CLASE CICLO CELULAR, CROMATINA Y CARIOTIPO NORMAL

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1 CLASE CICLO CELULAR, CROMATINA Y CARIOTIPO NORMAL DOCENTE: PATRICIA ESCORCIA MORA TEMAS A TRATAR CICLO CELULAR INTERFASE MITOSIS MEIOSIS LA CROMATINA NUCLEOSOMA FIBRA DE CROMATINA SOLENOIDE SUPRAEMPAQUETAMIENTO EL CARIOTIPO NORMAL LA SIEMBRA EL PROCESAMIENTO EL ANALISIS TIPOS DE BANDEO LOS POLIMORFISMOS CICLO CELULAR La célula como unidad de vida que es tomada desde su concepción más simplista, se encuentra sometida a una serie de transformaciones y cambios que suceden continua y periódicamente durante su tiempo de vida, permitiéndole crecer, madurar, especializarse, dividirse entre muchas otras cosas. Esta alternancia de eventos constituyen lo que se denomina ciclo celular. (4,7). Para que una célula se desarrolle, tres cosas deben ocurrir: la masa celular debe incrementarse, debe haber una duplicación del material genético y debe haber un proceso de división que asegure que cada célula hija recibe un complemento igual e idéntico del material genético para asegurar la perpetuación de su línea.(7). En la mayoría de las células eucariota, por ejemplo se da un ciclo celular que evidencia dicha progresión de eventos a través de 2 etapas fundamentales de División y no división. La de división está relacionada a su vez con dos procesos el de Mitosis y el de Meiosis y la de No División con el de interfase.(ver Diapositiva 3). INTERFASE Anteriormente se creía que la interfase era dedicada solamente al crecimiento y al cumplimiento de las funciones celulares normales. Sin embargo ahora se sabe también que interviene en un paso bioquímico crítico y en la preparación de la célula para que la división ocurra. Se han descrito entonces 4 fases:

2 El período presintético o G1 ( GAP 1): se caracteriza por el crecimiento e incremento en la masa celular que ocurre siguiendo la división celular precedente, por la proliferación de las constituyentes citoplasmáticas como RNA, organelos, membranas y ribosomas y porque la información Genética se observan constituida por una simple cromátida altamente descondensada (cromatina). El período sintético o S: en la cual el material genético de cada cromátida es replicado, de tal forma que se obtienen copias exactas denominadas Cromátides Hermanas. El período pos-sintético o G2 (GAP 2): considerado como el segundo período de crecimiento celular dado que el volumen citoplasmático de tales células, se iguala al de la célula que las originó; mientras que los cromosomas habiendo ya sufrido su duplicación aparecen formados por dos cromátidas unidas por el centrómero. Cuando las células humanas crecen fuera del organismo en un cultivo in vitro, por ejemplo, se requieren 24 horas en promedio para que se produzca un ciclo celular completo; (los tiempos reales varían según las líneas celulares estudiadas), y la mayor parte del tiempo se consume en la interfase, dado que la etapa de división tarda menos de 1 hora.(4,8). En muchos tipos celulares la longitud de S y G2 depende del tiempo empleado en la G1, puesto que en un punto tardío de ésta etapa las células deben escoger 1 de 2 caminos posibles: Alejarse del ciclo celular para hacerse quiescentes en una fase que se llama G0 (Gap 0) donde permanecen viables y metabólicamente activas aunque no son proliferativas. Algunas entran en esta etapa permanecen un tiempo y salen y otras entran pero nunca reingresan al ciclo nuevamente (como las células diferenciadas-neuronas). También pueden Iniciar la síntesis de DNA y dar paso a los otros procesos para continuar el ciclo celular.(4,8). MITOSIS La Mitosis fue primero descrita en 1879 por Walter Flemming como la base de la etapa de división del ciclo celular de células somáticas. Es un proceso crítico para todos los organismos eucarióticos, porque entre muchas otras razones, provee la base para la reproducción asexual de muchos organismos unicelulares, es la base para el desarrollo y crecimiento de los organismos pluricelulares y es fundamental en la curación de heridas y el reemplazamiento de células en ciertos tejidos.(4,2). La división celular comprende dos procesos: La citocinesis: o repartición del volumen citoplasmático en dos partes, seguido por el encerramiento de ambas células hijas dentro de una membrana citoplasmática distinta, mientras que las organelas citoplasmáticas se originan a partir de estructuras membranosas pre-existentes, por autorreplicación o por síntesis de Novo.

