Espectrometría de Masas

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1 Espectrometría de Masas 4. ESECTROMETRIA DE MASAS La espectrometría de masas (EM) es una técnica de análisis basada sobre la separación de acuerdo a sus razones masa/carga de las especies cargadas formadas a partir de la ionización de una muestra. Se trata de una técnica extremadamente sensible, de gran versatilidad y cuyos campos de aplicación experimentan un crecimiento vertiginoso en nuestros días. La EM suministra información muy valiosa sobre los compuestos químicos: la masa molecular, la fórmula global y, a partir del patrón de fragmentaciones, la estructura molecular. asi como la composición isotópica en sustancias naturales o marcadas. Debe reiterarse la elevada sensibilidad de la EM (en condiciones muy especiales pueden detectarse señales correspondientes a sólo 10 iones) por lo que es la preferida para la determinación de trazas en química ambiental y en los controles antidopaje. Los orígenes de la EM se remontan al estudio de la conducción de la electricidad en los gases a finales del siglo XIX. El descubrimiento por Goldstein en 1886 de los rayos canales (iones positivos) y la medición de su razón masa/carga por Wien en 1898, mediante deflexión bajo la acción de campos eléctricos y magnéticos, son los hitos iniciales del desarrollo de la espectrometría de masas. Wien encontró que los rayos canales tenían carga opuesta y una razón masa/carga muy superior a las del electrón, determinada ese mismo año por J.J.Thomson. Thomson comienza en 1905 a estudiar estos rayos canales positivos y recibe en 1906 el premio Nóbel de Física por sus estudios de la conductividad eléctrica en gases. En 1913 logra separar iones con diferente razón masa/carga, determinando la existencia de los dos isótopos del neón Ne. Francis Aston construye en 1919 el primer espectrógrafo de masas rudimentario con un poder de resolución de 130 y recibe en 19 el premio Nóbel por su descubrimiento, mediante el espectrógrafo de masas, de un gran número de isótopos de elementos no radiactivos Mattauch y Herzog desarrollan un espectrómetro de masa de doble enfoque y Dempster en 1936 la fuente de ionización por chispa. En 1937 Aston construye un espectrógrafo con un poder de resolución de 000. En 1931 Lawrence desarrolla el ciclotrón por lo que recibe el premio Nóbel en 1939 y sus principios son aplicados al enriquecimiento de uranio en el proyecto Manhattan. La urgente necesidad de métodos de análisis eficientes de las fracciones de petróleo durante la segunda guerra mundial llevó a la aplicación de la EM al campo de los compuestos orgánicos. Los primeros EM comerciales aparecerán al finalizar la guerra. En 1946 Stephens presenta al concepto de EM con analizador de tiempo de vuelo. La aplicación de la EM a los compuestos orgánicos y el estudio de las fragmentaciones como fuente de información estructural se desarrollan muy rápidamente desde fines de los años cuarenta del siglo XX. En 1956 Mc Lafferty propone la reacción de transferencia de hidrógeno o reordenamiento que 0 Ne y 43

2 y es a M E R (radical) se Espectrometría de Masas lleva su nombre. En 1959 se comienzan a desarrollar los sistemas acoplados (cromatógrafo gaseosoespectrómetro de masas). Aparecen nuevos métodos de generación de iones y de analizadores. En 1966 se introduce la ionización química y en 1968 Dole desarrolla la ionización por electronebulización. En 1974 Comisarow y Marshall diseñan la EM mediante resonancia ión ciclotrón-transformada de Fourier y en 1976 Mc Farlane y colaboradores desarrollan la EM por desorción de plasma. En los años ochenta se desarrollan nuevas técnicas de ionización efectivas que permiten la ionización de especies no volátiles, con mínima descomposición. Estos métodos abren las puertas a las aplicaciones de la EM al campo de las macromoléculas y en particular las biomoléculas. En 1984 Fenn y colaboradores aplican la electronebulización para ionizar biomoléculas. En 1985 Hillencamp, Karas y otros describen la ionización por desorción con láser inducida por matrices (MALDI) y en 1987 Tanaka perfecciona el método para ionizar proteínas intactas. En 1989 aul recibe el premio Nóbel por el desarrollo de la trampa de iones. En 00 Fenn y Tanaka reciben el premio Nóbel de Química por el desarrollo de métodos de ionización por desorción suaves para el análisis por EM de macromoléculas biológicas. 4.1 Espectrómetro de masas rincipios Los fundamentos de la espectrometría de masas pueden ejemplifican mediante la técnica de ionización electrónica. Electrones acelerados a través de un campo eléctrico adquieren energía cinética considerable y pueden interactuar con moléculas (M) para originar especies cargadas: M e-. e- En este caso M. un catión-radical molecular. Normalmente M puede sufrir fragmentación, que puede ser de diferentes formas:. forma en un estado excitado y. M.. N (molécula) Los iones E su vez pueden fragmentarse y así sucesivamente. La forma de fragmentación dependerá en cada caso de la estructura molecular. La mayoría de los iones producidos tiene una carga -19 correspondiente a la pérdida de un solo electrón (e = C), aunque también se pueden obtener iones multicargados. La carga total de los iones se representa usualmente por q (q=ze), donde e es la carga del. 44

3 kg) Espectrometría de Masas electrón y z el número de cargas sobre el ión. Todos los iones producidos son separados en un espectrómetro de masas de acuerdo con su razón masa/carga. La masa se expresa en unidades de masa atómica (u) o Dalton (Da) (1u = 1Da = de manera que la razón masa/carga (m/z) se expresa en Thompson (Th = Da/z). Los iones así separados son detectados como corrientes iónicas cuyas intensidades son proporcionales a sus abundancias respectivas. rocesando esta información se obtiene un espectro de masas (EM), tal como se muestra en la Figura 4.1 Figura 4.1 Espectro de masas del metanol obtenido mediante una fuente de ionización por EI. Representado como gráfico de líneas y como tabla. El pico más intenso en el EM se denomina pico base y en los gráficos de líneas, como el mostrado en la figura 4.1, se utiliza como intensidad de referencia para el resto de los picos significativos. De acuerdo con lo descrito hasta el momento, un espectro de masas puede ser representado por un gráfico en el cual el eje (x) corresponde a la razón m/z de cada ión y el eje (y) a la abundancia o intensidad relativa correspondiente a cada valor de m/z. ara obtener un espectro de masas es necesario: - Introducir la muestra en forma y cantidad apropiada [Sistema de introducción de la muestra] - roducir iones [Fuente de ionización] - Separar los iones de acuerdo con su razón m/z [Analizador] - Registrar (detectar) el resultado de la separación de los iones [Detector ] - Representar los resultados. En la Figura 4. se muestra esquematicamente un espectrómetro de masas, en este caso con ionización electrónica y analizador magnético. 45

