FUNDAMENTO DEL ENSAYO

Transcripción

1 1 INTERÉS CLÍNICO El UMELISA MICROALBÚMINA es un ensayo para la cuantificación de albúmina humana en muestras de orina. La microalbuminuria se define como la tasa de excreción de albúmina en orina de 20 a 200 mg/l, o de 30 a 300 mg de albúmina en 24 horas, como consecuencia de las alteraciones producidas en la permeabilidad glomerular (1-4). Dichos valores de concentración, aunque resultan superiores a los normales, aún se encuentran por debajo de los alcanzados en una proteinuria convencional, por lo que la microalbuminuria es utilizada como un marcador en el diagnóstico temprano de la nefropatía diabética incipiente, así como de alteraciones cardiovasculares en pacientes diabéticos tipo I y tipo II, aunque también se han comprobado asociaciones entre la presencia de una excreción anormal de albúmina urinaria y la aparición de eventos cardiovasculares, aún sin traducción clínica aparente (5,6). Por tanto, la cuantificación de pequeñas cantidades de albúmina en orina (microalbuminuria) resulta de gran interés no sólo en la detección temprana de la enfermedad renal, lo cual permite la aplicación de medidas terapéuticas antes que el daño sea irreversible; sino también en el seguimiento de la enfermedad luego del tratamiento. FUNDAMENTO DEL ENSAYO El UMELISA MICROALBÚMINA es un ensayo inmunoenzimático heterogéneo tipo sándwich que utiliza como fase sólida tiras de ultramicroelisa (10 µl por pocillo), revestidas con anticuerpos monoclonales obtenidos en ratones de la línea Balb/c, dirigidos contra la albúmina humana, lo cual garantiza la especificidad del ensayo. Las muestras se incuban en los pocillos de las tiras de reacción y la albúmina presente se fija a los anticuerpos revestidos en las mismas. Mediante un lavado se eliminan los componentes de la muestra no fijados, permaneciendo en la tira de reacción el complejo albúmina-anticuerpo. A continuación se lleva a cabo la adición de un anticuerpo de carnero anti-albúmina humana conjugado con Fosfatasa Alcalina (F.A), el cual se unirá a la albúmina fijada en la reacción anterior. Un nuevo lavado de las tiras elimina el conjugado no enlazado al complejo. La adición del sustrato fluorigénico (4- metilumberilferil fosfato) en los pocillos de las tiras, permite revelar la reacción inmunoenzimática mediante la hidrólisis del mismo por la enzima Fosfatasa Alcalina presente en el conjugado. La intensidad de la fluorescencia emitida será proporcional a la concentración de albúmina presente en la muestra de orina.

2 2 CONTENIDO DEL ESTUCHE Y PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES DE TRABAJO Código UM 2038 (288 pruebas) Contenido: Placa recubierta de 12 tiras x 8 pocillos 3 R1: Solución Tampón 2 x 25 ml R2: Suero de Carnero 1 x 22 ml R3: Estándar (a-f) * 6 x Liofilizado R4: Control 1 x Liofilizado R5: Conjugado 1 x 7,5 ml R6: Sustrato 1 x 2 ml R7: Tampón Sustrato 1 x 18 ml * Los Estándares y el Control han sido preparados utilizando albúmina humana altamente purificada, cuya trazabilidad se referencia a un juego de calibradores propio (MRCIE-AH0908). El lote de las placas recubiertas se muestra en el borde de su envase primario, el cual está compuesto por cinco dígitos, los cuatro primeros representan la fecha de vencimiento de las placas y el quinto representa un indicador numérico interno del proceso de producción. Todos los reactivos contienen azida sódica como preservante. Preparación de las soluciones de trabajo: R1: Para 4 tiras de reacción, diluya 2 ml de R1 hasta un volumen de 50 ml con agua destilada. Mezcle suavemente para evitar la formación excesiva de espuma. Prepare solamente la cantidad necesaria para el ensayo. R2: Diluya 1:10 con la solución de trabajo R1. Para 4 tiras de reacción prepare 20 ml (2 ml de R ml de R1). R3: Reconstituya cada frasco con 0,5 ml de la solución de trabajo R2. Permita su completa disolución y mezcle suavemente.