3 La cariocinesis o repartición del material genético que está dentro del núcleo entre 2 células hijas. (Ver Diapositiva 7). La cariocinesis es más compleja y requiere una mayor precisión, ya que los cromosomas deben ser primero exactamente replicados y luego apropiadamente distribuidos para que al final cada una de las células hijas, presente una composición cromosómica idéntica a la célula parental. Por tal motivo la mitosis se describe formada por varias fases consecutivas definidas por las características morfológicas, estructurales y de comportamiento que van presentando los cromosomas a lo largo del ciclo. (Ver Diapositiva 13). (3,4). Estas son: Profase: ( 35 minutos) Al rededor de la mitad del proceso mitótico se emplea en esta etapa ya que significativos eventos tienen lugar en ella. En ésta etapa los cromosomas que ya se habían duplicado en el periodo S de la interfase, inician un progresivo empaquetamiento, de tal forma que al finalizar la etapa pueden ser visualizados como unidades discretas con apariencia de bastones conformados por 2 cromátidas unidas por un centrómero. Así mismo, la membrana nuclear y el nucleolo dejan de hacerse visibles, mientras que los centríolos migran por la periferia del núcleo hacia los polos opuestos de la célula para dar paso entre sí al huso acromático. (Ver Diapositiva 9). En una etapa tardía de la profase se ha definido una subetapa por las características de descondensación y definición de estructura que presentan los cromosomas. La prometafase, nombre como se conoce ésta subetapa, es muy utilizada para estudios de alta resolución, dado que los cromosomas están lo suficientemente descondensados como para evidenciar perfectamente su morfología y un mayor número de bandas en comparación con los métodos convencionales que utilizan cromosomas metafásicos. Metafase: ( 3 minutos ) Se caracteriza por la migración de los cromosomas al plano ecuatorial de la célula y su unión por el centrómero a las fibras del huso acromático por un punto específico el cinetocoro. Las cromátidas del cromosoma metafásico están fuertemente enrolladas y permiten visualizarlo como una entidad discreta que facilita el exacto conteo y análisis estructural. (Ver Diapositiva 10). Anafase: ( 3 minutos ) Ocurre la división longitudinal del centrómero lo que permite que cada cromátida hermana se separe y unida por su centrómero al huso acromático por un punto específico denominado Cinetocoro, migre hacia el polo opuesto de la célula, como resultado del acortamiento de los microtúbulos. Posteriormente aparece un anillo contráctil debajo de la membrana para iniciar la división. (Ver Diapositiva 11). Telofase: ( 17 minutos ) Ocurre cuando se completa el movimiento de las cromátidas hacia los polos y los microtúbulos se desensamblan. Luego el nucleolo comienza a reaparecer y las cromátidas se desenrollan y extienden totalmente haciéndose menos visibles. Se forman dos núcleos hijos cuando una membrana nuclear es reconstruida alrededor de cada

4 grupo de cromátidas (por el proceso de la cariocinesis). El citoplasma también completa su división (por el proceso de citocinesis) mediante el plegamiento total de la membrana por su parte media hasta obtener 2 células hijas con igual dotación cromosómica y de citoplasma que la célula parental, aunque el tamaño que presenta es ligeramente inferior. (Ver Diapositiva 12). (2,3,4). LA MEIOSIS En 1883, cuatro años después de que la mitosis fuera inicialmente descrita, Edouard Van Beneden descubrió el proceso de Meiosis (del griego que significa disminución) al observar en los huevos de los gusanos redondos (Áscaris), que contenían la mitad de cromosomas de las células somáticas y que el número característico de la especie era reestablecido en la fertilización. Además que la capacidad de los organismos sexuados de adquirir combinaciones génicas favorables se debía precisamente a una característica esencial de la meiosis, la recombinación, que reordena todo el genoma en cada generación, de modo que los gametos producidos llevan nuevas combinaciones génicas diferentes de las propias del organismo en donde ocurre la meiosis. (1,6). La meiosis, otro de los procesos que permiten la división celular, se produce exclusivamente en células de tipo sexual y presentan una serie de variaciones con respecto a la mitosis, que le confieren una gran importancia, por ejemplo, aporta el mecanismo que mantiene constante el número de cromosomas de generación en generación en las especies que presentan reproducción sexual y fomenta la diversidad genética gracias a la recombinación de los cromosomas, generado por el fenómeno de entrecruzamiento o mezcla de porciones maternas y paternas de los cromosomas homólogos (pareja de cromosomas que comparten la codificación de las mismas características, son similares en forma y tamaño y que provienen uno del padre y otro de la madre).(2,4). A diferencia de la mitosis, la meiosis permite la reducción del número de cromosomas por medio de dos sucesivas divisiones celulares, denominadas primera y segunda división meiótica en donde solo una de ellas, la primera, ha sido precedida de la duplicación de los cromosomas. PRIMERA DIVISIÓN MEIÓTICA: Es denominada también como División Reduccional, y comparada con la mitosis la meiosis I es más complicada y de mayor extensión, dado que la profase I se encuentra dividida en 5 subetapas consecutivas: Leptoteno, Zigoteno, Paquiteno, Diploteno y Diacinésis. Leptoteno En ésta subetapa la cromatina nuclear comienza a condensarse rápidamente pero los cromosomas no son lo suficientemente evidentes y su naturaleza doble no puede ser discernida. El microscopio electrónico muestra que ambos extremos de cada cromosoma (telómeros) están aún unidos a la envoltura nuclear.

