Departamento de Ecología y Evolución, Facultad de Ciencias UNIVERSIDAD DE LA REPÚBLICA

Transcripción

1 CURSO DE EVOLUCIÓN GUÍA DE CLASES PRÁCTICAS 2014 Carolina Abud, Nicolás Boullosa, Alejandro D Anatro Guillermo D Elia, Felipe García Olaso, Mateo García Olazábal, Andrés Iriarte, Enrique P. Lessa, Andrés Parada, Ivanna H. Tomasco y Gabriela Wlasiuk. Departamento de Ecología y Evolución, Facultad de Ciencias UNIVERSIDAD DE LA REPÚBLICA

2 Práctico Nº 1 Lanzamiento del trabajo final Uno de los requisitos para ganar el curso de Evolución es aprobar el Trabajo Final. Con la realización de este ejercicio se pretende que el estudiante demuestre ser capaz de resolver un problema concreto mediante la integración de conocimientos teóricos y herramientas informáticas adquiridas en los ejercicios prácticos. Es decir, que se familiarice con todas las etapas de un estudio científico: obtención de datos (en este caso secuencias de ADN a partir de bases de datos), análisis de los mismos, interpretación de resultados y elaboración de un informe con formato de artículo científico. El trabajo es básicamente un ejercicio filogenético. Durante la elaboración del trabajo los docentes brindarán asistencia técnica, por ejemplo para el uso de los programas, y para ello se implementarán clases de consulta (calendario y horarios figuran en la plataforma EVA). El trabajo se realiza en grupos de 3 personas (no se aceptarán informes realizados por 1, 2 o más de 3 personas); los integrantes de un grupo de trabajo no tienen porqué ser del mismo grupo práctico. A la fecha del práctico Nº 3 los equipos de trabajo deben estar formados y se debe informar a un docente de práctico los nombres de los integrantes del grupo. Los informes deberán ser entregados indefectiblemente no más allá del viernes 28 de noviembre a las 17 hs. 2

3 Problema 1: Intercambio faunístico entre Norte y Sudamérica Sudamérica estuvo aislada de otros continentes durante la mayor parte del Cenozoico. Dicho aislamiento se rompió al formarse el Istmo de Panamá hace unos 3,5 millones de años. Dicho evento permitió migraciones entre Sudamérica y el continente norteamericano (incluyendo la mayor parte de Centroamérica, al norte del Istmo de Panamá), bien documentados en mamíferos. El intercambio fue asimétrico, y resultó principalmente en un influjo de linajes desde el continente norteamericano hacia Sudamérica. Numerosos grupos de mamíferos sudamericanos autóctonos actuales tienen su origen en dicho intercambio. En particular, se han identificado familias enteras de mamíferos que tienen orígenes documentados fuera del continente sudamericano, pero que en la actualidad están presentes y comprenden varias especies en el Sudamérica. El presente problema consiste en investigar, utilizando secuencias nucleotídicas disponibles en Genbank, dos escenarios alternativos que, en principio, pueden dar cuenta de la diversidad actual de varias de estas familias en Sudamérica: 1. El intercambio involucró varios linajes dentro de cada familia, por lo que la diversidad actual Sudamericana se produjo a partir de más de una especie ancestral; 2. La diversidad actual de cada familia representada en Sudamérica es el producto de la diversificación de un único linaje ancestral por familia. Problema: Mediante el empleo de secuencias de ADN extraídas del GenBank, se propone considerar el problema para el caso de la familia Felidae. Margay (Leopardus wiedii) Puma (Puma concolor) Jaguar (Panthera onca) Ocelote (Leopardus pardalis) 3

4 CLASIFICACIÓN SISTEMÁTICA DE LA FAMILIA FELIDAE: - ORDEN: CARNIVORA - SUBORDEN: FELIFORMIA - FAMILIA: FELIDAE - SUBFAMILIA: FELINAE - GÉNERO Acinonyx (Guepardo) Caracal (Caracal) Catopuma (e.g. Gato dorado de Asia) Felis (e.g. Gato doméstico) Leopardus (Gatos pequeños Americanos) Leptailurus (Serval) Lynx (Linces) Pardofelis (Gato jaspeado) Prionailurus (Gatos pequeños de Asia) Profelis (Gato dorado de África) Puma (Puma y Yaguarundí) - SUBFAMILIA: PANTHERINAE - GÉNERO Neofelis (Leopardo nebuloso) Panthera (Jaguar, Tigre, León y Leopardo) Uncia (Leopardo de las nieves) 4

5 Problema 3: Evaluación de la monofilia de Pinnipedia y de las relaciones filogenéticos con el resto de Carnivora Los pinípedos, grupo formado por las focas (Phocidae), los lobos marinos (Otaridae) y las morsas (Odobenidae), fueron considerados originalmente como un grupo monofilético, clasificado como un suborden (Pinnipedia) hermano de los carnívoros terrestres (Fissipedia), dentro del Orden Carnivora. Este concepto fue cambiando gradualmente con el transcurso del tiempo, dado que la visión morfológica colocaba a las focas (Phocidae) más cercanamente emparentadas a los mustélidos (Mustelidae) y a los lobos marinos (Otariidae) con los osos (Ursidae). A fines de la década de los 60, V. M. Sarich, basado en distancias inmunológicas, restablece a los pinnípedos como un grupo monofilético. Análisis moleculares posteriores apoyan esta última visión sobre las relaciones filogenéticas del grupo. Sin embargo, aún hoy es objeto de debate cuál familia dentro del orden Carnivora constituye el grupo hermano de los pinípedos, centrándose principalmente este dilema entre los osos y los mustélidos. Problema: Dado estos antecedentes, el objetivo principal de este trabajo es poner a prueba la hipótesis de que los pinípedos constituyen un grupo monofilético, y evaluar cual es el grupo hermano de este taxa dentro del orden Carnivora mediante el empleo de secuencias de ADN extraídas del GenBank. 5

