ALINEAMIENTO MÚLTIPLE DE SECUENCIAS Y ANÁLISIS FILOGENÉTICO

Transcripción

1 ALINEAMIENTO MÚLTIPLE DE SECUENCIAS Y ANÁLISIS FILOGENÉTICO Christian Rubén Vargas Cod: INTRODUCCIÓN Antes de que cualquier secuencia pueda ser utilizada para la reconstrucción filogenética, estas deben ser alineadas, siendo la calidad de este procedimiento un factor que afecta la calidad de la filogenia inferida (Yue, et al. 2009). Wong et al. (2008) analizaron secuencias nucleotidicas de siete especies de levadura con siete distintos programas de alineamiento y encontraron que el 46.2% de 1502 secuencias de genes ortólogos producían más de un árbol diferente dependiendo del proceso de alineamiento. Con base a lo anterior el objetivo de este trabajo es analizar la influencia del alineamiento múltiple de secuencias en el análisis de máxima verosimilitud. METODOLOGÍA Para el análisis se utilizó un set de de datos moleculares del gen mitocondrial ARNr 16s de varios mamíferos (tabla 1) seleccionados en el artículo de Hudelot et al (2003). Con estos datos se realizó un análisis inicial con 17 y otro con 50 taxa para evaluar la influencia del número de secuencias en un mismo alineamiento. Para el alineamiento múltiple de secuencias se utilizaron los programas Muscle 3.7 (Edgar, 2004), ClustalW2.0 (Larkin et al., 2007) y MAFFT 4.0 (Katoh & Toh, 2008). Posterior al alineamiento se buscó el modelo evolutivo más optimo con el programa Jmodeltest (Posada, 2008) bajo el criterio de Akaike y se procedió a realizar el análisis de máxima verosimilitud con el programa PhyML 3.0 (Guindon & Gascuel, 2003) con 1000 y 100 (datos de 17 y 50 taxa respectivamente) replicas de análisis de bootstrap no paramétrico. Las topologías y los valores de bootstrap fueron comparadas entre los distintos tratamientos de datos y con respecto a los resultados obtenidos por Hudelot et al (2003)(fig. 4). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Con el primer set de datos de 17 taxa se presentó una variación con respecto al modelo evolutivo seleccionado bajo el criterio de Akaike, ya que fue el modelo TIM2 + G el seleccionado para los alineamientos con MAFFT y MUSCLE y por otro lado el modelo GTR+G para el alineamiento realizado con ClustalW. Sin embargo, las tres topologías generadas con los diferentes programas (fig. 1, 2 y 3) coincidieron en las relaciones filogenéticas entre los taxa y con poca variación en los valores de bootstrap para la mayoría de los nodos. La diferencia con respecto al cálculo del modelo entre alineamientos también se vio cuando se utilizaron mas taxa ya que para los datos de ClustalW se encontró el modelo TVM+I+G y para los otros dos análisis fue GTR+I+G. En la figura 5 se observa el resultado del análisis de máxima verosimilitud de los datos alineados con MAFFT. En comparación al cladograma de la figura 4, en este análisis el grupo Dermoptera que es representado en todos los análisis por Cynocephalus variegatus forma un clado con el grupo Lemur catta y Nycticebus coucang los cuales se ubicaron por fuera de su grupo Primates. Cavia porcellus y Sciurus vulgaris aparecen por fuera de Rodentia, y este ultimo genero se ubica más cercano con los grupos Macroscelidea, Afrosoricida y Proboscidea. Episoriculus fumidus representante de Eulipotyphla aparece como hermano del grupo Primates. Otras diferencias subyacen en el grupo Cetartiodactyla donde aparece la agrupación de Hippopotamus amphibius y Bos taurus y a su vez Manis tetradactyla representante de Pholidota se ubica como hermano del grupo Carnivora. Dentro de Chriroptera tampoco se definió la agrupación de Chalinolobus tuberculatus y Artibeus jamaicencis.