5 Zigoteno Los cromosomas homólogos realizan la sinapsis, un fenómeno celular que consiste en el alineamiento y apareamiento específico de los dos miembros de cada pareja de cromosomas homólogos, de modo que todas las parejas (salvo la de los cromosomas sexuales en el varón) aparecen conformando un bivalente o tétrada (así llamadas porque cada cromosoma está constituido por dos cromátidas hermanas, cuatro en total). El mecanismo subyacente de esta sinapsis es la construcción de un aparato proteínico, llamado complejo sinaptonémico que ejecuta el apareamiento. Durante el zigoteno el nucleolo está aún visible y está asociado estrechamente con algunos de los bivalentes. Paquiteno Los bivalentes realizan el proceso de entrecruzamiento (crossing over) facilitado por la íntima relación en que se encuentran, de tal forma que dos cromátidas no hermanas ( una de cada cromosoma homólogo) intercambian su material genético. Una evidencia visual del entrecruzamiento son puntos específicos a lo largo del cromosoma con figura de X llamados Quiasmas. La recombinación meiótica consiste en un proceso de ruptura de dos moléculas de ADN homólogas, seguido de un intercambio de fragmentos entre ellas y una reconstitución de las dos moléculas que contienen partes intercambiadas. Diploteno Los bivalentes parecen repelerse ya que el centrómero de los cromosomas homólogos se apartan y aunque siguen enfrentados solo quedan unidos por los quiasmas formados. El diploteno en algunos animales es una subetapa extremadamente larga, por ejemplo en los humanos de sexo femenino los óvulos inmaduros permanecen suspendidos en éste estado hasta que se el período de la pubertad, cuando en cada ciclo menstrual un huevo continúa su proceso de meiosis y se madura en las trompas de Falopio, sin embargo la meiosis nunca es completada a menos que la fertilización ocurra. Diacinésis Los quiasmas parecen desplazarse hacia los extremos del cromosoma hasta desaparecer, el nucleolo y la envoltura nuclear se dispersan y los microtúbulos emanan de los centrosomas ubicados en los polos opuestos de la célula. (6,7,8). Posteriormente en la metafase I los pares homólogos se ubican en el plano ecuatorial de la célula, los microtúbulos se unen al cinetocoro en la región centromérica y en la anafase I se da una separación cromosómica longitudinal conformando Díadas las cuales se dirigen a los polos opuestos celulares para conformar las dos primeras células del proceso durante la telofase I. (Ver Diapositiva 15). SEGUNDA DIVISIÓN MEIÓTICA:

6 Después de un breve período intercinético en el que por supuesto no ocurre síntesis de ADN, se pasa inmediatamente a la segunda división meiótica descrita como División Ecuacional en la cual, los cromosomas o Díadas se colocan en el plano ecuatorial para sufrir una división longitudinal del centrómero (división cromatídica) conformando mónadas que se dirigen a los polos opuestos de cada una de las células obtenidas en la primera división. Por consiguiente se originan cuatro en total cada una de ellas con un número simple o haploide de cromosomas. (Ver Diapositiva 16). (4,6,7). Aunque la citocinesis tanto en meiosis como en mitosis puede ser algo imprecisa sin dejar de ser operativa, la división y la repartición de los cromosomas debe hacerse de un modo exacto y sin errores para que la célula pueda funcionar. Dada que toda la maquinaria que las mueve está contenida en la información genética que albergan.(2,3). El ciclo celular está altamente coordinado y regulado por señales químicas internas y externas en puntos muy específicos conocidos como puntos de chequeo o de restricción los cuales son regulados por miembros de una familia de proteínas llamadas ciclinas, que forman complejos con proteínas kinasas dependientes de ciclinas y los complejos formados son como el motor que dirige el ciclo celular. La función de los puntos de chequeo es hacer que la célula espere a que los daños del ADN sean reparados o se disparen los mecanismos de muerte celular según el grado de daño, por ejemplo en G1 se detectan los defectos del ADN, de disponibilidad de nutrientes, y de contactos célula a célula; en G2 se detectan problemas en la replicación de los cromosomas y en la metafase las aberraciones en la formación del huso mitótico que impiden la apropiada segregación de los cromosomas a las células hijas. La transición de cada fase del ciclo, requiere la integración de señales químicas específicas y de respuestas precisas a esas señales. Si las señales están incorrectamente sensibilizadas o si la célula no está apropiadamente preparada a responder, ésta puede ser eliminada o transformada en una célula maligna. (Ver Diapositiva 17). (7,8) LA CROMATINA Después de haber analizado cada una de los eventos del ciclo celular podemos destacar el papel que en cada uno de ellos desempeñan los cromosomas no solo como simples portadores de información genética si no también como estructuras organizacionales que permiten sistematizar dicha información. Todo ser vivo, procariótico y eucariótico posee una cierta cantidad de ADN organizado en mayor a menor grado dentro de estructuras celulares denominadas cromosomas los cuales poseen una constitución y un comportamiento variable dado el tipo de célula y el estadío del ciclo celular en el cual se estudien. Un cromosoma metafásico, por ejemplo, está constituido por dos Cromátides hermanas altamente empaquetadas, unidas por el centrómero y con una apariencia de X que es posible visualizar al microscopio durante la división celular. En un cromosoma el ADN tiene un grado de compactación de veces con respecto a la longitud del cromosoma ( 10 µm, en el cromosoma 1 que es el más grande y de casi 2 µm en el cromosoma de menor tamaño). Vale decir que un cromosoma humano de 5 µm de longitud posee en cada cromátida una cadena de ADN de