6 Guía para el trabajo final Un ejemplo de propuesta de trabajo final se titula Evaluación de la monofilia de Pinnipedia y de las relaciones filogenéticas con el resto de Carnivora A modo de introducción al problema se dice que los pinnípedos, grupo formado por las focas (Phocidae), los lobos marinos (Otaridae) y las morsas (Odobenidae), fueron considerados originalmente como un grupo monofilético, clasificado como un suborden (Pinnipedia) hermano de los carnívoros terrestres (Fissipedia), dentro del Orden Carnivora. Este concepto fue cambiando gradualmente con el transcurso del tiempo, dado que la visión morfológica colocaba a las focas (Phocidae) más cercanamente emparentadas a los mustélidos (Mustelidae) y a los lobos marinos (Otariidae) con los osos (Ursidae). A fines de la década de los 60, V. M. Sarich, basado en distancias inmunológicas, restablece a los pinnípedos como un grupo monofilético. Análisis moleculares posteriores apoyan esta última visión sobre las relaciones filogenéticas del grupo. Sin embargo, aún hoy es objeto de debate cuál familia dentro del orden Carnivora constituye el grupo hermano de los pinnípedos, centrándose principalmente este dilema entre los osos y los mustélidos. Dado estos antecedentes se plantea el problema, cuyo objetivo principal es poner a prueba la hipótesis de que los pinnípedos constituyen un grupo monofilético, y evaluar cual es el grupo hermano de este taxa dentro del orden Carnivora mediante el empleo de secuencias de ADN extraídas del GenBank. Considerando este ejemplo, realizar las siguientes actividades. 1) Entender el problema 1a- Considerar la hipótesis. Dibujar el árbol esperado en caso de que los pinnípedos formen un grupo monofilético. 1b- Dibujar un posible árbol a obtener en caso que los pinnípedos no formen un grupo monofilético. 1c- Dibujar el árbol que espera obtener en caso que Ursidae sea el grupo hermano de Pinnipedia. 2) Diseño 2a- Definir los integrantes del Grupo interno o grupo de estudio. Hay un mínimo de diversidad filogenética que deberá ser incluida para realizar una puesta a prueba adecuada de la hipótesis. Por ejemplo, si se quiere poner a prueba la monofilia de los mamíferos, debe incluirse una buena representación de la diversidad de este grupo incluyendo preferentemente representantes de varios géneros en vez de muchas especies dentro de pocos géneros. 2b- Definir un posible Grupo externo. Recordar que el grupo externo debe estar por fuera del grupo de estudio (o sea, el grupo interno no puede ser parafilético respecto al grupo externo). También es deseable que el grupo externo esté lo más cercanamente emparentado al grupo de estudio que sea posible; idealmente se utiliza como grupo externo al grupo hermano del grupo de estudio. 3) Datos 3a- Acceder a la base de datos GenBank en página del NCBI (National Center for Biotechnology Information). 3b- Buscar una secuencia de nucleótidos de lobo marino Arctocephalus australis restringiendo la búsqueda a la base de datos de nucleótidos (cambiar la opción All Databases que viene por defecto). 6

7 3c- Los resultados de la búsqueda se pueden mostrar de distintas formas. Ver el formato Genbank e identificar el trabajo que generó esa secuencia. 3d- Elegir tres secuencias (haciendo clic en las cajas), enviarlas a un bloc de notas (send to clipboard) y verlas en formato FASTA (text). Recomendaciones a) Evitar usar secuencias de genes no codificantes (ej., región de control), o que codifiquen para el ARN ribosomal; el alineamiento de éstas es, en general, bastante complicado. b) Se sugiere utilizar secuencias codificantes, independientemente de si son nucleares o mitocondriales, tanto en forma individual como una concatenación de las mismas. c) Recordar que el análisis de un mayor número de taxa requiere de mayor cantidad de caracteres para su resolución, y muchas veces se necesita probar más de una base de datos para encontrar la adecuada. La elección de la base de datos a usar lleva tiempo. d) Usar un gen cuya tasa de evolución se adecue al problema a tratar (ej. una región hipervariable no es buena para estudiar la radiación de los órdenes de mamíferos). 4) Análisis El programa que se usará para el alineamiento de secuencias y la reconstrucción filogenética será MEGA disponible en Alineamiento 7

8 4a- Abrir el programa. Ir a la opción alignment/ query databanks. Buscar secuencias del género Otaria. Seleccionar las primeras 5 y adicionarlas al alineamiento (add to alignment). A qué gen pertenecen y cuántos pares de bases tiene la secuencia? 4b- Una vez que MEGA avisa que incorporó las secuencias correctamente, mirar la ventana del explorador de alineamiento (alignment explorer). Qué señalan los asteriscos? Describir el primer sitio que no está marcado con un asterisco. Guardar el alineamiento como archivo MEGA. 4c- Buscar nuevamente secuencias del género Otaria. Alinear 3 genes distintos disponibles. Observar sitios variables y conservados. Recomendaciones a) Asegurarse que las secuencias representativas de cada taxon sean homólogas (mismo gen, misma región del gen). El algoritmo del CLUSTAL le brindará un alineamiento siempre, incluso si está alineando el citocromo b de una especie con el gen de la insulina de otra especie. b) Tratar de trabajar con secuencias de la misma longitud. c) Si se está trabajando con secuencias codificantes (en estos casos lo deseable) corroborar que el alineamiento resultante no haya alterado el marco de lectura del gen. Es decir que los tripletes (codones) no se pueden ver alterados; si hay inserciones o deleciones éstas deben de ser de tres nucleótidos o en múltiplos de tres. Recordar que los exones no tienen otros tipos de gaps. Reconstrucción filogenética 4d- Abrir el archivo generado en (4b). Cerrar el visor de datos, ir a Phylogeny/ Construct Phylogeny/ Maximum Parsimony. Identificar largo del árbol y número de árboles obtenidos. Recomendaciones a) Usando Máxima Parsimonia, si se realizan búsquedas heurísticas realizar un buen número de réplicas (con los taxones adicionados al azar) para así asegurarse una buena exploración del universo de árboles posibles. Sin embargo, recordar que el tiempo que demora el análisis dependerá, entre otras cosas, del número de réplicas. Otros factores que afectan el tiempo de la búsqueda son la cantidad de taxones y el grado de homoplasia existente en la matriz. b) Fijarse el número de árboles más parsimoniosos obtenidos. En caso de que haya más de uno reporte la cantidad y el consenso de los mismos. c) Reportar el largo del (de los) árbol(es) más parsimonioso(s). d) En general es de interés evaluar qué tan bueno es el árbol más parsimonioso o el consenso de los mismos. Para esto, por ejemplo, puede realizar un análisis de bootstrap. En este análisis use un número alto de seudoréplicas. Aquí también recuerde que el tiempo que demorará el análisis dependerá, entre otras cosas, del número de réplicas. 5) Redacción del informe El informe debe tener formato de artículo científico y se aceptará una extensión máxima de 12 carillas a interlineado 1,5 en letra arial tamaño 12. Se debe usar lenguaje neutro-formal y se deben incluir las siguientes secciones: Introducción- En esta sección se presenta el marco general del tema, se presentan los antecedentes generales y específicos, yendo de lo general a lo particular. Finalmente, se explicitan los objetivos del trabajo. Materiales y métodos- En esta sección se hace una descripción de los procedimientos o métodos utilizados. Recuérdese que esta información debería ser los suficientemente detallada como para que una tercera persona pueda repetir sus experimentos o análisis. 8