4 Figura 4. Esquema de un espectrómetro de masas Como se puede apreciar, la relación de los aspectos necesarios para obtener un espectro de masas de hecho incluye los componentes básicos de un espectrómetro de masas. Todos los espectrómetros de masas tienen que funcionar en condiciones de alto vacío. Esto es necesario para lograr que los iones puedan llegar al detector sin interactuar con otras moléculas gaseosas.esas interacciones unidas a las que pueden ocurrir con las paredes del instrumento provocan que los iones pierdan su carga. or otro lado, las interacciones ión-molécula pueden producir reacciones no deseadas e incrementar la complejidad de los espectros. Reducir el número de interacciones es tan importante que resulta necesario utilizar sistemas de bombas de vacío muy eficientes, que incluyen bombas mecánicas en unión de bombas turbomoleculares, de difusión o criogénicas Sistema de introducción de la muestra En la mayoría de las técnicas utilizadas para analizar compuestos de baja masa molecular la ionización ocurre en fase gaseosa, surgiendo la necesidad de que la muestra en el espectrómetro de masas se transfiera de la fase condensada a presión atmosférica a la fase vapor (alto vacío), sin comprometer las condiciones del vacío. ara las fuentes por ionización electrónica (Electron Ionization: EI) y por ionización química (Chemical Ionization: CI) existen cuatro opciones principales: - Recipiente de calentamiento de tabique con válvula de entrada. Es básicamente un recipiente de calentamiento conectado a la fuente iónica. La muestra se inyecta al recipiente a través de un tabique. Este sistema se utiliza para gases y líquidos volátiles. - Sonda de inyección directa. La muestra se carga en un tubo de cuarzo al final de una sonda y se inserta directamente en la fuente iónica. Si se requiere, el final de la sonda puede ser calentado. Se utiliza para sólidos relativamente volátiles. 46

5 - Cromatografía gaseosa (CG). La mezcla se inyecta en la columna de CG que se conecta directamente a la fuente iónica. Los componentes de la mezcla son separados por la columna de CG y entran sucecivamente en la fuente iónica. Se utiliza para mezclas volátiles. - Interfase de flujo de partículas. Las muestras se disuelven en un disolvente apropiado y la disolución se introduce en el espectrómetro de masas. El líquido se nebuliza con helio gaseoso para formar un aerosol de gotas de disolvente. El aerosol se pasa a través de una cámara de desolvatación y se remueven el disolvente y el helio, permitiéndose que el flujo de partículas sólidas de la muestra entre en la fuente EI o CI. Este sistema se utiliza para compuestos semivolátiles que pueden ser tratados mediante las fuentes de ionización EI y CI. En realidad existe una estrecha relación entre el sistema de introducción de la muestra y la fuente de ionización, de tal forma que la frontera de separación entre ambas es muy difusa para otras fuentes diferentes a las EI y CI. El estudio de las fuentes de ionización permitirá profundizar también en los sistemas de introducción de las muestras Fuentes de ionización En espectrometría de masas se utiliza una variedad de fuentes de ionización, siendo la energía que se transfiere durante el proceso de ionización y las propiedades químico-físicas de la especie a ionizar, los dos aspectos más importantes que deben considerarse en relación con las mismas. Algunas técnicas de ionización producen iones con gran exceso de energía, y se denominan técnicas duras, dando lugar a una fragmentación extensiva de la muestra. Otras, por su parte, sólo producen esencialmente el ión molecular y se denominan técnicas de ionización blandas. Las fuentes de ionización producen iones principalmente por ionización de una molécula neutra, mediante la expulsión o captura de electrones, protonación, desprotonación, formación de aductos o la transferencia de una especie cargada a partir de una fase condensada a la fase gaseosa. La producción de iones frecuentemente implica reacciones ión-molécula en fase gaseosa Ionización electrónica La fuente de ionización electrónica (Electron Ionization: EI) fue la técnica inicialmente más utilizada en espectrometría de masas y su descripción permite comprender los aspectos esenciales de este método. Las moléculas pueden interactuar con los electrones para dar iones, los cuales son micropartículas cargadas eléctricamente. La interacción molécula-electrón suele denominarse erróneamente impacto electrónico, aunque no es realmente una colisión en el sentido de la Física Clásica. La fuente de EI, cuyo esquema se muestra en la Figura 4.3, consiste en un filamento cargado negativamente y calentado por una corriente que circula en el mismo que actúa como emisor de electrones. 47

6 Figura 4.3 Fuente de iónización electrónica (EI) Los electrones son acelerados hacia un ánodo e interaccionan con las moléculas gaseosas de la muestra inyectada en la fuente o procedente del sistema de introducción. En la Figura 4.4 se muestran los gráficos típicos del número de iones producidos por longitud de recorrido libre (cm) y por presión de la muestra (mm de Hg) (F) cuando se varía el potencial de aceleración de los electrones (o su energía cinética). Estos gráficos reciben el nombre de curvas de eficiencia de ionización. Figura 4.4 Curvas de eficiencia de ionización. Cuando la energía de los electrones es menor que el potencial de ionización de la especie química no se generan iones. A energía electrónicas elevadas, la interacción molécula-electrón es poco eficiente. De acuerdo con la mecánica cuántica, la interacción es de máxima efectividad cuando la longitud de onda de los electrones (λ) es comparable con las dimensiones de los enlaces (d). La existencia de un máximo ancho en la curva de eficiencia de ionización precisamente alrededor de los 70 ev (λ d 140 pm en moléculas orgánicas). A este nivel de energía, pequeños cambios en la energía electrónica no afectan significativamente el patrón espectral. Como promedio se produce un ión por cada 1000 moléculas que 48

