RELACIONES FILOGENÉTICAS DE LA SUBFAMILIA LATRODECTINAE (ARANEAE: THERIDIIDAE), INFERIDA DESDE GENES NUCLEARES Y MITOCONDRIALES

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1 RELACIONES FILOGENÉTICAS DE LA SUBFAMILIA LATRODECTINAE (ARANEAE: THERIDIIDAE), INFERIDA DESDE GENES NUCLEARES Y MITOCONDRIALES Milenko A. Aguilera y María E. Casanueva. Laboratorio de Aracnología, Departamento de Zoología, Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas, Universidad de Concepción, Casilla 160-C, Concepción, Chile. miaguile@udec.cl RESUMEN. La subfamilia Latrodectinae es conformada por los géneros Steatoda, Latrodectus y Crustulina. Cada uno de estos géneros son considerados monofiléticos, pero diversos autores no han establecido claramente las relaciones filogenéticas internas de cada uno de estos taxas. Por ello en este estudio se pone a prueba la monofilia de los géneros de la subfamilia Latrodectinae. Se utilizan los genes Citocromo Oxidasa I, 18S y 28S, y de la glándula de seda; de 28 especies de Latrodectinae. Como grupo externo se utiliza a Argiope argentata. Se realizan análisis de parsimonia y bayesiano mediante TNT y Mr. Bayes respectivamente. A partir de estos resultados preliminares es posible observar que el género Latrodectus es parafilético con respecto a Steatoda. Asimismo la baja divergencia genética entre ambos géneros daría evidencias de la cercanía de ellos. Sin embargo, se hace necesario análisis más profundos en donde se incorpore un número mayor de especies de esta subfamilia. Palabras claves: araña del trigo, viudas negras, filogenia, marcadores moleculares. ABSTRACT. The subfamily Latrodectinae is comprised by genera Steatoda, Latrodectus and Crustulina. Each of these genera is considered monophyletic, but some authors have not clearly established relationships within each of these taxa. Therefore the generic monophyly into the subfamily Latrodectinae is tested in this study. The genes cytochrome oxidase I, 18S and 28S, and the silk gland of 28 species of Latridectinae were used for the analysis.. Argiope argentata is used as the outgroup. Parsimony analysis was performed using TNT and Bayesian analysis with Mr. Bayes. From these preliminary results can be seen that the genus Latrodectus is paraphyletic to Steatoda. Likewise, the low genetic divergence between these genera would evidence the closeness of them. However, deeper analysis whith a greater number of species of this subfamily are necessary Keyword: black widows, phylogenia, molecular markers Introducción La familia Theridiidae, constituye una de los taxones de mayor riqueza, con alrededor de 2384 especies, en 119 géneros (Platnick 2011). En la última década se han realizado algunos estudios filogenéticos de esta familia, en donde se puede mencionar a Agnarsson (2004), con un estudio filogenético morfológico y a Arnedo et al. (2004), con análisis filogenéticos moleculares. Aunque en estos estudios se llega a un consenso en términos generales dentro de la familia, se pueden observar relaciones aún no resueltas en categorías taxonómicas inferiores. En ambos estudios se reconoce la subfamilia Latrodectinae, denominación ya utilizada por Petrunkevitch (1928)que de acuerdo con Agnarsson (2004), la subfamilia se define filogenéticamente por varias sinapomorfías, e.g., la forma de los conductos espermáticos de la hembra, la base lobulada del émbolo del macho, cefalotórax densamente hirsuto, entre otras. Ahora bien, los soportes del nodo Latrodectinae para las hipótesis filogéneticas con caracteres morfológicos y moleculares son suficientemente robustos en ambos estudios (Agnarsson 2004, Arnedo et al. 2004). Latrodectinae incluye los géneros Latrodectus Walckenaer, 1805, Steatoda Sundevall, 1833 y Crustulina Menge, Conforme a estudios basados en caracteres morfológicos, Steatoda es el grupo hermano de Crustulina, y Latrodectus es el clado externo a Crustulina- Steatoda dentro de Latrodectinae. Alternativamente, los caracteres moleculares agrupan a los miembros de esta subfamilia como un clado monofilético, pero sin resolución de las relaciones entre sus elementos o con bajos soportes. Cabe destacar que con los escasos estudios sistemáticos en cada uno de los géneros (con excepción de Latrodectus), esto se hace más complejo. Por lo 68