9 Resultados- En esta sección se presentan y describen los resultados. Las tablas, gráficos y figuras deben estar numeradas y contener leyendas explicativas (en la parte superior para las tablas y en la parte inferior para las figuras y gráficos). El texto de esta sección debe describir toda tabla, gráfico y/o figura incluida, haciendo referencia a los números. Tener en cuenta que, en general, la inclusión de figuras y/o tablas ayudan en la comprensión del trabajo. Discusión y conclusiones- En esta sección se analizan en forma profunda los resultados, se comparan con las predicciones de la/las hipótesis a testar, y en base a ello se toma la decisión de rechazarla/s o no. Se pueden retomar elementos teóricos o antecedentes presentados en la introducción, o incluir nuevos elementos. Se espera que la discusión refleje en forma clara los resultados obtenidos y la forma en que los mismos, sumados a otros elementos (evidencia previa, por ejemplo), permiten evaluar la/las hipótesis puestas a prueba. Opcionalmente estos dos puntos pueden constituir secciones separadas, en cuyo caso, las conclusiones serán cortas, y sólo una reafirmación de los puntos principales de la discusión. Bibliografía- En esta sección deben incluirse todos los materiales citados en el texto (y solamente esos materiales). En caso de utilizar programas, se deben incluir las citas correspondientes a los mismos. Se deben incluir las CITAS COMPLETAS, en orden alfabético en primer lugar y luego por orden de publicación. Todas deben tener el mismo formato: en este caso, al formato a seguir se detalla a continuación, dependiendo de qué material se trate. i) Artículo de revista científica: Autores. Año. Título del artículo. Nombre de la revista, Volumen: páginas. Ejemplo: Rogers, A.R. and H. Harpending Population growth make waves in the distribution of pairwise genetic differences. Molecular Biology and Evolution, 9: ii) Capítulo de un libro (para libros en los que los diferentes capítulos tienen distintos autores): Autores. Año. Título del capítulo. Páginas del capítulo. Editores, Nombre del libro. Editorial. Ejemplo: Busch C., C.D. Antinuchi, J.C. del Valle, M.J. Kittlein, A.I. Malicia, A.I. Vasallo and R.R. Zenuto Population ecology of subterranean rodents. Pp in E.A. Lacey, J.L. Patton and G.N. Cameron, eds. Life Underground: the Biology of Subterranean Rodents. University of Chicago Press, Chicago, USA. iii) Libro (para el caso anterior o para libros escritos enteramente por el/los mismos autores): Autores. Año. Título del libro. Editorial. Número total de páginas. Ejemplo: Li, W.H Molecular Evolution. Sinauer, Sunderland Massachusetts, USA. 487 pp. Es importante verificar que las citas en el texto tengan su referencia completa en esta sección, y que todas las referencias en esta sección estén nombradas en el texto. A lo largo del informe, recordar que las CITAS DE TEXTO van entre paréntesis, en el lugar adecuado, de la siguiente forma: a) Si el trabajo tiene un autor (apellido, año) b) Si el trabajo tiene dos autores (apellido 1 & apellido 2, año) c) Si el trabajo tiene tres o más autores (apellido 1 et al., año) Apéndice: Incluir los alineamientos usados en el trabajo y, si así lo desea, algunas de las salidas de los principales análisis. Consideraciones generales a) Es recomendable realizar el trabajo de a poco, tomándose tiempo para entender cada etapa. Tener en cuenta que por tratarse de una primera aproximación a las herramientas y a la interpretación de resultados puede consumir más tiempo del pensado de antemano. b) Entregar la versión impresa del informe y un soporte digital del mismo y sus archivos de trabajo. 9

10 Práctico Nº2 Sistemática Filogenética Introducción El orden de aves no voladoras Struthioniformes (Ratites) está formado en la actualidad por 13 especies vivientes: dos especies de ñandú en América del Sur, dos especies de avestruz en África, tres especies de casuarios y una de emú en Australia y Nueva Guinea y cinco especies de kiwis en Nueva Zelanda. Se incluye dentro de este orden a los moas, extintos recientemente, también pobladores de Nueva Zelanda. Evidencia fósil, morfológica y citogenética relaciona a estas especies entre sí y sugiere que el grupo hermano de los ratites sería el orden Tinamiformes (perdices, martinetas, etc.). Al mismo tiempo, los resultados de estos estudios agrupan a las especies coincidentemente con su distribución geográfica actual, sugiriendo que el ancestro común a todas ellas habría existido antes del quiebre de Gondwana. Un esquema de la fragmentación de Gondwana se muestra en la figura 1. El objetivo de este práctico consiste en, mediante un análisis filogenético de secuencias de ADN, poner a prueba la hipótesis de trabajo que dice que la diferenciación de los ratites fue propiciada por la fragmentación de Gondwana. Mediante este ejercicio se pretende a) repasar los conceptos esenciales de reconstrucción filogenética vistos en el curso teórico, y b) evidenciar la utilidad de las hipótesis filogenéticas para poner a prueba las predicciones de distintas hipótesis biológicas (en este caso biogeográficas). 220 Ma 150 Ma 90 Ma 50 Ma Fig. 1 Secuencia simplificada de la fragmentación de Gondwana 10

