CINÉTICA DE OXIDACIÓN DEL HEXADECANO POR BACTERIAS AISLADAS DE ECOSISTEMAS MARINOS.

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1 CINÉTICA DE OXIDACIÓN DEL HEXADECANO POR BACTERIAS AISLADAS DE ECOSISTEMAS MARINOS. *Yoania Cabranes Campos, *Roberto Núñez Moreira, *Eudalys Ortiz Guilarte, **Jorge Martínez Silva. *Centro de Bioproductos Marinos (CEBIMAR). Ciudad de La Habana, Cuba. **Facultad de Biología, Universidad de La Habana. Ciudad de La Habana, Cuba. RESUMEN La contaminación del ambiente marino por idrocarburos del petróleo, es cada vez más alarmante por los nefastos daños que ocasiona. El departamento de Microbiología Aplicada del Centro de Bioproductos Marinos a desarrollado bioproductos para combatir los derrames de petróleo, uno de los cuales está formado por las bacterias degradadoras Bacillus alcalopilus cepa CBM-225 y Bacillus liceniformis cepa CBM-60. Con el objetivo de determinar la composición optimizada del bioproducto ante un derrame de idrocarburo y propiciar un aorro de tiempo y recursos, nos emos propuesto conocer las potencialidades degradativas de estas cepas. En el análisis degradativo del n-exadecano por la cepa CBM-60 se determinaron los parámetros cinéticos del crecimiento por el método de Lineweaver-Burk (Cávez y cols., 1990), obteniéndose una velocidad específica de crecimiento máxima de 0,302 ± 0,096-1 y una constante de afinidad de 4,040 ± 0,096 gl -1. Al comparar estos parámetros cinéticos con los alcanzados para la cepa CBM-225 (0,217 ± 0,116-1 ; 11,670 ± 0,116 gl -1 ) (Cabranes, 2005), se observó que la cepa CBM-60 mostró una velocidad específica de crecimiento máxima mayor y una constante de afinidad menor por el n-exadecano. Además, la cepa CBM-60 no manifestó inibición de su crecimiento asta 60 gl -1 de concentración de n-exadecano, mientras que la cepa CBM-225 se inibió a partir de los 22 gl -1. Bacillus liceniformis cepa CBM-60 presenta una mayor afinidad por este idrocarburo. PC: ecosistemas marinos, exadecanato cinética, bacterias aisladas INTRODUCCIÓN El Centro de Bioproductos Marinos (CEBIMAR) cuenta con una Colección de Bacterias Marinas (CBM), a partir de la cual se an obtenidos diferentes bioproductos para combatir los derrames de petróleo tales como el cultivo mixto A-5, CBM-225, BIOIL y BIOIL-FC. El BIOIL-FC a sido empleado en numerosos tratamientos en el país con resultados satisfactorios (Núñez y cols., 2003). El departamento de Microbiología Aplicada se a propuesto realizar el análisis cinético y bioquímico de los procesos de degradación de las cepas de este bioproducto, lo cual permitirá definir la composición y relación de las mismas ante un derrame de petróleo. Con tal propósito se trazó como objetivo: Evaluar la cinética del crecimiento de Bacillus liceniformis cepa CBM-60 en un idrocarburo tipo del petróleo, el n-exadecano y compararla con la de Bacillus alcalopilus cepa CBM-225. MATERIALES Y MÉTODOS Microorganismo empleado El trabajo fue realizado con Bacillus liceniformis cepa CBM-60, aislada de los sedimentos de la baía de Cárdenas, Matanzas perteneciente a la CBM del CEBIMAR. Medios de Cultivo