7 entran a la fuente en condiciones usuales, a 70 ev. En estas condiciones de 10 a 0 ev son transferidos a las moléculas durante el proceso de ionización. Dado que aproximadamente 10 ev son suficientes para ionizar la mayoría de las moléculas orgánicas, el exceso de energía origina una fragmentación abundante, pues la ruptura de enlaces químicos requiere energías del orden de 3-5 ev. La ionización utilizando electrones con energías ligeramente superiores al potencial de ionización genera iones moleculares con poca energía en exceso y poco proclives a la fragmentación. or encima de 30eV todos los iones fragmento que se observan a 70eV ya están presentes en el espectro A un potencial de aceleración dado y a temperatura constante, el número de iones producido por unidad de tiempo I en un volumen V está relacionado con la presión p y la corriente electrónica i mediante la expresión: I = N p i V [4.1] Donde N es una constante. Esta proporcionalidad directa entre la corriente iónica y la presión de muestra permite la utilización de la técnica en mediciones cuantitativas. En la Figura 4.5 se muestran los espectros de EI de una β-lactama obtenidos a 70 y 15 ev. Como era de esperar, a 15 ev la fragmentación es menos abundante, detectándose más fácilmente el ión molecular. Fig. 4.5 Espectros de masas EI de β-lactama Sin embargo, la intensidad absoluta (en unidades arbitrarias), que es proporcional al número de iones detectados, es realmente menor a 15 ev que a 70 ev. Así, el incremento en intensidad relativa debido a la baja fragmentación es ilusorio. Realmente hay una pérdida general de intensidad debida al decremento de la eficiencia de la ionización cuando la energía electrónica es baja. or lo tanto, en general, la fuente de EI no será muy útil para la detección del ión molecular. No obstante, la disminución de la energía de los electrones ionizantes podría favorecer algunos procesos de fragmentación, lo cual puede ser conveniente en algunos 49

8 casos. Es necesario destacar que en el proceso de interacción entre los electrones acelerados y las moléculas, éstas pueden también ganar electrones originándose aniones-radicales (M.- ). La formación de estos últimos requiere de apreciable electroafinidad Los aniones radicales se forman con gran energía interna fragmentándose totalmente a diferencia de los cationes radicales, donde buena parte de la energía en exceso se disipa como energía cinética de los electrones libres. ara la mayoría de las moléculas es más efectiva la producción de cationes-radicales y en la EM-EI sólo éstos serán considerados en lo adelante. Una modificación de la técnica de EI consiste en desorber la muestra a partir de un filamento de renio calentado cerca del flujo electrónico. Este método se denomina de Ionización Electrónica por Desorción (Desorption Electronic Ionization: DEI) Ionización química La ionización química (Chemical Ionization: CI) es una técnica blanda que produce iones con pequeña energía en exceso. La fuente de CI es muy similar a la de EI, en muchos instrumentos el cambio de fuente es expedito. En la fuente CI el flujo de electrones crea un plasma de gas reactivo ionizado (por ejemplo: metano, isobutano, amoníaco, agua) que se encuentra a mucha mayor concentración que la muestra (presión parcial 60 a, relación gas reactivo/muestra 1000:1). La ionización se origina entonces por la interacción entre las moléculas de la muestra y el gas, y no por la interacción directa de aquellas con el flujo electrónico. Como ilustración de los procesos que tienen lugar, se muestra lo que ocurre cuando se utiliza el metano como gas reactivo. Si se introduce metano como gas reactivo, la reacción primaria con los electrones será una clásica reacción de ionización: CH 4 e CH 4 e El ión-radical puede fragmentarse siguiendo principalmente las reacciones siguientes: CH 4 CH 3 H CH 4 CH H Sin embargo, en su mayor parte, dada la elevada presión, reaccionará con otras moléculas de metano dando lugar a : CH 4 CH 4 CH 5 CH 3 Otras reacciones de los iones formados con el metano ocurrirán en el plasma: CH 3 CH 4 C H 5 H 50

9 ,, debido y y. Espectrometría de Masas También se forma un ion CB3BHB5B a las reacciones sucesivas siguientes: CH CH 4 C H 3 H H C H 3 CH 4 C 3 H 5 H La abundancia relativa de todos esos iones dependerá de la presión. En la Figura 4.6 se muestra el espectro del plasma obtenido a 0 a por ionización del metano. Figura 4.6 EM metano a 0 a. Las moléculas de la muestra M reaccionarán en su mayor parte adquiriendo un protón en una reacción del tipo ácido-base con uno de los iones del plasma si la afinidad protónica (A, energía liberada en la protonación) de M es mayor que la del metano: M CH 5 MH CH 4 En el caso de moléculas que contienen heteroátomos, la reacción de ionización principal ocurre a través de reacciones ácido-base como la antes mostrada y con los iones CBBHB5B CB3BHB5B Si la muestra es un hidrocarburo saturado RH u otro compuesto de baja afinidad protónica, la reacción de ionización principal será una abstracción de hidruro : RH CH 5 R CH 4 H Cuando se trate de moléculas polares, se observará también la formación de aductos ion-molécula, lo cual es un tipo de solvatación en fase gaseosa: M CH 3 (M CH 3 ) Los iones ( MH) R ( M CHB3B ) otros aductos de iones con la molécula se denominan "especies moleculares " o menos frecuentemente "iones pseudomoleculares o cuasimoleculares". Ellos permiten la determinación de la masa molecular de la muestra. Los procesos que ocurren en la fuente de CI son menos energéticos que los presentes en la ionización electrónica y pueden formarse tanto iones positivos como negativos de la sustancia en estudio como 51