7 µm = 5 cm. de largo. Este enorme grado de empaquetamiento se alcanza mediante sucesivos órdenes de empaquetamiento. (Ver Diapositiva 27). (6). Por lo común las células eucariotas concentran dichas estructuras en el núcleo celular y están compuestos por fibras de cromatina altamente condensadas. A su vez la cromatina es un complejo constituido por ADN, proteínas, ARN y ciertos polisacáridos. Las proteínas cromosómicas asociadas son moléculas caracterizadas por su ph básico con carga altamente positiva como son las Histonas y otras también positivas pero en menor grado y con ph de tendencia ácida llamadas No Histonas. De éstas dos las Histonas juegan un papel fundamental en la estructura cromosómica, dado que éstas poseen grandes cantidades de aminoácidos positivos como son la lisina y la Arginina, los cuales permiten uniones electroestáticas fuertes con los grupos fosfato de los nucleótidos del ADN cargados negativamente. Hay 5 clases de Histonas : las H1, ricas en lisina; las H2A y H2B, ligeramente ricas en lisina; H3 y H4, ricas en arginina y la H5, una histona especial que reemplaza la H1 en eritrocitos nucleados. La proporción de Histonas en relación con el ADN en la cromatina es de 1:1 por peso. (1). Por otra parte las proteínas No Histónicas son muchos cientos con diferentes funciones estructurales, enzimáticas y regulatorias; éstas son más variables aunque ellas hacen mucho menos de la masa de la cromatina. Las proteínas No Histónicas están involucradas en el metabolismo cromosomal, en la estructura cromosómica y en la expresión génica, en la regulación de la cromatina activa, ya que su asociación con genes únicos le permiten cambiar la configuración de la cromatina para regular su transcripción. (1). La cromatina está organizada en varios órdenes sucesivos de empaquetamiento que pueden ser identificados en 4 niveles (Ver Diapositiva 19): NUCLEOSOMA El nucleosoma parece ser la unidad básica de la cromatina eucariótica, ya que está presente en cromatina condensada o dispersada, en áreas repetitivas o de secuencias únicas y en estado interfásico o metafásico. Está constituido por una serie de unidades repetitivas dispuestas sobre un eje que recuerda las perlas de un collar. Estas unidades se llaman Nucleosomas y están compuestas por porciones de ADN de 146 pb que se enrollan en espiral dando una vuelta y ¾, alrededor de octámeros proteicos de 10 nm de diámetro, que luego se continúan con un segmento internucleosómico que es más variables en longitud (de 50 a 60 pb). Los octámeros están conformados por 2 tetrámeros de proteínas Histónicas; un tetrámero interno constituido por 2 moléculas de H2A y 2 moléculas de H2B y un tetrámero externo constituido por 2 moléculas de H3 y 2 moléculas de H4. De ésta forma se logra empaquetar 6 veces más el ADN. (Ver Diapositiva 20). FIBRA DE CROMATINA El quinto tipo de Histona, la H1 está involucrada en la unión y compactación de los nucleosomas al intercalarse entre ellos y cerrar los espacios internucleosómicos. La H1

8 se une al ADN en una proporción de 1 molécula por nucleosoma (1:1). (Ver Diapositiva 21). SOLENOIDE El solenoide está conformado por seis unidades nucleosómicas que interactúan entre sí, arrollándose sobre sí mismas, girando helicoidalmente hacia la izquierda y formando estructuras más condensadas de un mayor diámetro (30 nm.), logrando empaquetar 40 veces más el ADN. (Ver Diapositiva 24). SUPRAEMPAQUETAMIENTO Poco a poco el cromosoma va tomando forma y el supraempaquetamiento al que finalmente llega es gracias al otro tipo de proteínas mencionadas, las No Histonas. Estas proteínas forman loops de diferentes longitudes (entre 75 y 100 kb), por afinidad química entre los solenoides, los cuales son atados o anclados en sus bases para formar lo que es conocido como scaffold. El scaffold presumiblemente forma un esqueleto de proteína No histónica que es responsable del mantenimiento de la figura básica del cromosoma y que sirve como un ancla para los loops de ADN que se forman hacia adentro y hacia afuera del cromosoma. El cromosoma finalmente logra un empaquetamiento del ADN de hasta veces, evidenciado en un cromosoma metafásico de nm de diámetro. (Ver Diapositiva 26). (1,4,6,8). Con base en éste modelo de organización se esperaría que los cromosomas demostraran una uniformidad estructural y funcional a lo largo de su longitud. Sin embargo se ha observado que la estructura y función de la cromatina varía a lo largo de la longitud del cromosoma reflejando el grado de empaquetamiento, la composición de bases y el tiempo de replicación del ADN. Subsecuentes investigaciones han conducido a la caracterización de tres tipos de cromatina que basan su funcionalidad dependiendo el tipo de ADN que las está constituyendo. (Ver Diapositiva 30). La eucromatina está constituida por ADN único rico en Guanina-Citosina, se descondensa durante la interfase para que pueda darse la transcripción génica, ya que está activa y se replica tempranamente durante la etapa de síntesis. La heterocromatina constitutiva está altamente empaquetada, nunca se elonga o descondensa durante el ciclo celular, presenta secuencias altamente repetitivas ricas en Adenina-Timina, transcripcionalmente inactivas y se tiñen diferencialmente de la eucromatina bajo técnicas de bandeo. La heterocromatina facultativa se comporta en forma similar a la heterocromatina constitutiva pero controlada de acuerdo a las exigencias del desarrollo, siendo transcripcionalmente inactiva o activa, de replicación tardía o temprana y condensada o descondensada durante la interfase, dadas las condiciones. El cromosoma X en las células somáticas de mamíferos femeninos es un claro ejemplo de la heterocromatina facultativa.(1,4,5,6).

