UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE QUIMICA

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1 i UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE QUIMICA ESTUDIO DE LA GENERACIÓN DE COLOR CARAMELO EN SISTEMAS GLUCOSA- FRUCTOSA Y AMONÍACO Trabajo especial de grado presentado ante la ilustre Universidad Central de Venezuela por la Br Noroska Salazar para optar al título de Licenciada en Química Caracas, abril, 2009

2 ii Los abajo firmantes asignados por la Universidad Central de Venezuela, como integrantes del jurado examinador del trabajo Especial de Grado titulado: ESTUDIO DE LA GENERACIÓN DE COLOR CARAMELO EN SISTEMAS GLUCOSA FRUCTOSA Y AMONÍACO. Presentado por la Br. Noroska Salazar, certificamos que este trabajo cumple con los requisitos exigidos por nuestra Magna Casa de Estudios para optar por el título de Licenciado en Química. Dr. Andrés Escalona, Dr Julio Herrera (Directores) Dra Rosa Amaro Nombres y Apellidos (Jurado) Dra Adriana Bravo Nombres y Apellidos (Jurado)

3 iii INDICE GENERAL LISTA DE ABREVIATURAS... 1 RESUMEN INTRODUCCIÓN Marco teórico Color Caramelo Clasificación del color caramelo y su uso en la industria alimenticia Clases de color caramelo Estabilidad del color caramelo y su uso en la industria Reacción de caramelización o degradación de azúcares a altas temperaturas Factores que afectan la velocidad de pardeamiento durante la caramelización Reacción de Maillard Pasos de la reacción de Maillard Etapa inicial: Condensación, enolización, rearreglo de Amadori y Heyns Etapa intermedia: Deshidratación de azúcares para formar compuestos α dicarbonilos, HMF, reductonas y pigmentos Etapa Final: retroaldolización, condensaciones aldólicas y la degradación de Strecker Reacción de agua amoniacal con azúcares reductoras Mecanismos de reacción entre azúcares reductoras y agua amoniacal Importancia de los Imidazoles durante la elaboración de color caramelo clase III (E150): Factores que afectan la velocidad de pardeamiento... 31

4 iv 2.7 Melanoidinas Cuantificación de las melanoidinas Factores que afectan la composición de las melanoidinas y sus estructuras hipotéticas ph, Temperatura y tiempo Tipo de azúcares reductoras Relación azúcar-aminocompuesto Metodos cromatográficos Métodos de tratamiento de muestra Objetivos de la investigación Objetivo General Objetivos Específicos Metodología Experimental Métodos Medidas de color Actividad de agua (a w ) Efecto de la actividad de agua inicial sobre la intensidad de oscurecimiento Efecto del cambio de ph inicial sobre la intensidad de oscurecimiento Efecto del ph inicial sobre la actividad de agua Efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno sobre la intensidad de oscurecimiento Efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno sobre la actividad de agua Efecto de la temperatura sobre la intensidad de oscurecimiento Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua Nitrógeno libre en los colorantes... 61

5 v Análisis por electroforesis Optimización de azúcar invertida, seguimiento del HMF y formación de 4- metilimidazol Optimización del Azúcar invertida Seguimiento del HMF Formación de 4-metilimidazol Determinación de compuestos de aroma Resultados y discusión Optimización de la reacción de inversión para la formación de azúcares reductoras Factores que afectan la intensidad de oscurecimiento Efecto de la actividad de agua y el ph sobre la intensidad de oscurecimiento Efecto de la actividad de agua inicial sobre la intensidad de oscurecimiento Efecto del ph sobre la intensidad de oscurecimiento no enzimático Efecto del ph sobre la actividad de agua Efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno sobre la intensidad de color Efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno sobre la actividad de agua Efecto de la temperatura en la intensidad de oscurecimiento no enzimático Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua Nitrógeno libre durante la formación de color Determinación de HMF Formación de 4 metil-imidazol Electroforesis Determinación de compuestos de aroma... 99

6 vi 6 Conclusiones ANEXOS REFERENCIAS

7 vii INDICE DE TABLAS Tabla 1.- Características de los tipos de color caramelo... 6 Tabla 2.- Porcentaje de azúcar acíclica en función del cambio de ph Tabla 3.- Cambios en la composición de las melanoidinas variando tiempo, ph, y temperatura Tabla 4.- Cambio en la cantidad de nitrógeno incorporado a la molécula variando el azúcar reductora Tabla 5.- Cambio en la composición de melanoidinas variando la relación molar glucosa-glicina Tabla 6. Condiciones de trabajo para el estudio del efecto de la actividad de agua a ph 10, Tabla 7. Condiciones de trabajo para el estudio del efecto de la actividad de agua a ph 5, Tabla 8. Condiciones de trabajo para el estudio del efecto de la actividad de agua a ph 7, Tabla 9. Condiciones de trabajo para el estudio del efecto relación molar sacarosa/nitrógeno Tabla 10. Variación del contenido de azúcares durante la reacción de inversión de sacarosa (75% p/p), 100ºC Tabla 11 Variación del contenido de azúcares durante la reacción de inversión de sacarosa (82% p/p), 100ºC Tabla 12. Efecto de la concentración inicial de sacarosa sobre la formación del color y actividad de agua. Condiciones de reacción: ph inicial (10,65 ± 0,07), temperatura (100 ± 1) ºC y relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno Tabla 13.Efecto de la concentración inicial de sacarosa sobre la formación del color y actividad de agua. Condiciones de reacción: ph inicial (5,06 ± 0,05), temperatura (100 ± 1) ºC y relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno

8 viii Tabla 14. Efecto de la concentración inicial de sacarosa sobre la formación del color y actividad de agua. Condiciones de reacción: ph inicial (7,06 ± 0,08), temperatura (100 ± 1) ºC y relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno Tabla 15.Efecto de la temperatura y ph sobre la velocidad media de formación de color luego de 5 horas, para ph 10,65, 7,06 y 5, Tabla 16. Efecto de la temperatura y ph sobre el cambio de velocidad media de actividad de agua luego de 5 horas, para ph 10,65, 7,06 y 5,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3: Tabla 17. Compuestos identificados en el perfil de volátiles de los tres colores caramelos preparados

9 ix INDICE DE FIGURAS Figura 1.- Estructuras hipotéticas de las melanoidinas formadas durante la reacción de caramelización Figura 2.- Reacciones que ocurren durante la caramelización Figura 3.- 1,2 y 2,3 enolización de glucosa y formación de HMF (5-Hidroximetilfurfural), HDF (hidroxidimetilfuranona) y HAF(2-hidroxiacetilfurano) vía 3 y 4 deoxiosulosa Precursores de la caramelización Figura 4.- Esquema de reacción Glucosa/ Glicina adaptado de Tressl (1995) AMP (Productos avanzados de Maillard), 3DH (3-Deoxyaldocetosa), 1DH (1-deoxy-2,3 dicetosa, 4DH (4-deoxy-2,3dicetosa) Figura 5.- Condensación y enolización de la glucosa para la formación de la glucosilamina, y subsecuente rearreglo de la misma para la formación de Amadori Figura 6.- Esquema general del rearreglo de Heyns Figura 7.- Rearreglo de Amadori en medio básico Figura 8.- Rearreglo de Amadori en medio ácido Figura 9.- Rearreglo de Heyns en medio básico Figura 10.- Rearreglo de Heyns en medio ácido Figura 11.- Producción de α dicarbonilos: 1-Deoxy-2.3-hexodisulosa, 1-amino-1,4- dideoxy-2,3hexodiolosa, 3-deoxy-2hexosulosa Figura 12.- Producción de HMF a partir de la 3-deoxy-2hexosulosa, y algunos de los productos por los cuales es reprimido en presencia de aminas primarias Figura 13.- Formación de reductonas Figura 14.- Derivados de las azúcares, que pueden dar compuestos coloreados Figura 15.- Productos de retroaldolización: compuesto coloreados Figura 16.- Algunos ácidos productos de la reacción de Maillard... 24

10 x Figura 17.- Degradación de Strecker y formación de amoníaco Figura 18.- Producción de Pirazinas por la formación previa de glucosilamina y fructosilamina Figura 19.- Producción de Imidazoles por la formación previa de la glucosilamina y fructosilamina Figura 20.- Formación de imidazoles por fragmentación de moleculas Figura 21.- Reacción de compuestos dicarbonilos con amoníaco Figura 22.- Intensidad de color en función de la actividad de agua (oscurecimiento no enzimático) Figura 23.- Efecto de la relación molar azúcar-aminoácido sobre la reacción de oscurecimiento, D glucosa-glicina relación A 1:1.5, B 1:1, C 2:1, D: 10:1, contenido de agua 65%, temperatura 65ºC Figura 24.- Efecto del ph sobre el oscurecimiento, (L) lisina, (AR) arginina, (G) glucosa, calentado a 121ºC durante 10 min Figura 25.- Melanoidinas de bajo peso Figura 26.- Formación de una macromolécula (melanoidina) Figura 27.- Hipótesis de una macromolécula (melanoidina) Figura 28.- Esquema de formación: polímeros con nitrógeno, y polímeros sin nitrogeno Figura 29.- Formación de melanoidinas de bajo peso molecular, sin contenido de nitrógeno Figura 30. Velocidad media de formación de color a 100 ºC en función de la actividad de agua inicial para una condición de ph 10,65, 5,06 y 7,06 y una relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno Figura 31. Efecto de la actividad de agua sobre la formación de color a ph (10,65±0,07), relación molar 3,3:1 sacarosa/ nitrógeno y a una temperatura de (100±1) ºC Figura 32 Efecto de la actividad de agua sobre la formación de color a ph (5,06±0,05), relación molar 3,3:1 sacarosa/ nitrógeno y a una temperatura de (100±1) ºC... 72

11 xi Figura 33. Efecto de la actividad de agua sobre la formación de color a ph (7,06±0,08), relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno y a una temperatura de (100±1) ºC Figura 34. Efecto del ph sobre la formación de color, RM 3,3:1 sacarosa/nitrógeno, Temperatura 100ºC Figura 35.Efecto del ph sobre la actividad de agua durante las reacciones de formación de color a 100ºC. La relación molar sacarosa/nitrógeno fue 3,3: Figura 36. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la formación de color, a ph 10,65, y 100ºC de temperatura Figura 37.. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la formación de color, a ph 5,06, y 100ºC de temperatura Figura 38. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la intensidad de oscurecimiento no enzimático, a ph 7,06, y 100ºC de temperatura Figura 39. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la actividad de agua, durante la formación de color a 100 ºC y ph 10, Figura 40. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la actividad de agua, durante la formación de color a 100 ºC y ph 5, Figura 41 Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la actividad de agua, durante la formación de color a 100 ºC y ph 7, Figura 42 Efecto de la temperatura sobre la formación de color ph 10,65, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3: Figura 43 Efecto de la temperatura sobre la formación de color ph 7,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3: Figura 44 Efecto de la temperatura sobre la formación de color ph 5,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3: Figura 45 Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua, durante la formación de color a y ph 10,65. relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3: Figura 46 Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua, durante la formación de color a ph 5,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:

12 xii Figura 47 Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua, durante la formación de color a ph 7,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3: Figura 48 Consumo de nitrógeno a través del tiempo, ph 10,65, 7,06 y 5,06 relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1, 100ºC Figura 49 Variación de ph a través del tiempo, ph 10,65, 7,06 y 5,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 y 100ºC Figura 50 Variación de HMF en función del tiempo a ph 10,65, 7,06 y 5,06, relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno y 100ºC Figura 51 Variación de la concentración de 4-metilimidazol en función del tiempo a ph 5,06, 10,65 y 7,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 y 100ºC Figura 52 Electroforesis. Condiciones de reacción ph 10,65; 7,06 y 5,06, relación molar sacarosa/nitrógeno 3,3:1 y 100ºC Figura 53 Perfil de volátiles de los caramelos preparados a diferentes ph

13 xiii Dedicatorias A mi papá Oscar Salazar el mejor hombre del mundo, gracias mi viejito lindo por estar ahí en todas mis etapas por llevarme de la mano, por tus consejos, por tu paciencia, por enseñarme cada día un poco más de la vida, soy lo que soy por ti, GRACIAS eres mi vida!, tu junto a mi mama son mi ejemplo de lucha, Te amo A mi mamita bella Norka de Salazar por enseñarme a tener tolerancia por todo el apoyo por entender mis sacrificios, por acompañarme todas las noches de trasnocho, por todo el ánimo que me brindabas junto a mi padre cada vez que decaía y por darme un poquito de toda tu energía mental positiva para que todo saliera como lo queremos y como Dios nos lo permitió, te amo mamita. A mi tía Nadeska mi segunda madre, este logro es tuyo también me llevaste de la mano desde mi nacimiento, nunca me dejaste solita viviste junto a mis padres cada etapa de mi vida ayudándome a crecer cada día mas. Eres una excelente mujer este es solo el comienzo de muchos triunfos familiares, vamos pa lante tía! A mi perrita perla maría a ti por llenarme de alegría cada día cada que el estress y la preocupación me contagiaba Gracias Dios por darme no cantidad de familia sino CALIDAD este logro es de ustedes. Los ama su hija Noroska Salazar

14 xiv Agradecimientos A mi Dios, por darme la vida, una familia tan maravillosa, gracias mi Señor por guiar mis pasos, por llenarme de sabiduría entendimiento y ganas de luchar cada día. A ti este título. A mi alma mater la Universidad Central de Venezuela, por brindarme la oportunidad de cursar mis estudios superiores, y dejarme conocer tanta gente maravillosa. A la profesora Inés Tovar por creer en mí! A mis amigos inseparables mi Glo!, Alexis, Omar, Virginia, Christian, Héctor, Jenireé a todos gracias por ser la familia que uno puede escoger, por formar parte de este logro y por acompañarme en cada etapa que fuimos superando, este es solo el comienzo de miles de triunfos los quiero. A Empresas Polar por permitirme realizar mi trabajo especial de grado, por brindarme conocer personas tan especiales como Adriana Bravo, Graciela Troncone (mi madre) gracias Graciela por no atenerte a ser solo mi supervisora, gracias por guiarme en cada paso, gracias por el apoyo, gracias por ser una gran amiga, gracias por adoptarme!, Lorena Reverol, Carlos Prazuela, Paula Guerra gracias por creer en mí, por ayudarme a crecer en mi ámbito profesional, y sobre todo por hacerme cada día mas ameno el laboratorio. A las amigas bellas, Marianela Conde, Odry Vivas, Genesis Carrillo, Myriam Montbrum, Raquel Rodriguez, Katheryn Zambrano todos ustedes son lo máximo de la gerencia de soporte científico, los quiero!. A mis tutores Julio Herrera y Andrés Escalona, por ser guías principales de este proyecto de investigación, por todos los conocimientos impartidos, gracias por las nuevas enseñanzas.