10 NHB4B Espectrometría de Masas resultado de reacciones químicas con los iones del plasma. El surgimiento de iones negativos se explica porque el plasma contiene electrones de baja energía, los cuales bien fueron utilizados para la primera ionización y posteriormente se hicieron más lentos, o bien fueron producidos por reacciones de ionización. Esos electrones lentos pueden asociarse con moléculas originando así iones negativos. Los iones formados cuando se utiliza la técnica de CI son relativamente estables y los procesos de fragmentación son mucho menos acentuados que en la técnica de EI. Así, la técnica de CI tiene la ventaja de producir un espectro de masas en el cual la especie molecular es fácilmente reconocible. Consecuentemente, la ionización química es complementaria con la ionización electrónica y es muchas veces recomedable obtener ambos espectros de la muestra en estudio. En la Figura 4.7 se muestran los espectros de masas del metacrilato de butilo registrados utilizando las fuentes de CI y EI respectivamente. En el espectro de masas-ei (a) no es observable el pico del ión molecular en m/z 14 mientras que en los espectros (b) y (c) se observa el pico del ión pseudomolecular protonado en m/z 143. Cuando el gas portador utilizado es metano (espectro b) el pico base se encuentra en m/z 87 y cuando es isobutano (espectro c) el pico base corresponde al ión pseudomolecular en m/z 143.Se evidencia aquí el efecto del gas portador sobre el espectro de masas-ci. En función de la acidez del agente protonante se formarán iones MH con mayor o menor tendencia a la fragmentación. La fortaleza como agente protonante de un ión puede expresarse como la afinidad protónica (A) de su base conjugada, definida como la energía liberada durante la protonación. A menor afinidad protónica de un gas portador mayor será la fortaleza de su agente protonante. Con el gas portador metano cuya afinidad protónica es baja (A = 5.7 ev) la tendencia a la fragmentación es mayor que con isobutano (A = 8.5 ev) y en éste mayor que con amoniaco (A = 9.0 ev), reflejando la acidez decreciente del agente protonante (CHB5B > ). (CHB3B)B3BC > Bombardeo con átomos rápidos El aspecto esencial de la técnica de ionización mediante el bombardeo con átomos rápidos (Fast Atom Bombardment: FAB) es que la muestra está disuelta en una matriz líquida no volátil, siendo la glicerina la sustancia más frecuentemente utilizada con este fin. Sobre la disolución se hace incidir un flujo de átomos (Xe, Ar) con elevada energía cinética, lográndose extraer iones y partículas neutras hacia la fase gaseosa. En condiciones favorables las moléculas de la muestra forman una monocapa en la superficie de la disolución que puede mantenerse continuamente pese al bombardeo, por difusión de otras moléculas de muestra del seno de la disolución hacia dicha superficie. Esto garantiza dos características muy deseables: reproducibilidad y presencia reducida de iones procedentes de la matriz en el espectro. En la Figura 4.8 se muestra un diagrama de la fuente de ionización por FAB. 5

11 Figura 4.7 Espectros de masas del metacrilato de butilo. (a) EI. (b) CI (metano). (c) CI (isobutano) Figura 4.8 Fuente de ionización por FAB De acuerdo con el diagrama, inicialmente ocurre la ionización del argón, estos iones son acelerados, y en la cámara de intercambio el choque de los iones con átomos de argón genera el flujo de átomos rápidos: Ar. (rápido) Ar (lento) > Ar. ( (lento) Ar ( rápido) 53

12 El flujo pasa entre dos electrodos que elimina todas las especies iónicas, de manera que solamente los átomos neutros rápidos impactan sobre la muestra disuelta en la matriz. Los iones extraídos son acelerados y enfocados por electrodos hacia el analizador. El bombardeo puede realizarse con iones (Cs ) en lugar de átomos neutros reportándose una mayor sensibilidad para masas moleculares altas. Sin embargo, la utilización de iones es desventajosa pues se acumulan cargas eléctricas en la matriz, sobre todo cuando se trata de muestras no conductoras. Si las especies a estudiar pueden ser preionizadas ya en la matriz mediante reacciones ácido-base la sensibilidad del método se eleva considerablemente La fuente de ionización FAB es muy eficiente para producir iones a partir de compuestos polares con masas moleculares altas, siendo muy útil para el estudio de péptidos y nucleótidos. Como se trata de una técnica de ionización blanda, los EM-FAB contienen esencialmente las señales de los iones pseudomoleculares y muy escasa presencia de iones fragmento. Mediante esta fuente los flujos de iones pueden mantenerse por largos períodos de tiempo, en ocasiones de varios minutos, lo cual garantiza la reproducibilidad y permite realizar diferentes tipos de análisis a la misma muestra. En la Figura 4.9 se muestra el espectro FAB de una mezcla de péptidos. Figura 4.9 Espectro de masas FAB de una mezcla de cinco péptidos. Se detectan los iones cuasimoleculares de cada uno de dichos péptidos. La fragmentación es escasa de acuerdo al carácter blando de la ionización. La fuente de ionización FAB tiene baja sensibilidad comparada con otras fuentes recientemente desarrolladas. El uso de una matriz hace que los espectros sean más complicados debido a las señales que las 54

13 mismas introducen. En la Tabla 4.1 se dan los picos asociados a las matrices más utilizadas en fuentes de ionización FAB. Tabla 4.1 Matrices utilizadas en fuentes de ionización FAB y señales en el espectro de masas. Matriz icos (m/z) Glicerol Tioglicerol Bala mágica* Alcohol nitrobencílico olietilenglicol Trietanolamina * Mezcla eutéctica de ditiotreitol y ditioeritriol (5:1) Ionización mediante desorción por láser asistida por matriz La desorción por láser (Laser Desorption: LD) es un eficiente método para producir iones gaseosos. 6 Generalmente, pulsos de láser intensos ( W -1 cm ) se enfocan sobre una superficie reducida de -3-4 muestra (10-10 cm ), usualmente un sólido. Esos pulsos de láser actúan sobre el material de la superficie y crean un microplasma de iones y moléculas neutras, los cuales pueden reaccionar entre ellos en la densa fase vapor, cerca de la superficie de la muestra. El pulso de láser realiza ambas funciones: la vaporización e ionización de la muestra. La técnica LD se utiliza en el estudio de superficies para el análisis de la composición total de muestras, tal como la inclusión de partículas en minerales. Mediante el ajuste de la longitud de onda del láser, se logra una ionización selectiva. Dado que los iones se generan en los cortos intervalos de tiempo en que se aplica el láser, se requiere utilizar analizadores rápidos de detección simultánea o de tiempo de vuelo. La probabilidad de obtener un espectro de masas útil depende críticamente de las propiedades físicas de la muestra analizada (fotodisociación, volatilidad, etc.). Más aún, los iones producidos son casi siempre productos de fragmentación de la molécula original si su masa está por encima de 500 Da aproximadamente. Las limitaciones de la fuente de ionización LD se superan en gran medida mediante el desarrollo de la técnica MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) donde la preparación de la muestra es esencial. El proceso de ionización utilizando una fuente de ionización MALDI se realiza en dos etapas. En la primera, el compuesto que se analiza se mezcla con un disolvente que contiene moléculas orgánicas pequeñas en disolución, que se utilizarán como matriz. Estas moléculas deben presentar una absorción fuerte a la longitud de onda del láser. La mezcla se seca antes del análisis, removiéndose todo el disolvente líquido utilizado, lo cual permite obtener un sólido formado por las moléculas orgánicas pequeñas (matriz) embebido del 55