3 R4: Reconstituya con 0,5 ml de la solución de trabajo R2. Permita su completa disolución y mezcle suavemente. R5: Listo para el uso. Para 4 tiras de reacción se requieren 0,8 ml. R6: Diluya 1:10 con R7. Cantidad necesaria para 4 tiras de reacción: 2 ml (0,2 ml de R6 + 1,8 ml de R7). Prepare inmediatamente antes de usar. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Todos los reactivos deben mantenerse entre 2 y 8 C, en su envase original. En estas condiciones, sin utilizar, serán estables hasta la fecha de vencimiento. Después de utilizar parte del contenido de los reactivos, el resto es estable durante 3 semanas, si se mantienen las mismas condiciones de almacenamiento y se evita la contaminación. Las tiras de reacción no utilizadas deben mantenerse en la bolsa suministrada, con el desecante y herméticamente cerrada. MATERIALES NECESARIOS NO SUMINISTRADOS - Agua destilada. - Hipoclorito de sodio. - Pipeta multicanal con puntas desechables para 10 µl. - Pipetas de precisión entre 10 y 1000 µl. - Probetas graduada entre 10 y 1000 ml. - Papel absorbente. - Placas o tubos para realizar la dilución de las muestras. PRECAUCIONES - Antes de iniciar el ensayo verifique que todos los reactivos estén completamente homogéneos y a una temperatura entre 20 y 25 ºC. - Manipule los Estándares, el Control y las muestras como potencialmente infecciosos. Utilice guantes desechables. Los materiales utilizados deben colocarse en una solución desinfectante (Hipoclorito de sodio al 5 %) o esterilizarse en autoclave. - Considere a los equipos y accesorios que han estado en contacto directo con la muestra como contaminados. Realice los procedimientos de limpieza que se recomiendan en los manuales de usuario correspondientes. - Las tiras de reacción deben estar a la temperatura del laboratorio antes de retirarles la cubierta protectora, para evitar que se condense humedad en su superficie. 3

4 - Verifique que las tiras de reacción estén niveladas en el soporte. - Utilice puntas nuevas para el trabajo con las soluciones y las muestras, así como para la reconstitución de los Estándares y el Control. - Adicione el Conjugado a las placas de reacción utilizando puntas nuevas para evitar la contaminación del mismo. - Garantice el adecuado control de la humedad en todos los pasos de la prueba. Las muestras y reactivos una vez aplicados, deben mantenerse en las cámaras húmedas para evitar su evaporación ya que esto puede alterar los resultados. - Verifique periódicamente la exactitud y precisión de las pipetas. - Verifique que las pipetas se encuentren limpias antes de su uso, ya que pueden transferir trazas de albúmina a los reactivos ocasionando su contaminación. - Cumpla las normas de manipulación de los equipos utilizados y verifique previamente su adecuado funcionamiento, tenga especial cuidado en las operaciones de pipeteo y lavado. - Evite posibles contaminaciones con materiales fluorescentes. - No incorpore a los frascos originales remanentes de reactivos. - Tenga especial cuidado en la utilización de equipos, (particularmente el lavador), áreas de trabajo y materiales que hayan estado en contacto con muestras de suero o plasma, las cuales pueden resultar fuentes externas de contaminación debido a sus elevadas concentraciones de albúmina humana, que pueden dar lugar a resultados falsos positivos en las muestras o a la contaminación del Control, los Estándares y el Conjugado. - Durante la ejecución del ensayo evite la contaminación de las placas y los reactivos con fluidos corporales que pudieran ocasionar alteración de los resultados (de manera específica la saliva al hablar, toser o estornudar). - Para la preparación de las soluciones R1 (Solución Tampón) y R2 (Suero de Carnero) utilice frascos o recipientes nuevos o lavados exhaustivamente con una solución de NaOH 1 mol/l, que garantice la eliminación total de trazas de albúmina humana, cuya presencia conllevaría a la posible contaminación de las muestras, los Estándares y el Control, una vez reconstituidos. - Evite la exposición a la luz de los frascos que contienen el Sustrato. - El juego de reactivos no debe emplearse después de la fecha de vencimiento. - Los reactivos de lotes diferentes no deben ser intercambiados. 4