11 Datos y programa de análisis La base de datos a analizar consiste en secuencias del gen mitocondrial ADNr 12S. Las secuencias ya se encuentran alineadas (las homologías posicionales entre las distintas secuencias ya están establecidas), por lo que ya están listas para ser analizadas. El programa que se usará para generar las hipótesis filogenéticas es el MEGA. Éste es un programa que se baja gratis de la red en y que tiene varias prestaciones (incluyendo el estudio descriptivo de las secuencias y reconstrucciones filogenéticas mediante métodos de basados en distancias genéticas y máxima parsimonia). Actividades a realizar durante el práctico 1) Dibujar el árbol filogenético de las ratites predicho por la hipótesis de trabajo. 2) Visualizar la matriz de datos en MEGA (ventana: Data Explorer ) e identificar los primeros 5 sitios variables y los primeros 3 informativos. Por qué algunos de los primeros sitios variables no son informativos? 3) Realizar un análisis utilizando el criterio de Máxima Parsimonia. Especificar el grupo externo. Analice el apoyo de los clados obtenidos utilizando "bootstrap", con 100 pseudoréplicas. Copie el árbol obtenido (o el consenso de los árboles obtenidos) junto a su longitud e índice de consistencia. Registre el valor de apoyo de los clados obtenidos utilizando "bootstrap". Indique cuáles son los 3 clados que reciben mayor apoyo estadístico. Compare los valores de bootstrap con los obtenidos por otros compañeros. Por qué difieren? Opcional: Repita la reconstrucción filogenética incluyendo el análisis de bootstrap utilizando el algoritmo de unión de vecinos ( Neighbour Joining ). 4) De acuerdo a los resultados obtenidos discutir si la hipótesis de trabajo se ve falsificada o corroborada. Para esto le puede ser útil contestar las siguientes preguntas: a) Forman los ratites de Nueva Zelanda un grupo monofilético? b) Teniendo en cuenta las topologías obtenidas: Cómo explicaría la coincidencia de moas y kiwis en Nueva Zelanda? Actividad: 1) Sintetice en un párrafo en qué consiste el criterio de reconstrucción filogenético por máxima parsimonia. 2) Cómo se explica la distribución geográfica actual de los ratites tomando en cuenta la filogenia obtenida? 11

12 Práctico Nº3 Deriva genética PARTE I. Ley de Hardy-Weinberg (Realizar previamente y consultar en los primeros minutos de clase) El modelo de Hardy-Weinberg describe el comportamiento de las frecuencias génicas de una generación a la otra en poblaciones ideales. Se dice que una población está en equilibrio de Hardy-Weinberg cuando sus frecuencias alélicas y genotípicas se ajustan a las predicciones del modelo. Bajo los supuestos del modelo, siendo pi la frecuencia del alelo Ai, las predicciones de frecuencias genotípicas serían las siguientes: E(Ai Ai) = pi 2 E(Ai Aj) = 2 pi pj Las predicciones de Heterocigosidad, para múltiples alelos, estarán dadas por la siguiente ecuación: E(H) = 1 Σ pi 2 Siendo Σ pi 2 la suma de las frecuencias esperada de homocigotos, o sea la Homocigocidad. La Heterocigosis (medida de la variabilidad en la población) aumenta a medida que aumenta el número de alelos en la población Figura- El área sombreada representa la fracción de homocigotos esperados bajo equilibrio Hardy-Weinberg. 12

13 Caso de estudio- Se estudia la variación genética de una población de Ctenomys rionegrensis. A partir del mismo, calcule las frecuencias alélicas y genotípicas observadas globales. Calcule la heterocigosis observada y la esperada a partir del modelo de Hardy-Weinberg considerando a toda la muestra como parte de una única población. Interprete los resultados. Figura- Gel de la poliacrilamida mostrando los resultados de la amplificación de microsatélites para tres individuos de cada una de ocho subpoblaciones de Ctenomys rionegrensis (arriba), y su representación esquemática (abajo). PARTE II. Deriva genética Cuando de los supuestos del modelo de Hardy-Weinberg se abandona la condición de que las poblaciones tienen tamaño infinito, se puede observar que de una generación a otra se producen cambios aleatorios en las frecuencias génicas. Esto es efecto directo de que los alelos que forman una nueva generación son un muestreo al azar de los alelos presentes en la generación parental. En este caso, el sentido de la evolución no se puede predecir, ya que no está causada por la selección sino por los efectos de muestreo de generación en generación, un proceso llamado deriva genética. El modelo poblacional que sólo difiere del de Hardy-Weinberg en poseer un tamaño poblacional finito es el modelo Fisher-Wright, que modela la probabilidad de un alelo de tener determinada frecuencia en la 13

14 generación siguiente, únicamente a partir de la frecuencia inicial del alelo y el tamaño poblacional, realizando muestreos al azar con reposición. Para los siguientes ejercicios se utilizará el programa EvoTutor ( que permite hacer simulaciones (eligiendo la opción online simulations). En particular, la simulación Genetic Drift > Allelic frequencies realiza simultáneamente una gráfica de las frecuencias génicas en función del tiempo. Esta simulación es para cinco loci no ligados, cada uno con dos alelos, y también se puede interpretar como cinco ensayos sucesivos independientes para un solo locus con dos alelos. En cualquier caso el programa graficará la frecuencia de uno de los dos alelos del locus, tomado arbitrariamente como marcador y la frecuencia del otro alelo será el complemento de esa. Como el modelo, el programa acepta como variables de ingreso para la ejecución de la simulación el tamaño poblacional, la frecuencia alélica inicial y el número de generaciones. Para ejecutar la simulación se debe apretar el botón Run. Tener en cuenta que para empezar una nueva simulación se debe apretar el botón Reset antes de ejecutar nuevamente, excepto cuando se pretenda continuar la misma simulación por más tiempo. Ejercicio 1. Efecto del tamaño poblacional Cómo supones que es el efecto de la deriva genética según el tamaño poblacional? Manteniendo siempre la frecuencia alélica inicial en 0,5 y en 100 generaciones, correr varias veces (aprentando reset cada vez) dos tipos de simulaciones: Simulación A: Gran tamaño poblacional: 5250 Simulación B: Pequeño tamaño poblacional: 500 Anotar por lo menos para una simulación de cada tipo las frecuencias finales de los alelos Cuántos se fijan o eliminan? En cuántas generaciones? Son estos resultados coherentes con tus predicciones? Comparar y discutir tus resultados con los de tus compañeros. Ejercicio 2. Efecto de la frecuencia alélica inicial Reflexione acerca de con qué frecuencia inicial se encontrará una mutación que recién surge. Por lo tanto, cuál será su probabilidad de fijarse? Corre algunas veces la siguiente simulación durante 100 generaciones: Simulación C: Tamaño poblacional: 500, y una baja frecuencia alélica inicial: 0,1 Nuevamente registre todas las mismas observaciones finales en al menos una corrida. Comparar los resultados obtenidos en C con los de B. Son estos resultados coherentes con sus predicciones? Ejercicio 3. Efecto a largo plazo sobre la heterocigosis. Calcular la Heterocigosis promedio mediante la ecuación básica H = 2pq para los 5 loci simulados, cada 235 generaciones durante una simulación con frecuencias iniciales de 0,5 y tamaño poblacional 500. Existe alguna tendencia en los resultados? 14