15 1 LISTA DE ABREVIATURAS a w : actividad de agua CLAR: Cromatografía Liquida de Alta Resolución DAD: Detector de arreglo de diodos EFS: Extracción en fase solida GM: Cromatografía gases-masas HMF: 5-hidroximetilfurfural RM: relación molar SDS: Poliacrilamida gel electroforesis (sodia dodecil sulfato) TEMED: N,N,N,N tetrametilendiamina Va w m: Velocidad media de actividad de agua VCm: Velocidad media de formación de color VFm4MEI: Velocidad media de formación del 4-metil imidazol VHMFm: Velocidad media de formación de 5-hidroximetilfurfural 4MeI: 4-metilimidazol

16 2 RESUMEN El color caramelo es un colorante aplicable en bebidas malteadas. El objetivo de este proyecto es el estudio de los factores que afectan la formación de color tales como a w, RM sacarosa/nitrógeno, ph y temperatura, para ello se optimizó la formación de azúcares reductoras, se medió HMF y 4-metil-imidazol. Se determinó la concentración de nitrógeno libre, determinación de pesos moleculares y aislamiento de compuestos aromáticos la metodología fue: para la formación de color se hicieron medidas de absorbancia y el factor respuesta fue intensidad de color EBC, se hizo un seguimiento del precursor HMF, 4-metilimidazol y optimización de azúcares reductoras por CLAR, pesos moleculares por electroforesis y los compuestos aromáticos por GM, los resultados fueron los siguientes: Mayor porcentaje de azúcares reductoras a los diez minutos de inversión. La a w dio un efecto significativo para las tres condiciones de ph de estudio (10,65±0,07, 7,06±0,08 y 5,06±0,05), se obtuvo un máximo de VCm mientras se varió la a w del sistema, a menor ph la mayor VCm se encontró a mayor a w La intensidad de oscurecimiento para aquellas reacciones con a w a la optima fueron aumentando progresivamente, mientras que para aquellas reacciones con a w < a la optima la formación de color parece detenerse luego de las primeras horas de reacción. Para sistemas de ph 7,06±0,08 y 5,06±0,05, se observó una solidificación después de 7 horas de reacción. Solo en sistemas de ph 10,65±0,07 se obtuvieron altos valores de intensidad de color. La VCm es mayor para phs 7,06±0,08 y 5,06±0,05. En los sistemas de ph 7,06±0,08 y 5,06±0,05 se obtiene una mayor Va w m. A mayor RM sacarosa/nitrógeno la intensidad de color es mayor. Disminuir la RM sacarosa/nitrógeno a condiciones de phs 7,06±0,08 y 5,06±0,05 conduce a una formación de sólidos en un mayor tiempo de reacción, al igual que disminuir la temperatura. La Va w m para diferentes RM sacarosa/nitrógeno a ph 10,65±0,07 es diferente, mientras que. La Va w m para diferentes RM sacarosa/nitrógeno a ph 7,06±0,08 y 5,06±0,05 es igual. Una mayor temperatura produce mayor intensidad de color, para 15ºC aumentados a condiciones de ph 10,65±0,07 se obtuvo una intensidad de color 3 veces mayor y para condiciones

17 3 de ph 7,06±0,08 y 5,06±0,05 se obtuvo una intensidad de color 4 veces mayor. Una mayor temperatura bajo las condiciones de estudio conlleva a una Va w m entre 2 y 3 veces mayor. A condiciones de ph 7,06±0,08 y 5,06±0,05 el consumo de nitrógeno es incompleto. La formación de HMF se favorece a phs bajos. La formación de 4- metilimidazol se favorece a condiciones de ph básico. El compuesto 4-metilimidazol se produce en las primeras horas de reacción hasta llegar a un máximo luego del cual comienza a consumirse y disminuye en el tiempo. Los pesos moleculares tienen un rango de y Da, el compuesto furfural es mayoritario a phs menores, mientras que compuesto como ác. acético, 1-hidroxi-acetona y el 2-acetil furano, aumentan con el ph, el 2-metil-benzofurano disminuye.

18 4 1 INTRODUCCIÓN El color caramelo es un colorante de gran interés para la industria de alimentos debido a que su uso se ha extendido a muchos productos, tanto alimentos como bebidas. Existen varios tipos de color caramelo, los cuales difieren en sus dos propiedades fundamentales: potencial de tinción (intensidad de color que aporta al producto) y carga eléctrica de las moléculas coloreadas en solución. La aplicación de los diferentes tipos de color caramelo en los sistemas alimenticios y bebidas, depende tanto de los requerimientos sensoriales del producto (intensidad del color y en algunos aporte de sabor) como de la compatibilidad del colorante con el ph del producto, para evitar floculaciones y precipitaciones. La aplicación de un color caramelo a un producto específico puede requerir de cambios en las propiedades del mismo la cual se logra a través del control de la reacción que lleva a la formación de los compuestos de color. La reacción de formación de color caramelo es conocida por el hombre desde hace mucho tiempo. La receta tradicional llamada caramelización es utilizada en todo el mundo tanto a nivel casero como industrial. El primer estudio de la reacción de formación de color fue realizada por Louis Maillard en 1912, quien demostró que el calentamiento de los alimentos producía la degradación de los azúcares la que conllevaba a la formación de compuestos de aroma, color y sabor, perdiendo además valor nutritivo. El color caramelo es ampliamente utilizado en la industria de bebidas, especialmente en la fabricación de cervezas oscuras, refrescos, maltas entre otras, en los cuales juegan un papel muy importante al aportar su color y aroma característicos El objetivo de este proyecto estará orientado hacia el estudio de los factores que afectan la formación de color caramelo con la finalidad de generar un producto aplicable en bebidas malteadas.

19 5 2 MARCO TEÓRICO 2.1 Color Caramelo Los colores caramelos se utilizan para dar color en alimentos y bebidas. Este no es más que el resultado del tratamiento térmico controlado de hidratos de carbono, por lo general, jarabe de azúcar invertida (glucosa y fructosa) en la presencia de ácidos sales, o álcalis 1. Según la FDA (Food and Drug Administration ) es un producto amorfo que va desde un color amarillo pálido hasta un pardo profundo 2, y tiene un olor a azúcar quemada y un sabor un tanto amargo. Entre las propiedades que deben tener estos colorantes, según la FDA, es tener alto grado de pureza (grado alimenticio) y ser solubles en agua 3, inertes, y físicamente estables cuando se almacenan adecuadamente, así como también debe ser totalmente estériles Clasificación del color caramelo y su uso en la industria alimenticia Clases de color caramelo El comité de expertos en aditivos alimenticios (JECFA) de la Organización para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y de la Organización Mundial de la Salud (OMS), dividió el color caramelo en cuatro clases dependiendo de los sustratos utilizados y su uso en la industria 4. Clase I: Es el elaborado por un proceso equivalente al de caramelización, se lleva a cabo manteniendo las azúcares a altas temperaturas, con o sin álcalis o ácidos presentes, no contiene ni amonio ni compuestos con sulfitos, su manera de elaboración genera una carga coloidal ligeramente negativa 4. Clase II: Es preparado por el calentamiento de las azúcares con o sin ácidos o álcalis en la presencia de compuestos que contienen sulfito, el amonio no es utilizado 4, y el sulfito brinda en este tipo de caramelo una carga coloidal negativa.

20 6 Clase III: Se prepara por calentamiento de las azúcares con o sin ácidos o álcalis, en presencia de amonio o sales de amonio, compuestos que tengan sulfito no son utilizados 4, el Ion amonio brinda a este tipo de caramelo una fuerte carga coloidal positiva. Clase IV: Preparado por calentamiento de las azúcares con o sin ácidos o álcalis en presencia de ambos compuestos tanto amonio como sulfito 4, sin embargo contiene más sulfito que amonio, por su forma de preparación este caramelo tiene una carga coloidal negativa. La siguiente tabla resume las características de los cuatro tipos de color caramelo: Tabla 1.- Características de los tipos de color caramelo 2 Parámetro Tipo I Tipo II Tipo III Tipo IV Intensidad de color* Nitrógeno total # (%) <0.1 < Sulfuro Total (%) < < Carga coloidal Negativa Negativa Positiva Negativa Punto Isolectrico ,5-2 *Absorbancia de una solución de caramelo en agua al 0,1 % (p/v), medida en un celda de 1 cm a 610 nm y expresada en base sólida total 2 # El porcentaje de nitrógeno se refiere al incorporado en las moléculas del colorante y el libre debe ser cero Estabilidad del color caramelo y su uso en la industria Las moléculas del color caramelo poseen carga positiva o negativa dependiendo de los reactantes utilizados durante su producción, siendo la mayoría de carga negativa. Una de las propiedades fundamentales de estos colorantes es su estabilidad

21 7 coloidal, la cual depende de su punto isoeléctrico. El punto isoeléctrico es el ph en el cual la carga coloidal del color caramelo es neutra. La estabilidad coloidal es una característica del color caramelo y en muchas aplicaciones determina qué producto debe ser utilizado. Por ejemplo los refrescos necesitan un caramelo con un punto isoeléctrico por debajo del ph de esta bebida, el refresco tiene un ph aproximadamente de 3 y el color caramelo útil para evitar floculaciones en el mismo es el clase IV de carga negativa que tiene un punto isoeléctrico generalmente entre 0.5 y 2 2, además es compatible con bebidas de bajo ph 5 El color caramelo clase I es exigido en colas para dar al producto un color hacia el rojizo o amarillo, por tener una ligera carga negativa es estable en este tipo de productos solo si la bebida tiene un ph por debajo de También es usado para dar una atractiva luz amarilla en la leche, y es útil como rocío de azúcares en las galletas y para bebidas que contengan un alto porcentaje de alcohol 5, además de que su manera de preparación le permite tener mayor producción de compuestos de sabor 6 Por su parte el color caramelo clase II es usado también para bebidas de alto contenido de alcohol especialmente que tengan extractos vegetales 5 debido a su carga negativa y así asegurar la compatibilidad del colorante en su matriz. La malta es la bebida de la excepción ya que posee requerimientos especiales. El ph del producto final es aproximadamente 4 2 y para evitar floculaciones se necesita un caramelo con un punto isoeléctrico mayor a éste 6 es decir, que al ph de la malta las moléculas de colorante se encuentren cargadas positivamente y no precipiten, y el único colorante de carga positiva es el color caramelo clase III que además tiene un punto isoeléctrico que está alrededor de 5 y 7. Adicionalmente entre las exigencias del producto está el requerir un fuerte potencial de tinción. En este sentido, el amoníaco y sobre todo el uso de las sales de amonio mejoran el potencial de tinción del caramelo. Sin embargo, la principal desventaja de este método de preparación es la posible

22 8 formación de 4-metilimidazol, conocido como un agente neurotóxico. Para mejorar el potencial de tinción y disminuir la producción de 4-metilimidazol, han sido descritos procedimientos tales como, la adición de óxido de magnesio en cantidades catalíticas o la adición de aminoácidos en forma libre o de sales, que permiten producir un caramelo cáustico con un alto grado de tinción 6. Además de esto el color caramelo ayuda a proteger los sabores del producto del deterioro causado por la luz, en cervezas por ejemplo 2. También en bebidas sin alcohol como el refresco, entre la fase acuosa y los taninos o terpenos (saborizantes), materia vegetal que está cargadas negativamente 2, un colorante con esta misma carga coloidal ayudaría como agente emulsionante. 2.3 Reacción de caramelización o degradación de azúcares a altas temperaturas Es el método más antiguo para producir color y sabor en los alimentos. En la reacción de caramelización las azúcares se someten a temperaturas mayores de 120º C y un ph entre 3 y 9. La aparición del color pardo oscuro es debido a la formación de polímeros mejor conocidos como melanoidinas. El mecanismo de esta reacción no se conoce en su totalidad ya que es una reacción bastante compleja, que ocurre en varias etapas y no se conocen todos los intermediarios de este proceso 7. Las melanoidinas son compuestos de alto peso molecular que se forman por la polimerización de 5-hidroximetilfurfural (HMF) y 2-hidroxiacetilfurano (HAF). Se sugiere que los compuestos coloreadas tienen las siguientes estructuras:

23 9 Figura 1.- Estructuras hipotéticas de las melanoidinas formadas durante la reacción de caramelización 7. La secuencia de reacción de la caramelización viene dada por la degradación del azúcar, y contiene los siguientes pasos: enolización, conocida como el rearreglo de Brujin van Eckenstein, deshidratación, β-eliminación, una descarboxilación, reacción retro aldólica, luego una condensación aldólica y por último una reacción radical. La enolización es considerada la parte inicial de la reacción ya que seguida a ella se dan el resto de las reacciones antes mencionadas, que pueden degradar las azúcares para continuar reaccionando y dar compuestos heterocíclicos que contengan oxigeno así como también compuestos carbocíclicos vía condensación aldólica. La secuencia de reacciones de caramelización se muestra en la siguiente figura:

24 Figura 2.- Reacciones que ocurren durante la caramelización 7 10

25 11 La reacción procede principalmente vía 1,2 o 2,3 enolización del azúcar y por β- eliminación de agua llevando así a la formación de las 1, 3 y 4-hexosulosas. La ciclización intramolecular y luego la deshidratación puede dar una extensa gama de O- heterociclos entre ellos furanos y pironas 7, obteniendose compuestos como HMF, HAF e hidroxidimetilfuranona (HDF). Es importante destacar que las reacciones de deshidratación generan aproximadamente el 40% del peso de agua del sistema 7. La figura 3 muestra la reacción de formación de los precursores de las melanoidinas. Figura 3.- 1,2 y 2,3 enolización de glucosa y formación de HMF (5-Hidroximetilfurfural), HDF (hidroxidimetilfuranona) y HAF(2-hidroxiacetilfurano) vía 3 y 4 deoxiosulosa 7 Precursores de la caramelización.

26 12 La reacción de caramelización puede ser seguida por la aparición de HMF 7. Se ha observado que mientras haya una mayor degradación de fructosa y glucosa mayor será la concentración de este intermediario Factores que afectan la velocidad de pardeamiento durante la caramelización La caramelización es afectada por parámetros tales como el ph, la concentración del sustrato (azúcar) y la temperatura. ph: El efecto del ph sobre la caramelización depende directamente de los reactivos de partida, por ejemplo, cuando el reactivo es un disacárido como la sacarosa, maltosa etc., el proceso es acelerado a ph bajos 7 para lograr hidrolizar rápidamente la sacarosa y así producir las azúcares reductoras fructosa y glucosa necesarias para producir el complejo de reacciones siguientes. Por otra parte cuando se trata directamente con monosacáridos es diferente y depende del grado de degradación del mismo a las nuevas condiciones de ph. Por ejemplo en un estudio de la velocidad de pardeamiento de una solución de glucosa en estado líquido, se observó que la reacción tuvo un aumento con el incremento del ph y a valores de temperatura media, dicho experimento fue realizado con glucosa sola a 100º C y un rango de ph desde 4 a A medida que el ph del medio aumentó, la tasa de pardeamiento era mayor 8. Se ha reportado que cuanto más alta es la basicidad del medio donde se encuentra la solución de azúcar, mayor es la intensidad del pardeamiento 8. Los más altos niveles de degradación de glucosa se produjeron durante los primeros minutos de ebullición de la solución a un ph de aproximadamente 11. Lo cual indica el alto grado de destrucción de la glucosa a 100º C en condiciones alcalinas 8 Concentración: La concentración del jarabe es muy importante y altos valores de este a una temperatura por encima de la ambiente y ph neutro fue estudiado como

27 13 parámetro importante. En soluciones muy concentradas de sacarosa se tiene un leve retraso en la degradación de la misma. Sin embargo luego de una fase inicial de demora, el contenido de sacarosa desciende rápidamente produciendo las azúcares reductoras para luego disminuir la fructosa, glucosa y comenzar a formar el intermediario HMF, así como también pudo ser identificado el 5-metilfurfural por cromatografía liquida de alta eficiencia. 9. Se sugiere que este cambio de fase en cuanto a la demora de la degradación del contenido de sacarosa se deba principalmente a un efecto catalítico natural durante la reacción de caramelización ya que a medida que transcurre la misma se forman ácidos débiles, acelerando de esta manera dicha reacción y degradando la sacarosa hacia la formación de fructosa y glucosa 8. Esto es consistente con lo mencionado anteriormente en la aceleración del proceso de caramelización (con disacáridos) a phs bajos. Sin embargo en sistemas donde haya una reducción extrema de agua (alta concentración de azúcar) se minimiza la movilidad molecular afectando de igual manera la cinética de reacción 9. Temperatura: El efecto de la temperatura acelera significativamente la caramelización ya que afecta la cinética de reacción. Este efecto se traduce en la dependencia de los parámetros cinéticos hacia la temperatura, y puede ser expresada ampliamente con la Ecuación de Arrhenius 9, a mayor temperatura mayor movimiento de moléculas, al incrementarse la energía cinética se incrementa la velocidad de reacción. 2.4 Reacción de Maillard La reacción de Maillard es responsable de la formación de compuestos de aroma, sabor y color en los alimentos, además durante esta reacción se generan una amplia gama de productos importantes para el valor nutritivo de los alimentos, así como también la formación de compuestos tóxicos y mutagénicos 10