5 5 PROCEDIMIENTO TÉCNICO 1.-Preparación de los Estándares, el Control y las muestras Estándares y Control: Los Estándares y el Control, una vez reconstituidos se encuentran listos para su uso. La concentración de los Estándares se corresponde con la especificada en la etiqueta de cada frasco. Muestras: Se recomienda, preferiblemente, el uso de muestras de orina frescas. En el caso de muestras turbias se recomienda centrifugar (5 minutos a g) antes de usar. Realice una dilución 1:500 de la muestra, empleando la solución de trabajo R2, al menos 15 minutos antes de transferir a las tiras de reacción. Para ello se sugiere realizar una dilución previa 1:100 (990 µl de solución de trabajo R µl de muestra) y a continuación una dilución 1:5 a partir de la dilución 1:100 (200 µl de la solución de trabajo R µl de la dilución 1:100). 2.-Adición de los Estándares, el Control y las muestras a las tiras de reacción Transfiera 10 µl de los Estándares, el Control y las muestras a las tiras de reacción, aplicando el siguiente esquema de distribución: A R 3a R 3e B R 3a R 3e C R 3b R 3f D R 3b R 3f E R 3c R F R 3c R G R 3d H R 3d Los Estándares (R3a-R3f) y el Control (R4) deben añadirse de forma manual con una pipeta de precisión utilizando puntas nuevas.

6 Se recomienda evaluar las muestras por duplicado. Si utiliza el programa UMELISA MICROALBÚMINA para la interpretación automática de los resultados, debe colocar en las posiciones 1 y 2 la primera muestra, en las posiciones 3 y 4 la segunda, y así sucesivamente. 3.-Incubación de los Estándares, el Control y las muestras Incube las tiras de reacción durante 30 minutos a una temperatura de 37 C en cámara húmeda. 4.-Lavado Utilice un lavador de la tecnología SUMA. Lave las tiras de reacción cuatro veces con 30 µl de la solución de trabajo R1. Verifique el llenado total del pocillo con la solución de lavado. La solución debe permanecer 30 segundos en los pocillos en cada lavado. Después de la última aspiración se recomienda golpear de 2 a 3 veces las tiras invertidas sobre un papel absorbente, para eliminar cualquier residuo de la solución de lavado. 5.-Adición del Conjugado Utilizando puntas nuevas, extraiga del frasco de conjugado la cantidad necesaria de acuerdo al número de tiras del ensayo y deposítela en un recipiente limpio. Adicione 10 µl de R5 en cada pocillo de las tiras de reacción. 6.-Incubación del Conjugado Incube las tiras de reacción durante 30 minutos a una temperatura de 37 C en cámara húmeda. 7.-Lavado Lave las tiras de reacción según se describe en el acápite Adición del Sustrato Coloque 10 µl de R6 diluido en cada pocillo de las tiras de reacción. 9.-Incubación del Sustrato Incube en cámara húmeda a una temperatura entre 20 y 25 C. Normalmente se requiere una incubación de 30 minutos para alcanzar una señal fluorescente de 100 a 160 unidades para el Estándar R3f, sin embargo, debido a las variaciones de temperatura, puede resultar conveniente que cada laboratorio ajuste el tiempo de incubación para lograr estos niveles de fluorescencia. 10.-Lectura Realice la lectura de la intensidad de la fluorescencia emitida en cada determinación utilizando un lector de la serie SUMA. 6

7 7 PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO - La concentración de las muestras se calcula mediante la interpolación de sus respectivas fluorescencias en la curva estándar, como se ilustra en la siguiente figura. La curva estándar se obtiene mediante un ajuste de regresión lineal simple. Los resultados de las muestras se multiplican por el factor de dilución y se expresan en mg/l. - El procesamiento de los datos, la validación, interpretación e impresión de los resultados, son realizados automáticamente por el programa UMELISA MICROALBÚMINA. 160 Curva estándar Unidades de Fluorescencia (UF) Concentración de Albúmina (ng/ml) CONTROL DE LA CALIDAD I. La curva estándar debe cumplir las siguientes condiciones: La media de los dos valores de fluorescencia para cada estándar (R3a al R3f) debe proporcionar un incremento en la fluorescencia proporcional a su concentración, siguiendo un patrón similar al ejemplificado. Los valores discordantes son eliminados automáticamente por el programa. II. El valor de concentración calculado para el Control debe encontrarse en el intervalo establecido para el ensayo.

