Comparación de dos métodos de fijación para la estabilización de glicocálix bacteriano.

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1 7 Rev Biomed 1998; 9:7-11. Comparación de dos métodos de fijación para la estabilización de glicocálix bacteriano. Artículo Original Karina Echandi 1, Francisco Hernández 2. 1 Centro de Información de Medicamentos (CIMED) Facultad de Farmacia, 2 Facultad de Microbiología, Unidad de Microscopia Electrónica y Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica. RESUMEN. Introducción. La información obtenida de estudios ultraestructurales depende entre otros aspectos del tipo de fijación y por lo tanto del nivel de conservación de las estructuras evaluadas. En el caso de la pared bacteriana el empleo de lisina y rojo de rutenio mejoran la visualización de sus componentes y permiten una imagen más contrastada que la obtenida mediante métodos de fijación clásicos. Material y métodos. Se empleó la cepa ATCC De pseudomonas aeruginosa para evaluar dos protocolos de fijación para microscopia electrónica de transmisión. El método estándar, consistente en una fijación secuencial, primero con glutaraldehido (GA) al 2,5% en amortiguador de fosfatos por 2 horas y luego con tetraóxido de osmio (Os O 4 ) al 1% por una hora, ambos fijadores en amortiguador de fosfatos (ph 7.2). El otro método de fijación consistió en una fijación inicial con una mezcla de GA al 2.5%, rojo de rutenio al 0.075% y lisina 50 mm en amortiguador de cacodilato. Luego se fijó nuevamente durante 100 minutos con una solución de glutaraldehido, rojo de rutenio y cacodilato (0.1 mm ph 7.2) y posteriormente se fijó con Os O 4 durante una hora. Ambas preparaciones se deshidrataron, embebieron en resina, se cortaron en un ultramicrótomo y analizaron al microscopio electrónico de transmisión. Resultados. En las preparaciones obtenidas por el método estándar se aprecia la estructura de la pared propia de los organismos Gram negativos, sin embargo, el material exterior a la pared no se visualiza fácilmente. Por el contrario, en la fijación a prueba se aprecia una imagen más contrastada, lo que facilita la identificación de los diversos elementos de la pared y se aprecia fácilmente el exterior a la pared. Discusión. El método evaluado facilita la observación del glicocálix, que aparece como un material electrodenso irregular, localizado en la parte Solicitud de sobretiros: Dr. Francisco Hernández-Chavarría, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica, Ciudad Universitaria "Rodrigo Facio", Codigo Postal 2060, San José, Costa Rica, América Central. Recibido el 122/Mayo/1997. Aceptado para publicación el 26/Nov./1997.

2 8 K Echandi, F Hernández. externa de la pared bacteriana. Por lo tanto, se propone el empleo de esta fijación para el análisis ultraestructural de glicocálix. (Rev Biomed 1998; 9:7-11) Palabras clave: Ultraestructura, pared celular bacteriana, rojo de rutenio, glicocálix. SUMMARY. Comparison of two methods of fixation for the stabilisation of bacterial glicocalix. Background. Information obtained from ultrastructual studies depends on the fixation method used. In the case of bacteria cell wall, the application of lisine and ruthenium red improves the observation of their components and allows for a more contrasted image than standard methods using only glutaraldehyde and osmium. Material and methods. Pseudomonas aeruginosa strain ATCC was used to evaluate two protocols of fixation for electron microscopy. The standard method consisting in a sequential fixation 2,5% glutaraldehyde (GA) in phosphate buffer for 2 hrs, then the specimens were fixed again with 1% osmium tetroxide (Os O 4 ) for 1 hr. The other fixation method used a mixture of 2,5% GA, 0.075% rethenium red, and lysine (50 mm) in cacodilate buffer for initial fixation. Specimens were fixed again in the same fixative solution, for 100 minutes, and later they were fixed once more 1% Os O 4 for one hour. Both groups of samples were dehydrated, resin embedded, cut ultrafinely into sections and analyzed under the electron microscope. Results. The samples fixed with the standard method showed a good conservation of their cell walls, however no material on the exterior of the cell wall was easily visualized. On the other hand, specimens prepared with the method showed a better rutenium red, lisine, and osmium, contrasted image which allowed for the identification of different elements of the cell wall and the exterior of the wall appeared clearly. Revista Biomédica Discussion. The method of fixation adding ruthenium red and lysine to the solution of GA or Os O 4 permits the observation of glicocalix, that appears as an electron-dense material attached to the outer membrane. Therfore the use of this fixative solution is proposed for use in ultrastructural studies of bacterial cell-wall and glicocalix. (Rev Biomed 1998; 9:7-11) Key words: Ultrastructure, bacterial cell wall, ruthenium red, glicocalix. INTRODUCCION. Los estudios sobre ultraestructura celular, ya sea de organismos eucarióticos o procarióticos están condicionados por el límite de resolución del equipo utilizado, por los métodos de fijación empleados (que sólo pueden revelar los componentes celulares estabilizados satisfactoriamente) y finalmente por los métodos empleados para incrementar el contraste (1). Un ejemplo de este tipo de interacción se presenta con las descripciones ultraestructurales de la membrana citoplasmática, que tres décadas atrás se describía como una estructura compuesta por una bicapa lipídica, contenida entre dos capas proteícas, tal como se apreciaba al microscopio electrónico, lo cual es producto de un articifio de laboratorio, dado por la fijación exclusiva con tetraóxido de osmio, pues este era el fijador empleado en aquellos estudios (2). Actualmente los estudios de criofractura muestran imágenes que corresponden al modelo aceptado de mosaico fluido. De manera similar, la estructura de los componentes de la pared bacteriana se describe más detalladamente conforme se refinan las técnicas. Por ejemplo, lo que tradicionalmente se describió como el espacio periplásmico y como exclusivo de bacterias Gram negativas, hoy se describe como periplasma y está constituido por peptidoglican menos laxo que el del resto de la pared y este periplasma es común a bacterias Gram negativas y Gram positivas, aunque es más prominente en las

