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2 Extensiones citoplasmáticas basadas en el citoesqueleto de actina órgano mecanosensorial células epiteliales intestinales, riñón células mecanosensoras (Drosohila) células sensoriales del órgano de Corti fibroblastos, conos de crecimiento neuronales Revenu et al., Nature RMCB2004

3 Lamelas, pliegues y filopodios son extensiones citoplasmáticas dinámicas observables en células migratorias Extensiones planas y delgadas adheridas al substrato se denominan lamelas; extensiones que no se adhieren y que se pliegan sobre la parte superior de la célula se denominan "ruffles". Proyecciones con forma de aguja adheridas al substrato se denominan filopodios. microscopía electrónica de barrido de fibroblastos ruffles filopodios lamela videos accesibles

4 Los conos de crecimiento neuronales son sitios de elongación de axones y dendritas Los conos de crecimiento varían en morfología, extienden una lamela con numerosos filopodios. La estructura y dinámica de la región periférica de los conos de crecimiento (P) depende del citoesqueleto de actina (en rojo). Los microtúbulos abundan en la región central (C) del cono. actina Dent & Gertler, Neuron, 2003 microtúbulos

5 Los filopodios son estructuras dinámicas que muestrean el ambiente Robles et al, Neuron ' 2' 4' 18' 20' 22' filopodios Paglini et al JCB 1998

6 La marcación con falloidina fluorescente revela la abundancia de los filamentos de actina en filopodios, lamela y lamelipodio lamelipodio lamela de avance fibroblasto citoplasma en retracción (cola) citoesqueleto de actina (rojo) predominante en la lamela y filopodios. Los microtúbulos (verde) terminan en un dominio proximal. axón filopodios Paglini et al JCB 1998 lamela Se denomina lamelipodio a una franja rica en actina, de 2-4 μm de ancho, adyacente al margen de avance de la lamela. Suter & Forscher J. Neurobiol. 2000

7 Numerosas proteínas contribuyen a la organización tridimensional de los filamentos de actina Varias proteínas se unen a actina mediante dominios CH (Calponin-Homology). Proteínas monoméricas con más de un dominio CH, o diméricas, con un solo CH en cada monómero, contribuyen a interconectar los filamentos de actina. CH Lodish et al., MCB2004

8 Diferentes arreglos 3D: Fascículos y redes de microfilamentos fascículos contráctiles "fibras de estrés" redes bidimensionales fascículos no contráctiles El número y ubicación de los dominios CH en las proteínas que unen actina determinan el arreglo tridimensional que estabilizan. Los sitios de unión a actina se muestran en rojo.

9 Organización 3D de los microfilamentos. Microscopía electrónica Fascículos de microfilamentos unidos por fimbrina Redes de microfilamentos conectados por filamina Lodish et al., MCB2004

10 El espaciamiento y capacidad contráctil de los filamentos de actina en los fascículos depende del tipo de proteínas accesorias Fascículo culo contráctil ctil el mayor espaciamiento permite la unión de miosina II entre los filamentos. Ej. en fibras de estrés. Fascículo culo no contráctil ctil el empaquetamiento denso de microflamentos impide la asociación de miosina. Ej. en filopodios. α-actinin Alberts Robles et al., MCB2002 et al, Ne

11 Lamelas y lamelipodios exhiben redes de filamentos de actina filamina estabiliza la red interaccionando con filamentos orientados perpendicularmente. lamela de keratinocito la parte distal de la lamela, denominada lamelipodio, exhibe una red dendrítica de filamentos de actina nucleados y anclados en complejos Arp2/3 (flechas). actina videos disponibles Svitkina et al, JCB 1997

12 En el lamelipodio los complejos Arp2/3 se asocian a filamentos preexistentes y nuclean la polimerización de actina Los complejos Arp2/3 se asocian lateralmente a microfilamentos preformados y facilitan el ensamble de actina formando filamentos ramificados. Proteínas de capping se asocian a los extremos (+) y terminan el crecimiento de los filamentos. capping protein Los filamentos de actina formados a partir de Arp2/3 emergen del filamento parental a un ángulo de 70 arreglo dendrítico Alberts et al., MCB2002

13 La fasciculación y elongación de filamentos de actina en la región distal de la lamela puede generar filopodios filopodio La flecha indica la elongación de un filopodio. La línea de puntos marca el borde de la célula. red dendrítica de actina los círculos señalan ramas a partir de las cuales se originan filamentos de actina que se empaquetan y forman el esqueleto del filopodio. Svitkina et al JCB 2003

14 La fasciculación de los filamentos de actina en los precursores de los filopodios depende de la proteína fascina La clave para la iniciación de un filopodio es la fasciculación (mediada por fascina) de los filamentos de actina y la inhibición de los mecanismos que bloquean la elongación, por ejemplo, por asociación de proteínas ENA/VASP que antagonizan la función de las proteínas de capping. Esquema de formación de un filopodio (ENA/VASP) fasciculación - elongación Svitkina et al JCB 2003

15 Fascículos contráctiles de microfilamentos o fibras de estrés le permiten a la célula traccionar sobre el substrato focos de adhesión (flechas) microscopía de reflexión focos de adhesión (verde) y fibras de estrés (rojo). Microscopía de fluorescencia fibras de estrés microscopía de fluorescencia La miosina asociada a las fibras de estrés les permite ejercer fuerzas de tracción sobre las adhesiones focales fibra de estrés actina α actinina adhesión focal Las fibras de estrés se anclan a las integrinas de las adhesiones focales mediante proteínas adaptadoras como vinculina, talina y paxilina. integrinas vinculina talina

16 El anclaje de las fibras de estrés a las adhesiones focales es determinado por Vinculina y otras proteínas focos de adhesión (vinculina) La unión de vinculina a PIP2 induce un cambio conformacional que le pemite exponer sitios de interacción con actina y con otras proteínas que unen actina como talina y α-actinina. conformación inactiva Zamir & Geiger, JCS conformación activa

17 En células epiteliales, el anclaje del citoesqueleto cortical de actina a la membrana plasmática es mediado por la familia de proteínas ERM Ezrina, Radixina y Moesina son miembros de la familia de proteínas ERM. La conformación activa de las proteínas ERM, que permite la unión a la actina y a proteínas de la membrana plasmática es regulado por fosforilación y unión a fosfoinosítidos fosforilados (PIP2).

18 Las interacciones entre la membrana y el citoesqueleto subcortical de espectrina y actina es esencial para la función de los eritrocitos microscopía electrónica de la red cortical de espectrina complejo de anclaje s = spectrin complejos de anclaje a actina o nodos Espectrina es un heterodímero que se asocia cabeza con cabeza formando tetrámeros de unos 200 nm de longitud. Los tetrámeros se unen a filamentos de actina en sitios denominados "nodos" o complejos de anclaje formando una malla bidimensional. Espectrina se ancla a la membrana plasmática a través de su unión a las proteínas periféricas ankirina y banda 4.1.

19 Los arreglos tridimensionales de actina son dinámicos y dependen de la actividad de numerosas proteínas reguladoras Gelsolina, cofilina y severina inducen la fragmentación de los microfilamentos y el capping de los extremos (+). La actividad de gelsolina es regulada positivamente por calcio. En contraste, la actividad de gelsolina y cofilina es regulada negativamente por PIP2. el fragmento formado se depolimeriza por el extremo (-) (-) Ca++ (+) capping del extremo (+) impide el crecimiento Vía a de señalizaci alización que activa a gelsolina trombina receptor acoplado PLC DAG/IP3 Ca++ gelsolina a proteína G

20 Cambios en las concentraciones de calcio citosólico afectan la reorganización de la actina La fluorescencia del compuesto Fura 2 incrementa proporcionalmente a su unión a Ca++. Esta fluorescencia puede ser visualizada en un microscopio. Debajo se visualiza en pseudocolor los niveles de fluorescencia (azul = min rojo = max) en un leucocito. Observe la existencia de un gradiente que revela picos de niveles de calcio en la región de la célula opuesta al margen de avance. margen de avance Ca ++ El aumento de Ca ++ estimula la actividad de gelsolina, la cual promueve el desensamble de microfilamentos en la región de la célula opuesta al margen de avance.

21 La remodelación del citoesqueleto de actina en plaquetas es esencial para su función La activación de plaquetas por trombina involucra cambios morfológicos rápidos que son promovidos por la reorganización del citoesqueleto de actina. Este proceso depende de proteínas como gelsolina y profilina cuya actividad es coordinada por señales citosólicas como el Ca 2+ y el PIP2. trombina INACTIVATES plaqueta inactiva lamela activa contracción mediada por miosina II

22 Cambios de forma y plasticidad del citoesqueleto de actina en células epiteliales (a) En una célula epitelial en reposo la proteína villina se localiza en los ramilletes de microfilamentos en las microvellosidades y también asociada a PIP2 en membranas. (b) En respuesta a la estimulación de ciertos receptores (ej. EGFR) y activación de PLC, se hidroliza el PIP2 y aumenta el calcio citosólico. La liberación de villina de la membrana y su unión a Ca++ activa su función de fragmentar filamentos de actina, promoviendo la remodelación del arreglo tridimensional de la actina. estimulación Revenu et al, Nature RMCB 2004

23 Comparación de proteínas accesorias que regulan el estado de polimerización de la actina y tubulina proteínas que se unen a las subunidades no ensambladas * proteínas que causan la fragmentación de los polímeros tubulina actina microtúbulos katanin microfilamentos gelsolin, severin stathmin thymosin stathmin-p profilin *las proteínas promueven la depolimerizacion ( )o polimerizacion ( ) de los respectivos polímeros proteínas que se asocian a las paredes de los polímeros y los estabilizan microtúbulos microfilamentos MAP2, Tau XMAP215 tropomyosin proteínas que se unen a los extremos de los polímeros microtúbulos γ-turc (-) nucleación catastrophins (+ y -) microfilamentos CapZ (+) capping Arp2/3 (-) nucleación proteínas que se asocian a las paredes de los polímeros y los desestabilizan microtúbulos microfilamentos XMAP215-P KIF2, Op18 cofilin

24 Las GTPasas rho, rac y Cdc42 controlan la actividad de varias proteínas reguladoras de la organización tridimensional de la actina Fibroblastos quiescentes microinyectados con mutantes de GTPasas constitutivamente activas. Se muestra el citoesqueleto de actina y los focos de adhesión (vinculina). La microinyección de rho activo induce la formación de fibras de estrés; Rac induce la formación de un lamelipodio; Cdc42 induce la formación de filopodios actina vinculina actina vinculina células quiescentes lamelipodio rho activo formación de fibras de estrés rac activo formación de lamelipodio Cdc42 activo formación de filopodios

25 La actividad de rho, rac y Cdc42 es regulada por señales extracelulares La señalización de diversos receptores de superficie convergen en la activación de rho, rac y Cdc42 suero ECM ECM Arp2/3

26 Rho se activa cuando se depolimerizan los microtúbulos, como consecuencia se forman fibras de estrés y adhesiones focales nocodazol control + nocodazol Rho microtúbulos Rho K miosina II F-actina Fibras de estrés actividad contráctil vinculina ensamble de adhesiones focales Bershadsky et al Curr. Biol., 1996

27 La actividad contráctil de miosina II y F-actina se traduce en fuerzas de tracción sobre el substrato La fuerzas de tracción pueden visualizarse sembrando las células sobre un substrato deformable. La inhibición de la miosina elimina las fuerzas de tracción. contracción mediada por miosina II contracción inhibida

28 Durante la migración, la fuerza dependiente de Miosina II contribuye a la translocación del núcleo en la dirección de avance núcleo miosina adhesiones La miosina se asocia a los filamentos de actina en la región de la lamela mas cercana al núcleo. Las moléculas de miosina se muestran en amarillo.

29 Experimentos con trampas láser revelan un flujo retrógado del citoesqueleto de actina en la lamela y lamelipodio Con la ayuda de una trampa láser puede posicionarse una microesfera cubierta con fibronectina sobre el borde de la lamela (a). Después de apagar la trampa láser se puede medir la velocidad y trayectoria de la microesfera determinando su posición en función del tiempo (gráfico en b). a microesfera a b miosina force integrinas actina microesfera El flujo retrógrado de actina es determinado por la fuerza de empuje causada por la polimerización de actina y por la tracción generada por miosina. El movimiento retrógrado de la microesfera hacia el centro de la célula requiere del anclaje de las integrinas a los filamentos de actina. video disponible MBC Choquet et al, Cell 1997

30 La extensión de la lamela de avance (protrusión) requiere de la activación de la GTPasa rac Rac-GTP promueve la extensión de la lamela de avance a través de la activación de los complejos Arp2/3. localización de rac activo mediante FRET no interaction = no FRET interaction = FRET Rac-GDP (-) nivel de activación (+) dirección del movimiento (del Pozo, Kiosses, Schwartz) efector Rac-GTP efector lamela de avance integrinas factores de crecimiento Rac Scare/WAVE Arp2/3 polimerización de actina Pak LIMK cofilina

31 La protrusión del lamelipodio depende de una red dinámica de actina En el lamelipodio la red dendrítica de actina experimenta un treadmilling, con un ensamble neto en el frente de avance y un desensamble neto por detrás Protrusión del frente de avance. Nucleación (Arp2/3, azul) y elongación de filamentos con actina- ATP (rojo); terminación por capping (proteínas CapZ, amarillo). La polimerización de actina empuja la membrana (protrusión). ensamble 4, Desensamble de la red de filamentos detrás del frente de avance. Fragmentación y desensamble de la actina-adp (en blanco) mediado por cofilina y gelsolina. 5, 6. La unión de profilina a actina-adp promueve el intercambio del ADP por ATP en la actina la cual es reutilizada en el frente de avance. Señales extracelulares activan a la GTPasa rac. Rac activa a las proteínas WASP/Scar y éstas a los complejos Arp2/3. Los complejos Arp2/3 activos se asocian a filamentos preexistentes y nuclean actina. Este proceso da lugar a nuevos filamentos de actina (ramas). desensamble fuerza de empuje Alberts et al MBC 4th Ed

32 La polaridad de las células migratorias involucra la actividad coordinada de las GTPasas rho, rac y Cdc42 protrusión Rac Cdc42 Arp2/3 Rho miosina II retracción tracción Ridley et al, Science 2003

33 La migración de un fibroblasto involucra eventos que se repiten cíclicamente polimerización de actina en el lamelipodio. Arp2/3 adhesión mediada por integrinas contracción mediada por miosina II desensamble de los complejos adhesivos

34 A través de las actividades de protrusión y retracción las células sensan la rigidez del substrato y adaptan la respuesta migratoria La migración direccionada de las células hacia regiones mas rígidas del substrato se denomina durotaxis redireccionamiento de la migración en respuesta a la tensión del substrato. En este experimento una célula sembrada en el borde un substrato que exhibe un gradiente de rigidez es filmada a distintos tiempos. redireccionamiento de la migración en respuesta al incremento de tensión ejercido por una micropipeta. Note la formación de una nueva lamela orientada hacia la región tensionada por la micropipeta. lamela Note que la célula produce una lamela (flecha) y migra hacia la región mas rígida (stiff) del substrato. micro pipeta tensión En este experimento las células estan adheridas a un substrato deformable (poliacrilamida). lamela Lo et al. Biophys J. 2000

35 Las fibras de estrés y la elongación de las células endoteliales se orientan en dirección del flujo de fluído la figura muestra que a las 16 h de exposición a un flujo laminar de medio de cultivo, la forma de las células y los filamentos de actina (en rojo) se orientan en dirección de la corriente del fluído (flecha) Noria et al Am. J. Pathol. 2004

36 La polimerización de actina genera fuerzas de empuje esenciales durante el proceso acrosomal La reacción acrosomal en espermatozoides es disparada al contacto con la zona pelúcida del huevo y es mediada por una rápida polimerización de actina

37 La polimerización de actina también es explotada por algunos parásitos para impulsar su movimiento intracelular La proteína ActA localizada en el polo caudal de la bacteria Listeria monocytogenes se une y activa proteínas del huesped, como Arp2/3VASP y profilin, induciendo la nucleación y polimerización de actina. La rápida polimerización de actina en el polo caudal de la bacteria le permite moverse en el citosol de la célula huesped. dirección del movimiento polimerización de actina homólogos de ActA en eucariotas son las proteínas WASP/Scar video disponible Cameron et al, Nature RMCB 2001

38 Movimiento de Listeria monocytogenes basado en la polimerización de actina Visualización del movimiento de L. monocytogenes dentro de la célula empleando microscopía de fluorescencia. La bacteria se visualiza en rojo, y la actina polimerizada en el polo caudal se visualiza como una cometa en verde video disponible MBC2004

39 Las miosinas constituyen una gran superfamilia de proteínas motoras asociadas a filamentos de actina microscopía electrónica. "Freeze etch" Todas las miosinas consisten de una o dos cadenas pesadas y una o varias cadenas livianas. Las cadenas pesadas exhiben tres dominios, cabeza, cuello y cola. Las colas de las miosinas I y V interaccionan con membranas. Las colas de las miosinas II interaccionan entre si formando filamentos gruesos bipolares de cuyos extremos proyectan las cabezas.

40 Ensayos in vitro revelan el desplazamiento de filamentos de actina sobre moléculas de miosina en una manera dependiente de la hidrólisis de ATP filamentos de actina (1-3 en b) se desplazan sobre moléculas de miosina adsorbidas a un vidrio. Las cabezas se desplazan hacia el extremo (+) de los filamentos en un proceso dependiente de ATP.

41 Miosina II es requerida en diversos eventos celulares estructuras contráctiles formadas por actina y miosina II

42 Mecanismos de regulación de la actividad de la miosina II En células musculares esqueléticas la actividad de la miosina II (MLC) es regulada por fosforilación mediada por MLCK. MLCK es activada por calcio y calmodulina. En células musculares lisas y no musculares, ej. fibroblastos, la activación de MLC depende de la Rho kinasa. Rho kinase Rho kinase Integrinas Rho Rho kinasa MLC-Pi + actina contractilidad MLC fosfatasa

43 Modelo del movimiento de la miosina II sobre el filamento de actina (+) brazo móvil filamento grueso (empaquetamiento de las colas) Las cabezas motoras (en azul) se conectan mediante un cuello móvil (en amarillo) a la región rígida "coiled coil" (en gris) de las colas. La hidrólisis del ATP extiende el brazo móvil ~ 10 nm hacia el extremo (+). La cabeza de miosina unida a ADP-Pi interacciona con baja afinidad con la actina (en verde) del microfilamento. Pi La liberación del Pi de la cabeza motora incrementa la afinidad por la actina e induce un cambio conformacional del brazo móvil y una fuerza de torque que mueve al resto de la molécula de miosina sobre el filamento de actina ~10 nm (flecha) El reemplazo del ADP por ATP induce la disociación de la miosina del microfilamento. Vale & Milligan, Science 2000

44 Comparación de los ciclos mecano-químicos de kinesina y miosina miosina ejecuta un paso y se disocia del filamento. En contraste, kinesina es un motor áltamente procesivo y ejecuta varios cientos de pasos antes de disociarse del microtúbulo. Vale & Milligan, Science 2000

45 - Son polímeros no polares extremadamente estables - Los monómeros son proteínas fibrosas ricas en alfa hélice - Los monómeros no unen nucleótidos - El ensamblaje no requiere de hidrólisis de nucleótidos - No participan en motilidad celular ni se conocen motores asociados a IFs - Proveen resistencia al estrés mecánico

46 Los filamentos intermedios se forman a partir de una familia de subunidades variada

47 Las diferentes subunidades de los filamentos intermedios comparten un dominio rígido rico en alfa hélice, y difieren en las regiones amino y carboxilo

48 Los filamentos intermedios son polímeros no polares que se ensamblan por interacciones laterales de dímeros y tetrámeros monómero 2 monómeros se asocian por sus α-hélice y forman un dímero coiled coil 2 dímeros se asocian lateralmente en orientación antiparalela. Tetrámero 2 tetrámeros se asocian lateralmente. Protofilamentos 8 protofilamentos asociados lateralmente forman los filamentos de 10 nm.

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50 Las células epiteliales poseen filamentos de la proteína queratina

51 Los filamentos de queratinas se anclan en desmosomas y hemidesmosomas estabilizando la estructura del epitelio desmosomas filamentos de queratinas desmogleinas y desmocolinas miembros de la familia de las caderinas integrinas (α6β4) hemidesmosomas

52 Mutaciones en la queratina desestabilizan la estructura de la epidermis Sección normal de piel Sección de piel de ratón mutante en un gen de queratina epidermis esquema de epitelio mutante. La flecha indica la ruptura de las células debido a la fragilidad de los filamentos de queratina

53 Filamentos de la proteína desmina estabilizan la estructura de los sarcómeros en las células musculares Skelemina y sinemina alinean los filamentos de desmina con las miofibrillas. Ankirina y paranemina anclan los filamentos de desmina a la membrana plasmática. H Zone sarcomero

54 Los Neurofilamentos (NFs) son esenciales para la estructura del axon Neurofilamentos axonales note la alta densidad de NFs en el axon Los NFs axonales estan áltamente interconectados por puentes de NFH subunidades: Alteraciones en proteínas de neurofilamentos en neuronas motoras estan asociadas a la enfermedad neurodegenerativa amyotrophic lateral sclerosis (ALS). NFs - NF-L (light) - NF-M (middle) - NF-H (heavy)

55 Los filamentos de laminas estabilizan la envoltura nuclear Hay tres tipos de laminas: A, B y C. Las laminas son fosforiladas por Cdks-M al comienzo de la mitosis provocando el desensamble de los filamentos y el desarmado de la red.

56 Los filamentos intermedios se asocian con microtúbulos mediante proteínas puente: plectina microscopía electrónica de barrido