2 En la conservación de la cepa CBM-60 se utilizó el medio 6 agarizado para bacterias marinas eterótrofas según Gorbienko (1961) y la fermentación para la obtención de la biomasa microbiana se realizó según Ortiz (2004). Medio de degradación de n-exadecano El medio de degradación corresponde al medio de Rontani y cols. 1986, modificado por Núñez, Se utilizaron concentraciones de n-exadecano (Merck-Scucardt, 99 % de pureza) de 5, 10, 20, 30, 40 y 60 gl -1. Condiciones de cultivo Los experimentos se desarrollaron a partir de cultivos de 24 en cuñas de medio Agar Nutriente. Con este cultivo se obtuvo el preinóculo en el medio de fermentación (Ortiz, 2004). Luego de 24 oras se inocularon a concentración inicial de 10 6 celml -1 en los medios de degradación y se tomaron muestras cada cuatro oras. Todos los experimentos fueron desarrollados a escala de zaranda orbital rotatoria Infors a 125 r.min -1 y 30 ºC. Crecimiento microbiano en medio de degradación de idrocarburos La determinación del crecimiento microbiano se realizó mediante el conteo total de células en cámara de Neubauer (Martínez y cols., 1989). Determinación de los parámetros cinéticos del crecimiento Para cada una de las concentraciones de sustrato fue calculada en la fase exponencial la velocidad específica de crecimiento (µ) de la cepa CBM-60 según López y Gódia, A partir de ellas fueron estimados los valores de velocidad específica de crecimiento máxima (µmax) y de la constante de afinidad (Ks) mediante la transformación lineal de Lineweaver-Burk (Cávez y cols., 1990). Tratamiento estadístico de los resultados En todos los casos una vez que fue verificado el cumplimiento de la distribución normal de los datos según Kolmogorov Smirnov y la omogeneidad de varianzas por el método de Bartlett, se realizó el análisis de varianza de clasificación simple y la prueba de comparación de medias de rangos múltiples de Duncan (Lerc, 1977). Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y los resultados fueron procesados con el paquete estadístico Statistica 4.0 y/o Excel 7.0 para Windows. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Estudio de cinético del crecimiento de la cepa CBM-60 con n-exadecano En la figura 1 se refleja el comportamiento de los valores experimentales de µ para la cepa CBM-60 y los de µ determinados por el modelo de Monod con respecto a la concentración de n-exadecano.

3 0.35 µ ( -1 ) c d e f g 0.10 b 0.05 a µ experimental µ Monod Conc.Hexad. (g.l -1 ) Figura 1. Comportamiento dinámico de los valores de µ experimentales y los calculados por el modelo de Monod con respecto a la concentración de n-exadecano para la cepa CBM-60 (P<0,05, n=3). En esta figura se observa un aumento lineal de µ entre cero y 7 gl -1 de concentración de n-exadecano, donde alcanza un valor de 0,210-1, luego continúa aumentando asta valores de 0,280-1 a los 27,5 gl -1. Posteriormente los valores de µ se mantienen prácticamente constantes, sin presentar diferencias estadísticamente significativas (representado por la misma letra) asta los 60 gl -1 de n-exadecano, lo que muestra una zona de saturación de los procesos de degradación. En la zona de no saturación se determinaron los parámetros cinéticos de µmax y Ks, los cuales se compararon estadísticamente con los de la cepa CBM-225 (Cabranes, 2005), donde se observó que existieron diferencias significativas representada por diferentes letras (tabla I). Los parámetros cinéticos se evaluaron en la expresión que representa el modelo de Monod (figura 1) y se corroboró que dico modelo se ajustó matemática y fisiológicamente a los datos experimentales, al presentar un comportamiento de ipérbole rectangular igual que la ecuación deducida por Micaelis y Menten para una reacción enzimática monosustrato. Tabla I. Parámetros cinéticos del crecimiento de la cepa CBM-60 y CBM-225 consumiendo n-exadecano en la zona de no saturación (P<0,05, n=3). microorganismos µmax ( -1 ) Ks (gl -1 ) Bacillus alcalopilus 0,217 b ± 0,116 11,670 a ± 0,116 Bacillus liceniformis 0,302 a ± 0,096 4,040 b ± 0,096 Las cepas CBM-60 y CBM-225, producen compuestos con actividad superficial en medios de degradación con agua de mar y n-exadecano como única fuente de carbono y de energía (Almazán, 2004). Estos compuestos favorecen la formación de emulsiones de idrocarburo, la adesión y colonización de la interfase y permite la incorporación del idrocarburo a la célula, garantizando los procesos de oxidación asta formas no contaminantes (Rojas y cols., 2003). La cepa CBM-60 presentó una µmax mayor que la cepa CBM-225 (tabla I), lo que significa que la primera creció más rápido en el medio de degradación con bajas concentraciones de n-exadecano, alcanzando mayor valor de µ a la misma concentración de este. Esto pudiera estar dado a que el compuesto tensioactivo que produce la cepa CBM-60, posee una mayor actividad superficial o es producido en mayor concentración que la cepa CBM-