15 PARTE III. Deriva genética y mutación Ahora introduciremos una fuente de variación retirando otro de los supuestos de Hardy-Weinberg. Permitiremos el surgimiento de mutaciones a una tasa neutral µ por alelo por generación. Consideramos que cada variante nueva puede surgir por mutación una única vez. Para esta parte utilizaremos la simulación Genetic Drift > Population size del mismo programa. En este caso las variables de ingreso son el tamaño poblacional, la tasa de mutación y el número de generaciones. Ejercicio 4 Antes de realizar las próximas simulaciones, piense: Cuántas mutaciones neutrales, en promedio, se fijarán por deriva en cada generación? Cómo afecta el tamaño de la población a esta tasa de sustitución? Ejecutar 5 veces cada una de estas simulaciones: Simulación D: Tamaño poblacional: 5, tasa de mutación: 1 x 10-4 y por 2000 generaciones. Simulación E: Tamaño poblacional: 252 y el resto de los parámetros igual que en la simulación anterior. Registre en cada ejecución la cantidad de alelos que se fijan. Comparando los resultados obtenidos por toda la clase para los dos tipos de simulaciones, qué sucede con la heterocigosis a largo plazo ahora que en la población surgen mutaciones? Actividad: Sintetizar en un párrafo qué es la deriva genética, cuáles son sus principales características, y cómo interacciona con las mutaciones. 15

16 Práctico N 4 Microevolución Introducción Ctenomys rionegrensis es una de las tres especies de este género de roedores subterráneos, generalmente conocidos como Tucu-tucus, presentes en Uruguay. Su distribución geográfica para nuestro país está restringida a un área de aproximadamente 60 x 50 km al suroeste del departamento de Río Negro (fig. 1). Figura 1. Distribución geográfica de C. rionegrensis en Uruguay. Los sitios que se detallan corresponden a las localidades de muestreo Pese a su pequeña distribución, existen tres coloraciones de pelaje marcadamente diferentes: melánico, agutí y dorso oscuro. Mientras que algunas de las poblaciones están enteramente constituidas por individuos que presentan la misma coloración, otras son polimórficas, presentándose distintas combinaciones de pelajes. Esta marcada diferenciación cromática de C. rionegrensis es llamativa por varias razones. En primer lugar, por ocurrir en un área geográfica tan reducida. Segundo, no se cumple con la regla general (que incluye a roedores subterráneos) de correspondencia entre color de pelaje y color del sustrato en el que se habita, debido presumiblemente a presiones selectivas impuestas por la depredación. Todas las poblaciones de esta especie se limitan a la ocupación de suelos arenosos claros, sin diferencias obvias en la vegetación, y de esta forma los individuos melánicos contrastan marcadamente con el sustrato donde viven. 16

17 La estructura genética de las poblaciones de roedores subterráneos, como C. rionegrensis, estaría principalmente determinada por: a) su baja vagilidad, y por lo tanto bajos niveles de flujo génico, y b) el pequeño tamaño de sus poblaciones, que las hace más susceptibles a los efectos de la deriva genética (operando en mayor grado, fijando o eliminando alelos al azar). Bajo estas premisas, y dado que hasta el momento no se ha encontrado ninguna posible explicación seleccionista que explique la fijación del pelaje melánico en algunas poblaciones, se ha planteado la hipótesis de una posible fijación del melanismo por deriva genética. Esta hipótesis prevé: 1) Una reducción de la variación genética en las poblaciones melánicas. 2) Bajos niveles de flujo génico entre las poblaciones, posibilitando que la deriva se sobreponga a los efectos homogenizadores del primero. Métodos y Resultados Para poner a prueba esta hipótesis, se analizaron 11 loci microsatelitales en 150 individuos de C. rionegrensis pertenecientes a 8 poblaciones donde se encuentran representados los tres tipos de pelaje, tanto en alopatría como en simpatría (ver mapa). 1) Se calculó la heterocigosis promedio observada Ho y la esperada He para cada población y los estadísticos F de Wright. Actividad 1) - Calcular los F IS para cada población. 2) Los niveles de flujo génico, globales y entre pares de poblaciones fueron estimados de dos formas: a) Niveles globales - a partir de F ST, mediante la formula Nm = (1/F ST -1)/4. Se obtuvo Nm= b) Estimaciones pareadas - a partir de F ST calculados para pares de poblaciones, y Para evidenciar si existe un patrón de aislamiento por distancia, se construyó también un gráfico, con los valores de flujo génico entre pares de poblaciones (los calculados a partir de F ST ) en función de la distancia geográfica que las separa (fig. 2). 17

18 Figura 2. Gráfica del logaritmo de número de migrantes, expresado como Nm, en función del logaritmo de las distancias geográficas. Los círculos y los triángulos denotan estimaciones basadas en microsatélites y citocromo b, respectivamente Además de los microsatélites, se analizó otro marcador, el gen del citocromo b del ADN mitocondrial. Se obtuvieron las distintas variantes de las secuencias (haplotipos) y se estudió su frecuencia, su relación con la procedencia de la muestra y la relación entre ellas (fig 3). Figura 3. Red de distancias mínimas para los 15 haplotipos de citocromo b encontrados. Cada haplotipo se representa con un círculo, cuya área es proporcional a la frecuencia. Sobre las líneas que conectan haplotipos, los cambios están marcados como rayas transversales. 18

19 Actividad 2) Qué sugiere el gráfico de flujo génico en función de distancias geográficas para pares de poblaciones? (vea también la Fig. 3) Actividad 3) Las estimaciones de flujo génico obtenidas, corresponden a métodos directos o indirectos? Tiene esto alguna implicancia para nuestros resultados? Un estudio anterior que considera algunas de las mismas poblaciones y que emplea marcadores alozímicos, propone una estimación de Nm 6 a 10 y los siguientes valores de F IS : Localidad Abrojal Guarida Mafalda Las Cañas Nuevo Berlín F IS 0,365 0,577 0,312 0,349 0,242 Actividad 4) Discutir a que pueden atribuirse las discrepancias entre ambas aproximaciones al mismo problema. Actividad: Evaluando la totalidad de los resultados presentados, acepta o rechaza la hipótesis de que el melanismo se fijó por deriva en algunas poblaciones? Qué interpretación plantearías para explicar el patrón de estructura poblacional encontrado? 19