3 9 Métodos de fijación bacteriana. primeras (3). También las estructuras externas a la pared -como cápsula, microcápsula o glicocálixson difíciles de conservar, por lo que usualmente requieren de medios de fijación y sustitución a temperaturas inferiores a los -100 o C (4). Los componentes extracelulares, como la cápsula, microcápsula y glicocálix, son factores de virulencia importantes, pues le permiten a la bacteria adherirse a superficies, como paso previo a la colonización de un nuevo nicho, o bien le permiten mimetizarse y evadir la respuesta inmune del hospedero. No obstante, con los métodos de fijación estándar este material extracelular no se pone de manifiesto, por lo que en este trabajo se presenta una técnica alternativa de fijación que incluye rojo de rutenio para estabilizar esos materiales extracelulares, gracias al efecto estabilizador del rojo de rutenio sobre grupos aniónicos (5), lo que pone de manifiesto el glicocálix (6). MATERIAL Y MÉTODOS. Se inocularon 100 µl de una suspensión (ca.3 x 10 8 /ml) de Pseudomonas aeruginosa (cepa ATCC 27853) en placas de Müeller Hinton sin antibióticos e incubaron a 37 o C durante 24 h. Las colonias obtenidas se colectaron y subdividieron en dos porciones. Una de las cuales se suspendió en amortiguador de fosfatos (ph 7.2) y fijó siguiendo el esquema clásico de fijación para microscopia electrónica, utilizando una primera fijación con glutaraldehido al 2.5% por 2 horas a 4 o C y una post fijación con tetraóxido de osmio por una hora a 4 o C. Ambos fijadores se diluyeron en amortiguador de fosfatos 0.1 mm a ph 7.2. La suspención de bacterias fijadas se incluyó en un cuágulo de plasma (7), se seccionó en cubos de ca. 1 mm 3, que se fijaron nuevamente con glutaraldehído al 2.5% durante 30 minutos, se lavaron con el amortiguador de fosfatos, se fijaron de tetraoxido de osmio, como se describió anteriormente. Luego los bloques se deshidrataron en una gradiente de etanol (30% a 100%) por 10 minutos en cada alcohol, a temperatura ambiente y se incluyeron en resina Spurr de baja viscosidad para obtener secciones finas (ca. 90 nm de grosor), que se tiñieron con acetato de uranilo y citrato de plomo. La otra porción de la suspención bacteriana se suspendió en amortiguador de cacodilato (0.1 mm ph 7.2), se fijó durante 20 minutos a temperatura ambiente con una mezcla de glutaraldehído al 2.5%, rojo de rutenio al 0.075% y lisina 50 mm en amortiguador de cacodilato. Luego se fijó nuevamente durante 100 minutos con una solución de glutaraldehído (2.5%) y rojo de rutenio (0.075%) en el amortiguador de cacodilato, pero sin lisina (6). El resto del proceso fue similar al descrito anteriormente. Ambas preparaciones se analizaron en un microscopio electrónico de transmisión (Hitachi H 7000). RESULTADOS. En las muestras fijadas por el método estándar se obtiene buena información del citoplasma, pero la membrana citoplasmática y la pared bacteriana aparecen poco definidas; además, el exterior de las bacterias aparece limpio debido a la pérdida de materiales de glicocalix (figs. 1 y 2). Por otra parte, cuando se incluyó lisina y rojo de rutenio en la solución fijadora se aprecia un mayor contraste, que delimita mejor los componentes como membrana citoplásmica, capa de peptidoglican, periplasma y membrana externa (figs. 3 y 4). Además, externamente a la pared bacteriana aparece un material amorfo electrón denso, que corresponde al glicocálix. DISCUSIÓN. El método de fijación empleado en microscopia electrónica más frecuentemente consiste en una doble fijación secuencial con aldehidos. Generalmente se utiliza glutaraldehido, en una concentración entre el 1% y 6% en amortiguador de fosfatos a ph 7.2, o una mezcla de glutaraldehido y formaldehido, conocida como solución fijadora