8 8 III. Al evaluarse las muestras por duplicado, debe cumplirse la siguiente condición: La diferencia de los valores de fluorescencia de los duplicados de una muestra debe ser menor al 10 % con respecto a su valor medio. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La microalbuminuria se establece cuando la concentración de albúmina en orina es igual o superior a 20 mg/l en el caso de las muestras de orina fresca, o 30 mg en muestras de orina de 24 horas (7,8). Atendiendo a posibles variaciones poblacionales, la práctica internacional recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DEL ENSAYO 1. PRECISIÓN. Se evaluaron tres muestras, con concentraciones que se encontraban dentro del rango analítico de la curva, en el ensayo (intraensayo) y el mismo fue repetido durante varios días (interensayo), utilizando un número de réplicas igual a 24. Precisión del UMELISA MICROALBÚMINA Intraensayo Interensayo Concentración de (n=24) (n=68) albúmina (mg/l) DE CV (%) DE CV (%) 21,9 0,995 4,35 2,20 7,59 51,3 1,035 4,09 2,32 7,76 80,2 1,821 3,98 3,79 8,92 DE: Desviación Estándar CV: Coeficiente de Variación 2. EXACTITUD El porcentaje de recuperación obtenido, al añadir diferentes cantidades de albúmina a tres muestras de orina de concentración conocida fue de 96,43 ± 3,6 %.

9 9 Recuperación del UMELISA MICROALBÚMINA Muestras Valor esperado Valor obtenido Exactitud Recuperación (%) (mg/l) (mg/l) Relativa (%) 1 12,89 12,15 94,26-5, ,67 47,94 96,52-3, ,23 83,95 98,50-1,50 Paralelismo del UMELISA MICROALBÚMINA Se evaluaron tres muestras de orina de concentraciones elevadas de albúmina, a las que se le realizaron diluciones seriadas. Las muestras se cuantificaron desde pura hasta una dilución 1/8. Las concentraciones estimadas después de la corrección con el factor de dilución, estuvieron en el rango de ± 3,52 % de la concentración original de las muestras sin diluir.

10 10 Linealidad Se prepararon 16 mezclas con muestras de orina a diferentes concentraciones de albúmina (Linealidad) y se determinó el porcentaje de recuperación de las concentraciones obtenidas en comparación con las concentraciones esperadas para cada mezcla, obteniéndose un porcentaje de recuperación de 103,4 ± 5 %. 3. DETECTABILIDAD La concentración mínima detectable fue de 1,44 ± 0,3 mg/l. Se definió como la concentración estimada para el valor de fluorescencia equivalente al intercepto + 2 D.E. de la media del estándar R3a. 4. ESPECIFICIDAD (SUSTANCIAS INTERFERENTES) Se evaluó la influencia de ciertas sustancias, a concentraciones clínicamente relevantes, sobre la concentración de albúmina en orina: glucosa (2 g/l), urea (1 g/l), hemoglobina (10 g/l), bilirrubina (1 g/l), creatinina (3 g/l), creatina (1 g/l), ácido úrico (1 g/l), ácido ascórbico (2 g/l), NaCl (900 mg/dl), KCl (300 mg/dl), Mg 2+ (30 mm), Ca 2+ (30 mm), ninguna de las cuales produjo interferencia en los resultados. 5. EFECTO A CONCENTRACIONES ELEVADAS (HOOK) DE ALBÚMINA HUMANA No se observó este efecto en muestras con concentraciones de albúmina humana de hasta 1000 mg/l.

11 11 BIBLIOGRAFÍA 1. Friedman and Young. Effects of diseases on clinical laboratory tests, 3th ed. AACC Press, Gansevoort RT., et al. The validity of screening based on spot morning urine samples to detect subjects with microalbuminuria in the general population. Kidney Int, Vol.67: 28-35, Mogensen CE. Microalbuminuria as a predictor of clinical diabetic nephrophaty. Kidney Int 31: , Bakris GL. Microalbuminuria: prognostic implications. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens 5: , Gertstein HC., et al. Albuminuria and risk of cardiovascular events, death, and heart failure in diabetic and nondiabetic individuals. JAMA 286: , Hillege HL, et al. Urinary albumin excretion predicts cardiovascular and noncardivascular mortality in general population. Circulation 106: , Mogensen, CE et al. Microalbuminuria and potential confounder. A review and some observations on variability of urinary albumin excretion. Diabetes Care 18: 572, Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3 rd edition. Burtis CA, Ashwood ER. WB Saunders Co., Edición No. 5 Septiembre 6, 2013 UMELISA MICROALBÚMINA Código UM 2038 Centro de InmunoEnsayo. Calle 134 y Ave. 25, Apdo. Postal 6653, La Habana, CUBA. Teléf: , Fax: (537)