9 EL CARIOTIPO NORMAL Siendo los cromosomas los portadores de la información genética de mayor y mejor visualización, éstos han sido objeto de constante estudio, dado que cualquier anormalidad a nivel funcional de las células y del organismo en general dependería en últimas de alteraciones localizadas en la información que llevan. Los cromosomas aportan una gran ayuda ya que no solamente revela información valiosa acerca de la constitución genética de las personas sino que además tienen un número constante en todas las células somáticas de una especie y presentan una tamaño, estructura y morfología definidas.(6). La citogenética se encarga entonces de estudiar todo comportamiento celular basada en la información génica contenida en los cromosomas, su función, su comportamiento, su relación con patologías y sus consecuencias a nivel físico, orgánico y poblacional. Esta disciplina es más reciente que la genética ya que solo en 1956 fue determinado el número de cromosomas humanos (46), sin embargo ya desde 1875 se tiene registro de las primeras observaciones de cromosomas en plantas por Eduard Strasburger y en en animales por Walter Flemming. En 1959 se describió la primera anormalidad cromosómica humana, la trisomía 21 en el síndrome de Down y a partir de allí se constituyó en un campo propio de estudio dentro de la Genética Médica. Algunos problemas técnicos hicieron el análisis cromosómico muy difícil, dado que la coloración solo permitía agrupar los cromosomas por tamaño y figura, pero no podían ser identificados individualmente. En 1968 Caspersson y colaboradores idearon un método de coloración que permitió identificar un patrón de regiones claras y oscuras llamadas bandas, único para cada cromosoma, lo cual permitió la detección y caracterización de muchas mas anormalidades citogenéticas que la tinción regular. En la década de los 80 el desarrollo de la citogenética molecular revolucionó el campo al permitir la identificación de rearreglos únicamente visibles en el nivel molecular mediante la utilización de sondas incluso en etapas del ciclo poco convencionales.(1). Los cromosomas son mejor estudiados en la metafase o la profase meiótica o mitótica, aunque algunos estudios tales como los métodos de hibridación in situ por fluorescencia pueden utilizar células interfásicas. Es posible realizar un análisis cromosómico en una variedad de tejidos, dividiéndose espontáneamente como en médula ósea, nodos linfáticos, testículos, algunas sangres leucémicas, tumores sólidos, algunos fluidos pleurales y frecuentemente en sangre fetal o de recién nacido; pero también en células que han sido estimuladas en cultivo para entrar en activa división como linfocitos sanguíneos, fluido amniótico, piel y otros tejidos conteniendo fibroblastos.(1). Los procedimientos más empleados en el análisis cromosómico, recurren a técnicas de cultivo celular in vitro para analizar cromosomas durante la profase tardía o la metafase, estadíos en los cuales como ya se recordó están más condensados y con una morfología más definida que permita ordenarlos, compararlos y analizarlos.(8). Para el estudio de los cromosomas se han desarrollado diversos procedimientos que comprenden tres pasos fundamentales: Siembra, Procesamiento y Análisis. (Ver Diapositiva 32).