28 14 La reacción de condensación entre grupos carbonilo y grupos amino, comúnmente llamada reacción de oscurecimiento no enzimático o reacción de Maillard, ha sido objeto de revisión durante muchos años. Las primeras investigaciones acerca de la reacción de azúcares reductoras con aminoácidos fue hecha en el año 1912 por Maillard 11. Posteriormente Amadori reportó dos productos de reacción, que describió como los isómeros estables e inestables 11. Más tarde se mostró luego que la glucosilamina producto de la reacción entre el compuesto amino y el carbonilo (el isómero inestable) es formado primero y sufre un rearreglo hasta formar una aminocetona (el isómero estable).en la literatura se reporta que las mismas reacciones correspondientes a las cetonas con aminoácidos, dan como resultado la formación de aminoaldosas, los cuales mas tarde contribuyeron al entendimiento de la fase temprana de la reacción de Maillard 11 A pesar de los muchos resultados que se han tenido a través del tiempo todavía no es posible presentar un esquema completo de la reacción de Maillard. Como datos tenemos solo pocos productos de reacción que han sido aislados e identificados. Estos productos que han sido caracterizados son preponderablemente aquellos que son estables y no han sufrido mayores cambios a través del tiempo en la reacción o durante el aislamiento del mismo. Cada compuesto puede servir como indicador de los pasos de la reacción de Maillard. Sin embargo algunas dificultades son encontradas durante el aislamiento de intermediarios, estos son presentados en muy pocas cantidades durante la reacción, los cuales cumplen un papel muy importante en la producción del oscurecimiento y de las sustancias de alto peso molecular (melanoidinas). La reacción de Maillard de aminoácidos con azúcares reductoras difiere de la reacción con aminas de la siguiente manera El grupo α-amino reacciona fácilmente con compuestos α-dicarbonilo, además los mismos están propensos a la oxidación y descarboxilación a través de la degradación de Strecker 11

29 15 Por lo tanto el esquema de reacción para ambas reacciones es el mismo (figura 4). Lo que se trata de ilustrar con este esquema es el hecho de que los intermediarios clave para la formación de melanoidinas son los 1-,3- y 4- deoxyosulosas, además de que a ph mayores de 7 se ven favorecidos los compuestos que dan sabor. Figura 4.- Esquema de reacción Glucosa/ Glicina adaptado de George Njoroge (1989) 11 AMP (Productos avanzados de Maillard), 3DH (3-Deoxyaldocetosa), 1DH (1-deoxy-2,3 dicetosa, 4DH (4-deoxy-2,3dicetosa)

30 Pasos de la reacción de Maillard Etapa inicial: Condensación, enolización, rearreglo de Amadori y Heyns12 Condensación y enolización: Los grupos aminos que son nucleófilos fuertes reaccionan con el grupo carbonilo del azúcar, para la formación de la glucosilamina, esto es mostrado en la figura 5. Rearreglo de Amadori y Heyns: Las glucosilamina de aminoácidos o aminas alifáticas son usualmente detectadas en muy pequeñas cantidades, ellas pueden sufrir un rearreglo vía aminoenol y así formar el rearreglo de Amadori. Entre las azúcares reductoras con las que se trabajará tenemos la fructosa por esto es relevante mencionar el rearreglo de Heyns que es mostrado en la figura 6, se puede asumir que los compuestos de Amadori y Heyns se descomponen de forma paralela 13. Existen reportes de que ambos rearreglo son dado tanto a ph ácido como básico, esto es ilustrado en las figuras 7, 8, 9 y 10

31 17 Glucosa Glucosilamina Imina Rearreglo de Amadori Figura 5.- Condensación y enolización de la glucosa para la formación de la glucosilamina, y subsecuente rearreglo de la misma para la formación de Amadori 13 Fructosa Fructosilamina Rearreglo de Heyns Figura 6.- Esquema general del rearreglo de Heyns 13

32 18 D-Glucosilamina 1-Amino-1-deoxy-α-D-Fructopyranosa (Rearreglo de Amadori) Figura 7.- Rearreglo de Amadori en medio básico 16

33 19 Figura 8.- Rearreglo de Amadori en medio ácido 16 D-Fructosilamina 2-Amino-2-deoxy-α-D-glucopyranosa (Rearreglo de Heyns) Figura 9.- Rearreglo de Heyns en medio básico 16

34 20 Figura 10.- Rearreglo de Heyns en medio ácido Etapa intermedia: Deshidratación de azúcares para formar compuestos α dicarbonilos, HMF, reductonas y pigmentos 12 Producción de compuestos α dicarbonilos: Los compuestos α dicarbonilos son los más reactivos y los intermediarios más importantes en la formación de color aroma y sabor en la reacción de Maillard, la formación de estos es producto de las seguidas reacciones antes mencionadas y son mejor ilustradas en la figura 11.

35 21 Rearreglo vía enediol Rearreglo de Amadori 1-Deoxy-2.3-hexodisulosa 1-amino-1,4-dideoxy-2,3hexodiolosa Rearreglo vía aminoenol 3-deoxy-2hexosulosa Figura 11.- Producción de α dicarbonilos: 1-Deoxy-2.3-hexodisulosa, 1-amino-1,4-dideoxy- 2,3hexodiolosa, 3-deoxy-2hexosulosa 13 Producción de 5-hidroximetilfurfural (HMF): el HMF es un producto secundario que es utilizado comúnmente en la caramelización para el seguimiento de la reacción, este se da a través del intermediario 3-deoxy-2hexosulosa, sin embargo su aparición se puede ver en gran medida reprimida por aminas primarias para obtener en su lugar pirroaldehídos y pirididiumbetainas, la aparición de estos

36 22 últimos y el poco rendimiento del HMF demuestra que la incorporación de los amino compuesto toma parte como precursores de la reacción de Maillard 13, esto es mostrado en la siguiente figura. 3-deoxy-2hexosulosa 5-hidroximetil-2-furfural (HMF) Pirroaldehído Piridinium Figura 12.- Producción de HMF a partir de la 3-deoxy-2hexosulosa, y algunos de los productos por los cuales es reprimido en presencia de aminas primarias 16 Se ha reportado en la literatura que la formación de HMF está relacionada con el ph a valores bajos se da la formación de furfural (proveniente de pentosas) y de 5- hidroximetilfurfural, HMF (proveniente de hexosas), y a altos valores de ph predomina la formación de furanonas 22.

37 23 Formación de Reductonas: Son un grupo de derivados de los carbohidratos los cuales tienen un grupo carbonilo vecinal a un grupo enediol, estas se caracterizan por tener un fuerte poder reductor en medio acido aun a bajas temperaturas, sin embargo su estructura no es conocida con certeza, es probable que estas reductonas puedan sufrir reacciones de oscurecimiento y dar un aporte a este mucho más rápido que las azucares comunes, la formación de reductonas puede ser mejor ilustrado en la figura 13, dichas reacciones pertenecen a la clase oxidativa, sin embargo esto no quiere decir que se excluirán de las otras reacciones por el contrario son un aporte al oscurecimiento, aunque todo compuesto carbonilo broncea mucho más rápido en presencia de un amino compuesto. 1-Deoxy-2.3-hexodisulosa Acetilfomoina Reductona Figura 13.- Formación de reductonas Etapa Final: retroaldolización, condensaciones aldólicas y la degradación de Strecker En la etapa final se llevan a cabo reacciones que llevan a la formación de aldehídos y N-heterociclos a elevadas temperaturas donde se genera dióxido de carbono y se forman las melanoidinas. 12

38 24 Retroaldolización y condensaciones aldólicas: Muchas azúcares o derivados de ellas pueden sufrir retroaldolización, y estas a su vez reacciones de condensación, que forman compuestos coloreados 13, esto es ilustrado en las figuras 14 y 15. HCHO HOH 2C-CHO OHC-CHO H 3C-CO-CH 2OH HOH 2 C-CO-CH 2 OH H 3 C-CO-CO-CH 3 H 3 C-CO-COCH 2 OH Figura 14.- Derivados de las azúcares, que pueden dar compuestos coloreados 13 Figura 15.- Productos de retroaldolización: compuesto coloreados 13 Estos productos de retroaldolización pueden de cierta manera acelerar la reacción de Maillard, debido a que poseen una alta reactividad en reacciones de condensación. Sin embargo los mismo se dan muy lentos cuando entre los productos de partida está un disacárido esto se debe a que la retroaldolización solo se puede dar luego de la hidrólisis y rompimiento del grupo glucósido 13. La retroaldolización está envuelta también en la formación de ácidos tales como el acido β-hidroxipropionico y el acido láctico que en conjunto con las reductonas son las responsables de la disminución del ph durante el transcurso de la reacción, estos producto son mostrados a continuación. Acido β-hidroxipropionico Acido láctico. Figura 16.- Algunos ácidos productos de la reacción de Maillard 16

39 25 Degradación de Strecker: es una de las reacciones más importantes asociadas con la formación de compuestos de aroma, la cual involucra transferencia de un grupo amino desde un α-aminoácido, vía base de shiff como intermedio para formar un compuesto α-dicarbonílico, la base de shiff se descarboxila y después de una hidrólisis se genera un aldehído y un aminocarbonílico. El aldehído formado posee un átomo de carbono menos que el aminoácido de partida y el compuesto α- aminocarbonílico, esto es ilustrado en la figura 17, estos productos son altamente reactivos y puede condensar con otra molécula similar para generar heterociclos de nitrógeno 13 Figura 17.- Degradación de Strecker y formación de amoníaco 13 La importancia de la degradación de Strecker reside en el hecho de que los aminoácidos pueden proporcionar amoníaco y aldehídos 13 al igual que pueden continuar reaccionando a través de condensaciones acelerando de esta manera la reacción de Maillard. Todos estos intermediarios y compuestos formados son altamente reactivos y pueden participar en nuevas reacciones con los grupos aminos, posteriormente en una fase avanzada dar una serie de reacciones que llevan incluidas ciclaciones, deshidrataciones, reordenamientos, isomerizaciones y condensaciones las cuales conducen a la formación de los polímeros y co-polímeros llamados melanoidinas.

40 Reacción de agua amoniacal con azúcares reductoras Como es bien conocido las azúcares reaccionan con agua amoniacal para producir compuestos heterocíclicos en bajo rendimiento. Los productos de reacción de mono y disacáridos con soluciones concentradas de amonio dependen de tres factores: (1) el tiempo en que la reacción procede, (2) la temperatura de reacción y (3) el catalizador usado 14. Las reacciones de azúcares con agua amoniacal se asemejan a las reacciones de azúcares con aminas (Maillard) en medio alcalino 15, los productos de estas azúcares cuando se calientan en presencia de amoniaco forman muchos compuestos substituidos como imidazoles, pirazinas y pocas piridinas 16. A bajas temperaturas y a menor tiempo de reacción la D-glucosa, D-fructosa reaccionan con agua amoniacal para dar como resultado un polímero de alto peso molecular de color oscuro llamado melanoidinas 16,como mínimo 15 compuestos son formados de una simple azúcar 16. A elevadas temperaturas estas azúcares reaccionan mucho más rápido trayendo consigo en su mayoría productos como imidazoles y pirazinas Mecanismos de reacción entre azúcares reductoras y agua amoniacal Mecanismo de formación de pirazinas e imidazoles: ya que el rearreglo de Amadori y Heyns se lleva a cabo en ph alcalino en base a esto se proponen dos teorías (a) la previa formación de la glucosilamina y el rearreglo de Amadori y Heyns (b) el mecanismo de fragmentación (a)formación previa de la glucosilamina-fructosilamina para luego dar el rearreglo de Amadori y Heyns, este mecanismo de reacción es ilustrado en la figura 18

41 Figura 18.- Producción de Pirazinas por la formación previa de glucosilamina y fructosilamina 16 27

42 28 Figura 19.- Producción de Imidazoles por la formación previa de la glucosilamina y fructosilamina 16 Esta hipótesis consta en la formación de 2-amino-2-deoxy-D-glucosa o de D-fructosa y amoníaco, sin una fragmentación anterior de moléculas de azúcar. Luego la

43 29 condensación de estos productos con una segunda molécula de 2-amino-2-deoxy-Dglucosa o con una molécula de 1-amino-1-deoxy-D-fructosa las cuales podrían dar pirazinas, también se puede observar que la D-glucosilamina y la D-fructosilamina son considerados intermediarios en la formación de compuestos heterocíclicos como los imidazoles substituidos 16 los aportes que se tienen sobre esta consideración son los siguientes (a) El aislamiento de 2-amino-2deoxy-D-glucosa de la reacción de D- glucosa y D-fructosa con amoniaco a bajas temperaturas. (b) El aislamiento de D- glucosylamina de la reacción de D-glucosa con amoníaco a bajas temperaturas y a altas temperaturas. (c) El aislamiento 2-Amino-2-deoxy-D-glucosa y amoníaco a bajas temperaturas durante 6 meses con un buen rendimiento de pirazinas. (d) Las pirazinas, se han sintetizado por la condensación de dos moléculas de 1-amino-1- deoxy-d-fructosa o de 2-amino-2-deoxy-D-glucosa y también son obtenidas de la condensación de 2-amino-2-deoxy-D-glucosa. (b) Mecanismo de fragmentación: Para la formación de imidazoles, en la literatura se propone que una molécula de D-glucosa se descompone para dar dos moléculas de D-glyceraldehido 16.En apoyo a este mecanismo de formación de los imidazoles se tiene que los mismos son comúnmente formados de compuestos α-dicarbonilos. Esto es ilustrado en la siguiente figura Figura 20.- Formación de imidazoles por fragmentación de moleculas 16 Reacción de los compuestos dicarbonilos con amoníaco: Este rearréglo de tipo bencílico es el resultado de la acción del medio alcalíno sobre el compuesto

44 30 dicarbonilo 16. La reacción del intermediario carbonílico con amoníaco ocurre rapidamente y, por lo tanto, la formación de imidazoles se da a continuación Figura 21.- Reacción de compuestos dicarbonilos con amoníaco Importancia de los Imidazoles durante la elaboración de color caramelo clase III (E150): El color caramelo se considera como un componente natural de la dieta alimenticia ya que puede formarse cuando cientos de alimentos se cocinan o sacarosa se calienta, sin embargo durante la producción del color caramelo clase III aparecen compuestos substituidos con nitrógeno de los cuales se considera en promedio que 20% son pirazinas y 10% imidazoles 17, como se mostro en la reacción entre dicarbonilos y amoniaco hay casi una exclusiva aparición del 4(5)-metillimidazol, este compuesto es un señal del progreso de esta reacción, y ha sido mostrado como el más toxico entre todos los imidazoles a través de pruebas de toxicidad, en la literatura se reportan experimentos donde se impartía una dosis oral diaria de caramelo clase III a conejos, ratones y polluelos 17, las pirazinas por su parte resultaron ser leves depresores del sistema inmunológico 17. Una relación del grado alimenticio del color caramelo clase III marco que los productos comerciales contienen de ppm de 4(5) metilimidazol determinado por CLAR 17. Se ha demostrado que los rendimientos de imidazol aumentan linealmente con

45 31 el incremento de la relación molar amoníaco-glucosa 18. La European Commision especificó como límite contenido para el color caramelo clase III 200mg/Kg de 4- Metilimidazol 6 referido a un color de unidades EBC, para una ingesta diaria de 250 mg/kg por peso corporal Factores que afectan la velocidad de pardeamiento La velocidad de reacción del oscurecimiento no enzimático se ve afectada por las condiciones en las que se desarrolla. Una lista de procedimientos fueron sugeridos para el control de la reacción de Maillard 19. (a) Aumento de la temperatura. (b) Aumento de la actividad de agua. (c) Aumento del ph. (1)Temperatura: En una revisión bibliográfica se encuentra que bajo la mayoría de las condiciones de almacenamiento (T<60 C), el oscurecimiento puede ser modelado como un orden de reacción cero. Por otro lado a temperaturas altas (T>80 C) el oscurecimiento puede seguir una reacción de primer orden, aumentando hasta alcanzar un máximo 19. Mostrando además que la energía de activación para el oscurecimiento predomina por encima de 32ºC 19. En general, el oscurecimiento es sensible a la temperatura, por cada 10 C que incrementamos, asciende sobre unas cuatro u ochos veces la velocidad de oscurecimiento. Además se reporta que el papel de la temperatura difiere acorde al criterio escogido, es decir, oscurecimiento o pérdida del amino compuesto. Por ejemplo en un sistema glucosa-glicina calentado por una hora a 90 C y otro por 9 horas a 70 C se obtuvo la misma perdida de glicina, pero el primero tiene el doble de absorbancia que el de este último. Esto indica que la naturaleza exacta de la cantidad de oscurecimiento producido es diferente a 70 C comparado con el que ocurre a 90 C 19.