14 compuesto que se analiza. Las moléculas de éste se encuentran completamente aisladas unas de otras en la matriz sólida. El segundo paso corresponde a la aplicación de pulsos intensos y cortos del láser sobre la disolución sólida. La irradiación con el láser induce un rápido calentamiento de los cristales debido a la acumulación de una gran cantidad de energía en la fase condensada a través de la excitación de las moléculas de la matriz. El rápido calentamiento causa la sublimación localizada de los cristales de la matriz y la expansión de ésta en la fase gaseosa, lo cual permite la entrada de compuesto intacto en la matriz extendida. Se transfiere poca energía interna a las moléculas del compuesto estudiado y éstas pueden enfriarse durante el proceso de expansión. Las reacciones de ionización pueden ocurrir en cualquier momento durante este proceso. El origen de los iones producidos en la técnica MALDI no está aún suficientemente aclarado. Los caminos de ionización química y física sugeridos para la técnica MALDI son la fotoionización en fase gaseosa, transferencia protónica en estado excitado, reacciones ión-molécula y desorción de iones preformados. El mecanismo de formación de iones más ampliamente aceptado es la transferencia protónica en fase gaseosa desde las moléculas de matriz fotoionizadas. En la Figura 4.10 se muestra un diagrama del proceso MALDI. Figura 4.10 Diagrama de la fuente de ionización MALDI. La fuente de ionización MALDI es más sensible que otras técnicas de ionización por láser, a lo cual contribuyen diferentes factores. El número de moléculas de la matriz excede ampliamente al de la muestra analizada, separando a éstas y evitando la formación de agrupaciones moleculares que pueden inhibir la aparición de iones moleculares. La matriz también sirve para minimizar el daño que puede causar el pulso de láser a la muestra, absorbiendo la mayor parte de la energía incidente e incrementando la eficiencia de la transferencia de energía del láser a la muestra. or esta vía se incrementa notablemente la intensidad. También es más universal que otras técnicas de ionización por láser, pues no es necesario ajustar la longitud de onda para hacerla coincidir con la absorción de cada muestra pues es la matriz la que absorbe la radiación del láser. Además, dado que el proceso es independiente de las propiedades de absorción y tamaño del 56

15 compuesto que se analiza, MALDI permite la desorción e ionización de sustancias con masas moleculares muy altas. or ejemplo, es posible la detección de picomoles de proteínas con masas moleculares superiores a Da. En la técnica de ionización MALDI se han utilizado láseres de diferente tipo. Los láseres ultravioleta (UV) son los más utilizados debido a su fácil manipulación y bajo costo, siendo los de nitrógeno (λ= 337 nm) los estándares. También se pueden utilizar láseres infrarrojos (IR) tales como los de COBB (λ= 10,6 μm). Los espectros de masas MALDI obtenidos con láseres UV e IR son esencialmente idénticos. Una de las pocas diferencias es que en MALDI-IR ocurre menos formación de aductos y menos fragmentación que con un láser UV. Los pasos más importantes para la obtención de un espectro de masas MALDI son la selección de la matriz y el protocolo de preparación de la muestra. Las matrices, como se ha señalado antes, deben tener una fuerte absorbancia a la longitud de onda del láser, masa suficientemente baja para que la sublimación ocurra con facilidad, estabilidad al vacío y prácticamente carecer de reactividad química excepto su capacidad para ceder protones. No obstante, esta generalización es insuficiente para garantizar que se pueda disponer de una matriz apropiada, que continúa siendo una selección guiada por la experiencia práctica. En la Tabla X. se incluyen algunas matrices UV-MALDI comunes. Una preparación típica de muestra para MALDI se logra disolviendo 0mg de ácido sinápico en 1mL de una mezcla acetonitrilo: agua: ácido trifluoroacético 50:50:0.1, se añade la muestra y finalmente se evapora cuidadosamente el solvente. Tabla 4. Matrices UV-MALDI comunes. Matriz Aplicaciones Ácido α-ciano-4-hidroxicinámico éptidos, proteínas, compuestos orgánicos Ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico(sinápico) Biopolímeros de elevada masa molecular Ácido,5-dihidroxibenzóico(gentísico) éptidos,proteínas, carbohidratos Ácido 3-hidroxipicolínico Oligonucleótidos Trihidroxiacetofenona Oligonucleótidos, péptidos Ácido 5-clorosalicílico olímeros insolubles en agua. La espectrometría de masas con fuente de ionización MALDI es un poderoso método para el estudio de polímeros y biopolímeros sintéticos. Un espectro MALDI típico incluye principalmente especies moleculares monocargadas (iones cuasimoleculares), algunos iones con carga múltiple y muy pocos fragmentos. En proteómica se utiliza la técnica MALDI-TOF para identificar proteínas aisladas por electroforesis en gel y en la llamada peptide mass fingerprint (ver aplicaciones). En la Figura 4.11 se muestran dos espectros de masas obtenidos utilizando la fuente de ionización MALDI. Obsérvese en (a) la detección del ión molecular del anticuerpo monoclonal y de algunas especies multicargadas y la ausencia de fragmentaciones. En el espectro 57