2 De las diferencias encontradas entre el análisis de los datos alineados con ClustalW (fig. 6) y los resultados encontrados por Hudelot et al. (2003). cabe destacar que la relaciones internas del grupo Rodentia se rompen, y se rescata el mayor grupo con Microtus kikuchii, Mus musculus y Rattus norvegicus. El grupo Lagomorpha coincide con las relaciones internas pero aparece agrupado con Dermoptera y por otro lado dentro de Primates no se rescató la agrupación de Gorilla gorilla con Homo sapiens. También Chalinolobus tuberculatus perteneciente a Chiroptera se unió a Episoriculus fumidus y los demás taxa de Chiroptera formaron un grupo hermano con respecto al grupo Perissodactyla. Por último en el análisis de los datos alineados con MUSCLE (fig. 7) se rescató la mayor agrupación de Rodentia con excepción (al igual que los otros análisis) de Sciurus vulgaris. Con respecto a Primates Nycticebus coucang se separó y se ubicó como taxón hermano de Cynocephalus variegatus, y Lemur catta se ubicó como hermano del grupo Lagomorpha. Así mismo, Proboscidea se agrupó con Afrosoricida y al igual que con los datos alineados con MAFFT Eulipotyphla aparece como hermano del grupo Primates. En general con el alineamiento de MUSCLE se recuperaron mayor numero de grupos con relaciones internas que coinciden con los resultados de Hudelot et al. (2003). pero la relaciones entre los grupos fueron poco congruentes para los tres análisis. A parte de los grupos externos, Lagomorpha, Carnivora y Perissodactyla fueron los únicos grupos completamente resueltos internamente que coincidieron entre los todos los análisis y solo representan el 28% de los taxa analizados en el ingroup. En general estos tres programas tienen una estrategia de alineamiento progresivo pero también tienen características particulares. Estas diferencias se basan en que al alinear las secuencias se busca el alineamiento mínimo para una función o esquema de costos seleccionado (Eguiarte, 2007). Los esquemas de costos se centran en valores de extensión de gap, apertura de gap y valores de transición entre nucleótidos. La puntuación representa típicamente alguna función del número y posición de columnas que contiene bases idénticas, diferentes o gaps, siendo cada diferencia penalizada (Kumar & Filipski, 2007). En ClustalW por ejemplo encontramos valores por defecto de apertura de gap de 10, extensión de gap 0.2 y 0.5 en la transición de nucleótidos. En MAFFT se dan valores de 1.53 por la apertura de gap y para la extensión. A su vez las características de las secuencias (numero de nucleótidos, regiones conservadas, numero de secuencias) utilizadas pueden demarcar una diferencia en los resultados como se observó con los dos tratamientos donde con pocos taxa no se observó diferencias tanto en la topología como en los valores de bootstrap pero al triplicar el número de secuencias para analizar las diferencias fueron evidentes. Qué podría ser un buen alineamiento para hacer un análisis filogenético? Una práctica generalizada es la combinación de un programa de alineamiento múltiple de secuencias (generalmente ClustalW) con un respectivo alineamiento o retoque manual en el cual en algunos casos se suprimen regiones ambiguas debido a las características implícitas en el proceso de secuenciación y disponibilidad en las bases de datos moleculares. Al respecto Wong et al. (2008) sugiere que descartar información de alineamientos ambiguos no es aconsejable ya que se pueden perder porciones de datos primarios altamente informativos y en algunos casos eventos de inserción y deleción son básicos para la información filogenética. Además cabe la duda acerca del patrón de repetibilidad que tiene un alineamiento manual. Con respecto al tiempo como parámetro de calidad de un alineamiento esté no fue relevante en este trabajo debido al tamaño del set de datos. La mayor exactitud en este trabajo es atribuida al alineamiento con MUSCLE en términos de número de grupos resueltos internamente y tomando como valor más cercano al valor real la hipótesis filogenética de Hudelot et al. (2003) que utilizó todo el genoma mitocondrial. En términos de precisión la herramienta de iteración para estos programas podría evitar caer en arboles guías incorrectos.

3 CONCLUSIÓNES Los alineamientos generados por los programas MUSCLE, ClustalW y MAFFT influenciaron en los análisis de máxima verosimilitud para el set de datos utilizado. Se encontraron tanto congruencias como diferencias entre los resultados obtenidos pero en general se evidencia que se pueden generar hipótesis filogenéticas diferentes. Las características de las secuencias y el set de datos en general aunado a las características de los programas y sus estrategias implícitas de alineamiento influencian en la calidad posterior del análisis filogenético.

