ENZIMAS CELULOLÍTICAS HERRAMIENTAS PARA LA UTILIZACIÓN DE RECURSOS RENOVABLES QUE CONTIENEN CELULOSA

Transcripción

1 ENZIMAS CELULOLÍTICAS HERRAMIENTAS PARA LA UTILIZACIÓN DE RECURSOS RENOVABLES QUE CONTIENEN CELULOSA

2 RECURSOS RENOVABLES CIENCIA DE LA SUSTENTABILIDAD UTILIZACION DE RECURSOS RENOVABLES OBTENCIÓN DE BIOPRODUCTOS MÚLTIPLES APLICACIONES

3 UTILIZACIÓN DE CELULOSA Celulosa es la reserva de Carbono orgánico más abundante del planeta, como resultado de la fotosíntesis de las plantas que incorporan el CO 2 en carbohidratos. Esta fuente inagotable y sustentable de Carbono es un polímero de glucosa que para poder ser utilizada debe ser transformada previamente en glucosa por enzimas celulolíticas. La utilización de enzimas celulolíticas permitirá degradar residuos de origen vegetal, que contienen celulosa. Los productos tienen el potencial de ser utilizados con múltiples fines como la biosíntesis de etanol por Saccharomyces cerevisiae.

4 ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS La hidrólisis de celulosa requiere las siguientes actividades enzimáticas: a) Endoglucanasa (endo 1,4 βglucanasa; Egl; EC ) b) Exoglucanasa o cellobiohidrolasa (exo 1,4 β glucanasa; Cbh; EC ) c) β glucosidasa (β 1,4 glucosidasa; EC )

5 ENDOGLUCANASAS Las enzimas con actividad endoglucanasa hidrolizan los enlaces glicosídicos interiores de las cadenas de celulosa, iniciando la hidrólisis en zonas amorfas, y tienen como producto cadenas de celulosa con menor grado de polimerización

6 EXOGLUCANASAS Las enzimas con actividad exoglucanasa continúan la acción de las endoglucanasas sobre la misma cadena (que tiene extremos libres como resultado de la acción de las endoglucanasas) y liberan como producto el dímero de glucosa, la celobiosa. También se unen a otras cadenas en zonas cristalinas, siendo su acción esencial en la degradación de zonas cristalinas.

7 βglucosidasa La β glucosidasa hidroliza la celobiosa en dos monómeros de glucosa.

8 CELULOSA AMORFA Y CRISTALINA Celulosa es insoluble en agua estructura amorfa o distintos porcentajes de cristalinidad, debido a una red de puentes de Hidrógeno entre cadenas. En estado cristalino se encuentra formando fibrillas que a su vez forman fibras. Tiene distinta accesibilidad en distintos sustratos. En los sustratos naturales o residuos de origen vegetal lignocelulósicos, las fibras de celulosa se encuentran en una matriz de lignina y hemicelulosa lo que dificulta aún más su accesibilidad a las enzimas.

9 ACTIVIDADES 1. Screening de enzimas celulolíticas sobre sustratos amorfos y cristalinos 2. Enzimas celulolíticas de microorganismos, Rhizobium cellulosilyticum 3. Evaluación de eficiencia y costo de enzimas celulolíticas, pretratamientos y sustratos como fuente de celulosa 4. Expresión de enzimas celulolíticas (nativas, recombinantes)

10 METODOLOGÍA OPTIMIZADA Detección y diferenciación cualitativa de las actividades celulolíticas: endoglucanasa y exoglucanasa y screening cualitativo de la enzima β glucosidasa. Ensayos de actividad in vivo (asociadas al microorganismo vivo) e in vitro (en sobrenadante y extracto posterior a su aislamiento) de las tres actividades enzimáticas. Determinación cuantitativa de las tres actividades enzimáticas. Ensayos de actividad (cualitativos y cuantitativos) con sustratos amorfos y cristalinos. Pretratamientos de papel y celulosa cristalina (disolución y reprecipitación). Determinación cuantitativa de actividades y crecimientos sobre sustratos cristalinos con y sin pretratamiento. Ensayos de degradación de papel y aserrín con preparaciones enzimáticas y determinación cuantitativa de los carbohidratos solubles liberados. Ensayo de compuestos celulósicos como fuentes de Carbono para el crecimiento de distintas cepas microbianas en medio líquido y como inductores de la producción de enzimas.

11 Detección y diferenciación cualitativa de las actividades celulolíticas: endoglucanasa y exoglucanasa y screening cualitativo de la enzima β glucosidasa.

12 ENDO IN VIVO

13 EXO IN VIVO

14 Ensayos de actividad in vivo (asociadas al microorganismo vivo) e in vitro (en sobrenadante y extracto posterior a su aislamiento) de las tres actividades enzimáticas.

15 EXO IN VITRO

16 Determinación cuantitativa de las tres actividades enzimáticas.

17 Ensayos de actividad (cualitativos y cuantitativos) con sustratos amorfos y cristalinos.

18 Pretratamientos de papel y celulosa cristalina (disolución y reprecipitación).

19 Determinación cuantitativa de actividades y crecimientos sobre sustratos cristalinos con y sin pretratamiento.

20 Ensayos de degradación de papel y aserrín con preparaciones enzimáticas y determinación cuantitativa de los carbohidratos solubles liberados.

21 PAPEL SIN TRATAMIENTO

22 PAPEL CON TRATAMIENTO

23 PAPEL CON TRATAMIENTO

24 PERSPECTIVAS TEMA ESTRATÉGICO 1. Screening de enzimas celulolíticas sobre sustratos amorfos y cristalinos 2. Enzimas celulolíticas de Rhizobium cellulosilyticum 3. Evaluación de eficiencia y costo de enzimas celulolíticas, pretratamientos y sustratos como fuente de celulosa 4. Producción de enzimas celulolíticas

25 PERSPECTIVAS En Uruguay no hay aún producción nacional de enzimas celulolíticas. Tampoco se ha desarrollado su aplicación para degradar celulosa a glucosa, con la consiguiente utilización de la glucosa para obtener bioproductos, por ejemplo bioetanol, a partir de recursos renovables que contienen celulosa.

26 PERSPECTIVAS Es reconocido internacionalmente que el cuello de botella en la utilización de la celulosa es la disponibilidad de enzimas eficientes y económicas. El objetivo de la innovación, es por lo tanto contribuir a resolver este problema

27 EQUIPO COLABORACIONES AGRADECIMIENTOS PASANTÍA DE GRADO, Estudiante Ramiro Pérez Financiación PROGRAMA INNOVA POLO TECNOLÓGICO PANDO ÁREAS BIOTECNOLOGÍA, BIOTEFA FACULTAD DE QUÍMICA PEDECIBA QUÍMICA PARQUE TECNOLÓGICO PANDO

28

29

30

31