10 LA SIEMBRA Aunque el estudio puede llevarse a cabo en forma directa sobre cualquier tipo de célula de multiplicación activa, las células vivas más fácilmente accesibles son las obtenidas mediante punción venosa de sangre periférica, a la cual se añade heparina para evitar su coagulación. El término sembrar hace referencia a la incorporación de más o menos 1ml de sangre en un medio apropiado para su crecimiento bajo estrictas condiciones de esterilidad. Como las células que se estudian son los linfocitos dado que los eritrocitos y las plaquetas han perdido su núcleo y por lo mismo no tienen cromosomas. El medio contiene los siguientes reactivos: RPMI 1640 es un medio bufferizado a base de bicarbonato, enriquecido con proteínas, carbohidratos, aminoácidos, vitaminas, minerales y otros suplementos en proporciones adecuadas para mantener el crecimiento celular. Suero Fetal Bovino (SFB) es un suplemento del medio que entre muchos otros componentes posee factores de crecimiento que estimulan el cultivo y es determinante para la adaptación de las células al nuevo ambiente artificial. Fitohemaglutinina (PHA) es una glucoproteína vegetal (lectina) la cual se acopla a las proteínas de la membrana de los linfocitos en las primeras 24 horas de crecimiento del cultivo para actuar como un agente mitógeno que induce la transformación blástica de los linfocitos. Posteriormente los propios linfocitos segregan interleuquina 2 para continuar el estímulo. Solución penicilina estreptomicina para evitar cualquier tipo de proliferación bacteriana o micótica durante las 72 horas que estarán en crecimiento a 37º C.(1,6). EL PROCESAMIENTO Como se deben obtener cromosomas en metafase es necesario detener las células que están en división activa, en dicho estadío. Esto se logra con el empleo de la colchicina o el colcemid, una sustancia que impide la formación del huso acromático, evitando la polimerización de las fibras del uso, de tal forma que no se puede avanzar en las etapas de mitosis. El colcemid también afecta la cantidad de mitosis y la condensación del cromosoma, ya que el proceso de supraempaquetamiento es acentuado por el incremento en el tiempo de exposición y concentración de la colchicina. Así mismo los cromosomas deben presentar una adecuada dispersión que permita visualizarlos en toda su extensión. Por tanto, el uso de soluciones hipotónicas es importante, ya que incrementan el volumen celular y los cromosomas encuentran el espacio suficiente para dispersarse. El precalentamiento de la solución hipotónica a 37ºC puede incrementar la efectividad por la rapidez con que el agua se transporta a través de la membrana Finalmente éstos deben ser fijados y limpiados de cualquier resto celular que impida su visualización, de tal forma que se utiliza una solución de Carnoy preparada con Metanol absoluto (Deshidrata y fija los cromosomas) y Ácido acético glacial (degrada la membrana citoplasmática) en una proporción 3:1 antes de extender en una placa 2 o 3 gotas de la preparación cromosómica procesada.(1).

11 EL ANALISIS Para ser observados bajo el microscopio de luz los cromosomas se deben teñir con un colorante que resalte su morfología. Después se cuenta un número significativo de metafases entre 25 y 100 según sean normales o no, se escogen las mejores en cuanto a morfología y dispersión de cromosomas y se les toma una fotografía se recortan los cromosomas homólogos y se elabora así un cariotipo, objetivo final de todo este procedimiento. El cariotipo es una forma de análisis cromosómico que se basa en el ordenamiento estándar de los cromosomas contenidos en una célula, de acuerdo con su tamaño, localización del centrómero y patrón de bandeo.(8). Con base en el criterio de tamaño y posición del centrómero los cromosomas pueden ser de cuatro tipos (Ver Diapositiva 40): Metacéntricos: Si el centrómero está localizado en la parte media del cromosoma designando dos brazos sensiblemente iguales. Submetacéntrico: Si el centrómero está mas cerca de uno de los extremos del cromosoma, determinando claramente un brazo corto o p (petit) y uno largo o q ( por ser la letra del alfabeto que le sigue a la p). Acrocéntrico: Si el centrómero está situado hacia uno de los extremos quedando un brazo p muy reducido poco observable. En el caso de los humanos se observan dos pequeñas estructuras similares a palillos de tambor denominados Satélites. Telocéntricos: Si carece totalmente de brazo corto. En el caso de los humanos no existe este tipo de cromosomas.(1,3,5). La precisión del ordenamiento propuesto por los procedimientos de análisis para la elaboración del cariotipo, se ha logrado establecer a través del desarrollo de las técnicas de bandeo, es decir, el tratamiento de una placa para obtener una secuencia de segmentos claros y oscuros o fluorescente y no fluorescentes que aparecen a lo largo del cromosoma, tiñéndolo en forma no uniforme cuando se le aplican colorantes, que permiten establecer correlaciones más precisas entre los síndromes clínicos y las alteraciones cromosómicas que los ocasionaron. (Ver Diapositiva 42). Estas técnicas permiten visualizar un patrón estable y característico para cada cromosoma, de gran utilidad práctica porque permite la identificación precisa de cada cromosoma y la caracterización de regiones particulares dentro de cada brazo cromosómico, haciendo posible comparar los cromosomas individualmente con ideogramas estándar (esquema que representa la distribución normal de las bandas cromosómicas obtenidas bajo una técnica particular) y el patrón de bandeado entre los miembros de un par homólogo. (Ver Diapositiva 43). (1,5). El patrón de bandas varía según el estado de elongación de los cromosomas, por ejemplo en cromosomas metafásicos, acortados por mayor tiempo de exposición a la colchicina, el número total de bandas detectables en todo el cariotipo humano no pasa