20 Práctico Nº 5 Selección Natural Objetivo Familiarizarse con el concepto de selección natural y algunos métodos para detectar su acción en distintos tipos de datos. Parte I. Estimación de eficacia y coeficiente de selección a partir de datos de campo. El tucu-tucu de Río Negro presenta fenotipos melánicos y agutís, con frecuencia coexistiendo en suelos arenosos. El fenotipo melánico debiera ser más fácilmente detectable, y por tanto sufrir mayor mortalidad por depredación. Un estudio de la población de Estancia La Tabaré, Depto. de Río Negro, obtuvo 74 juveniles en una estación reproductiva: algunos en trampas colocadas dentro de las cuevas y otros en bolos regurgitados en torno a un nido de lechuzas de tierra (Athene cunicularia) localizado en el mismo campo 1. C. rionegresis Athene cunicularia En la siguiente tabla, se estima la supervivencia de cada fenotipo descontando los observados en bolos de lechuza del total de juveniles de cada fenotipo 2 : Fenotipos Total de juveniles Sobrevivientes agutís melánicos Eficacia absoluta Eficacia relativa (w) Coeficiente de selección (s) s (%) a) Calcular la eficacia absoluta (fracción de sobrevivientes), la eficacia relativa w (cociente entre eficacia absoluta de un fenotipo y la correspondiente al fenotipo más apto) b) Calcular el coeficiente de selección (s) para cada fenotipo. Qué significan en términos biológicos los coeficientes de selección calculados? 1 Vasquez Herrera, A Posible depredación diferencial sobre individuos agutís y melánicos de Ctenomys rionegrensis, reflejada en bolos de Athene cunicularia. Informe de Pasantía, Licenciatura en Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, 35 pp. 2 Datos adicionales: De los 50 bolos estudiados, 26 contenían restos de tucu-tucus. De éstos, fue posible determinar el color del pelaje en 17. El estudio mencionado incluye una prueba de χ 2 con un p-valor de 0,14, que no muestra diferencias significativas en la distribución de agutís y melánicos al comparar las colectas en las cuevas con los observados en los bolos. 20

21 Qué utilidad, y qué limitaciones, tienen estos resultados para entender la posible mortalidad diferencial de los dos fenotipos por causa de la depredación? Qué utilidad, y qué limitaciones, tienen estos resultados para entender la eficacia darwiniana general de estos fenotipos? Si la mortalidad diferencial de juveniles fuese un fenómeno real, cómo podría explicarse la persistencia del fenotipo melánico, y qué estudios podrían hacerse para avanzar en la comprensión del problema? Parte II. Detección de la selección natural a nivel molecular Cuando la selección natural actúa sobre las poblaciones, deja huellas que pueden ser reconocidas en el ADN. Para identificar esas huellas se han desarrollado diferentes pruebas aplicables a secuencias nucleotídicas codificantes de proteínas. Una aproximación robusta y sencilla desarrollada por McDonald y Kreitman es considerar que, bajo neutralidad, la relación entre la tasa de cambio nucleotídico sinónimo (ds) y no sinónimo (dn) o de reemplazo aminoacídico será la misma dentro y entre poblaciones. Cualquier desviación sugiere un apartamiento de la neutralidad, incluyendo algún tipo de selección positiva. Si no se cuenta con información poblacional, otra aproximación muy utilizada aunque exigente es considerar que, bajo neutralidad estricta, ambas tasas deberían ser iguales, por lo que dn/ds, también conocido como ω será 1. Si dn supera ampliamente ds, es decir si ω>1, se asume que actuó selección positiva (el caso inverso, ω<1 indicaría selección purificadora). En el este práctico aplicaremos ambas aproximaciones. Test de McDonald y Kreitman Cuando McDonald y Kreitman en 1991 propusieron su test de neutralidad, lo aplicaron a un conjunto de secuencias de la enzima Alcohol deshidrogenasa (Adh), para tres especies diferentes. La figura 3 muestra el resumen de los sitios variables de las secuencias incluidas en la base de datos por ellos utilizada. a) Interprete la tabla siguiente: qué hay en las filas y las columnas? b) Completar con valores tomados de la figura 3 las tablas que se encuentran a continuación. Reemplazo Sinónimos Reemplazo Sinónimos D.simulans vs. D.yakuba Sustituciones Polimorfismos D.melanogaster vs. D.yakuba Sustituciones Polimorfismos c) Reemplazo Sinónimos D.melanogaster vs. D.simulans Sustituciones Polimorfismos Utilizado las tablas anteriores ya completadas, realizar el test de McDonald_Kreitman y sacar conclusiones. 21

22 Resumen de los sitios variables de las secuencias de Adh usadas por McDonald y Kreitman (1991) para proponer su test de neutralidad. La primera columna a la izquierda indica la posición del sitio en cuestión, la segunda es la secuencia consenso de referencia; : nucleótido idéntico a dicha secuencia. D. melanogaster, Adh S (a-f) y Adh F (g-k). D yakuba, sitios subrayados son heterocigotas (variante de referencia y esa). 22

23 Variación en el ω entre sitios y entre linajes Usaremos secuencias de la lisina espermática de 25 especies de abalones (Haliotis) y estimaremos las tasas dn y ds y su relación mediante máxima verosimilitud. Estas estimaciones pueden ser realizadas para cada codón y/o linaje, considerando una filogenia que permita estimar las secuencias de los nodos ancestrales. Utilizaremos la aproximación Branch-REL (Random effects likelihood) implementada en el programa DataMonkey ( a) Ir a e identificar las posibles prestaciones de este servidor b) Opción Analize your data, seleccionar el archivo Lysin_Tree.nex, que incluye la base de datos nucleotídica y el árbol filogenético a considerar en formato nexus. Manteniendo las opciones por defecto, cliquear en Upload. c) Corroborar los datos de los archivos, y cliquear en Proceed to the analysis menu d) Seleccionar el método a usar y especificar que lo haga con el árbol cargado en el archivo e) El resultado demorará unos minutos. Mientras espera los resultados reflexione y comente cuál podría ser una presión selectiva importante en la evolución de este gen f) Una vez obtenidos, interprete los resultados. Compare los valores obtenidos de dn y ds. Existe algún sitio y/o linaje seleccionado? Ha actuado la selección positiva o negativa y en qué proporciones? Los resultados están de acuerdo a lo esperado? g) En la figura 2 están resumidos los resultados obtenidos por Yang et al con las mismas secuencias. Son compatibles con los obtenidos por Ud.? h) Qué similitudes y diferencias encuentra entre esta aproximación y el test de M&K? Figura 2. Figura tomada de Yang y Bielawski 2000, modificada de Yang et al