16 del polimetacrilato de metilo (b) pueden detectarse las especies moleculares de diferente grado de polimerización. Figura 4.11 Espectros de masas registrados mediante una fuente de ionización MALDI: (a) de un anticuerpo monoclonal y (b) del polimetacrilato de metilo de masa molecular promedio 7100 Da donde se observa la dispersión de masas moleculares Ionización por electronebulización (Nebulización eléctrica) La fuente de ionización por electronebulización (Electrospray Ionization: ESI) se incluye en el conjunto de técnicas denominadas de ionización a presión atmosférica (Atmospheric ressure Ionization: AI). En la Figura 4.1 se muestra un diagrama de una fuente ESI. La muestra se disuelve en una fase móvil volátil, tal como una mezcla de agua con acetonitrilo o metanol (1:1), se bombea a través de un fino capilar de acero inoxidable cuyo extremo se encuentra a un potencial eléctrico elevado (3-6 kv). Este elevado potencial unido al pequeño radio de curvatura al final del capilar crean un fuerte campo eléctrico, que produce reacciones de oxidación-reducción y hace que el líquido emerja como gotas finas cargadas eléctricamente. En la formación de las gotas cargadas resultan críticas la velocidad del flujo, la tensión 58

17 superficial y la conductividad de la solución. La conductividad debe ser baja lo que implica concentraciones -4 de electrolitos menores que 10 M. La nebulización ocurre a presión atmosférica y es usualmente asistida por un flujo de nitrógeno gaseoso (el gas nebulizador) que fluye a través de un tubo coaxial al capilar principal. La niebla atraviesa una serie de cámaras con vacío creciente. En la medida en que las gotas pasan por las cámaras, se evaporan y se hacen cada vez más pequeñas debido a la evaporación del disolvente. Al mismo tiempo, dado que el área superficial de las gotas se reduce, aumenta la densidad de carga eléctrica sobre la superficie hasta llegar a un límite en que se tornan inestables y estallan. Figura 4.1 Diagrama de una fuente por electronebulización Un importante aspecto de la fuente de ionización ESI es la tendencia a producir iones multicargados, lo cual por una parte beneficia la exactitud de las mediciones de masas moleculares elevadas y por otra origina espectros de masas complicados. ara péptidos y proteínas las moléculas intactas adquieren un número n de protones generados por reacciones oxidativas que ocurren en la punta del capilar, de manera que los iones moleculares tienen una masa [MnH], adquiriendo n cargas positivas. Dado que el espectrómetro de masas registra el valor de m/z = [MnH]/n, m/z es sólo una fracción de la masa molecular en una magnitud que depende de n. Realmente el espectro consiste en una serie de iones cuasimoleculares que poseen carga n múltiple [MnH].Cada ión en la serie difiere por más o menos una carga de los iones adyacentes. Así, el espectro de masas-esi contiene información redundante sobre la masa molecular, pues cada señal corresponde a un estado cargado de la sustancia sin fragmentar. Se han desarrollado algoritmos que transforman esa distribución de iones multicargados en una señal única. En la Figura 4.13 se muestra el espectro de masas- ESI de la mioglobina del corazón de caballo (parte superior) y el espectro obtenido luego de la aplicación de un algoritmo de deconvolución (parte inferior) que suministra la masa molecular de la proteína. La espectrometría de masas-esi se caracteriza por su elevada exactitud, que se debe precisamente a la información redundante de m/z que origina y que corresponde a los diferentes estados con carga múltiple de cada especie analizada. Es posible resolver en los picos individuales, como los mostrados en la 59

18 obtenido Espectrometría de Masas Figura 4.13, los componentes individuales correspondientes a las diferentes distribuciones isotópicas. Esto permite una determinación directa de la carga de cada pico. Figura 4.13 Espectro de masas-esi de la proteína mioglobina de corazón de caballo La fuente ESI se considera una de las más suaves. Aún para moléculas altamente polares y térmicamente lábiles, se produce una escasa fragmentación Fuentes de ionización para compuestos inorgánicos La espectrometría de masas se aplica exitosamente en el campo de las sustancias inorgánicas y organometálicas, siendo destacables los notables avances que se han logrado en la diversificación de las fuentes de ionización. De éstas, la ionización electrónica es la fuente de ionización preferida para el trabajo con sustancias inorgánicas volátiles, mientras las no volátiles son analizadas mediante fuentes tales como FD, FAB o ESI. En la Figura 4.14 se muestran el espectro de masas del azufre ortorrómbico (SB8B) obtenido con una fuente EI. Figura 4.14 Espectro de masas del SB8B con una fuente EI. 60

19 La espectrometría de masas permite realizar el análisis elemental cualitativo y cuantitativo de compuestos inorgánicos con elevadas exactitud y sensibilidad. ara el análisis elemental, la atomización de la muestra y la ionización de los átomos resultantes ocurren en la fuente. La descomposición completa de la muestra en sus átomos constituyentes resulta necesaria, porque de lo contrario se originaría un espectro de masas en el cual la superposición de picos podría causar interferencias espectrales insospechadas. Más aún, la dispersión de cualquier elemento en especies diferentes lleva al decremento en la sensibilidad de su detección. ara el análisis elemental de trazas de compuestos inorgánicos se utilizan ampliamente cuatro técnicas basadas en la espectrometría de masas, que son: ionización térmica, de chispa, de descarga incandescente y de plasma acoplada inductivamente. Todas son fuentes de ionización clásicas que se utilizan también en la espectroscopia óptica. La diferencia fundamental es que en este caso se utilizan para generar iones en lugar fotones. Las técnicas basadas en la espectrometría de masas muestran un incremento en la sensibilidad y en el rango analítico de trabajo de algunos órdenes de magnitud cuando se comparan con las técnicas ópticas de espectrometría para el análisis elemental. Las interferencias más comunes son las llamadas espectrales o isobáricas, las cuales se deben a la superposición de picos, que pueden enmascarar a las de la muestra de interés y dar resultados erróneos. Tales interferencias pueden ocurrir debido a la presencia de iones de otros elementos dentro de la matriz de la muestra, combinación elemental, formación de óxidos o iones doblemente cargados. Una solución al problema de la superposición de picos consiste en la identificación de las especies que interfieren y aplicar correcciones a su contribución a la señal a de la muestra analizada. Esta corrección no es apropiada cuando la interferencia es más abundante que la propia muestra. Otra solución es aumentar la resolución espectral, lo cual puede lograrse mediante espectrómetros de masas de alta resolución, capaces de eliminar muchas interferencias isobáricas y permitir la realización de análisis cuantitativos sin ambigüedad Consideraciones sobre las fuentes de ionización Las fuentes de ionización EI y CI son generalmente las más utilizadas para el estudio de compuestos de baja masa molecular (M < 1000 Da), volátiles y térmicamente estables. La fuente CI genera espectros que tienen información sobre la masa molecular de la sustancia analizada, mientras que la fuente EI origina una gran fragmentación, siendo muy útil para obtener información estructural. Los espectros de masas obtenidos con una fuente de ionización EI son reproducibles y pueden ser utilizados para la identificación estructural de sustancias con el auxilio de extensos bancos de datos, lo cual no ocurre con otras fuentes de ionización. ara el análisis de una sustancia es con frecuencia conveniente registrar los espectros de masas EI y CI, por su complementariedad. En el caso de compuestos térmicamente lábiles o con baja presión de vapor, los iones tienen que ser directamente extraídos de la fase condensada, para lo cual existen dos variantes: la extracción 61