46 32 Ahora bien, esto demuestra la degradación significante de la glucosa a estas altas temperaturas, dependiendo de la temperatura la glucosa desaparece variablemente durante el calentamiento la cual es mucho más rápida en presencia de un grupo amino 20, de la misma manera se manifiesta la pérdida del grupo amino al calentarse a altas temperaturas tanto con glucosa como en ausencia de la misma; a pesar de ser más rápido en el primer caso ya que solo una ligera pérdida de aminoácidos se produce cuando esta se calienta sola. 20 (2) Actividad de agua: El agua es el constituyente predominante en la mayoría de los alimentos y sirve como medio para que las reacciones químicas se lleven a cabo, remover parte de ella en un sistema azúcar-aminocompuesto incrementaría la concentración de azúcares, retardando también muchas reacciones 3. La actividad de agua, a w se puede definir como lo siguiente: a w = P/P 0 P= Presión de vapor parcial del alimento medida a una temperatura T P 0 = Presión de vapor saturada del agua pura a una temperatura T Esta división es llamada presión de vapor relativa, dicha igualdad se basa en condiciones ideales (soluto ideal en solución diluida) y en equilibrio termodinámico. Los alimentos suelen no estar en estas condiciones, por esto la ecuación debe tomarse solo como una aproximación, la presión de vapor tiene una dependencia con la temperatura, pudiéndose determinar cuantitativamente aplicando la ecuación de Clausius-Clapeyron modificada de la siguiente forma: dln a w = - H d(1/t) R

47 33 Donde T es la temperatura absoluta, R es la constante de gases ideales y el H es el calor isosterico neto de sorcion de agua en la muestra. Reorganizando esta ecuación observamos que se comporta como una la línea recta 3. Entonces es evidente que la representación grafica del ln a w versus 1/T (a contenido de agua constante) es lineal, esto también ocurre con el ln P/P 0 versus 1/T. La reacción de oscurecimiento como una función de la a w sigue el mismo patrón de curvas con un mínimo y un máximo Como es mostrado a continuación 19. Figura 22.- Intensidad de color en función de la actividad de agua (oscurecimiento no enzimático) 19 En general, la tasa de oscurecimiento incrementa desde el estado seco como actividad de agua hasta llegar a un máximo sobre la cual el oscurecimiento decrece. El principio físico se basa en que la movilidad de los solutos se ve gravemente limitada por una difusión cada vez menor, creando una resistencia que reduce la movilidad de las moléculas debido a una alta viscosidad de azúcar a valores de actividad de agua muy bajas 21. Por el contrario a valores más altos de actividad de agua los solutos se movilizaran y reaccionarán con facilidad, sin embargo si el valor de actividad de agua es muy alto los solutos son totalmente disueltos causando así una disminución en la velocidad de reacción 19

48 34 La actividad de agua disminuye la energía de activación 20, sin embargo existe un compromiso entre la cantidad de agua inicial en el sistema azúcar- aminocompuesto ya que el agua es una producto de condensación en varios pasos de la reacción de oscurecimiento por lo tanto también puede producir un efecto inhibidor diluyendo los reactantes de tal manera que disminuye la velocidad de reacción. (3) Efecto de la relación azúcar- amino compuesto: en un estudio reportado por sobre el desarrollo de color en mezclas D-glucosa-glicina, en un sistema con 65% de agua que se encontraban almacenadas a 65 C, se probaron relaciones de D-glucosaglicina desde 10:1 hasta 1:5. Los datos mostraron una marcada dependencia sobre la proporción relativa de aminoácidos en base a la cantidad de azúcar. El desarrollo de color era acelerado con proporciones desde 1:1 y 1:5, es decir, aquellas donde la proporción azúcar-aminoácido eran iguales hasta una relación donde la cantidad de aminoácido se encontraba en exceso, el oscurecimiento fue mayor. Estos resultados se muestran a continuación 19. Figura 23.- Efecto de la relación molar azúcar-aminoácido sobre la reacción de oscurecimiento, D glucosa-glicina relación A 1:1.5, B 1:1, C 2:1, D: 10:1, contenido de agua 65%, temperatura 65ºC. 19 (4) Efecto del tipo de aminoácido: En la literatura se ha reportado el efecto del tipo de aminoácido en una mezcla 1:1 de D-glucosa/ mezcla de aminoácidos, sobre la cantidad de oscurecimiento. Una comparación fue hecha entre nueve diferentes aminoácidos que son conocidos por su frecuente existencia en alimentos. Los resultados indicaron

49 35 que tanto la L-arginina y el ácido 4-aminobutirico tienen la más intensa y rápida formación de color seguida de la glicina, alanina, serina y L-prolina 19. La lisina es a menudo reportada como el aminoácido más reactivo de la reacción de Maillard. Esta hipótesis es basada en que la lisina tiene dos grupos aminos disponibles sobre la molécula 19. En otro estudio sobre la formación de productos de Maillard en alimentos, el triptofano fue el más reactivo seguido de la serina y treonina, sin embargo este conflicto resulta ser explicado porque la reactividad de diferentes los aminoácidos dependen también del ph, de esta manera se espera que los aminoácidos reaccionen similarmente a un rango de ph pero esto no puede ser necesariamente la misma respuesta bajo otras condiciones de ph. 19 (5) Efecto del ph: La reacción de Maillard es considerablemente influenciada por el ph del sistema 22.En un estudio que comprendía un sistema azúcares reductorasaminoácidos el desarrollo de color muestra una dependencia que resulto ser una curva en forma de campana 19. Como un ejemplo, se ha reportado el estudio de un sistema modelo que contiene diferentes combinaciones de dos aminoácidos y dos azucares reductoras. Ellos encontraron que la reacción de Maillard tiene un aumento de intensidad sobre un valor de ph de 10.0 y luego disminuyo a muy altos valores de ph. 19

50 36 Figura 24.- Efecto del ph sobre el oscurecimiento, (L) lisina, (AR) arginina, (G) glucosa, calentado a 121ºC durante 10 min. 19 El incremento del oscurecimiento durante la reacción de Maillard se intensifica cuando se aumenta el ph. Además el ph afecta a la energía de activación de la reacción de pardeamiento, el bajar el ph aumenta la energía de activación para la formación de las melanoidinas 23 Hay que tomar en cuenta que durante la reacción de Maillard se producen ácidos débiles y reductonas, ya antes mencionadas que a su vez disminuyen el ph, cuando el mismo no es controlado tiende a disminuir la tasa de pardeamiento. La razón de porque decrece la intensidad el color a ph mayores de 10.0 podría deberse al pequeño número de protones disponibles, los cuales son necesarios en los primeros pasos de la reacción de Maillard 19. Por otra parte el hidróxido actúa como un catalizador tanto en la deshidratación como la degradación de las reacciones que impliquen reducciones de azúcares 20.Como es de esperarse la intensidad de pardeamiento es mayor con el aumento de la basicidad. Esto se debe a que la pérdida de grupos aminos a ph altos es menor por lo cual pueden servir mejor como catalizadores en la generación de pardeamiento 8. Una explicación sobre la perdida de grupos aminos a ph bajos y su efecto en la reacción es la forma de equilibrio de protonación y no protonación del grupo amino.

51 37 NH 3 + ph > NH 2 + H + A ph menores de siete 50% del grupo amino se encuentra en su forma protonada, impidiendo así el efectivo transporte de electrones, es por esto que a phs menores de siete la velocidad de pardeamiento es menor. Otra causa por la que disminuye la velocidad a bajos ph se le puede atribuir a el nivel de forma acíclica o reductora de las azúcares lo cual también influye en la cinética de oscurecimiento 19.En la literatura se reporto la determinación de la concentración de forma acíclica de diferentes azucares reductoras en un rango de ph de 6.5 a 7.5. Tabla 2.- Porcentaje de azúcar acíclica en función del cambio de ph 19 Azúcar ph D-Glucosa D-Galactosa D-Manosa D-Xylosa Con el incremento del ph aumenta la concentración del azúcar reductora en su forma acíclica. La reacción de mutarotación que toma lugar cuando las azúcares reductoras están disueltas en agua u otro solvente, es importante por el comportamiento que pueden tener las mismas. Las azúcares cuando están disueltas en agua sufren muchas transformaciones particularmente en presencia de ácidos o álcali. La mayoría de los estudios agregaron que la ínter conversión cíclica de los mismos procede vía un intermediario central el cual es el azúcar en su forma ceto o aldehído, este equilibrio de reacción es el siguiente.

52 38 α-pyranosa Β-pyranosa Forma acíclica α-furanosa β-furanosa Se ha encontrado en la literatura que cuanto más alto es el nivel de azúcares en su forma acíclica en solución más rápida será la tasa de pardeamiento 19.La transformación de la forma acíclica envuelve la transferencia de protones desde el solvente usado que usualmente es agua, por sus propiedades es el más favorable entre cualquier otro solvente 19 (6) Cinética de reacción: En un estudio sobre la cinética de reacción de oscurecimiento no enzimático en un sistema azúcar-aminoácido, (glucosa-glicina) se estudió la pérdida de uno con respecto al otro, la cual es seguida por una cinética de primer orden en cada una, y de segundo orden en total. 24 La cantidad de azúcares reductoras sugiere que pueda tener un factor importante en la formación de la reacción de oscurecimiento de Maillard, en general se dice que un exceso de azucares reductoras sobre la cantidad de amino compuesto, promueve el oscurecimiento 24. Tres de cuatro estudios determinaron que la velocidad de reacción de Maillard fue mayor cuando la glucosa estuvo en exceso, pero se estuvo en desacuerdo con la relación de máxima velocidad lograda por el exceso de esta. Lo mismo ocurrió cuando el aminoácido se mantuvo en exceso 24. Por su parte la formación de melanoidinas puede ser descrita como una reacción de pseudo-cero-orden y de primer orden 24. La reacción de pardeamiento no enzimático

53 39 demostró gráficamente que aumentaba con el incremento de glicina y lo mismo ocurre con el de glucosa. Esto indica que no hay diferencia entre la velocidad de reacción en sistemas de diferentes concentraciones tanto de glicina como de glucosa Melanoidinas En la etapa final de las reacciones de caramelización (Maillard y la simple degradación de azucares a altas temperaturas) hay un desarrollo de color oscuro llamado melanoidinas, sin embargo muy poco se conoce sobre la química natural de estos compuestos formados, lo que se mantiene hasta ahora son solo hipótesis 25. Estos productos coloreados pueden ser divididos según su formación en tres grupos; las melanoidinas que poseen un bajo peso molecular, estas estructuras comprenden de 2-5 anillos unidos 25. La importancia de estos polímeros de bajo peso molecular también fue estudiado en un sistema glucosa-alanina donde solo habían trazas de compuestos con un peso (> 3000 Da) esto significa que la causa de color se debió exclusivamente a las fracciones de bajo peso molecular, la explicación a esto se debe a que hay muchos sistemas donde los grupos aminos están más bloqueados que otros, por lo tanto prefieren otras vías de degradación principalmente Strecker, conduciendo así a la formación de polímeros de bajo peso molecular que igualmente producen color. 28 estas estructuras se muestran a continuación

54 40 R= H X= O, N Figura 25.- Melanoidinas de bajo peso 26 Para los de alto peso molecular, aproximadamente unos cientos de Daltons, se mantiene la hipótesis de que esta formación de melanoidinas provienen de la copolimerización de las primeras subunidades formadas 27. Por otro lado, en la literatura se informa que la parte predominante de los productos de reacción eran de alto peso molecular (> Da), y que este aumento del peso molecular ocurrió de forma paralela con la intensidad de oscurecimiento sin embargo esto depende de las condiciones de reacción 28. La hipótesis de formación de este polímero se basa en que el monómero pueda ser el compuesto de Amadori, por lo cual el mismo puede crecer por perdida de moléculas de agua lo cual es obligatorio en este proceso. De la misma manera la pirolisis de este polímero trae consigo la formación de productos tales como pirazinas, pirroles, piridinas, furanos, etc. Acorde con esto los productos de Amadori pueden polimerizar por adición de un nucleófilo como reacciones de grupos aminos hacia el carbonilo y la fracción de una segunda molécula, seguir la deshidratación para formar el zwiterion (polímero I), este puede perder una molécula de hidrógeno para formar el polímero IIa, o someterse a una trasferencia intramolecular para formar un derivado neutro IIb el cual puede convertirse en un derivado conjugado III. (Figura 26)

55 41 Figura 26.- Formación de una macromolécula (melanoidina) 30. Luego de esto en su mayoría forman furanos, pirroles y anillos que contienen nitrógenos éter de metilo y/o grupos hidroxilos y algunos con aminoácidos, sin embargo se debe tener en cuenta que los aminoácidos en si ya son de alto peso molecular, la figura hipotética de las melanoidinas se muestra a continuación 30

56 42 Figura 27.- Hipótesis de una macromolécula (melanoidina) 28 El tercero modelo fue descrito en la literatura donde se encuentra que mucho de estos compuestos coloreados son productos de retroaldolizaciones y deshidrataciones de las azúcares las cuales pueden ser o no atacadas por proteínas y otros amino compuestos 29. Esta hipótesis se basa en que el esqueleto principal es formado en los primeros pasos de la reacción de Maillard, condensación, aldolización y algunas reacciones que estas puedan tener con los aminocompuestos 29 para formar las melanodinas sin contenido alguno de nitrógeno, además se identificaron estructuras intactas de hidratos de carbono provenientes de una hidrólisis ácida, esto indica que no todas las azúcares se degradan inevitablemente para formar heterociclos tales como furanos y pirroles 29

57 43 Glicina + Glucosa Intermediario de Amadori Polímero con nitrógeno Glucosona Glicina 3-Deoxyglucosona Polímero sin nitrógeno 1-Deoxyglucosona Figura 28.- Esquema de formación: polímeros con nitrógeno, y polímeros sin nitrogeno 30 Asignando a las 3- o 1-deoxyglucosonas como intermediarios se explica la falta de nitrógeno en las melanodinas formadas durante la reacción de Maillard dicho esquema de formación para estos polímeros es mostrado en la figura 28, quienes indican la alta presencia de oxígeno y carbono produciendo mayoritariamente furanos por la presencia de el enlace glucosídico. Estos polímeros tienen una composición similar a la glucosa. Esto es una muestra de los compuestos los cuales son ilustrados en la siguiente figura:

58 44 Figura 29.- Formación de melanoidinas de bajo peso molecular, sin contenido de nitrógeno Cuantificación de las melanoidinas El mecanismo de formación de las melanoidinas no está plenamente comprendido ya que sus estructuras son en gran parte desconocidas, por ello resulta difícil cuantificar estos compuestos. Sin embargo esta cuantificación es necesaria cuando se trata de predecir u optimizar el oscurecimiento en alimentos procesados. Según Lambert-Beer y su ecuación (A=ε*c*l), existe una relación lineal directa entre la absorbancia (A) y la concentración (C), a través del coeficiente de absortividad molar (ε). Estudios previos han demostrado que es posible relacionar la absorbancia de las melanoidinas con el numero de moléculas de azúcar incorporados en el mismo. Para ello solo falta el coeficiente de extinción molar que se determino en un sistema glucosaglicina y otros aminoácidos, donde la glucosa se etiqueto con 14C, y el coeficiente de extinción se mantuvo constante durante todo el tiempo de calentamiento 29. Una de las

59 45 ventajas de este enfoque es que el coeficiente de extinción molar de las melanoidinas puede ser sencillamente expresado en términos de la concentración de glucosa convertidos en el compuesto coloreado. De esta manera la relación entre el oscurecimiento y la cantidad de azúcar incorporada en la melanoidina es claramente lineal así que el coeficiente de extinción puede deducirse de la pendiente de esta recta 29, y aplicando la ley de Lambert -Beer se obtiene un aproximación de la concentración de melanoidinas en un sistema azúcares reductoras-aminoácidos. La intensidad de oscurecimiento de estas mezclas de reacción es determinada comúnmente por espectrofotometría a 420nm y cuando es necesario las muestras son diluidas en agua, si no son diluidas se mide la absorbancia directa del color caramelo y con el coeficiente de extinción molar se puede expresar en moles de azúcar incorporados en las melanoidinas, esto da una información cualitativa en términos de color, pero esta no estará relacionada en términos cuantitativos a la concentración molecular del polímero sino de las pérdidas de azúcar para formarlo Factores que afectan la composición de las melanoidinas y sus estructuras hipotéticas Tanto las materias primas, así como las condiciones de reacción tienen una fuerte influencia sobre la composición de las melanoidinas, estas pueden determinar el tipo de estructuras que se formaran durante la reacción de Maillard y de esta manera los precursores de las melanoidinas ph, Temperatura y tiempo Las melanoidinas son generalmente conocidas como un grupo muy similar a los compuestos de Amadori, de hecho los mismo son encontrados junto con los aminoácidos y el HMF como producto remanente en las mismas; incluso aminoácidos han sido reportados sin cambios 30. Con incremento del tiempo de reacción y

60 46 temperatura, el contenido total de carbono incrementa más que el de nitrógeno, así se promueve el carácter aromático y la insaturación de la melanoidina 31 La cantidad de nitrógeno incorporado en la molécula difiere significantemente según las condiciones de reacción por ejemplo, en un sistema de aminoácidos en la literatura se reporta que la cantidad de aminocompuestos que se incorpora al polímero incrementa con el decrecimiento de la temperatura resultando así una baja relación C/N. Obteniendo que un bajo valor de C/N se da cuando decrece tanto el ph como la temperatura 27. Otro microanálisis arrojó datos sobre las melanoidinas donde se fueron variando las condiciones de reacción para así observar la composición elemental de los polímeros y como pueden ser influenciados por la temperatura, ph y tiempo esto es mostrado en la siguiente tabla Tabla 3.- Cambios en la composición de las melanoidinas variando tiempo, ph, y temperatura 30 Datos del microanálisis en % (elementos) de melanodinas relación molar glucosa/glicina 1:1 variando condiciones de reacción Condiciones de reacción C N H O C/N 170ºC/20min 53,42 4,26 4,26 37,61 12, ºC/10h/pH 5 55,58 6,97 5,38 32,07 7, ºC/10h/pH7 49,05 6,12 5,25 39,57 8, ºC/160h/pH5 43,02 6,94 4,78 45,25 6,1988 La temperatura influye sobre las propiedades aromáticas de las melanoidinas y sobre su relación C/N, lo que se observa en esta tabla es que a bajas temperaturas aumenta la cantidad de aminoácido incorporado en la molécula, mientras que a diferentes ph este cambio en la relación C/N no es muy apreciable. El ph también afecta en la variación de punto isoeléctrico de las melanoidinas 31, en un sistema se trabajaron con tres condiciones, en una solo había formación de

61 47 melanoidinas sin control de ph, en otro el ph fue controlado con un buffer de fosfato y en el ultimo simplemente se agrego bicarbonato de sodio al inicio de la reacción para garantizar un alto ph al principio de la misma. La melanoidina mas estable fue aquella donde se controlo el ph mediante un buffer de fosfato, las etiquetas de punto isoeléctrico estuvieron dentro de rango de ph mucho menor que aquellas donde no se controlo. Además en la que se controlo el ph con buffer de fosfato se obtuvo la máxima coloración, esto se le atribuye al fosfato ya que puede servir como catalizador acelerando la formación del compuesto de Amadori Tipo de azúcares reductoras La composición elemental de las melanoidinas producidas en mezclas de reacción difiere marcadamente si se usan pentosas (ribosa) o hexosas (glucosa, fructosa). Lo que se conoce en un sistema azúcar-aminoácido es que el caso de las ribosas, más de 4 moles de azúcar son incorporados dentro de la melanoidina, por mol de aminoácido, tomando en cuenta que para hacer estas comparaciones se necesitan las mismas condiciones de reacción, mientras que solo la mitad de moles de las hexosas participan (2 moles de azúcar por cada mol de aminoácido) 31, esto indica que para tener melanoidinas con alto contenido de nitrógeno la lactosa y la sacarosa son útiles, como es mostrado en la siguiente tabla Tabla 4.- Cambio en la cantidad de nitrógeno incorporado a la molécula variando el azúcar reductora 30 Datos del microanálisis de melanodinas en % (elementos) relación molar carbohidratos/glicina 1:1 Azúcar C N H O C/N Ribosa 50,28 2,41 6,28 41,03 24,1825 Glucosa 53,42 4,26 5,38 37,31 12,5339 Fructosa 47,39 5,00 6,42 41,19 7,3816

62 48 Esta diferencia se podría explicar por la reactividad de las azúcares. La composición fundamental de las melanoidina es influenciada principalmente por la cantidad molar de reactantes. En algunos reportes se ha hecho el intento de describir la estructura de los mismos usando 13 C y 15 N-CP-MAS y espectroscopia de RMN, donde la formación fue monitoreada con la ayuda de aminoácidos y azúcares etiquetados, la técnica donde se etiqueta el carbono sirve para saber los aminoácidos incorporados y la técnica de nitrógeno etiquetado para observar la formación de pirroles y grupos amida, sin embargo describir la estructura resulta ser bastante complejo Relación azúcar-aminocompuesto Datos interesantes de en un microanálisis en un modelo glucosa/glicina produciendo melanoidinas con diferentes concentraciones molares son mostrados en la siguiente tabla

63 49 Tabla 5.- Cambio en la composición de melanoidinas variando la relación molar glucosaglicina 30 Microanálisis elemental de la composición de melanoidinas variando la relación molar glucosa/glicina Relación molar C N H O C/N 8:2 50,23 4,15 6,19 39,34 12,1036 1:1 53,42 4,26 5,39 37,61 12,5396 2:8 47,81 3,50 6,21 42,48 13,66 Incluso un exceso de glicina (2:8) en el sistema de reacción puede afectar significativamente la composición molar del polímero. En presencia de un exceso de azúcar, es muy probable que los productos de reacción sean de bajo peso molecular. 2.8 Métodos cromatográficos Compuestos como el 4-metilimidazol y 5-hidroximetilfurfural pueden ser determinados de forma cromatográfica, de la misma manera se realizo una separación de pesos moleculares (electroforesis) para los colorantes obtenidos y por ello se presenta una pequeña revisión de este tema. Cromatografía de gases: Esta es una técnica de separación que consiste en volatilizar la muestra la cual se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de un gas inerte, a diferencia de otros métodos cromatográficos, la fase móvil no interacciona con el analito; su única función es la de transportar el analito a través de la columna, en la cromatografía gas-solido la retención de los analitos se realiza en una fase estacionaria solida, como consecuencias de la adsorción física 22.

64 50 La cromatografía de gases también puede ser acoplada a un espectrómetro de masas de barrido rápido. El caudal de las columnas capilares en general es suficientemente bajo como para que la salida de la columna pueda introducirse directamente en la cámara de ionización de un espectrómetro de masas. Su rapidez y alta sensibilidad son especialmente ventajosas para su aplicación. Cromatografía liquida de alta eficiencia (CLAR): De los métodos de separación este es el mas ampliamente utilizada; la razón de su popularidad es debido a su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas y su método de análisis mucho más rápido, así como su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles, puede separar compuestos que sean solubles en líquidos que pueden ser usadas como fase móvil a diferencia de la cromatografía de gases que los componentes de la muestra necesitan no ser volátilizados 32. Cromatografía en fase normal: fases estacionarias de elevada polaridad y fase móvil un disolvente apolar 32. Cromatografía en fase inversa: fase estacionaria no polar con frecuencia trata de un hidrocarburo, y la fase móvil con frecuencia es altamente polar 32. Cromatografía de exclusión de iones: esta técnica no es necesariamente una cromatografía iónica debido a que son especies neutras y no iones los que se separan, la fase estacionaria es una resina de intercambio catiónico en su forma ácida y la elución se lleva a cabo mediante una disolución diluida de ácido. La columna analítica va seguida de la columna supresora que esta rellena con una resina de intercambio catiónico. Los protones del eluyente se intercambian por los iones que quedan atrapados en la columna 32 Isoelectroenfoque: El isoelectroenfoque consiste en la migración de moléculas cargadas en solución por la exposición de un campo eléctrico sobre un soporte gelificado en el que se ha establecido un gradiente de ph. Cada molécula migra y

65 51 queda enfocada en aquella porción del gradiente de ph cuyo valor es su punto isoeléctrico y forma allí una banda estacionaria bien definida 33 Electroforesis: es una técnica de separación que se basa en la migración diferencial (en sentido y velocidad) de partículas cargadas (analitos) en un campo eléctrico establecido al efecto, es decir, en un gradiente de potencial. La electroforesis en geles tales como poliacrilamida como medio de soporte proporciona una inestimable resolución, particularmente para proteínas, incluyen la combinación de una reducción de la difusión por la malla del gel y la acción separadora de la cromatografía en gel (tamiz molecular) al cual se le aplica el voltaje adecuado, esto en presencia de un tampón y patrones de peso molecular; las proteínas quedan enfocadas en el rango de peso molecular correspondiente a las mismas Métodos de tratamiento de muestra Para el aislamiento de 5-hidroximetilfurfural se utilizó la extracción en fase solida la cual es una potente y simple técnica, al mismo tiempo, rápida y económica. Esta se aplica pasando una disolución que contiene analito(s) sobre una fase solida (o fase estacionaria) que lo(s) adsorbe específicamente. La fase solida suele estar compactada en el fondo de una pequeña columna (3-20mL). Despees de la adsorción, los analitos se eluyen con una pequeña cantidad de otro disolvente extractor, con el que interaccionan más fuertemente que con la fase estacionaria. Por lo tanto la EFS no solo consigue un cambio de matriz del analito, sino que reduce el volumen de muestra 34 Es más eficiente que la extracción liquido/liquido además de ser mucho más rápida, los cartuchos de C18 para extracción en fase reversa son ideales para separar compuestos polares de los no polares, los pasos para el uso de estos cartuchos son los siguientes: Activación: El primer paso es la activación en la que se utiliza un solvente orgánico para "humidificar" la fase. Con fases hidrofóbicas (p. ej. C18) se usa un solvente polar, como el metanol 34.

66 52 Acondicionamiento: La fase estacionaria con el mismo solvente de la matriz de la muestra, por ejemplo, con matrices acuosas el solvente es agua. El acondicionamiento permite "alinear" la fase estacionaria lejos de la superficie de la sílice, permitiendo la interacción entre el analito y la fase estacionaria. Cualquier solvente orgánico residual se elimina en esta etapa, asegurando que los componentes de interés sean retenidos en la parte superior de la columna. Retención: Las interacciones entre las moléculas de la muestra y la fase estacionaria controlan la retención en el adsorbente del cartucho. Para maximizar las interacciones la muestra (A=analitos + M=matriz) deben cargarse en el adsorbente del cartucho a aproximadamente 3 ml/min. Este caudal puede controlarse mediante una válvula en la estación de vacío. Los componentes de matriz y los contaminantes han de retenerse en el adsorbente del cartucho mientras que los componentes de interés deben eluirse o viceversa. Micro extracción en fase solida: Se basa en la absorción de compuestos sobre una fase absorbente emplazada en el extremo de una micro jeringa modificada, las cuales se desorben posteriormente en el inyector de un cromatografo de gases o líquidos. La extracción se puede realizar por inmersión directa de la fibra en la muestra liquida, o por el espacio de cabeza (un sistema cerrado, donde la fibra se encuentra suspendida sobre la muestra). La principal ventaja de esta técnica es que elimina la utilización de disolventes y usa poca mano de obra; sus inconvenientes son que requiere tiempos largos, que la extracción es reproducible, pero no necesariamente cuantitativa, y que para cada muestra debe estudiarse los efectos de la matriz 35.