24 Práctico Nº 6 Evolución molecular Objetivos A partir del análisis del patrón de sustituciones nucleotídicas de una secuencia codificante en un grupo taxonómico particular: 1) visualizar patrones generales de evolución molecular y 2) discutir la validez y el alcance de la idea de reloj molecular, identificando factores que pueden producir desviaciones aparentes del mismo. Introducción Datos El archivo Primates_datos.meg contiene los 1000 primeros sitios del gen del citocromo b del ADN mitocondrial de 13 especies de primates. Clasificación de los primates considerados en este práctico Suborden Familia Género Nombre común Distribución Strepsirrhini Lemuridae Lemur Microcebus lemur Madagascar Platyrrhini Cebidae Cebus mono capuchino Saimiri mono ardilla Neotrópico Catarrhini Cercopithecidae Papio babuino Macaca macaco Africa Hylobatidae Hylobates gibón Asia, Indonesia... Hominidae Pongo orangután Borneo Gorilla gorila Africa Pan chimpancé Africa Homo humano cosmopolita Tiempos de divergencia Datos paleontológicos sugieren los siguientes tiempos de divergencia 3 desde el ancestro común (dados en millones de años desde el presente): 58 Lemuridos vs. los restantes primates 40 Platirrinos vs. Catarrinos 15 Orangután vs. restantes homínidos 6 Gorila vs. chimpancés y humanos 3 En la discusión sobre el reloj molecular y temas relacionados se habla de divergencia para referirse al cambio total que ha ocurrido en la evolución de dos especies desde su ancestro común. Este cambio se cuenta, por tanto, a lo largo de dos líneas evolutivas, bajo la hipótesis del reloj molecular la tasa de divergencia de un gen o región cualquiera es el doble que la tasa de evolución. 24

25 Actividades a realizar Parte I Usar el programa Mega 5.2 Una vez abierto la base de datos primates_datos.meg en el programa MEGA 5, realizar las siguientes actividades. I.a Por qué será útil indicarle al programa el carácter codificante de la secuencia? y que el origen de la secuencia sea ADN mitocondrial de mamíferos? I.b Las secuencias aminoacídicas son más o menos informativas que las secuencias nucleotídicas? I.c Obtener una filogenia usando el criterio de Máxima Parsimonia (utilizando las opciones que vienen por defecto). Definir como grupo externo a Lemuridae, reportar el índice de consistencia (en i > general). Qué información aporta este índice a cerca de la filogenia? I.d Representar el árbol anterior como filograma (por defecto aparece un cladograma). Reportar si existen diferencias entre grupos en la tasa de evolución y reflexionar las posibles causas que pueden producirlas. I.e Obtener una tabla de distancias absolutas pareadas. Escoger en el menú la opción Distances, Compute Pairwise y elegir la opción Model / Nucleotide / No. of Differences. Visualizar las otras opciones. I.f Observar la copia de la matriz obtenida anteriormente que se encuentra a continuación. Luego: a) Completar la información ausente, b) en la matriz reconocer los recuadros para las 2 comparaciones con que se cuenta con información paleontológica. Número total de diferencias (en 1000 sitios) Lemur catta - 2 Microcebus grise Macaca mulatta Papio hamadryas Cebus albifrons Saimiri sciureus - 7 Hylobates agilis Hylobates lar Pongo pygmaeus Gorilla gorilla Homo sapiens Pan paniscus Pan troglodytes

26 Parte II Usar el programa Excel II.a Abrir el archivo distancias primates.xls. Encontrará el número de diferencias discriminado entre las posiciones del codón, así como transiciones y transversiones, obtenidos de la forma anterior. Estas distancias pareadas se han graficado para cada uno de los tiempos de divergencia. Observe los rangos de valores para cada una de estas medias, y saque conclusiones de las dos gráficas. II.b Pensar, discutir y responder: para el caso de la cantidad de cambios según las posiciones del codón, qué gráfico esperaría obtener según el reloj molecular? Se ajustan en apariencia las gráficas a la idea del reloj molecular? Qué factores pueden dar cuenta de las variaciones observadas? Cómo pueden explicarse estas tasas en términos neutralistas? II.c De ser posible, estimar el tiempo de divergencia de los gibones y los homínidos. Actividad: Mencione los problemas asociados a la estimación del tiempo de divergencia entre gibones y homínidos, realizada anteriormente. De encontrarse un pseudogen del citocromo b para estas especies, discuta cómo espera que sea el patrón de sustituciones nucleotídicas en esta secuencia. Bajo neutralidad es esperable obtener un gen, o región de un gen, con mayor cantidad de cambios no sinónimos que sinónimos, qué interpretación podría darle a este fenómeno? 26

27 Práctico N 7 Familias multigénicas. Globinas Objetivo Mediante el estudio los genes de Globinas en primates, familiarizarse con la identificación de familias multigénicas, su problemática y limitaciones. Introducción Una familia génica o familia multigénica es un grupo de loci cromosómicos cuya secuencia de nucleótidos es similar y derivan de una secuencia común ancestral. Puede incluir copias de genes ligeramente diferentes y/o pseudogenes más variables, en uno o varios cromosomas. Grupo heme Hemoglobina Citoglobina Los genes codificantes para las Globinas representan un ejemplo clásico de familia multigénica. En general, estas proteínas portan un grupo heme y se caracterizan por unirse y transportar oxigeno. Presentan dominios homólogos en varios taxa: a) hemoglobinas tetraméricas de vertebrados (componente proteico principal de los eritrocitos), b) flavohemoglobinas en microorganismos, c) hemoglobinas homodiméricas bacterianas, d) leghemoglobinas en plantas (asociadas al metabolismo del nitrógeno en plantas con rhizomas), e) hemoglobinas de invertebrados, f) mioglobinas monoméricas usualmente encontradas en el músculo animal entre otras. En primates existen varias clases de globinas dentro de la familia, generalmente designadas con letras griegas (por ejemplo, α, β, γ, δ, ε, ξ y Mioglobina MB). Recientemente se ha identificado una nueva clase, la citoglobina (CYGB). En humano, el gen que la codifica parece expresarse en todos los tejidos y se localiza en el brazo largo del par cromosómico 17. Se sugiere que su tamaño está conservado en varios mamíferos y es de 190 aminoácidos. Figura 1 - Localización de los genes codificantes para globinas en humanos. Localización de los genes codificantes para globinas en humanos. Localización de los genes codificantes para globinas en humanos. 27

