos Los principales derivados purínicos que se encuentran en la célula son los de la adenina y de la guanina, que se muestran en la Figura 11: Figura 11. Estructuras de la adenina y la guanina (Devlin, 1984)

30 15 Los derivados nucleosídicos de estas moléculas contienen ribosa o 2-desoxirribosa unida al anillo de purina mediante un enlace β-n-glucosídico en N-9 (Figura 12). Figura 12. Nucleósidos derivados de la adenina (Devlin, 1984) Los ribonucleósidos contienen ribosa, mientras que los desoxirribonucleósidos contienen desoxirribosa. Los nucleótidos pirimidínicos que se encuentran a mayores concentraciones en la célula son los que contienen las bases pirimidínicas uracilo, citosina y timina (Devlin, 1984; Bloomfield y col., 2000), que se muestran en la Figura 13: Figura 13: Bases pirimidínicas (Devlin, 1984) Los nucleótidos de uracilo y citosina son los componentes pirimidínicos mayoritarios del RNA mientras que los de citosina y timina son los componentes pirimidínicos mayoritarios del DNA. Los nucleósidos de las pirimidinas son uridina, citidina y timidina (Devlin, 1984; Bloomfield y col., 2000) y se muestran en la figura 14: Figura 14: Nucleósidos derivados de las pirimidinas (Devlin, 1984)

31 16 Los ésteres fosfato de los nucleósidos pirimidínicos (nucleótidos) son UMP (uridina monofosfato), CMP (citidina monofosfato), y TMP (timidina monofosfato); sus estructuras se muestran en la Figura 15. En la célula, los principales derivados pirimidínicos se encuentran en forma de tri- y difosfatos (Devlin, 1984; Bloomfield y col., 2000): Figura 15: Nucleótidos del uracilo (Devlin, 1984) Síntesis de Nucleótidos El Ciclo de las Pentosas es la compleja ruta que conecta con el metabolismo de los glúcidos a través de la ribosa o ruta de las pentosas, la base metabólica más trascendental, para la información genética y la actuación de las importantes bases nitrogenadas, ya que a partir de esta ruta sintetizamos los nucleósidos, los nucleótidos y los ácidos nucléicos. Por tanto, la información genética para todos y cada uno de los sistemas enzimáticos que hemos empleado en el metabolismo intermediario depende de la correspondiente información genética de nuestros cromosomas. Asimismo, en esta ruta quedan patentes la formación de las moléculas nucleotídicas como el ATP, GTP, UTP y CTP, que son a su vez claves en la definición y configuración de la energía biológica (Devlin, 1984; Bloomfield y col, 2000) Propiedades de los Oligonucleótidos En ph neutro los oligonucleótidos son polianiones debido a los grupos fosfato que contienen en su estructura. En estas mismas condiciones las bases heterocíclicas debido a su distribución de cargas electrostáticas pueden formar enlaces de puente de hidrógeno, lo cual es crucial para el apareamiento de estas bases, conformándose de esta manera la doble hélice de las moléculas de ADN, en la manera ya detalladamente descrita. En ph ácido y alcalino, las bases heterocíclicas del ADN se ionizan al protonarse o desprotonarse, es decir al ganar o perder protones en diferentes posiciones que serán descritas a detalle más adelante Usos de los oligonucleótidos Los oligonucleótidos con una secuencia de bases predeterminada, son fácilmente asequibles mediante síntesis programadas en máquinas automatizadas, y son utilizados no sólo como cebadores para las dos aplicaciones primordiales anteriormente enunciadas. Otros usos de importancia de estos oligómeros son:

32 17 a) como cebadores en el copiado inicial de ARN a ADN (first-strand synthesis) mediante transcriptasa reversa, para la producción de ADN complementario (cdna) en la construcción de bibliotecas de expresión, b) como sondas específicas en varios protocolos de detección (Southern blots, Northern blots, FISH = fluorescent in-situ hybridization), c) como sondas inmovilizadas en microplantillas para proyectos altamente paralelos de análisis por hibridación, y d) como grapas altamente selectivas para impartir deformaciones específicas a moléculas de ADN de doble hélice, en la construcción planeada de estructuras complejas a nanoescala (Rothemund, 2006). La importancia central de los oligonucleótidos en todas estas aplicaciones hace que un entendimiento profundo de sus propiedades físicas prometa ventajas significativas en su aplicación práctica, por la posibilidad de utilizar estos materiales de una manera más inteligente y refinada. Cabe considerar por ejemplo, que una desnaturalización alcalina más cuidadosa del ADN de doble hélice, en preparación para su secuenciación, servirá para reducir daños químicos que pueden afectar la precisión de la lectura de la secuencia, y que la posibilidad de manipular de manera diferenciada la desnaturalización alcalina o ácida de determinados tramos de un ADN de doble hélice revela la perspectiva de utilizar tales desnaturalizaciones parciales en la construcción planeada de nanoestructuras. Es por estas razones que estudios detallados del comportamiento físico de oligonucleótidos, como se plantea en el presente trabajo para el tema específico de la desprotonación de las bases heterocíclicas dentro del entorno del ADN de hebra sencilla, son de interés en el ambiente científico. 2.4 Ionización de las Bases Heterocíclicas Los compuestos químicos al disolverse pueden presentar un proceso llamado ionización, mediante el cual se forman cationes (partículas con carga positiva) y aniones (partículas con carga negativa). Esto sucede por disociación (separación de sus componentes) y/o por asociación (unión con otras partículas con carga definida), como por ejemplo con átomos de hidrógeno con carga positiva: protones (protonación o desprotonación). Cuando este proceso es reversible, se le puede calcular un valor característico de cada sustancia llamado constante de ionización (K a ) que se expresa en unidades de M (mol/litro), a determinadas condiciones de temperatura, presión, concentración, etc. Cuando al valor numérico de la K a se le calcula el valor del logaritmo decimal de su inverso se obtiene una constante denominada pk a o potencial de la constante de ionización. El pk a es una indicación de la facilidad o dificultad de la protonación o desprotonación. Para el ambiente acuoso, el pk a para una transición de desprotonación es numéricamente igual al valor de ph en que esta transición se da al 50%. El ph o potencial de iones de hidrógeno es una medida de la concentración de iones de hidrógeno (H + ), igual al logaritmo decimal del inverso edel valor numérico de la concentración molar de iones hidrógeno en una solución acuosa, y es una cantidad adimensional. Bajo el término de ambiente alcalino se entienden condiciones de una solución acuosa que implican una mayor concentración de iones OH - que de iones H + (o H 3 O + ) (Baeza, 1997; Bevilacqua, 2003).

33 18 Las bases heterocíclicas del ADN (adenina, guanina, citosina y timina) presentan la mencionada propiedad de ionización. Debido al carácter moderadamente ácido de las bases timina y guanina, estos grupos dentro de nucleótidos, oligonucleótidos o polinucleótidos pueden ceder, en ph alcalino, a los hidrógenos de las posiciones N 3 en la timina y de la N 1 en la guanina. Por ello a estos compuestos se les pueden determinar valores de pk a (Saenger, 1984). Asimismo, el carácter moderadamente básico que exhiben las bases adenina, citosina y guanina, lleva a que, en ambiente ácido, estos grupos pueden ser protonados, en las posiciones N 1, N 3 y N 7, respectivamente. Para los 2 -desoxirribonucleósidos correspondientes, el Cuadro 1 lista los valores de pk a para su protonación (en los casos de 2 -desoxadenosina y 2 -desoxicitidina) o desprotonación (para los casos de 2 -desoxiguanosina y 2 -desoxitimidina). Cuadro 1: Valores de pk a de los desoxirribonucleósidos NUCLEÓSIDO pk a REFERENCIA 2 -desoxiadenosina 3.79 Clauwaert y Stockx, desoxicitidina 4.25 Fox y col., desoxiguanosina 9.52 Clauwaert y Stockx, desoxitimidina 9.8 Fox y Shugar, 1952 Una inspección de este cuadro nos indica que los únicos desoxirribonucleósidos que sufren desprotonación en el ambiente alcalino son la 2 -desoxiguanosina y la 2 - desoxitimidina. Para determinar las mencionadas constantes de ionización se incrementan sucesivamente las condiciones de alcalinidad. El seguimiento de la protonación/desprotonación de las bases heterocíclicas se puede efectuar mediante espectrofotometría UV, ya que estas bases absorben radiación en este intervalo de longitud de onda y que su absorbancia cambia en función de su estado de protonación. En el presente trabajo, las moléculas que se someten a la experimentación son oligonucleótidos que contienen alguna de las bases ionizables en medio alcalino (guanina o timina) y de forma colateral otras bases insensibles al medio alcalino tal como la adenina. Esto permite interpretar los cambios espectrales que tienen lugar en función del ph de la solución inequívocamente en términos de la protonación/desprotonación de la base de interés, mientras que las demás unidades nucleotídicas dentro del oligómero, insensibles al cambio de ph en el intervalo básico, sirven para representar en sus características físicas, el entorno generalizado de ADN. Para seguir con un tratamiento matemático-gráfico de los datos obtenidos de absorbancias determinadas a distintos ph y determinar de esta forma los valores de pk a (Clauwaert y Stockx, 1968; Acharya y col, 2002; 2003; Airoldi y col, 2003). Dentro del fenómeno de la ionización un aspecto importante es la fuerza iónica de la solución, representada por la letra I. Se define como una medida de la intensidad del campo eléctrico creado por los iones existentes en la solución. Puede calcularse por la ecuación: n I=( z i 2 c i )/2 i=1