12 de 400. Sin embargo, cuando se observan cromosomas prometafásicos, como son más elongados, el número de bandas puede llegar a sobrepasar las 1000 y es llamado bandeo de alta resolución y difiere del anterior en el desdoblamiento de bandas metafásicas en subbandas.(5,6). Algunas de las técnicas de bandeo más utilizadas son (Ver Diapositiva 41): BANDEO G Esta técnica ha llegado a ser la más utilizada para la tinción de rutina de placas de cromosomas, dado que los procedimientos son muy simples y pueden ser mantenidas por muchos años sin deteriorarse. Aunque hay una variedad de metodologías descritas en términos generales, ésta técnica involucra la desnaturalización por calor a 60ºC en un buffer 2XSSC de la placa extendida, para que las proteínas que empaquetan el cromosoma se suelten un poco. Luego la digestión con la enzima proteolítica Tripsina, elimina aquellas que están en las zonas menos empaquetadas, de tal forma que el colorante Giemsa se pega solo a aquellas zonas que aún conservan proteínas. Es decir que la heterocromatina por ser de replicación tardía va a quedar intensamente coloreada, mientras las zonas de eucromatina quedan claras por la pérdida más fácil de sus proteínas. Al compararlas con el ideograma se puede determinar qué genes se han perdido y por consiguiente, qué proteínas no se están sintetizando, para así asociarlas a patologías específicas. Especialmente las asociadas a los cromosomas autosómicos y a las anomalías numéricas. (Ver Diapositiva 53-56). (1,5). BANDEO R Es contraria a las bandas G, ya que evidencian las zonas de replicación tardía como zonas claras. Para tal fin se utilizan reactivos afines a la Timina como la Bromodesoxiuridina y el Höechst. La Bromodesoxiuridina es un reactivo análogo de la timina que desplaza dicha base en la síntesis del ADN y el Höechst es un fotolítico que presenta gran afinidad por la bromodesoxiuridina y provoca la ruptura y pérdida de las zonas ricas en A-T. Por lo tanto el giemsa se une a las proteínas de la eucromatina que se conservan. Este bandeo es útil para identificar cualquier anomalía estructural por pequeña que sea, especialmente, las relacionados con los cromosomas sexuales. (Ver Diapositiva 57). (1,5). BANDEO C Solo evidencia las zonas de replicación tardía mas empaquetadas, es decir, la heterocromatina constitutiva ( correspondiente a las regiones α satélite, centroméricas y teloméricas). Con un tratamiento con ácido clorhídrico (HCl), Hidróxido de Bario (Ba(OH) 2 ) y desnaturalización al calor se sueltan todas las proteínas asociadas al ADN excepto las más empaquetadas. Este bandeo es muy útil cuando se sospechan daños en las zonas centroméricas como inversiones pericéntricas y para la búsqueda de polimorfismos de heterocromatina de los cromosomas autosómicos 1, 9,16 y la parte distal del brazo largo del cromosoma Y. (Ver Diapositiva 58). (1,5). BANDEO Q Utilizando mostaza de quinacrina (un tinte de acridina que se une al ADN por intercalación o por unión iónica externa) y estimulando los cromosomas con una luz ultravioleta, se ponen de manifiesto bandas fluorescentes de idéntico patrón al de las

13 bandas G excepto en las zonas heterocromáticas de los cromosomas 1, 9 y 16,en los satélites de los acrocéntricos y en la porción distal del cromosoma Y, que dan una tinción variable. (Ver Diapositiva 59). (1,5). FISH Actualmente la citogenética médica usa metodologías derivadas de la genética molecular para complementar, verificar y ampliar sus posibilidades diagnósticas. La Citogenética Molecular como una de las más recientes aplicaciones a los estudios clínicos de aberraciones cromosómicas es la visualización de loci utilizando la técnica bioquímica dinámica de Hibridación In Situ. El uso de ésta tecnología empezó a finales de los años sesenta cuando Gall y Pardeu reportaron la hibridación de sondas radioactivas de ADN para secuencias repetitivas de cromosomas de ratón y de Drosophila. Métodos para hibridaciones in situ no isotópicas fueron pronto desarrolladas, dada la dificultad y los costos que conlleva el uso de sondas radioactivas. La técnica de Hibridación In Situ por fluorescencia (FISH) ha progresado en la actualidad hasta tal punto, que incluso más de 27 sondas coloreadas de ADN, pueden ser hibridadas simultáneamente y detectadas con un set de filtros especializados y un software acoplado a un analizador de imágenes (1,3,4,5). Al aplicar conjuntamente los criterios de organización aportados por el cariotipo y el patrón de bandas ha sido más fácil la ubicación de los pares homólogos en grupos morfológicos que en el caso de los humanos comprende 7 grupos designados con letras así (Ver Diapositiva 44-51).: Grupo A: Son los Metacéntricos Grandes, que incluyen los pares homólogos 1, 2 y 3, aunque el 2 tiende a ser submetacéntrico Grupo B: Son los Submetacéntricos Grandes, que incluyen los pares homólogos 3 y 4. Grupo C: Son los Submetacéntricos Medianos, que incluyen los pares autosómicos del 6 al 12 y el gonosoma X, que por su tamaño y morfología puede ser ubicado entre el 7 y el 8. Grupo D: Son los Acrocéntricos Grandes, que incluyen los pares homólogos 13, 14 y 15 caracterizados por presentar satélites en sus brazos cortos. Grupo E: Son los Submetacéntricos pequeños, que incluyen los pares homólogos 16, 17 y 18, aunque el par 16 tiende a ser metacéntrico. Grupo F: Son los Metacéntricos Pequeños, que incluyen los pares homólogos 19 y 20. Grupo G: Son los Acrocéntricos Pequeños, que incluyen los pares homólogos 21 y 22 que presentan satélites en sus brazos cortos y el gonosoma Y, que aunque es morfológicamente acrocéntrico carece de satélites y constituye junto con el X el par 23, único del cariotipo no homólogo estructuralmente.(1,5,6). Aunque los pares cromosómicos establecidos a través del cariotipo deben corresponderse en tamaño, estructura y forma, existen variaciones en algunos segmentos cromosómicos que no implican ningún tipo de patología específica o anormalidad cromosómica. Los Polimorfismos se definen entonces como variantes cromosómicas cuya frecuencia en la población, es más elevada de lo que se esperaría en una tasa normal de mutación recurrente (es decir que es mucho más habitual que una mutación común). (Ver Diapositiva 52).