28 Parte I: Conceptos generales. a. Qué procesos podrían estar involucrados en la aparición de las familias multigénicas? b. Qué ventajas conferirían estas familias génicas? Parte II: Análisis del alineamiento de secuencias proteicas de globinas, identificación de regiones conservadas. Cargue el alineamiento en el programa MEGA (Alignment/Align_Explorer/Retrieve./ Globinas(aa).fas). Alinear. c. Identifique los sitios conservados en todas las secuencias y sugiera su posición en la proteína. Justifique. d. Visualiza algún patrón particular en la secuencia de estas proteínas? Interprete. e. Opcional: Una forma de identificar a que corresponden dichas regiones es mediante la base del genbank, Conserved Domain Database (CDD). La búsqueda de dominios similares en tu secuencia esta automáticamente incorporada al blastp. 1. Selecciones y recorte (ctr + c) la región conservada (al menos 50 aa.) en una de las secuencias y haga un blastp (blast de sec. aminoacidicas) contra la base de datos del genbank ( A qué corresponde dicha región? Parte III: Reconstrucción filogenética de las globinas. Cargue los datos en el programa MEGA (File / Open Data/ Globinas(nt).meg). Esta base de datos tiene las secuencias codificates (ADNc) reportadas de genes miembros de la familia de las globinas en los siguientes primates: Homo sapiens, Gorilla gorilla, Pongo abelii, Macaca mulatta, Callithrix jacchus, Papio anubis, Pan troglodytes, Microcebus murinus y Otolemur garnettii (ver Figura 2). Callithrix jacchus Papio anubis Macaca mulatta Gorilla gorilla Homo sapiens Pan troglodytes Pongo abelii Microcebus murinus Otolemur garnettii Figura 2 - Cladograma de las especies incluidas f. En base a los datos disponibles (ver Fig 1 y 2), cómo piensa usted que ocurrió la evolución de las diferentes clases dentro de la familia? Genere un esquema. 28

29 g. Realice la reconstrucción filogenética en base a los datos que se le brindan (Método Neighbor-Joining, Gaps Pairwise deletion, Bootstrap 1000 réplicas). 1. Son los resultados coincidentes con el esquema que usted generó? 2. Identifique aquellos nodos que se corresponden con eventos de especiación y/o duplicación. 3. Analice e interprete algunos casos particulares: 1. clase delta en humanos 2. ausencia de γ-globina en M. murinus y O. garnettii 3. ausencia de µ-globina en M. murinus 4. relación de las citoglobinas con las otras globinas 4. Si le interesara, en cuál cromosoma buscaría la µ-globina en humanos? 5. Qué información adicional sería útil para establecer el origen de un nuevo gen de globinas? Parte IV: Estimación del parámetro ω (dn/ds) entre clases y dentro de las clases. Los genes ya están agrupados en las clases correspondientes en la base de datos. Calcular las distancias media dentro y entre clases (Distances/Compute within group mean y Distances/Compute between group mean), incluyendo sustituciones sinónimas (ds) y no-sinónimas (dn), estimadas con el modelo de Kumar y Gaps Pairwise deletion. h. Cuál espera sea el resultado dentro y entre clases? Por qué? Qué relación tiene esto con el árbol reconstruido? Cómo piensa que será la estimación de la tasa sinónima y por qué? i. A partir de los valores de distancia media sinónima y no-sinónima calcule la relación entre ellas ( dn/ds) dentro de las clases y entre cases, y tome nota. j. Interprete ambos resultados, relacione los mismos con procesos evolutivos dados en clase. 29

30 Práctico Nº 8 Genómica comparada Objetivo Mediante la comparación de dos genomas completos de bacterias cercanamente emparentadas, una infecciosa y otra no, se pretende destacar las potencialidades de la genómica comparada como herramienta para poner a prueba hipótesis en biología evolutiva. Introducción Listeria monocytogenes es un patógeno intracelular causante de listeriosis, tanto epidémica como esporádica. Es una enfermedad transmitida por el alimento, particularmente peligrosa en recién nacidos, ancianos, embarazadas y pacientes inmunodeprimidos. Una vez ingerida, se dirige desde el lumen intestinal hacia el sistema nervioso y a la placenta, causando meningitis, meningo-encefalitis, septicemia, aborto espontáneo, infecciones perinatales y gastroenteritis. Se ha encontrado en varios animales domésticos y en un amplio rango de condiciones (temperatura, salinidad, etc.), incluso extremas. Poco se conocía sobre las bases moleculares de su patogenicidad, hasta que en 2003 fue secuenciado completamente su genoma y el de una especie cercanamente emparentada no patógena, L. innocua. Buchrieser y cols. (2003), plantean que la patogenicidad de L. monocytogenes se debe a la adquisición (por transferencia horizontal), de genes de proteínas de superficie, en particular internalinas, InlB (necesarias para entrar a las células eucariotas) o ActA, que juega un papel clave en la movilidad basada en actina. Así mismo, ambas especies presentan un conjunto de genes homólogos a los de Salmonella que les permitirían tener metabolismo anaeróbico. Parte I. Familiarización con el programa. Abrir el programa Artemis Comparison Tool (ACT) y cargar en éste tres archivos en este orden: secuencia de L. innocua, la comparación entre L. innocua y L. monocytogenes, secuencia de L. monocytogenes (esas secuencias con su descripción se bajan de internet en forma gratuita). Una vez abierto reconocer las diferentes regiones: secuencia de L. innocua (arriba), la comparación (medio) y la secuencia de L. monocytogenes (abajo), acercamiento y desplazamiento (locked). Trabajar con una de las secuencias. Trabajar con una de las secuencias, por ejemplo, la de L. innocua. Se sugiere realizar la siguiente secuencia de pasos: 1) Poner el máximo de aumento y visualizar los tres marcos de lectura. Con las opciones del botón derecho del mouse -BD, active y desactive diferentes funciones (Ej.: codones stop). 2) Desactivar la anotación automática (BD, Entries, desmarcar el archivo.embl), y moverse sobre la secuencia. 3) Identificar los marcos abiertos de lectura (Open Reading Frames: ORFs). 4) Verifique que los ORF por Ud. identificados se corresponden con genes ya anotados, volviendo a activar el archivo.embl. Identificar la orientación de los mismos. Cuente el número de genes en cada organismo (View / L_innocua / Overview) y proponga mecanismos que expliquen la diferencia en el número de genes. 30