20 de iones de la fase líquida y de la fase sólida. En el primer caso, la muestra se encuentra en disolución, ésta se transforma mediante un procedimiento de nebulización y las gotas formadas se introducen en el espectrómetro mediante el auxilio de una bomba de vacío. Las fuentes de ionización por electronebulización (ESI) y termonebulización corresponden a este tipo. En el caso de la fuente FAB se utiliza una matriz líquida no volátil. La fuente FAB es útil para el estudio de sustancias de masa molecular elevada (6 kda), no volátiles, polares y térmicamente inestables. Los péptidos, proteínas pequeñas y otros biopolímeros son ejemplos de sustancias a las cuales se ha aplicado con éxito la técnica de ionización FAB. No obstante la fuente FAB ha sido gradualmente sustituida en este campo por fuentes como MALDI y ESI. En el caso de una fuente de ionización con extracción de iones de la fase sólida, la muestra se encuentra embebida en una matriz y ésta se irradia con partículas energizadas o fotones que desorben iones cercanos a la superficie sólida. Esos iones pueden ser extraídos mediante un campo eléctrico y enfocados hacia el analizador. La fuente de ionización MALDI es apropiada para registrar espectros de masas de sustancias con propiedades similares a las descritas para la fuente FAB, pero su sensibilidad es muy superior. Se aplica a compuestos con masas moleculares por sobre 500 kda. Dado que los iones producidos por esas fuentes son predominantemente monocargados, la elevada razón masa/carga hace necesaria la utilización de analizadores con gran alcance de masas como los de tiempo de vuelo. or su parte, la fuente de ionización ESI es apropiada para compuestos similares a los que se estudian mediante la fuente MALDI, con una ligera reducción en la sensibilidad y en el rango de masas. Cuando se utiliza esta técnica se generan iones con carga múltiple, lo cual hace que la razón masa /carga se encuentre dentro del alcance de masas de los espectrómetros de masas comunes, aun para proteínas de elevada masas moleculares. En Tabla 4.3 se resumen los aspectos básicos analizados sobre las fuentes de ionización que hemos considerado previamente. Tabla 4.3 Aspectos básicos de algunas fuentes de ionización. Fuente de ionización Tipo de muestra Sistema de introducción Ionización electrónica (EI) Masas relativamente pequeñas/volátiles CG o sonda líquida /sólida Rango de masas Hasta 1000 Da Características principales. Método duro. Versátil. Información estructural Ionización química (CI) Masas relativamente pequeñas/volátiles CG o sonda líquida /sólida Hasta 1000 Da Método blando. ico del ión molecular. Electronebulización (ESI) éptidos/roteínas. Cromatografía líquida/inyección Hasta 00 kda Método blando. Iones con carga múltiple. Bombardeo con átomos rápidos (FAB). Carbohidratos/Organometálicos/ éptidos Muestra mezclada en matriz viscosa. Hasta 6 kda Método blando, pero más duro que ESI y MALDI. Desorción por láser asistida por matriz (MALDI). éptidos/roteínas/nucleótidos. Muestra mezclada en matriz sólida. Hasta 500 kda Método blando./masas muy altas. 6

21 4.1.4 Analizadores Luego de que los iones se han producido en la fuente de ionización, deben ser separados y enfocados hacia el detector de acuerdo con el valor de la razón masa/ carga de cada uno. Esto se logra mediante los analizadores, que constituyen la óptica iónica de un espectrómetro de masas. Esta óptica iónica es frecuentemente un sistema de campos eléctricos y magnéticos mediante el cual un flujo de iones puede ser separado en sus componentes de acuerdo con sus valores de m/z y enfocado hacia el detector. Al sistema de campos eléctricos y magnéticos se le denomina lentes por analogía con su contraparte óptica. Las tres características principales de un analizador son el límite de masas superior o alcance de masas, la transmisión y la resolución. El límite de masas es el valor más alto de la razón m/z que puede ser medido y se expresa en thomson (Th) o unidades atómicas (u) para un ión portador de una carga elemental, esto es z =1. La transmisión es la razón entre el número de iones que llega al detector y el número de iones producido en la fuente. El poder de resolución es la capacidad del espectrómetro para detectar señales diferentes correspondientes a iones con una diferencia de masas pequeña. Al igual que existe una gran variedad de fuentes de ionización, también existen analizadores de diferente tipo Analizadores de sector magnético y eléctrico y lentes de enfoque eléctrico Analizador de sector magnético Cuando especies cargadas en movimiento son sometidas a la acción de un campo magnético sufren deflexión, bajo la acción de fuerzas descritas por la ley de Lorentz y cuya magnitud está gobernada por el momento del ión, tal como se muestra en la Figura La energía cinética del ión es esencialmente la adquirida a través de la aceleración a la salida de la fuente iónica y viene dada por: 1 mv = zv [4.] siendo V el potencial de aceleración aplicado a los iones que salen de la fuente iónica y z el número de cargas sobre cada ión de masa m que se mueve a la velocidad v. La fuerza centrípeta sobre el ión que experimenta la acción del campo magnético B es igual a la fuerza ejercida por dicho campo sobre una carga en movimiento y se expresa por: mv = zvb a partir de donde : mv = zb [4.3] r r r es el radio del arco de la trayectoria del ión que es deflectado en el campo magnético B. 63