4 10 K Echandi, F Hernández. Figuras 1 y 2.- Micrografías electrónicas de transmisión, correspondientes a un corte transversal y otro longitudinal de Pseudomonas aeruginosa. Muestras procesadas con el método estándar, utilizando una doble fijación con glutaraldehido y osmio. Se observa una buena conservación del citoplasma y pared bacteriana, pero el glicocálix no se evidencia. (Barra=0.25 µm). de Karnowski. Luego de un período de 1 a 2 h de fijación, los especímenes se lavan en el mismo amortiguador, para fijar nuevamente en tetraóxido de osmio, usualmente al 1%, durante 30 a 60 minutos. Tal método ha brindado magníficos resultados para describir la ultraestructura tanto de células eucariotas como procariotas. El primer fijador estabiliza fundamentalmente la matriz proteica de la células y el segundo los lípidos. Sin embargo, el glicocálix, integrado fundamentalmente por mucopolisacáridos y localizado externamente a la membrana o a la pared bacteriana, según se trate de células eucariotas o procariotas, no se evidencia con esta fijación estándar, por lo que las células aparecen limpias, como se aprecia en las figuras 1 y 2. El método de fijación alterno, que emplea lisina y rojo de rutenio en amortiguador de cacodilato, estabiliza los polímeros constituyentes de la cápsula e incrementa su electrodensidad, lo que facilita la observación al microscopio electrónico de las estructuras externas a la membrana citoplasmática (figs. 3 y 4). El amortiguador de cacodilato no es muy empleado en microscopia electrónica por su contenido de arsénico y elevado precio. En la mezcla de fijación la lisina actúa como agente estabilizador de la cápsula y glicocálix, cuyo efecto es muy efectivo a concentraciones a 100 mm y que en sólo diez minutos de exposición a la superficie bacteriana la estabilizaría (6). Además, tiene la habilidad de formar largos polímeros cuando reacciona con glutaraldehido, produciendo puentes cruzados de diferente longitud, lo que provee enlaces efectivos confiriendo gran estabilidad a los constituyentes capsulares durante el proceso de deshidratación (6) y aumentando la electrodensidad de la preparación. Por otro lado, el rojo de rutenio se une a grupos aniónicos y sirve de receptor para el osmio, lo que en última instancia se traduce en un aumento de la electrodensidad en el glicocalix, lo que se evidencia en los resultados obtenidos. Por lo tanto, recomendamos la inclusión de lisina y rojo de rutenio en la fijación de suspensiones Revista Biomédica

5 11 Métodos de fijación bacteriana. Figuras 3 y 4.- Micrografías electrónicas de transmisión de Pseudomonas aeruginosa. Al fijador, tanto glutaraldehido como osmio, se agregó rojo de rutenio y lisina. Se aprecia un mayor contraste y aparece el glicocálix como un meterial electrón denso (flechas pequeñas) rodeando las bacterias. En la pared bacteriana se aprecian fácilmente los elementos constitutivos. La flecha grande señala la capa de peptidglican, al lado interno aparece la membrana citoplasmática como una línea negra y hacia el exterior el periplasma y la membrana externa. (Barra=0.25 µm). bacterianas para evidenciar los componentes externos a la pared bacteriana. Además, no es recomendable emplear amortiguador de fosfatos y rojo de rutenio juntos, pues en esta combinación precipitan los fosfatos. AGRADECIMIENTO. Se agradece las sugerencias y la corrección de estilo hechas por los revisores anónimos de la Revista Biomédica y el apoyo de la Vicerrectoría de Investigación de la Universidad de Costa Rica. REFERENCIAS. 1.- Robinson DG, Ehlers U, Herken R, Herrmann B, Mayer F, Schurmann FW. Methods of preparation for electron microscopy. An introduction for the biomedical sciences. London: Springer-Verlag 1987: Robertson JD. The anatomy of biological interfaces. En: Physiology of membrane disorders. New York: Plenum Medical Book Company. 1986: Beveridge TJ. The periplasmic space and the periplasm in Gram-positive and Gram-negative bacteria. ASM News 1995; 61: Sluiman HJ, Lokhorst GM. The ultrastructure of cellular division (autosporogenesis) in the ccoccoid green alga, Trebouxia aggregata reveled by rapid freeze fixation and freeze substitution. Protoplasma 1988; 144: Nagano Y, Shimai K, Kushida T, Kushida H. Staining of intestinal goblet cells with ruthenium red in semithin sections. J Electron Microsc 1990; 39: Jacqes M, Graham L. Improved preservation of bacterial capsule for electron microscopy. J Electron Microsc Tech 1989; 11: Hernández F, Coto E, Colmenares A, Moreira L. Aplicación del método de coagulación de plasma al estudio ultraestructural de especímenes biológicos. Rev Biol Trop 1991; 39: