Dako EnVision+ System-HRP (DAB) Para su uso con anticuerpos primarios de conejo

Transcripción

1 Dako EnVision+ System-HRP (DAB) Para su uso con anticuerpos primarios de conejo Código K ml Código K ml Indicaciones de uso Para uso diagnóstico in vitro. Estas instrucciones se aplican al sistema Dako EnVision+ System, Peroxidase (EnVision+ System, HRP). Este kit está indicado para su uso con anticuerpos primarios de conejo suministrados por el usuario para la identificación cualitativa de antígenos mediante microscopía óptica en tejidos normales y patológicos incluidos en parafina y preparaciones de cortes de tejidos o celulares realizados con cryostat. Pueden utilizarse tejidos procesados con diversos fijadores, entre los que se encuentran el etanol, B-5, Bouin, el formol-zinc y el tampón de formol neutro. Consulte el manual "General Instructions for Immunohistochemical Staining" o las instrucciones del sistema de detección del procedimiento IHC si desea información respecto a: (1) Principios del procedimiento, (2) Materiales necesarios que no se suministran, (3) Almacenamiento, (4) Preparación del espécimen, (5) Procedimiento de tinción, (6) Control de calidad, (7) Resolución de problemas, (8) Interpretación de la tinción, (9) Limitaciones generales. Resumen y explicación Principio del procedimiento Reactivos suministrados El sistema EnVision+ System, HRP es una técnica de tinción IHC que se realiza en dos pasos. El sistema se basa en un polímero marcado de HRP que está conjugado con anticuerpos secundarios. El polímero marcado no contiene avidina ni biotina. Por ello, la tinción no específica que resulta de la actividad endógena avidinabiotina en hígado, riñón, tejido linfático y en cortes realizadas con cryostat puede eliminarse o reducirse significativamente. Todos los reactivos de EnVision+ System, HRP, con la excepción de Liquid DAB+ Substrate-Chromogen, son reactivos listos para su utilización. Este sistema es un método extremadamente sensible y, por ello, las diluciones óptimas de anticuerpo primario son hasta 20 veces superiores comparadas con aquellas que se utilizan en las técnicas PAP más tradicionales y varias veces más altas que las de métodos tradicionales ABC o LSAB. Este protocolo ofrece un sistema de generación de señal potenciada para la detección de antígeno presente a baja concentración, para un aumento de la intensidad de tinción aumentada en compensación por el bajo título del anticuerpo primario. Los anticuerpos primarios de conejo reaccionan bien con el polímero marcado. La interpretación clínica de toda tinción positiva o de su ausencia debe evaluarse en el contexto de la presentación clínica, la morfología y de otros criterios histopatológicos. La actividad de la peroxidasa endógena puede mitigarse procediendo al incubado inicial del espécimen durante cinco minutos en bloqueante de peróxido. A continuación, el espécimen se incuba con un anticuerpo primario de conejo adecuadamente caracterizado y diluido, seguido de la incubación con el polímero marcado, mediante dos incubaciones secuenciales de 30 minutos. Debe mencionarse que para los anticuerpos que precisan digestión enzimática o recuperación de blancos puede ser necesario para aumentar el tiempo de incubación con el anticuerpo primario y marcado con polímero en unos 5 y 10 minutos. La tinción se complete mediante una incubación de 5 a 10 minutos con 3,3 -diaminobenzidina (DAB+) sustrato-cromógeno que produce un precipitado de color en el lugar del antígeno (DAB es un agente potencialmente carcinogénico; consulte la sección Precauciones). Código K4010: En este kit se suministran los siguientes materiales, que son suficientes para el procesado de 150 cortes de tejido, basado en 100 µl por corte: Cantidad Descripción 1x15 ml Bloqueante de peróxido Peróxido de hidrógeno al 0,03% que contiene azida sódica. 1x15 ml Polímero marcado El polímero marcado con peroxidasa conjugado con inmunoglobulinas de cabra anti anticuerpos de conejo en tampón Tris-HCl que contiene una proteína estabilizadora y un agente antimicrobiano. 1x18 ml Tampón sustrato (Substrate Buffer) Solución tampón sustrato, a ph 7,5, que contiene peróxido de hidrógeno y un conservante. ( ) P04047ES_01_K4010_K4011/ p. 1/8