67 Objetivo General 3 OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN Estudiar los factores que afectan la formación de color caramelo clase III: actividad de agua, ph, relación molar azúcar-nitrógeno y temperatura, con la finalidad de comprender el efecto de los mismos sobre la intensidad de oscurecimiento. 3.2 Objetivos Específicos Optimizar la formación de azúcares reductoras a partir de sacarosa, con la finalidad de obtener la mayor disponibilidad de las mismas para la formación de compuestos de color. Estudiar el efecto de los factores que afectan la formación de color: ph, relación molar azúcar-nitrógeno, temperatura y actividad de agua. Establecer metodologías analíticas para el seguimiento de la formación de color a través de la medición del precursor HMF. Determinar la cantidad de nitrógeno libre en el color caramelo. Evaluar la formación de 4-metil imidazol en los colorantes obtenidos. Determinar los pesos moleculares de los compuestos de color con la finalidad de establecer a que producto se le mediría punto isoeléctrico Determinar los compuestos de aroma que son productos de reacción

68 54 4 METODOLOGÍA EXPERIMENTAL Equipos: Medidor de actividad de agua (Aqualab serie 3 3TE, Decagon Paw Kit) Unidad de Electroforesis mini protean II electrophoresis cell, BIO RAD Visiprep Solid Phase Extraction Vacum Supelco phmetro (Thermo Scientific Orion 3-Star, Thermo Electron Corporation) Espectrofotómetro UV-Visible Hewlett Packard 8453, lámparas de Deuterio y Wolframio y un detector de diodos en serie Destilador (Bϋchi Auto Kjeldahl Unit K- 370, Buchi/switzerlarnd) Cromatografo líquido, equipo Waters LC module plus 410, detector de Índice de refracción. AUFS 3. columna YMC-Pack PA, (4.6 mm x 250 mm, S-5 m Waters), otro sistema con un detector UV Waters 2475, columna Aminex HPX-87H, 300mm x 7.8mm (BioRad), y por ultimo un sistema con un detector UV-DAD- 310/nm, Waters 996, columna LiChroCART 100RP-18.5mm HP 50833, Chromolith RP-18e 100mmx 4.6mm id Merck (2 columnas unidas) Cartuchos de extracción en fase solida LC18 de 3mL (Supelco, Sigma-Aldrich) Cromatografía de gases, equipo HP-6890N, detector de masas HP-5973N fase no polar (HP-5MS, 30 m de largo x 0,25 mm de diámetro interno x 0,25 mm de espesor de fase estacionaria) Fibra de micro extracción en fase solida: fase combinada Divinilbenceno / Carboxen / Polidimetilsiloxano (DVB /CAR /PDMS), Supelco Reactivos: Sacarosa (Azúcar común marca Montalbán) Acido sulfúrico 98% p/p (EMD grado alimenticio) Hidróxido de amonio 25%p/v (Rieldel-de Haën sigma aldrich) Agua destilada

69 55 Agua desionizada 18 Ω/cm -1 Sulfato de amonio (Merck KGaA 99%) Patrones para medir actividad de agua (KCl 0,5m a w 0,984; NaCl 6m a w 0,760; LiCl 8,57m a w 0,500) aqualab water activity meter decagon, verification Standars devices Óxido de magnesio (Merck, Darmstadt 97%) Ácido bórico (Sigma Chemical 99%) Hidróxido de sodio (Merck, KGaA, Darmstadt 99%) Patrones para electroforesis KDa (Precision Plus Protein Dual Color Standars BIO RAD) Dodecanesulfonato de sodio (Merck, Darmstadt 99%) Fosfato potásico (Merck, Darmstadt 99%) Metanol 98% (Merck, Darmstadt 99,8%) 2-metilImidazol (Merck, Darmstadt 99%) Etanol(Merck, Darmstadt 99,9%) Acrilamida (BIO RAD laboratorios, 99%) Helio (AGA) Acetonitrílo (J.T Baker HPLC, 99, 90%) Persulfato de amonío (BIO RAD laboratorios, 99%) TEMED (sigma Chemical 99%) SDS (BIO RAD laboratorios, 99%) Tris HCl 0,5M y 0,8M (BIO RAD laboratorios, 99%) Glicina (BIO RAD laboratorios, 99%) β mercapto etanol (BIO RAD laboratorios, 99%) Azul de comassie (BIO RAD laboratorios R-2500, 99%)

70 Métodos Medidas de color El seguimiento de la formación de color se realizó en un espectrofotómetro UV- Visible, debido a la alta viscosidad de la muestra la intensidad de color fue expresada según los manuales cerveceros 37, en unidades EBC, por lo tanto su tratamiento se llevó de la siguiente manera: Se pesó la muestra en una balanza analítica (aproximadamente 0,5g), y se le agrego agua destilada hasta llegar a un volumen de 500mL, la solución se homogenizó, y se realizó la medición en una celda de cuarzo de 1cm a una λ= 430nm El cálculo EBC fue EBC= Abs 430 *25 * Factor de dilución Actividad de agua (a w ) Se realizaron curvas de actividad de agua para las tres condiciones de ph que se estudiaron 5,06 ± 0,05, 7,06 ± 0,08 y 10,65 ± 0,07 graficando la velocidad media de formación de color en función de la actividad de agua, para realizar estas curvas se escogieron ocho puntos los cuales variaban en sus concentraciones iniciales de sacarosa, para observar este efecto se dejó fijo siempre la cantidad en gramos de sacarosa y se comenzó a variar la cantidad de agua en forma continua. Seguidamente la actividad de agua es medida al principio y final de la reacción. Para su medición se peso (0,5 1 g) se coloco en una bandeja para medir actividad de agua, y se introdujo en el bloque de sensor del equipo. Se esperó aproximadamente 5 minutos para que se generara la medida. Tabla 6. Condiciones de trabajo para el estudio del efecto de la actividad de agua a ph 10,65 CONDICIONES DATOS Sacarosa (%) Sacarosa (g) Agua (g)

71 57 Ácido sulfúrico (μl para la inversión de azúcar) Hidróxido de amonio (ml) Temperatura ºC para la inversión de azúcar Temperatura ºC para la formación de color Relación molar azúcar: nitrógeno Peso total de la solución (g) :1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3: Tabla 7. Condiciones de trabajo para el estudio del efecto de la actividad de agua a ph 5,06 CONDICIONES DATOS Sacarosa (%) Sacarosa (g) Agua para la inversión (g) Agua donde se disolvió el sulfato de amonio (g) Agua total utilizada en el proceso (g) Ácido sulfúrico (μl para la inversión de azúcar)

72 58 Sulfato de amonio (g) Temperatura ºC para la inversión de azúcar Temperatura ºC para la formación de color Relación molar azúcar: nitrógeno Peso total de la solución (g) :1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3: Tabla 8. Condiciones de trabajo para el estudio del efecto de la actividad de agua a ph 7,06 CONDICIONES Sacarosa (%) DATOS Sacarosa (g) Agua para la inversión (g) Agua donde se disolvió el sulfato de amonio (g) Agua total utilizada en el proceso (g) Ácido sulfúrico (μl para la inversión de azúcar) Sulfato de amonio (g)

73 59 Hidróxido de amonio (ml) Temperatura ºC para la inversión de azúcar Temperatura ºC para la formación de color Relación molar azúcar: nitrógeno Peso total de la solución g :1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3: Estas condiciones se realizaron por triplicado para cada ph Efecto de la actividad de agua inicial sobre la intensidad de oscurecimiento. Se evaluó el efecto de la actividad de agua inicial sobre el oscurecimiento para cada ph 10,65 ± 0,07, 5,06 ± 0,05 y 7,06 ± 0,08 realizando mediciones de color a través del tiempo, con una relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno y 100ºC temperatura Efecto del cambio de ph inicial sobre la intensidad de oscurecimiento Se evaluaron tres condiciones de ph inicial para las soluciones de jarabe invertido y aminocompuesto 5,06 ± 0,05, 7,06 ± 0,08 y 10,65 ± 0,07 para ellos se emplearon diferentes fuentes de nitrógeno, primeramente sulfato de amonio para obtener un ph de 5,06, luego una mezcla de sulfato de amonio e hidróxido de amonio para lograr el efecto inicial de un buffer a ph 7,06 y por último hidróxido de amonio quien aportaba un ph de 10,65, a través de estas condiciones se realizaron curvas de cinética intensidad de color EBC en función del tiempo. La actividad de agua inicial se ajusto para cada ph al nivel correspondiente de VCm máxima optimizada por medio del efecto de la

74 60 actividad de agua, la relación molar utilizada fue 3,3:1 sacarosa/nitrógeno y 100ºC de temperatura. Las medidas de ph se hicieron tomando siempre la misma cantidad de jarabe invertido aproximadamente 0.1 g y se llevó a 100mL de solución con agua destilada, el ph de esta mezcla se midió directamente con el phmetro Efecto del ph inicial sobre la actividad de agua Se evaluó el efecto del ph sobre la actividad de agua a condiciones de ph 5,06±0,05, 7,06±0,08 y 10,65±0,07 midiendo la actividad de agua a través del tiempo, los sistemas evaluados para los tres ph correspondieron a la actividad de agua inicial donde se encontró máxima VCm, la relación molar utilizada fue 3,3:1 sacarosa/nitrógeno y 100ºC de temperatura Efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno sobre la intensidad de oscurecimiento Se evaluó el efecto de la relación molar a las tres condiciones de ph respectivos para así realizar curvas de cinética de reacción, Intensidad de color EBC en función del tiempo, las relaciones molares azúcar: nitrógeno que se evaluaron fueron las siguientes: 3.3:1, 33:1 y 330:1. La actividad de agua inicial se ajusto para cada ph al nivel correspondiente de VCm máxima, a una temperatura de 100ºC, los datos fueron los siguientes: Tabla 9. Condiciones de trabajo para el estudio del efecto relación molar sacarosa/nitrógeno RM RM RM RM RM RM RM RM RM ph 10,65 3,3:1 33:1 330:1 ph 7,06 3,3:1 33:1 330:1 ph 5,06 3,3:1 33:1 330:1 Sulfato de amonio (g) Sulfato de amonio (g) 5,06 0,506 0,0506 Sulfato de amonio (g) 8,133 0,813 0,081 Hidróxido Hidróxido Hidróxido de amonio 9,4 0,94 0,094 de amonio 3,7 0,370 0,037 de amonio (ml) (ml) (ml)

75 Efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno sobre la actividad de agua Se evaluó el efecto de la relación molar sobre la actividad de agua a condiciones de ph 5,06±0,05, 7,06±0,08 y 10,65±0,07 midiendo la actividad de agua a través del tiempo, los sistemas evaluados para los tres ph correspondieron a la actividad de agua inicial donde se encontró máxima VCm, a 100ºC de temperatura Efecto de la temperatura sobre la intensidad de oscurecimiento Se evaluó el efecto de la temperatura a las tres condiciones de ph 10,65, 7,06 y 5,06 para así realizar curvas de cinética de reacción, Intensidad de color EBC en función del tiempo, las temperaturas de trabajo evaluadas fueron: 100ºC y 85ºC. La actividad de agua inicial se ajusto para cada ph al nivel correspondiente de VCm máxima, y la relación molar utilizada fue 3,3:1 sacarosa/nitrógeno Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua Se evaluó el efecto de la temperatura sobre la actividad de agua a condiciones de ph 5,06±0,05, 7,06±0,08 y 10,65±0,07 midiendo la actividad de agua a través del tiempo, los sistemas evaluados para los tres ph correspondieron a la actividad de agua inicial donde se encontró máxima VCm, la relación molar se ajusto a 3,3:1 sacarosa/nitrógeno Nitrógeno libre en la molécula Se realizó a través de método de Kjeldahl, para aquellos sistemas con relación molar sacarosa/nitrógeno 3,3:1; 100ºC de temperatura, la actividad de agua inicial se ajusto para cada ph a la optima donde se obtuvo la VCm máxima Nitrógeno libre: Se pesó la muestra en una balanza analítica (aproximadamente 0.5 g), se colocaron en un tubo de vidrio Büchi y se le agrego óxido de magnesio (0.6 g), etanol (3 ml) y agua destilada (30 ml). El tubo se coloco en él, la muestra es neutralizada

76 62 con hidróxido de sodio (50mL, 33%) el amoníaco libre es arrastrado por vapor hasta el recipiente de titulación. A esta solución se le añadió ácido bórico en exceso (50 ml, 4%) el cual reacciona con el amoníaco generando amonío e ión borato. El ión borato es titulado con ácido sulfúrico (0,1 N). El contenido de amoníaco libre se expresó en mol/g de muestra de nitrógeno Análisis por electroforesis. Las melanoidinas fueron sometidas a una previa electroforesis, para aquellos sistemas con relación molar sacarosa/nitrógeno 3,3:1; 100ºC de temperatura, la actividad de agua inicial se ajusto para cada ph a la optima donde se obtuvo la VCm máxima, se prepararon los geles de resolución y apilamiento, se utilizó un gel de 15% de poliacrilamida, se realizó el tratamiento de muestra con β mercapto etanol y azul de comassie, se colocaron patrones de peso molecular, el campo eléctrico tuvo un valor inicial de 80 V hasta 150V durante una hora Optimización de azúcar invertida, seguimiento del HMF y formación de 4-metilimidazol Optimización del Azúcar invertida Para la separación cromatográfica se utilizó un equipo de cromatografía liquida a una temperatura de columna 25ºC y un detector de Índice de refracción. Se usó una columna fase normal. La separación se realizó de forma isocrática y la fase móvil consistió en una mezcla de solvente (v/v): solución de acetonitrílo en agua (75:25) 39. El flujo utilizado fue 0.8 ml/min. Las azúcares eluyen con la fase móvil quedando retenidos compuestos de menor polaridad tales como las melanoidinas formadas durante la caramelización Seguimiento del HMF Para la separación del HMF de las melanoidinas en las muestras de caramelo se pesó 1g de la misma, se llevó a un volumen de 10mL con agua destilada se

77 63 homogeneizó la mezcla, se tomo 1mL y se pasó por un cartucho de C18 donde todas las melanoidinas formadas durante la reacción quedaron retenidas dejando pasar el HMF, al cual se le realizaron lavados con 3mL de acetonitrílo: agua (10:90). Para la separación cromatográfica de HMF se utilizó un equipo de cromatografía líquida, una temperatura de columna de 55ºC, un detector UV. La detección se realizó a 283 nm. Se utilizó una columna de intercambio iónico. La separación se realizó isocraticamente y la fase móvil consistió en una solución de H 2 SO N (v/v). A un flujo de 0.6 ml/min Formación de 4-metilimidazol Las condiciones de cromatografía liquida fueron el equipo anterior a una temperatura del horno de 40ºC, la detección se realizó a 310/nm. La columna es de fase reversa. La separación se realizó isocraticamente y la fase móvil consistió en tres solventes (v/v): A: solución de dodecanesulfonato de sodio (0.005M) B: KH 2 PO 4 (0.2M) y C: metanol (98%), a proporciones de 42,5%, 25% 32,5% respectivamente, se utilizó 2- metilimidazol como estándar interno. El flujo de trabajo fue 1mL/min Determinación de compuestos de aroma Para el aislamiento de los compuestos aromáticos se utilizó una fibra de micro extracción en fase solida, la cual se limpia previamente de impurezas a (250ºC). Se tomaron 10mL de la muestra y se agregó en viales de 40 ml, los cuales se cerraron con tapas provistas de un septum. Se esperó que la muestra alcanzara el equilibrio durante 15 min. y luego se muestreo con la fibra expuesta durante 25 min a 25 C en el espacio confinado, para la desorcion de los analitos se coloco en el puerto de inyección por 9min, se uso una temperatura del puerto de inyección de 250ºC modo splitless, el programa de calentamiento del horno fue: Tinic. 40 C (3 min.), 6.5 C/min hasta 200 C, 35 C/min. Hasta 250 C (1 min.). El gas de arrastre utilizado fue He, a una velocidad lineal de 42 cm./s, la temperatura del cuadrupolo fue 150 C. El rango de masas u.m.a y la temperatura de la cámara de ionización: 230 C, el flujo fue constante 1.3 ml/min

78 64 5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1 Optimización de la reacción de inversión para la formación de azúcares reductoras Se ha reportado en la literatura (A. Kaanane and T. P. Labuza, 1989) 19 que cuanto mayor es el porcentaje de azúcares en solución más rápida será la tasa de pardeamiento. En esta sección se optimizó la reacción de hidrólisis de sacarosa a partir de dos concentraciones de la misma 75 y 82% p/p, partiendo de una misma cantidad de sacarosa (140 g), con el agua se adicionó el ácido sulfúrico manteniéndose la relación molar sacarosa ácido de 240,58:1. La hidrólisis de sacarosa se llevó a cabo a (100±1) ºC y se estudió, mediante CLAR el contenido de glucosa, fructosa y sacarosa en función del tiempo. Los resultados obtenidos se presentan en las tablas 9 y 10, los análisis se realizaron por duplicado Tabla 10. Variación del contenido de azúcares durante la reacción de inversión de sacarosa (75% p/p), 100ºC. Tiempo (min) Concentración ± s mg/ml Concentración ± s (mmoles/ml) Glucosa± s Fructosa± s Sacarosa± s Glucosa± s Fructosa± s Sacarosa± s 0 23,98±0,02 7,67±0,06 1,78±0,03 0,13±0,02 0,04±0,06 0,01±0, ,04±0,06 7,63±0,06 0 0,15±0,06 0,04±0, ,59±0,08 7,15±0,02 0 0,13±0,08 0,03±0, ,69±0,05 5,89±0,03 0 0,04±0,05 0,03±0,03 0

79 65 Tabla 11 Variación del contenido de azúcares durante la reacción de inversión de sacarosa (82% p/p), 100ºC. Tiempo (min) Concentración ± s mg/ml Concentración ± s (mmoles/ml) Glucosa± s Fructosa± s Sacarosa± s Glucosa± s Fructosa± s Sacarosa± s 0 20,10±0,03 8,57±0,03 1,57±0,03 0,11±0,03 0,04±0,03 0,004±0, ,34±0,05 6,72±0,03 0 0,14±0,05 0,04±0, ,79±0,06 6,44±0,09 0 0,12±0,06 0,04±0, ,94±0,09 6,58±0,02 0 0,11±0,09 0,04±0,02 0 Se observó que a los 10 minutos la sacarosa reaccionó completamente. La glucosa estuvo siempre en mayor proporción que la fructosa, lo cual es indicativo de una menor reactividad. A medida que transcurrió el tiempo, la cantidad de azúcares reductoras disminuyeron. Según Kroh,1970 7, las azúcares reductoras pueden reaccionar en medio ácido, sin necesidad de alguna fuente de nitrógeno, para formar color vía caramelización. En este trabajo, los estudios de formación del color en presencia de nitrógeno amoniacal se llevaron a cabo con soluciones de sacarosa invertida durante 10 min.