22 Espectrometría de Masas Figura 4.15 Fundamentos del analizador magnético. Una partícula con carga z a una velocidad v experimenta al ingresar en un campo magnético B la acción de una fuerza dada por F = zv B. Si los vectores v yb son perpendiculares la fuerza tiene una magnitud igual a zvb, produciendo una deflección que corresponde a un arco de circunferencia de radio r De las ecuaciones [4.] y [4.3] se obtiene: m B r = [4.4] z V Esta es la ecuación fundamental del analizador magnético. El radio r de las trayectorias iónicas es: 1 mv r = [4.5] zb ara iones con z =1, manteniendo constantes B y V, el radio del arco de la trayectoria depende de la masa de cada ión, lo cual permite su separación. En la Figura 4.16 los iones que arriban a la posición 1 sufren la mayor deflexión (menor r), lo cual se corresponde a su menor masa. Figura 4.16 Deflexión de un haz de iones en un campo magnético homogéneo Es posible lograr que los iones arriben a un solo punto del detector de forma secuencial, lo cual significa que r se mantiene constante, de donde: kb m = [4.6] V De la ecuación [4.6] se desprende que mediante un barrido de campo B, de voltaje de aceleración V o de ambos, el rango total de masas de los iones puede ser enfocado secuencialmente hacia un punto del detector. Generalmente un espectrómetro de masas de sector magnético realiza el trabajo manteniendo 64

23 V constante y variando el campo magnético B y el alcance de masas depende de la potencia del magneto. Una posibilidad adicional del campo magnético es hacer convergente un haz de iones divergente que entra en su zona acción. En este caso se dice que el campo magnético realiza un enfoque direccional (o angular) del haz, lo cual se ilustra en la Figura 4.17 El campo magnético realiza solamente un enfoque direccional o simple enfoque. Figura 4.17 Enfoque direccional (angular) de un haz iónico en un campo magnético. Al plantear la ecuación [4.] se ha asumido que todos los iones que salen de la fuente de ionización tienen la misma energía cinética, lo cual no es rigurosamente cierto. En una fuente de EI la dispersión de valores de la energía cinética puede ser mayor de 1 ev y en el caso de una fuente FAB de 4 ev. Este rango de valores de energía cinética causa una imagen difusa en el detector porque el campo magnético no puede enfocar los iones de la misma masa y diferente energía cinética hacia un mismo punto. Analizador de sector eléctrico Un analizador electrostático (AE) está compuesto por dos arcos de sección cilíndrica cargados eléctricamente tal como se muestra en la Figura Este analizador realiza enfoque direccional (o angular) y también dispersivo de la energía de un haz de iones. Figura 4.18 Analizador electrostático. 65

24 La energía adquirida por los iones acelerados a partir de la fuente iónica viene dada por la ecuación (4.), mientras que la fuerza centrípeta que actúa sobre ellos en el sector es: mv = r ze donde E es el potencial eléctrico (voltaje) entre los platos del analizador electrostático y r el radio de curvatura de la trayectoria del ión. Es evidente que los iones con igual energía cinética se moverán en una trayectoria común de igual radio r. or lo tanto un analizador electrostático dispersa un haz iónico de acuerdo a sus energías cinéticas. De las ecuaciones [4.] y ([4.7] se obtiene: [4.7] V r = [4.8] E Según la ecuación [4.8], en el sector eléctrico la trayectoria de un haz de iones con igual energía cinética describe un arco que depende solamente del voltaje de aceleración V y del campo eléctrico E del analizador electrostático. Combinación de analizadores magnético-electrostático Los sistemas combinados que hacen uso de analizadores electrostáticos y magnéticos están presentes en los equipos EM llamados de doble enfoque o doble sector. En esta combinación el flujo de iones puede ser colimado primero en un analizador electrostático y entonces los haces correspondientes a iones de igual relación m/z pero diferencias ligeras en sus energías cinéticas pueden ser reenfocados por el analizador magnético tal como se muestra en la Figura Figura 4.19 Óptica iónica de doble enfoque con geometría directa. 66

25 Esta combinación de analizadores se denomina doble enfoque, porque incluye los enfoques direccional (o angular) y de energía. El espectrómetro de masas de doble enfoque está diseñado de forma tal que iones de la misma masa con energías diferentes converjan a un mismo punto del registrador por lo que estos equipos poseen muy alta resolución y se pueden utilizar para la determinación de fórmulas globales de los iones (ver epígrafe 4...6) y mediciones muy exactas de masas moleculares. Los sistemas ópticos de espectrometría de masas de doble enfoque pueden ser de dos tipos en dependencia de las posiciones relativas de los analizadores magnético y eléctrico. En la Figura 4.18 se ha mostrado el de geometría directa (configuración EB o de Nier-Johnson) donde el haz iónico penetra primero en el analizador electrostático. En los equipos con geometría inversa el haz iónico penetra primero en el analizador magnético. El sistema de doble enfoque permite compensar la dispersión del haz iónico debido a las diferencias en energía cinética en el mismo y garantiza que iones con el mismo valor de la razón m/z lleguen a un mismo punto del registrador, garantizando un alto poder de resolución, por lo que son muy útiles para la determinación exacta de valores de m/z, por el amplio rango de masas que cubren y por su sensibilidad sobre todo a valores elevados de la razón m/z Analizador cuadrupolar Los analizadores de masas cuadrupolares se componen de cuatro varillas paralelas equidistantes a un eje central imaginario, como se muestra en la Figura 4.0. La sección transversal contiene las cuatro superficies conductoras o polos que adoptan idealmente la forma de hipérbolas ortogonales. Figura 4.0 Esquema de un analizador cuadrupolar. A las varillas opuestas, que corresponden a cada una de las hipérbolas, se le aplica un potencial electrostático U ( V) de igual signo y opuesto al de las otras dos varillas. Adicionalmente se aplica un potencial alterno V ( V) asociado con una radiofrecuencia ω: φ = ( U V cosω ) φ = ( U V cosω ) 0 t 0 t En estas condiciones los iones avanzarán a lo largo del analizador siguiendo trayectorias oscilantes siendo repelidos y atraídos continuamente por las placas polares. ara valores definidos de U y V sólo 67