2 1x1 ml DAB+cromógeno líquido (Liquid DAB+ Chromogen) Solución cromógeno de 3,3 -diaminobenzidina. Código K4011: En este kit se suministran los siguientes materiales, que son suficientes para el procesado de cortes de tejido, basado en 100 µl por corte: Cantidad Descripción 1x110 ml Bloqueante de peróxido Peróxido de hidrógeno al 0,03% que contiene azida sódica. 1x110 ml Polímero marcado El polímero marcado con peroxidasa conjugado con inmunoglobulinas de cabra anti anticuerpos de conejo en tampón Tris-HCl que contiene una proteína estabilizadora y un agente antimicrobiano. 1x120 ml Tampón sustrato Solución tampón sustrato, a ph 7,5, que contiene peróxido de hidrógeno y un conservante. 1x5 ml DAB+cromógeno líquido Accesorios 1 Tubo de ensayo calibrado 1 Pipeta de plástico tipo Pasteur Solución cromógeno de 3,3 -diaminobenzidina. Materials required, but not supplied Paños absorbentes para limpieza Tejido de control, positivo y negativo Agente de contratinción; en solución acuosa, como hematoxilina de Mayers o hematoxilina de Mayers modificada por Lillie (código S3309) Cubreobjetos Agua destilada Etanol, absoluto y al 95% Microscopio óptico (20x 800x) Medio de montaje, como medio de montaje Glycergel (código C0563) o medio de montaje en solución acuosa Faramount, listo para su utilización (código S3025) o medio de montaje permanente en solución no acuosa, Ultramount (código S1964) Anticuerpos primarios y reactivo de control negativo Portaobjetos, portaobjetos recubiertos de poli-l-lisina (código S3003) Recipientes o baños de tinción Temporizador (con capacidad para intervalos de 3 40 minutos) Botellas de lavado Solución Wash Buffer Solution Xileno, tolueno o sustituto de xileno Materiales opcionales que se necesitan, que no se suministran Hidróxido de amonio, 15 mol/l diluido al 0,037 mol/l PAP Pen (código S2002) Precauciones 1. Para uso por profesionales. 2. Este producto contiene azida sódica (NaN3), un compuesto altamente tóxico en su forma pura. A las concentraciones en que está presente en el producto, aunque no se clasifican como peligrosas, la azida sódica puede reaccionar con las cañerías de plomo y cobre, formando acumulaciones de azidas metálicas altamente explosivas. En el momento de su desecho, añada grandes cantidades de agua, para impedir que la azida se acumule en las tuberías. 1,2 3. No utilice los reactivos después de la fecha de caducidad para el método de almacenamiento prescrito. Si los reactivos se almacenan en condiciones distintas de las especificadas, éstas deben ser verificadas por el usuario. 4. No sustituya los reactivos por los de otro número de lote o por los de kits procedentes de otros fabricantes. ( ) P04047ES_01_K4010_K4011/ p. 2/8

3 5. Los enzimas y sustrato cromógenos pueden verse afectados si quedan expuestos a niveles de luz demasiados intensos. No almacene los componentes ni realice la tinción bajo una luz demasiado intensa, como la luz solar directa. 6. La aplicación de tiempos o temperaturas de incubación diferentes de los especificados pueden producir resultados; el usuario deberá validar cualquier modificación en este sentido. 7. Como con cualquier producto derivado de fuentes biológicas, deben seguirse los procedimientos de manipulación apropiados. 8. Utilice el equipo de protección personal adecuado para evitar el contacto con los ojos y la piel. 9. Cualquier solución no utilizada debe desecharse con arreglo a las normativas locales, provinciales y nacionales. 10. Los usuarios profesionales pueden solicitar una hoja de datos sobre seguridad. Peligro DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Puede provocar cáncer. H341 Se sospecha que provoca defectos genéticos. P201 Procurarse las instrucciones antes del uso. P202 No manipular antes de haber leído y comprendido todas las precauciones de seguridad. P281 Utilizar el equipo de protección individual obligatorio. P308 + P313 EN CASO DE exposición manifiesta o presunta: Consultar a un médico. P405 Guardar bajo llave. P501 Eliminar el contenido y el recipiente de acuerdo con las normativas locales, regionales, nacionales e internacionales. Almacenamiento Los reactivos de EnVision+ System, HRP pueden almacenarse a una temperatura entre 2 8 C. No se deben congelar. No los utilice después de la fecha de caducidad impresa en los viales de reactivos y las etiquetas del producto. Cualquier alteración en el aspecto de cualquiera de los reactivos, como la aparición de precipitados puede indicar la inestabilidad o deterioro del kit. En estos casos, el/los reactivo(s) no