80 Factores que afectan la intensidad de oscurecimiento Efecto de la actividad de agua y el ph sobre la intensidad de oscurecimiento El efecto de la actividad de agua en la formación de compuestos de color se evaluó modificando la concentración inicial de sacarosa manteniendo la relación molar sacarosa/nitrógeno a 3,3:1. La generación del color se estudió a tres condiciones de ph iniciales (10,65± 0,07, 5,06± 0,05 y 7,06± 0,08). La temperatura de las reacciones fue (100±1) C. La actividad de agua se midió al inicio y al final de la reacción de formación del color. Para las reacciones a ph inicial de 10,65±0,07 la fuente de nitrógeno fue el hidróxido de amonio, las de ph 5,06±0,05 se realizaron con sulfato de amonio y las de ph 7,06±0,08 con una mezcla de hidróxido de amonio-sulfato de amonio. Las reacciones se replicaron 3 veces. Los resultados para cada ph se muestran en las Tablas 11, 12 y 13 y en forma combinada en la Figura 30. Para realizar comparaciones se estimó la velocidad de formación del color media (VCm). En este trabajo la VCm está estimada a partir de la intensidad de color alcanzada al final de un lapso dado de reacción menos la intensidad de color a los 30 minutos iniciales, dividido por el tiempo respectivo. Los datos se sometieron al análisis estadístico ANOVA, el cual mostró que valores de VCm mayores a 26 EBC/h pueden considerarse diferentes con p< 0.05.

81 67 Tabla 12. Efecto de la concentración inicial de sacarosa sobre la formación del color y actividad de agua. Condiciones de reacción: ph inicial (10,65 ± 0,07), temperatura (100 ± 1) ºC y relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno. Las reacciones se repitieron 3 veces Sacarosa (% p/p) Color promedio a alcanzado ± s (EBC) Tiempo de reacción (h) VC m ± s (EBC/h) a w ± Inicial a w ±0.003 Final ± ± 3 0,916 0, ± ± 35 0,899 0, ± ± 20 0,714 0, ± ± 11 0,686 0, ± ± 8 0,598 0, ± ± 9 0,531 0, ± ± 9 0,508 0, ± ± 10 0,493 0,744 Tabla 13.Efecto de la concentración inicial de sacarosa sobre la formación del color y actividad de agua. Condiciones de reacción: ph inicial (5,06 ± 0,05), temperatura (100 ± 1) ºC y relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno. Las reacciones se repitieron 3 veces Sacarosa (% p/p) Color promedio a alcanzado ± s (EBC) Tiempo de reacción (h) VC m ± s (EBC/h) a w ± Inicial a w ±0.003 Final ± ± 10 0,935 0, ± ± 73 0,887 0, ± ± 65 0,712 0,889

82 ± ± 53 0,684 0, ± ± 14 0,587 0, ± ± 21 0,527 0, ± ± 12 0,504 0, ± ± 3 0,488 0,759 Tabla 14. Efecto de la concentración inicial de sacarosa sobre la formación del color y actividad de agua. Condiciones de reacción: ph inicial (7,06 ± 0,08), temperatura (100 ± 1) ºC y relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno. Las se hicieron por triplicado. Sacarosa (% p/p) Color promedio a alcanzado ± s (EBC) Tiempo de reacción (h) VC m ± s (EBC/h) a w ± Inicial a w ±0.003 Final ± ± 63 0,924 0, ± ± 21 0,889 0, ± ± 15 0,712 0, ± ± 59 0,684 0, ± ± 20 0,585 0, ± ± 25 0,525 0, ± ± 25 0,506 0, ± ± 15 0,485 0,755

83 69 Figura 30. Velocidad media de formación de color a 100 ºC en función de la actividad de agua inicial para una condición de ph 10,65, 5,06 y 7,06 y una relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno. El ph y la actividad de agua inicial afectaron significativamente la VCm. A ph 10,65 la VCm máxima fue 435 ± 9 EBC/h obtenida a a w 0,531 ± 0,003, mientras que a ph 5,06 la VCm máxima fue 1699 ± 65 EBC/h pero a a w 0,712 ± 0,006, y a ph 7,05 la VCm máxima alcanzó 1511 ± 59 EBC/h a a w 0,684 ± 0,004. Por lo cual se encontró que a valores de ph menor de 10,65 la VCm máxima aumenta y se obtiene a valores mayores de actividad de agua. El aumento en la VCm máxima con la disminución del ph sugiere un efecto catalítico de los protones sobre la formación del color, dado que la relación sacarosa nitrógeno fue constante.

84 70 Los valores relativamente bajos de VCm a a w altos puede explicarse porque los reactantes se encuentran muy diluidos y reaccionan lentamente (Karl Eichner and Marcus Karel, 1972) 21. Por otra parte, la velocidad de formación de color pasa por un máximo a medida que disminuye la a w, a consecuencia de la disminución de la movilidad de los reactantes. El aumento en a w al cual se observa la VCm máxima con la disminución del ph es por lo tanto probable debido a una disminución en el coeficiente de difusión Efecto de la actividad de agua inicial sobre la intensidad de oscurecimiento De la misma manera se realizaron curvas de cinética de intensidad de color para estas tres condiciones de ph, en la figura 31 se observa el comportamiento para un valor de ph 10,65, figura 32 para un valor de ph 5,06 y figura 33 para un valor de ph 7,06.

85 71 Figura 31. Efecto de la actividad de agua sobre la formación de color a ph (10,65±0,07), relación molar 3,3:1 sacarosa/ nitrógeno y a una temperatura de (100±1) ºC En el sistema a ph 10,65 se observó un aumento en el oscurecimiento durante las primeras 5 horas de reacción, luego el oscurecimiento se hace más lentamente. Para los sistemas con mayor actividad de agua, 0,916 y 0,899, el color prácticamente no se incrementa después de las primeras cinco horas. En las reacciones con actividades de agua menores a 0,531 el incremento del color fue hasta las 25 horas aproximadamente. En las soluciones con actividades de agua entre 0,531 y 0,598, la reacción de oscurecimiento continúa hasta las 57 horas.

86 72 Figura 32 Efecto de la actividad de agua sobre la formación de color a ph (5,06±0,05), relación molar 3,3:1 sacarosa/ nitrógeno y a una temperatura de (100±1) ºC En los sistemas a 5,06 y 7,06 se observó que los tiempos de reacción fueron al menos 6 veces menores que los tiempos de reacción a ph 10,65. En esos sistemas las reacciones no se pudieron prolongar porque la mezcla se solidificaba y se tornaba negra con olor desagradable. Al sólido se le hicieron pruebas de solubilidad en ácido y base resultando ser insolubles. En los sistemas de menor ph y cuyas actividades de agua eran menores al correspondiente máximo de formación de color (a w alrededor de 0,712), se observó solidificación entre las cinco horas de reacción y sin embargo no llegaron a generar una alta intensidad de color. La VCm en las primeras cinco horas fue relativamente baja (480 ± 8EBC/h) para los sistemas con aw 0,713, la VCm alcanzó (4747± 86 EBC/h) luego de esas cinco horas de reacción.

87 73 Figura 33. Efecto de la actividad de agua sobre la formación de color a ph (7,06±0,08), relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno y a una temperatura de (100±1) ºC En este sistema se observó que a actividades de agua menores al correspondiente máximo de formación de color (a w alrededor de 0,684), se observó solidificación entre las cinco horas de reacción y sin embargo no llegaron a generar una alta intensidad de color. La VCm en las primeras cinco horas en los sistemas con aw 0,684 fue 1355 ± 26EBC/h. Por otra parte, la VCm alcanzó 1900 ± 37EBC/h luego de esas cinco horas de reacción.

88 Efecto del ph sobre la intensidad de oscurecimiento no enzimático En la sección anterior se estudió el efecto de la actividad de agua en la VCm para tres valores de ph, con la finalidad de hallar los niveles máximos de VCm en función de la actividad de agua (Figura 30). En esta sección se evalúa el efecto del ph sobre la intensidad de color, ya que éste es uno de los objetivos del presente estudio. Para ello se muestra en la Figura 34 la variación del color en función del tiempo de reacción para los tres ph estudiados a la a w donde se encontró máxima VCm. Figura 34. Efecto del ph sobre la formación de color, RM 3,3:1 sacarosa/nitrógeno, Temperatura 100ºC

89 75 Como podemos observar únicamente a ph 10,65 se pueden alcanzar intensidades de color mayores a EBC, pues a phs 5,06 y 7,06 las soluciones se solidificaban después de las 7 horas de reacción. Se puede observar además que las VCm de las reacciones a phs 5,06 (1696 ± 65 EBC/h) y 7,06 (1511 ± 59 EBC/h) son mayores que a ph 10,65 (1014 ± 5 EBC/h) en las primeras 7 horas de reacción. En el caso de la curva a ph 10,65 pueden distinguirse tres VCm. La primera desde el inicio de la reacción hasta las 10 horas aproximadamente, la cual es la mayor de todas (1037 ± 13EBC/h). La segunda entre las 10 y las 30 horas (568±9EBC/h), y finalmente una VCm al cabo de las 30 horas en la cual se observa muy poca formación de color (138 ± 7EBC/h). En el caso de la reacción a ph 5,06, se pueden observar sólo dos etapas En las primeras 5 horas la reacción es más lenta con VCm 481 ± 4EBC/h, luego de 5 horas la velocidad de reacción se hizo mayor 4747 ± 86 EB C/h. Esta velocidad permaneció hasta las 7 horas cuando comenzó el proceso de solidificación. La reacción a ph 7,06 durante las primeras 5 horas tiene una VCm de 1355 ± 26EBC/h, luego de esas primeras horas de reacción la VCm aumenta hasta 1900 ± 37EBC/h. Estos cambios diferentes en los VCm según el ph sugieren cambios en los mecanismos de reacción Efecto del ph sobre la actividad de agua Se ha reportado en la literatura (Kroh, 1994) 7 que uno de los primeros pasos de las reacciones de caramelización es la deshidratación, aproximadamente el 40% en peso del agua del sistema se forma en el transcurso de la reacción, hacer un seguimiento de la cantidad de agua que se forma en el medio es un indicativo del progreso de la misma. En la figura 36 se realizó una cinética de actividad de agua para las tres condiciones de ph. Para realizar comparaciones se estimó la Velocidad de cambio en la actividad de agua media (Va w m) calculada a partir de la a w final menos la a w inicial entre el tiempo de reacción.

90 76 Figura 35.Efecto del ph sobre la actividad de agua durante las reacciones de formación de color a 100ºC. La relación molar sacarosa/nitrógeno fue 3,3:1. Se puede observar que a ph 10,65 el aumento en la actividad de agua durante la reacción de formación de color tuvo una Va w m mucho menor (0,004 ± 0,003 a w /h) que a ph 5,06 (0,025 ± 0,003 a w /h) y 7,06 (0,026 ± 0,003 a w /h). Estos resultados indican que los procesos de deshidratación son favorecidos a mayor concentración de protones. Es interesante resaltar que Va w m son muy similares a ph 5,06 y 7,06. Esto pareciera sugerir que otro factor además del ph está jugando un papel importante en la catálisis del paso de deshidratación de la reacción de formación de color.

91 Efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno sobre la intensidad de color Se ha demostrado en la literatura que un aumento en la relación molar del amino compuesto respecto al azúcar reductor, lleva a un incremento en la intensidad de color del producto formado, en sistemas de reacción de glucosa y glicina a 65 C y ph neutro (A. Kaanane, 1989) 19. Sin embargo, el efecto de la relación molar azúcar reductor y amoníaco en la formación de color no ha sido estudiado hasta ahora en la literatura. Uno de los subproductos que se forman en la reacción de formación de color cuando se utiliza amoníaco como fuente nitrógeno es el 4metil-imidazol, un compuesto neurotóxico el cual aumenta linealmente con la cantidad de amoníaco (Roger Wood, 2004) 18 por lo que se busca generar un color caramelo con la mínima cantidad de nitrógeno incorporado. Con la finalidad de estudiar el efecto de la relación molar azúcar: amoníaco se realizaron reacciones adicionales, relaciones molares 33:1 y 330:1. Los sistemas evaluados mantuvieron una concentración de azúcar que correspondió al máximo en la curva de velocidad media de formación de color en función de la actividad de agua (Ver Sección 5.2.1).

92 78 Figura 36. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la formación de color, a ph 10,65, y 100ºC de temperatura. Como podemos observar, con una relación molar de 3,3:1 se alcanzó la máxima intensidad de oscurecimiento, mientras que a una relación diez veces menor la intensidad de color alcanzada es 4 veces menor lo cual es consistente con lo expuesto por A. Kaanane, en sus sistemas azúcar- aminoácidos. Por otra parte a una relación molar 100 veces menor no se aprecia formación de color. Cabe la pena destacar que en el sistema con una relación molar 3,3:1 la reacción de oscurecimiento se inicia desde la primera hora de reacción, mientras que en el sistema con relación molar 33:1, la reacción de oscurecimiento se retrasa hasta después de las 10 horas.