14 Algunos de los polimorfismos más habituales son los relacionados con: Tamaño: (Longitud del cromosoma) ocasionado por artefactos adicionados por las técnicas de preparación de los cromosomas o por cambios reales en la longitud de algunos segmentos cromosómicos. Satélites: Los brazos cortos, los tallos o los satélites en sí pueden aparecer duplicados, en tandem o separados. El brazo corto puede aparecer notablemente aumentado (p+) o con aparente deleción (p-), pueden presentar variación en la intensidad de tinción o fluorescencia o en su funcionalidad. Constricciones secundarias o Zonas Heterocromáticas: Corresponden a aquellas regiones que revelan la localización de la heterocromatina constitutiva, regiones ampliamente polimórficas en la población humana, asiento de los distintos tipos de ADN satélite o altamente repetitivo, que se tiñe pálidamente con las técnicas usuales. Se encuentra en las regiones proximales de los brazos largos de los cromosomas 1,9 y 16, la porción distal del brazo largo del cromosoma Y y los brazos cortos y satélites de los acrocéntricos. Polimorfismos con las técnicas de Bandas: Generalmente corresponden a la heterocromatina constitutiva o en el caso de las bandas Q pueden ponerse de manifiesto polimorfismos en la intensidad de fluorescencia de zonas Heterocromáticas. En general, dichos polimorfismos resultan útiles para identificar el origen paterno o materno de las anormalidades cromosómicas.(5,6). Se ha establecido un Sistema Internacional de Nomenclatura para la Citogenética Humana (ISCN) por medio del cual la descripción del cariotipo normal y patológico está estandarizado. La denominación de un cariotipo comienza con el número cromosómico, continúa con la fórmula sexual y después se inscriben las diferentes anormalidades cromosómicas encontradas designadas por sus respectivas abreviaturas en letra minúscula y especificando los cromosomas, regiones, bandas y subbandas implicadas ( 46, XX o 46,XY ). Los centrómeros, los telómeros y las zonas intermedias se usan como hitos, para definir regiones principales en el cromosoma y se expresan como un primer dígito después de la designación del cromosoma y del brazo, empezando siempre desde el centrómero. Luego se designa un segundo dígito que corresponde a las bandas de cada región de proximal a distal (alejada del centrómero), y en cromosomas más elongados, de alta resolución se usa un tercer dígito separado de los dos anteriores por un punto para denotar las subbandas (46,XX,del(1)(q18); 46,XY,t(1;8)(p21;q32); 47,XXY). (5,8).

15 BIBLIOGRAFÍA 1. BARCH, M. J., KNUTSEN, T. AND SPURBECK, J. L The AGT Cytogenetics Laboratory Manual. Editorial Lippincott-Raven. Tercera Edición. 2. CUMMINGS, M. R Herencia Humana: Principios y Conceptos. Editorial Interamericana Mc Graw Hill. Tercera Edición. 3. GRIFFITHS, A., GELBART, W., MILLER, J. and LEWONTIN, R Genética Moderna. Mc Graw Hill. Primera Edición. 4. KLUG, W. S. and CUMMINGS, M. R Essentials of Genetics. Editorial Prentice Hall. Tercera Edición. 5. ROONEY, D. J Human Cytogenetics: Constitutional Analysis. A Practical Approach. Tercera Edición. Oxford University Press. 6. SOLARI, A. J Genética Humana: Fundamentos Y Aplicaciones en Medicina. Editorial Médica Panamericana. Segunda Edición. 7. SNUSTAD, D.,SIMMONS, M., and JENKINS, J Principles of Genetics. Editorial John Wiley and Sons, Inc. Primera Edición. 8. SALAMANCA, F Citogenética Humana: Fundamentos y Aplicaciones Clínicas. Editorial Médica Panamericana. Primera Edición.