deben utilizarse. No existen signos claros que indiquen que este producto sea inestable. Por lo tanto, los controles positivos y negativos deben realizarse simultáneamente con las muestras del paciente. Si observan tinciones inesperadas que no puedan atribuirse a las variaciones en los procedimientos de laboratorio y sospecha que existe un problema con el producto, contacte con el servicio de asistencia técnica de Dako. Preparación del reactivo Es conveniente preparar los siguientes reactivos antes de proceder a la tinción. Solución Wash Buffer Solution Se recomienda utilizar la solución TBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (código S3006) como solución tampón de lavado en la detección IHC tanto automatizada como manual. Las soluciones TBS, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline (código S1968) y PBS 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (código S3024) también son adecuadas como soluciones tampón de lavado en tinciones manuales. No se recomienda el uso de solución de lavado que contenga azida sódica. La presencia de azida sódica inactiva la peroxidasa (HRP, por sus siglas en inglés) lo que supone una tinción negativa. Almacene la solución tampón no utilizada a una temperatura entre 2 y 8 C. Deseche dicha solución si aparecen turbiedades. Puede utilizar agua destilada para aclara el bloqueante de peroxidasa, el sustrato y el agente de contratinción. Anticuerpo primario Dako también suministra anticuerpos concentrados; sin embargo, el procedimiento óptimo debe determinarlo y verificarlo el usuario. Dada la gran sensibilidad del sistema EnVision+ System, HRP las diluciones de anticuerpos primarios pueden ser entre cinco y veinte veces superiores a las de los métodos IHC tradicionales. Las diluciones deben prepararse utilizándose un diluyente que contenga 0,05 mol/l tampón Tris con 1% de seroalbúmina bovina (BSA, por sus siglas en inglés) (Antibody Diluent, código S0809). Con la mayoría de los anticuerpos primarios que se utilizan con este kit, tiempos de incubación de 30 minutos son suficientes. Los anticuerpos NP-Series Plus listos para su utilización se optimizan cuando se utilizan con el sistema Dako Plus, y es por ello que se recomienda su utilización con este sistema de detección de alta sensibilidad. Dako también suministra anticuerpos concentrados. El usuario final debe optimizar los anticuerpos concentrados. Las diluciones deben prepararse utilizándose diluyente de anticuerpos Antibody Diluent (código S0809) u otro diluyente que contenga 0,05 mol/l tampón Tris con 1% de seroalbúmina bovina (BSA, por sus siglas en inglés). Los anticuerpos Dako N-Series listo para su utilización no están optimizados para su utilización con los sistemas de detección Dako Plus. ( ) P04047ES_01_K4010_K4011/ p. 3/8

4 Reactivo de control negativo Lo ideal es que el reactivo de control negativo contenga un anticuerpo que muestre una reactividad no específica en tejidos humanos o suero normal/ no inmune en la misma matriz/solución que el anticuerpo o primario diluido. El reactivo de control negativo debe ser de la misma subclase y especie animal que el anticuerpo primario, diluido en la misma concentración de inmunoglobulina o proteína que el anticuerpo primario diluido y utilizando el mismo diluyente. El periodo de incubación del reactivo de control negativo debe corresponder a la del anticuerpo primario. Siempre que utilice los anticuerpos Dako NP-Series Plus listos para su utilización, se recomienda utilizar un reactivo de control negativo Universal Negative Control(s)+. Estos reactivos de control han sido optimizados para su utilización tanto con anticuerpos NP-Series Plus listos para su utilización de ratón (código NP015) o de conejo (código NP001). Solución sustrato-cromógeno El protocolo para la preparación de 1 ml de solución sustrato-cromógeno solución que sigue a continuación es suficiente para el procesado de hasta diez cortes de tejido o hasta cinco extensiones de células. Paso 1 Paso 2 Dependiendo del número de portaobjetos que se desee teñir, transfiera un número suficiente de partes alícuotas de 1 ml de solución tampón de la botella 3a (tampón sustrato) al tubo de ensayo calibrado que se suministra. Por cada 1 ml de tampón, añada una gota (aproximadamente 20 µl) de la botella 3b DAB cromógeno (Liquid DAB+ Chromogen). Mezcle inmediatamente y aplíquelo inmediatamente a los cortes de tejido con la pipeta Pasteur que se suministra. La solución sustrato-cromógeno se mantiene estable aproximadamente cinco días siempre que se almacene a una temperatura entre 2 y 8 C. Esta solución debe mezclarse minuciosamente antes de su utilización. La calidad de la tinción no se verá afectada por la formación de precipitado en la solución. Aclare abundantemente el tubo de ensayo y la pipeta después de cada uso. Si se utiliza en su totalidad, el volumen de 18 ml de solución tampón de sustrato que se suministra en el producto K4010 es suficiente para realizar 150 pruebas. Es posible que quede una cantidad remanente de solución. Si se utiliza en su totalidad, el volumen de 120 ml de solución tampón de sustrato que se suministra en el producto K4011 es suficiente para realizar 1100 pruebas. Es posible que quede una cantidad remanente de solución. Agente de contratinción El producto final coloreado de la reacción de tinción es insoluble en alcohol y puede utilizarse con un agente de contratinción como la hematoxilina de Mayer o la hematoxilina de Mayer modificada por Lillie (código S3309). Tras la contratinción con hematoxilina, realice un aclarado abundante en agua destilada y, seguidamente, sumerja los cortes de tejido en un baño de amoníaco 0,037 mol/l o agente azulante similar. El agua de amoniaco 0,037 mol/l se prepara mezclando 2,5 ml de hidróxido de amonio 15 mol/l (concentrado) a un 1 litro de agua. El agua de amoníaco 0,037 mol/l que no se utilice puede conservarse a temperatura ambiente (20 25 C) en un frasco tapado herméticamente hasta 12 meses. Consulte las indicaciones del fabricante si desea conocer procedimientos de contratinción alternativos. Medio de montaje Se recomienda utilizar medio de montaje Glycergel Mounting Medium (código C0563) o medio Faramount, Aqueous Mounting Medium, listo para utilizar (código S3025) para el montaje en solución acuosa. Glycergel debe calentarse como mínimo a 50 C justo antes de su utilización. También puede utilizarse el medio de montaje en solución no acuosa (Ultramount, código S1964). Preparación de especímenes Consulte el manual "General Instructions for Immunohistochemical Staining" o la hoja de especificaciones del anticuerpo. Antes de proceder a la tinción IHC, los tejidos deben estar fijados y procesados. La fijación evita la autólisis y la putrefacción de los tejidos extraídos, mantiene su antigenicidad, potencia el índice de refracción de los constituyentes del tejido y aumenta la resistencia de los elementos celulares al procesado de la muestra. El procesado del tejido supone su deshidratación, la retirada de los agentes deshidratantes, la infiltración del medio de inclusión, y la inclusión y seccionado del tejido. Los fijadores que suelen utilizarse en la preparación de tejidos para IHC se detallan en las instrucciones General Instructions for Immunihistochemical Staining. Los datos que se aportan son a título informativo. El procedimiento óptimo debe determinarlo y verificarlo el usuario. ( ) P04047ES_01_K4010_K4011/ p. 4/8

5 Procedimiento de tinción Notas referentes al procedimiento El usuario debe leer estas instrucciones atentamente y familiarizarse con los productos antes de su utilización. Los reactivos y las instrucciones suministrados con este kit están pensados para un rendimiento óptimo. Una nueva dilución de los reactivos o la alteración de los tiempos o las temperaturas de incubación pueden dar lugar a resultados erróneos. Todos los reactivos deben equilibrarse a temperatura ambiente (20 25 C) antes de la inmunotinción. De forma similar, todas las incubaciones deben realizarse a temperatura ambiente. No deje que los cortes de tejido se sequen durante el procedimiento de tinción. Los cortes de tejido que se hayan secado durante el proceso pueden mostrar una mayor tinción no específica. Cubra los portaobjetos que estén expuestos a corrientes de aire. Si se utilizan incubaciones prolongadas, coloque los tejidos en un ambiente húmedo. La sensibilidad del sistema EnVision+ System, HRP puede aumentarse prolongando los tiempos de incubación de los pasos 2 y 3 entre 5 y 10 minutos. Protocolo de tinción PASO 1 BLOQUEANTE DE PEROXIDASA Elimine el exceso de líquido golpeando suavemente los portaobjetos. Con la ayuda de una tela sin pelusa (como una toallita Kimwipe o una gasa), limpie cuidadosamente alrededor del espécimen para eliminar cualquier líquido presente y conservar los reactivos dentro del área especificada. Aplique suficiente bloqueante de peroxidasa Peroxidase Block de la botella 1 como para cubrir el espécimen. Incúbelo 5 (±1) minutos. Aclárelo suavemente con agua destilada procedente o solución tampón procedente de un frasco de lavado. (no aplique el flujo directamente sobre el tejido) y colóquelo en un baño de tampón. PASO 2 ANTICUERPO PRIMARIO O REACTIVO DE CONTROL NEGATIVO Elimine el exceso de líquido golpeando suavemente los portaobjetos y límpielos de la forma indicada anteriormente. Aplique suficiente anticuerpo primario diluido o reactivo de control negativo para cubrir el espécimen. Incúbelo 30 (±1) minutos. Aclárelo suavemente con solución de lavado procedente de la botella de lavado. (no aplique el flujo directamente sobre el tejido) y colóquelo en un baño de tampón. Si debe interrumpirse el procedimiento de tinción, los portaobjetos pueden guardarse en un baño de tampón después de la incubación del anticuerpo primario (paso 2) como máximo una hora a temperatura ambiente (20 25 C) sin que afecte al rendimiento de la tinción. PASO 3 POLÍMERO MARCADO DE PEROXIDASA Elimine el exceso de líquido golpeando suavemente los portaobjetos y límpielos de la forma indicada anteriormente. Aplique suficiente polímero marcado Labelled Polymer de la Botella 2 para cubrir el espécimen. Incúbelo 30 (±1) minutos. Aclare los portaobjetos como en el paso 2. PASO 4 SUSTRATO-CROMÓGENO Limpie los portaobjetos como se indica anteriormente. Aplique suficiente solución líquida DAB+ sustrato-cromógeno como para cubrir el espécimen (consulte la sección Preparación del reactivo). Incúbelo entre 5 y 10 minutos. Aclárelo suavemente con agua destilada procedente de la botella de lavado (no aplique el flujo directamente sobre el tejido). Recoja los residuos de sustrato-cromógeno en un contenedor para materiales peligrosos para desecharlos de forma apropiada. PASO 5 HEMATOXILINA PARA CONTRATINCIÓN (opcional) Sumerja los portaobjetos en un baño de hematoxilina en solución acuosa (código S3309). La duración de la incubación depende de la concentración de la hematoxilina que se utilice. Aclare suavemente en un baño de agua destilada. Sumerja los portaobjetos 10 veces en un baño de 0,037 mol/l de amoníaco o agente azulante similar. Aclare los portaobjetos suavemente en un baño de agua destilada o desionizada entre 2 y 5 minutos. PASO 6 MONTAJE Los especímenes pueden montarse y taparse con cubreobjetos con un medio de montaje acuoso como Glycergel Mounting Medium (código C0563) o Faramount (código S3025) o un medio de montaje permanente en solución no acuosa, Ultramount (código S1964). Los portaobjetos también pueden deshidratarse y montarse permanentemente. ( ) P04047ES_01_K4010_K4011/ p. 5/8

6 Control de calidad Las diferencias que pueden darse en el procesado de las muestras o técnicas en el laboratorio del usuario puede suponer una variabilidad significativa de los resultados obtenidos, lo que establece una necesidad de realización de controles propios. Consulte las indicaciones de control de calidad del Programa de certificación de inmunocitoquímica del Colegio de patólogos americanos (CAP, por sus siglas en inglés) y las referencias 3 a 5 si desea información adicional. Consulte los detalles relativos a sensibilidad e inmunorreactividad en el prospecto de cada anticuerpo primario que se utilice. Consulte el manual "General Instructions for Immunohistochemical Staining" si desea información respecto a los controles positivo y negativo. Interpretación de la tinción Limitaciones Consulte el manual "General Instructions for Immunohistochemical Staining" si desea indicaciones para la interpretación de la tinción. Consulte el manual "General Instructions for Immunohistochemical Staining" si desea indicaciones sobre las limitaciones generales. El resultado de la tinción de tejidos depende de la manipulación y el procesamiento al que someta el tejido antes de su tinción. Una técnica incorrecta en el fijado, congelado, descongelado, lavado, secado, calentado o seccionado, o la contaminación por contacto con otros tejidos o líquidos, puede producir artefactos o resultados falso negativos. La utilización de fiadores antiguos o no tamponados, o la aplicación de calor excesivo durante el procedimiento de inclusión (temperaturas superiores a 60 C) puede suponer una disminución de la sensibilidad. Puede detectarse actividad de la peroxidasa endógena o pseudoperoxidasa en hemoproteínas como son la hemoglobina, mioglobina, citocromo y catalasa, así como en eosinófilos. 6,7 Esta actividad puede inhibirse incubando los especímenes con el bloqueante de peroxidasa Peroxidase Block Botella 1 del sistema Dako EnVision+ System, HRP durante cinco minutos antes de la aplicación del anticuerpo primario. Las extensiones de sangre y de médula ósea congeladas pueden tratarse con este reactivo. Sin embargo, este procedimiento no anula el pigmento marrón rojizo de las hemoproteínas. También puede utilizarse una solución de metanol y peróxido de hidrógeno, sin embargo. Sin embargo, algunos antígenos puede desnaturalizarse en este proceso. Es posible que los tejidos de las personas infectadas con el virus de la hepatitis B y con antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) muestren tinción no específica con peroxidasa. 8 El suero normal o no inmune de la misma fuente animal que el antisuero secundario utilizado en los pasos bloqueantes puede causar resultados falso negativos o falso-positivos dada la presencia de auto-anticuerpos o anticuerpos naturales. Los reactivos se han diluido de forma óptima. Una nueva dilución puede ocasionar la pérdida de la tinción antigénica. Resolución de problemas Problema Posible causa Medida sugerida 1. Los portaobjetos no se tiñeron. 1a. Los reactivos no se utilizaron en el orden correcto. 1b. El baño de tampón contenía azida sódica. 1a. Revise la aplicación de los reactivos. 1b. Utilice un tampón recientemente preparado sin azida. 2. Todos los portaobjetos aparecen débilmente teñidos. 3. Todos los portaobjetos muestran un exceso de tinción de fondo. 2a. Los cortes retuvieron demasiada solución de lavado. 2b. No se incubó los portaobjetos con los anticuerpos o la mezcla de sustrato durante un periodo de tiempo suficientemente prolongado. 3a. Los especímenes presentan una alta actividad de peroxidasa. 3b. No se ha retirado toda la parafina. 2a. Elimine el exceso de líquido golpeando suavemente los portaobjetos antes de limpiar alrededor de la sección. 2b. Revise los tiempos de incubación que se recomiendan. 3a. Utilice un periodo de incubación más prolongado con el bloqueante de peroxidasa, botella 1. 3b. Utilice baños de xilol o tolueno sin utilizar. Si varios portaobjetos se tiñen simultáneamente, el segundo baño de xilol debe contener xilol fresco. ( ) P04047ES_01_K4010_K4011/ p. 6/8

7 3c. Los portaobjetos no se han aclarado adecuadamente. 3d. Se ha producido una reacción de sustrato más rápida que la esperada debido a, por ejemplo, una temperatura ambiente demasiado alta. 3e. Las secciones se secaron durante el procedimiento de tinción. 3f. Enlace no específico de reactivos a los cortes de tejidos. 3g. El anticuerpo primario estaba demasiado concentrado. 3c. Utilice soluciones recientemente preparadas en los baños de tampón y en las botellas de lavado. También puede utilizarse una solución TBST 0.05 mol/ltris Buffer que contenga 0,3 mol/l NaCl y 0,1% Tween (código S3306). 3d. Utilice un periodo de incubación más corto con la solución sustrato-cromógeno. 3e. Utilice una cámara húmeda. Limpie sólo de tres a cuatro portaobjetos a la vez antes de aplicar el reactivo 3f. Aplique una solución de bloqueo que contenga proteínas. 3g. Utilice una mayor dilución del anticuerpo primario. NOTA: si el problema no puede atribuirse a ninguna de las causas aquí citadas, o si la medida de correctiva que se sugiere no resuelve el problema, llame a los Servicios técnicos de Dako para obtener más ayuda. Puede encontrar información adicional sobre las técnicas de tinción y preparación de especimenes en el manual Handbook -Immunochemical Staining Methods 9 (disponible de Dako), del Atlas of Immunohistology 10 y del Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 11 Referencias Referencias adicionales 1. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. April 30, Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4 5. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73: Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako Corporation Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3 8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct ( ) P04047ES_01_K4010_K4011/ p. 7/8

8 Edition 07/15 ( ) P04047ES_01_K4010_K4011/ p. 8/8