4 225. Además, de que el mecanismo de transporte del idrocarburo al interior celular pudiera ser más eficiente para la cepa CBM-60 y siendo éste el paso determinante en la degradación de idrocarburos alifáticos para algunas bacterias (Goswami y Sing, 1991), se facilitaría la incorporación del n-exadecano y también su crecimiento con respecto a la cepa CBM-225. Estos valores se corresponden con el menor valor de Ks obtenido para la cepa CBM-60, o sea una mayor afinidad por el idrocarburo, con respecto a la cepa CBM-225. La cepa CBM-225 a partir de los 22 gl -1 de concentración de n-exadecano manifestó inibición de su crecimiento con una disminución de los valores de µ de 0,16 a 0,088-1 (Cabranes, 2005). Sin embargo, los procesos metabólicos, de síntesis de tensioactivos y de transporte de idrocarburos y metabolitos para el crecimiento de la cepa CBM-60, no se inibieron por ningún intermediario de la degradación del idrocarburo. Debido a que esta cepa puede ser menos sensible a la influencia negativa de las altas concentraciones del mismo o porque el mecanismo de degradación es diferente que el de la cepa CBM-225. Incluso, el mecanismo de transporte del idrocarburo al interior celular puede ser distinto para ambas cepas y solo encontrarse inibido para la cepa CBM-225 (Cabranes, 2005). CONCLUSIONES 1. Bacillus liceniformis cepa CBM-60 es capaz de degradar el n-exadecano como única fuente de carbono y energía. 2. Bacillus liceniformis cepa CBM-60 presentó una velocidad específica de crecimiento máxima y afinidad mayor por el n-exadecano con respecto Bacillus alcalopilus cepa CBM-225, no reflejando inibición de su crecimiento a las concentraciones de exadecano estudiadas. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Cabranes, Y. (2005). Cinética de Degradación de Bacillus alcalopilus cepa CBM-225 en idrocarburos del petróleo. Tesis de Maestría. Facultad de Biología. Universidad de La Habana. Cavez, P. M.; Díaz, D. J.; Pérez, L. V.; Delfín, G. J. (1990). Temas de Enzimología. Tomo I. Facultad de Biología. Universidad de La Habana. Gorvienko, Y. A. (1961). Sobre las ventajas cualitativas del agar nutriente en medios de cultivos para microorganismos eterótrofos. Mikrobiol. 30(1) Goswami, P.; Sing, D. (1991). Different Modes of Hydrocarbon uptake by two Pseudomonas species. Biotecnology and Bioengineering. 37:1-11. Lerc, G. (1977). La experimentación en las ciencias biológicas y agrícolas. Editorial Científico Técnica. La Habana. Capítulo 16: Análisis de Varianza. Clasificación triple: López, J.; Gódia C. F. (1998). Ingeniería Bioquímica. 1 ra Edición. Ed. SINTESIS, S.A. Martínez, J.; Sáncez, A. I.; Quintana, M.; Pazos, V.; Del Barrio, G. (1989). Microbiología General. Editorial Pueblo y Educación. 3: 31-55, Núñez, R. (2003). Obtención, caracterización y aplicación de un bioproducto bacteriano para la bioremediación de derrames de idrocarburos. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana. Cuba.

5 Ortiz, E. (2004). Obtención de un tensioactivo a partir de una bacteria marina para la biorremediación de la contaminación con idrocarburos. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana. Cuba. Rojas, A. G.; Rodríguez, V. R.; Martínez, C. J.; Zermeño, E. L. (2003). Levels of polyclorinated bipenyls in mexican soils and teir biodegradation by bioaugmentation. Bulletin of Toxicology and Contamination. 70: Rontani, J.F.; Bertrand, J.C.; Blanc F.; Giusti G. (1986): Gas cromatograpic and gas cromatograpy/ mass spectrometry applied to te determination of to new patway of pristane degradation by to marine mixed bacterial population. Mar.Cem., 18: 9-16.