4 BIBLIOGRAFÍA Edgar R MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity. BMC Bioinformatics. 5: 113. Eguarte, L. Souza, V & Aguirre, X Ecología molecular. SEMANART. México. 592 p. Hudelot, C., Gowri-Shankar, V., Jow, H., Rattray, M. & HIggs, P. 2003, RNA-based phylogenetic methods: application to mammalian mitochondrial RNA sequences. Elsevier. 28: Katoh K. and Toh H. (2008) Recent developments in the MAFFT multiple sequence alignment program. Briefings in Bioinformatics : Kumar, S. & Filipski, A Multiple sequence alignment: In pursuit of homologous DNA positions. Genome Res. 17: Guindon S. & Gascuel, O PhyML 3.0. Systematic Biology. 52: Larkin M., Blackshields G., Brown N., Chenna R., McGettigan P., McWilliam H., Valentin F., Wallace I.., Wilm A., Lopez R., Thompson J., Gibson T. and Higgins D ClustalW and ClustalX version 2. Bioinformatics (21): Posada D jmodeltest: Phylogenetic Model Averaging. Molecular Biology and Evolution. 25: Wong, K., Suchard, M & Huelsenbeck, J Aligment uncertainty and genomic analysis. Science. Vol Yue, F. Shi, J & Tang, J Simultaneous phylogeny reconstruction and multiple sequence aligment. BMC Bioinformatics. 10:S11.

5 ANEXOS Tabla 1 Taxa y codigos de acceso del GenBank OUTGROUP Ornithorynchidae Ornithorhynchus anatinus NC Tachyglossidae Tachyglossus aculeatus NC_ Didelphimorphia Didelphis virginiana NC_ Diprotodontia Macropus robustus NC_ INGROUP Afrosoricida Echinops telfairi NC_ Carnivora Arctocephalus forsteri NC_ Carnivora Canis familiaris NC_ Carnivora Felis catus NC_ Carnivora Halichoerus grypus NC_ Carnivora Odobenus rosmarus NC_ Carnivora Phoca vitulina NC_ Cetartiodactyla Balaenoptera musculus NC_ Cetartiodactyla Balaenoptera physalus NC_ Cetartiodactyla Bos taurus NC_ Cetartiodactyla Hippopotamus amphibius NC_ Cetartiodactyla Lama pacos NC_ Cetartiodactyla Physeter catodon NC_ Chiroptera Artibeus jamaicencis NC_ Chiroptera Chalinolobus tuberculatus NC_ Chiroptera Pteropus dasymallus NC_ Chiroptera Pteropus scapulatus NC_ Dermoptera Cynocephalus variegatus NC_ Eulipotyphla Episoriculus fumidus NC_ Lagomorpha Lepus europaeus NC_ Lagomorpha Ochotona collaris NC_ Lagomorpha Oryctolagus cuniculus NC_ Macroscelidea Macroscelides proboscideus NC_ Perissodactyla Ceratotherium simum NC_ Perissodactyla Equus asinus NC_ Perissodactyla Equus caballu NC_ Perissodactyla Rhinoceros unicornis NC_ Pholidota Manis tetradactyla NC_ Primates Cebus albifrons NC_ Primates Gorilla gorilla NC_ Primates Homo sapiens NC_ Primates Lemur catta NC_ Primates Macaca sylvanus NC_ Primates Nycticebus coucang NC_ Primates Pan paniscus NC_ Primates Pan troglodydes NC_ Primates Papio hamadryas NC_ Primates Hylobates lar NC_ Primates Pongo pygmaeus NC_ Proboscidea Loxodonta africana NC_ Rodentia Cavia porcellus NC_ Rodentia Mus musculus NC_ Rodentia Myoxus glis NC_ Rodentia Rattus norvegicus NC_ Rodentia Sciurus vulgaris NC_ Rodentia Microtus kikuchii NC_003041

6 Figura 1 Análisis de máxima verosimilitud (alineamiento con ClustalW2)

7 Figura 2 Análisis de máxima verosimilitud (alineamiento con MUSCLE 3.7)

8 Figura 3 Análisis de máxima verosimilitud (alineamiento con MAFFT 4.0)

9 Figura 4 Hipótesis filogenética Hudelot et al. (Análisis Bayesiano)

10 Figura 5 Análisis de máxima verosimilitud para 50 taxa (alineamiento MAFFT 4.0)

11 Figura 6 Análisis de máxima verosimilitud 50 taxa (alineamiento ClustalW 2.0)

12 Figura 7 Análisis de máxima verosimilitud 50 taxa (alineamiento MUSCLE 3.7)