93 79 La segunda condición de estudio del efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno se realizó a ph 5,06, los resultados se muestran en la Figura 37 C Figura 37.. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la formación de color, a ph 5,06, y 100ºC de temperatura Como podemos observar en la Figura 37, para una relación molar 3,3:1 se alcanza la máxima intensidad de oscurecimiento, para una relación molar 10 veces menor la intensidad de color es 5 veces más pequeña y para una relación molar 100 veces menor la intensidad de color es 6 veces menos. Sin embargo es muy importante destacar que la máxima intensidad en el sistema 3,3:1 se alcanza a las 7 horas, mientras que en los sistemas 33:1 y 330:1 la máxima intensidad de color se alcanza a las 24 horas. Si se comparan las intensidades al cabo de 7 horas, el sistema a una relación molar de 3,3:1 reacciona 20 veces más rápido que el sistema 33:1 Es

94 80 interesante resaltar que la intensidad de color alcanzada a ph 5,06 con una relación molar de 330:1 (6015±41EBC) fue muy similar a la alcanzada a ph 10,65 con relación 33:1 (7892±26 EBC). La cinética de formación del color a ph 5,06 presentó un aumento de la velocidad de reacción en la etapa final, a diferencia de lo encontrado a ph 10,65 en la cual la velocidad disminuyó. Para la relación 3,3:1 y al cabo de las primeras 5 horas, la VCm fue 481 ± 4 EBC/h mientras que al final la VCm fue 4747 ± 86 EB C/h. Para una relación molar de 33:1 se encontró al cabo de las 7 horas una VCm de 97 ± 6 EBC/h y al final la VCm fue 486 ± 15 EBC/h hasta solidificarse. Finalmente para una relación de 330:1 se distinguió una VCm en las primeras 7 horas de 96 ± 3 EBC/h y luego la VCm aumentó a 312 ± 12 EBC/h hasta la formación de sólidos. 38. El efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno a ph 7,06 se muestra en Figura

95 81 Figura 38. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la intensidad de oscurecimiento no enzimático, a ph 7,06, y 100ºC de temperatura. Como podemos observar en la figura 38, al igual que a los otros phs para una relación molar 3,3:1 se alcanza la máxima intensidad de oscurecimiento, para una relación molar 10 veces menor la intensidad de color es 3 veces más pequeña y para una relación molar 100 veces menor la intensidad de color es 4 veces menor. Sin embargo es muy importante destacar que la máxima intensidad en el sistema 3,3:1 se alcanza a las 7 horas, mientras que en los sistemas 33:1 y 330:1 la máxima intensidad de color se alcanza a las 24 horas. Si se comparan las intensidades al cabo de 7 horas, el sistema a una relación molar de 3,3:1 reacciona 10 veces más rápido que el sistema 33:1. La cinética de formación de color a ph 7,05 también presentó un aumento de la velocidad de reacción en la etapa final. Para la relación 3,3:1y al cabo de las primeras 5

96 82 horas, la VCm fue 1355 ± 26 EBC/h mientras que al final la VCm fue 1900 ± 37 EBC/h. Para una relación molar de 33:1 se encontró al cabo de las 7 horas una VCm de 212 ± 19 EBC/h y al final la VCm fue 158 ± 5 EBC/h hasta solidificarse. Finalmente para una relación de 330:1 se distinguió una VCm menor en las primeras 7 horas de 120 ± 8 EBC/h y luego la VCm disminuyo a 99 ± 4 EBC/h hasta la formación de sólidos Efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno sobre la actividad de agua Los mecanismos aceptados para la formación de color a partir de azúcares reductoras contienen pasos de deshidratación de ellas y sus intermediarios, los cuales podrían dar origen al aumento de la actividad de agua. A continuación se presenta los resultados de evaluar el efecto de las relaciones molares sacarosa/nitrógeno sobre los cambios de la actividad de agua durante la formación del color a 100 ºC, VCm máxima y a los ph 10,65 (Figura 39), 5,06 (Figura 40) y ph 7,06 (Figura 41).

97 83. Figura 39. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la actividad de agua, durante la formación de color a 100 ºC y ph 10,65 La cantidad de nitrógeno en el sistema de reacción cumple un rol importante en el paso de la deshidratación en la reacción de Maillard a ph 10,65, para una relación molar 3,3:1 se obtiene una Va w m de 0,004 ± 0,003 a w /h siendo esta dos veces mayor que a una relación molar 33:1 y 20 veces más que a una relación molar 330:1.

98 84 Figura 40. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la actividad de agua, durante la formación de color a 100 ºC y ph 5,06. A ph 5,06 y 7,06 las Va w son similares como independientes del contenido de nitrógeno que si fue el caso a ph 10,65, el aumento en la deshidratación se produjo en las primeras 7 horas Va w m de 0,003 ± 0,001 a w /h, luego disminuyo hasta 0,0010 ± 0,00020 a w /h momento en que se solidifica.

99 85 Figura 41 Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la actividad de agua, durante la formación de color a 100 ºC y ph 7,06. El aumento en la deshidratación se produjo en las primeras 7 horas Va w m de 0,003 ± 0,001 a w /h, luego disminuyo hasta 0,0010 ± 0,00020 a w /h hasta solidificarse Efecto de la temperatura en la intensidad de oscurecimiento no enzimático Como se ha reportado en la literatura la energía de activación para el oscurecimiento disminuye por encima de 32ºC, generalmente la intensidad de oscurecimiento es sensible a la temperatura, por cada 10ºC incrementados asciende entre unas cuatro u ocho veces la intensidad de oscurecimiento (A. Kaanane, 1989) 19.

100 86 En esta sección se muestra los cambios obtenidos en la formación del color a 100ºC y 85ºC. La relación molar sacarosa / nitrógeno se mantuvo a 3,3:1 El efecto se evaluó a los ph 10,65 (Figura 42), 7,06 (Figura 44). y 5,06 (Figura 45) La actividad de agua inicial se ajusto para cada ph al nivel correspondiente de VCm máxima (Ver Sección 5.2.1). Figura 42 Efecto de la temperatura sobre la formación de color ph 10,65, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 A ph 10,65 la máxima intensidad de color (24844 ± 27 EBC) se alcanza a una temperatura de 100ºC, siendo ella 3 veces mayor a la intensidad de color que se alcanza a 85ºC (9356 ± 8 EBC), lo cual es consistente con lo expuesto por A. Kaanane, Adicionalmente se observó a 100ºC, en las primeras 5 horas de reacción, una VCm mayor (1006 ± 15 EBC/h) que a 85 ºC (25 ± 3 EBC/h). A 85 ºC la VCm máxima (177 ± 11 EBC/h) se encontró después de las 5 h de reacción (Tabla 14)

101 87 Figura 43 Efecto de la temperatura sobre la formación de color ph 7,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 Por otra parte, a ph 7,06 la máxima intensidad de color (10610 ± 37 EBC) también se alcanzó a una temperatura de 100ºC, mientras que a 85 ºC la intensidad de color fue 4 veces menor (3016 ± 5 EBC) Igualmente se encontró a 100 ºC, en las primeras 5 horas de reacción, que la VCm fue mayor (1355 ± 9 EBC/h) comparada a 85 ºC (15 ± 4 EBC/h). A 85 ºC la VCm máxima (117 ± 9 EBC/h) se encontró también después de las 5 horas de reacción (Tabla 14).

102 88 Figura 44 Efecto de la temperatura sobre la formación de color ph 5,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 Finalmente, a ph 5,06 encontramos la máxima intensidad de color (11923 ± 55 EBC) también a 100ºC, mientras que a 85 ºC la intensidad de color fue en este caso 4 veces menor (3010 ± 25 EBC). Adicionalmente se encontró a 100 ºC, en las primeras 5 horas de reacción, que la VCm fue mayor (480 ± 8 EBC/h) comparada a 85 ºC (19 ± 3 EBC/h). A 85 ºC la VCm máxima (116 ± 8 EBC/h) se encontró después de las 5 horas de reacción (Tabla 14) a lo igual que los otros dos ph estudiados.

103 89 Tabla 15.Efecto de la temperatura y ph sobre la velocidad media de formación de color luego de 5 horas, para ph 10,65, 7,06 y 5,06 VCm después de 5 horas de reacción (EBC/h) ph 100 ºC 85 ºC 10, ± ±11 7, ±37 117±9 5, ± ± Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua En esta sección se quiso evaluar el efecto de la temperatura en la velocidad del deshidratación de las azúcares y sus derivados durante la caramelización. Para ello se determinó la actividad de agua a los ph 10,65 (Figura 45), 5,06 (Figura 46),y 7,06 (Figura 47). Las condiciones de actividad de agua iniciales correspondieron a las que produjeron la máxima VCm (Ver Sección 5.2.1)

104 90 Figura 45 Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua, durante la formación de color a y ph 10,65. relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 Como podemos observar la temperatura es un factor determinante en la deshidratación del sistema (Tabla 15). A todos los ph se observó un aumento en la Va w m al aumentar de 85 ºC a 100 ºC. Al ph 10,65 el incremento fue de 2 veces, mientras que a los ph 5,06 y 7,06 el incremento fue de 3 veces. Lo cual sugiere a su vez que el efecto de la temperatura depende del ph. Es notable que a 85 ºC no se encontró diferencias significativas en la Va w m.

105 91. Figura 46 Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua, durante la formación de color a ph 5,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1

106 92 Figura 47 Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua, durante la formación de color a ph 7,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 Tabla 16. Efecto de la temperatura y ph sobre el cambio de velocidad media de actividad de agua luego de 5 horas, para ph 10,65, 7,06 y 5,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 Va w en las primeras 7 horas de reacción (a w /h) ph 100 ºC 85 ºC 10,65 0,039±0,002 0,015 ± 0,006 7,06 0,030±0,001 0,015 ± 0,008 5,06 0,030±0,001 0,015 ± 0,008

107 Nitrógeno libre durante la formación de color Se midió el consumo de nitrógeno a través del tiempo con el método de Kjeldahl. Los sistemas evaluados mantuvieron una concentración de azúcar que correspondió al máximo en la curva de velocidad media de formación de color en función de la actividad de agua (Ver Sección 5.2.1) Figura 48 Consumo de nitrógeno a través del tiempo, ph 10,65, 7,06 y 5,06 relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1, 100ºC Es evidente que el mecanismo de reacción para las tres condiciones de ph es diferente. Se observó un consumo acelerado de nitrógeno que se le incorpora al jarabe azucarado a ph 10,65. Por su parte los caramelos formados a ph 5,06 y 7.06 se caracterizaron por no consumir todo el nitrógeno añadido. A menor ph la concentración

108 94 de la especie NH 3 disminuye (El Hassan, 2008) 20 lo cual justificaría la menor reactividad encontrada. Sin embargo es probable también que la menor reactividad sea consecuencia de una disminución en la concentración de las especies participantes de las reacciones nucleofílicas observadas a ph 10,65. Es importante señalar que en el transcurso de la reacción hay formación de reductonas y ácidos débiles que disminuyen el ph del sistema. Por ejemplo, en este trabajo encontramos que al ph inicial de 10,65 (figura 49), donde el nitrógeno se consumió por completo a las 4 horas, el ph de la solución a este tiempo bajó a 7,23, mientras que a condiciones de ph inicial 7,06 en 4 horas el ph de la solución resultó 5,23 y a condiciones de ph 5,06 fue 4,09. Figura 49 Variación de ph a través del tiempo, ph 10,65, 7,06 y 5,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 y 100ºC.

109 Determinación de HMF La reacción de caramelización puede ser seguida por la aparición de HMF. Segun Kroh, se ha observado que mientras haya una mayor degradación de fructosa y glucosa mayor será la concentración de este intermediario. Los análisis de HMF se realizaron durante la formación del color a los ph de 10,65,7,06,y 5,06, teniendo como actividad de agua inicial los niveles correspondientes a la VCm máximas (Ver Sección 5.2.1). Los resultados se pueden observar en la figura 50. Para la comparación, se estimaron las velocidades de formación de HMF media (VHMFm) siendo esta la concentración de HMF al final de un lapso dado de reacción menos la concentración inicial entre el tiempo. Figura 50 Variación de HMF en función del tiempo a ph 10,65, 7,06 y 5,06, relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno y 100ºC

110 96 Al tiempo cero cuando se añadió la fuente de nitrógeno se detectó la presencia de HMF, lo cual es probablemente consecuencia del proceso de inversión de la sacarosa a temperatura ambiente. Con el comienzo del calentamiento a 100 ºC el nivel de HMF disminuyó hasta un punto desde el cual comienza a aumentar progresivamente. Para un ph 5,06 se observa un cambio a la VHMFm de ± 44 mmol HMF/h a la primera hora de reacción. A ph 7,06 el cambio de VHMFm fue a 16053±54 mmol HMF/h, ocurrido a partir de 6 horas. A ph 10,56 se observaron dos cambio en la VHMFm, al principio de la reacción no hay formación importante de HMF. Entre las 6 y las 9 horas de reacción la VHMFm fue de ± 71 mmol HMF/h y luego la VHMFm disminuyó a 4891 ± 26 mmol HMF/h. Fran Ledl and Erwin Scheicher, exponen que el HMF se produce a phs ácidos, lo cual es consistente con los resultados encontrados en este trabajo. 5.4 Formación de 4 metil-imidazol En la reacción entre dicarbonilos y amoniaco hay casi una exclusiva aparición del 4-metillimidazol, este compuesto es un indicativo del avance de esta reacción, y ha sido mostrado como un agente neurotóxico (Roger Wood, 2004) 18. Los análisis de 4-metil-imidazol se realizaron durante la formación del color a los ph de 10,65, 7,06, y 5,06, teniendo como actividad de agua inicial los niveles correspondientes a la VCm máximas (Ver Sección 5.2.1) Para realizar comparaciones se estimó la Velocidad media de formación de 4metilimidazol (VFm4MeI) siendo esta la concentración de 4MeI al final menos la concentración inicial de 4MeI entre el tiempo de seguimiento de la reacción. Los resultados obtenidos sobre la concentración de 4 metil-imidazol en el tiempo se pueden observar en la figura 51

111 97 Figura 51 Variación de la concentración de 4-metilimidazol en función del tiempo a ph 5,06, 10,65 y 7,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 y 100ºC En la figura 51 se puede observar que la máxima formación de imidazoles se produce a ph básico que según Kort, esto puede explicarse debido a que la reacción de Maillard con agua amoniacal y elevadas temperaturas trae consigo en su mayoría productos como imidazoles, pirazinas y pocas piridinas por ello en las primeras horas de reacción se obtiene una formación de 4-metilimidazol al cabo de 1 hora de 6,86 4MeI/h, luego de este tiempo se observa un consumo en el 4 metil-imidazol esto podría explicarse según la literatura (Carline M. J, 2002) 28 una de las hipótesis para la formación de melanoidinas son la previa formación de anillos de 2 o 4 miembros en su mayoría piridinas e imidazoles los cuales pueden polimerizar entre si y generar melanoidinas de alto peso molecular e intensidad de color, para un ph de 7,06 se observa un comportamiento similar, al principio una VFm4MeI elevada 2,70 4MeI/h) y

112 98 luego un consumo del mismo es importante recordar que el buffer para trabajar a ph neutro se formo de sulfato de amonio-hidróxido de amonio. Por otra parte para un ph 5,06 no hay formación apreciable de 4metil-imidazol. Si se realiza la conversión para determinar la cantidad de 4-metilimidazol referido a un color de unidades EBC se obtiene una concentración final en un sistema de ph inicial de 10,65 de 73mg/Kg; 7,06 53mg/Kg y para un sistema de ph inicial 5,06 < 0,001mg/Kg resultando estar los tres sistemas por debajo del límite establecido para un color caramelo clase III, recordando que el límite es 200mg/Kg de 4-metilimidazol referido a un color de EBC. 5.5 Electroforesis Los sistemas evaluados por electroforesis mantuvieron una concentración de azúcar que correspondió al máximo en la curva de velocidad media de formación de color en función de la actividad de agua (Ver Sección 5.2.1)., relación molar azúcar/nitrógeno 3,3:1 y 100ºC de temperatura Los resultados se observan en la Figura 52

113 99 Figura 52 Electroforesis. Condiciones de reacción ph 10,65; 7,06 y 5,06, relación molar sacarosa/nitrógeno 3,3:1 y 100ºC Como se puede observar para los tres sistemas de reacción no se obtiene un compuesto mayoritario al cual se le pueda realizar medición de punto isoeléctrico, por el contrario se observa un rango bastante amplio de compuestos, los cuales tendrán a su vez un extenso rango de puntos isoeléctricos razón por la cual se sugirió no realizar el isoelectroenfoque, el peso molecular esta alrededor de y Da 5.6 Determinación de compuestos de aroma Se ha reportado en la literatura que los compuestos de aroma difieren según el ph inicial del sistema de reacción, a phs mayores de 7 se ven favorecidos los compuestos que dan sabor, mientras que a phs menores se favorecen los compuestos que dan un agradable aroma al color caramelo (F. George Njoroge, 1989) 11, los sistemas evaluados