2 tanto, se hace necesario realizar estudios filogenéticos profundos incorporando el mayor número de especies que conforman esta subfamilia y así generar una hipótesis filogenética robusta de los distintos grupos, con el fin de entender cómo diferentes rasgos de las especies que conforman la subfamilia han evolucionado. Por lo tanto un contexto filogenético es esencial para comprender los patrones de diversificación de linajes específicos, y los principales atributos que pueden estar involucrados en la generación de estos procesos. Este estudio provee la primera hipótesis filogenética para las relaciones intragenéricas de la subfamilia Latrodectinae, basada en datos moleculares mitocondriales, ribosomales y nucleares, considerando además, la utilidad comparativa de diferentes marcadores moleculares en la resolución de la filogenia de este grupo de arañas. Materiales y Método Especímenes: Para los análisis filogenéticos de la subfamilia Latrodectiinae se utilizaron fragmentos del genoma mitocondrial Citocromo Oxidasa I (COI), fragmentos del genoma ribosomal 18 S y 28 S y el gen nuclear de la glándula de la seda tubuliforme (Tubul). Los análisis para el gen COI incluyeron secuencias de 48 especímenes que representan 25 especies. De estas siete fueron obtenidas en este estudio: Steatoda triangulosa C. A. Walckenaer, 1802, S. grossa (C. L. Koch, 1838), Latrodectus thoracicus Nicolet, 1849, L. geometricus C. L. Koch, 1841, L. variolus Walckenaer, 1837, L. mirabilis (Holmberg, 1876), L. hesperus Chamberlin y Ivie, Para el gen 18S y 28S incluyeron 21 individuos correspondientes a 12 especies y finalmente para el gen Tubul se utilizaron 13 individuos de 7 especies. Las secuencias fueron obtenidas desde BOLD (Barcode of Life Data) y GenBank en abril del Extracción de ADN: Se extrajo ADN genómico a partir de la musculatura de las patas de arañas mediante el kit comercial Qiagen DNeasy Tissue Kit. Para amplificar un fragmento del Gen COI, se usaron los partidores LCOI 1498 y HCO 2198 (Folmer et al. 1994). La amplificación se realizó con una mezcla maestra conteniendo Taq polimerasa KAPA. El perfil térmico de PCR utilizado fue: 1) denaturación inicial, 90 a 9 C; 2) ciclos de denaturación durante 0 a 9, alineamiento 0 a, y extensión a 2 ; ) extensión final 10 a 2. Del producto amplificado se utilizaron 1 μl para visualizar el producto en un gel de agarosa. El volumen restante del producto fue enviado a Macrogen Inc. Korea, para la purificación y secuenciación. Análisis de datos: El alineamiento fue realizado con Clustal X (Thompson et al. 1997), usando los valores por defecto en todos los parámetros de alineamiento. El cladograma de genes fue inferido por Máxima Parsimonia (MP) (Farris 1983), usando TNT (Goloboff et al ), con los caracteres tratados como no ordenados y sin peso. La estrategia de exploración consistió en encontrar en forma independiente y por 20 veces el resultado óptimo, usando valores por defecto de xmult, y además 10 ciclos de tree-drifting (Goloboff 1999). El árbol de consenso se calculó a través de TBR-colapsado. El soporte de los grupos fue calculado por el índice de Bremer, mediante TBR con intercambio de los árboles encontrados (Goloboff y Farris 2001). Adicionalmente se realizó un remuestreo simétrico (Goloboff et al. 2003), con 100 réplicas, analizando cada set de datos con una adición de secuencias al azar y se colapsaron los árboles resultantes con TBR (Goloboff y Farris, 2001). La inferencia Bayesiana se realizó usando el programa Topali (Milne et al. 2004). Los modelos evolutivos más adecuados para los genes fueron: COI, modelo GTR+Γ+I; para las secuencias 18 69

3 S, 28 S y Tubulifrons, modelo HKY+Γ. Bajo esta metodología se obtiene una muestra de árboles equivalentemente probables usando MCMC (Huelsenbeck y Ronquist 2001, Ronquinst y Huelsenbeck 2003). El análisis se realizó cuatro veces (Nylander et al. 2004), cada uno empezando en un árbol diferente seleccionado al azar; se corrieron cuatro cadenas calientes simultáneas por 5 x 10 6 generaciones con muestreo cada 1000 generaciones. Se descartaron todas las generaciones existentes antes de alcanzar la estabilización (de manera conservativa los primeros 150 de 5001 árboles) y se compararon las probabilidades posteriores de los análisis independientes para evaluar congruencia entre las corridas (Huelsenbeck et al. 2002, Nylander et al. 2004). Los valores de distancia genética y tasas evolutivas se estiman con MEGA4 (Tamura et al. 2007) y DAMBE (Xia y Xie 2001). Para cada uno de los análisis como grupo externo se utilizó Argiope argentata (Fabricius, 1775). Resultados Gen COI: Para el análisis de MP, de los 1278 caracteres utilizados, 785 fueron constantes y 340 parsimoniosamente informativos. El resultado del análisis mostró cladogramas igualmente parsimoniosos (Longitud = 1414 pasos; IC = 0,427; IR = 0,694). El árbol de consenso está parcialmente resuelto (Fig. 1). Con el análisis bayesiano se recuperó a los representantes de la subfamilia Latrodectinae como un grupo monofilético (Clado L; probabilidad a posteriori = 76). Este clado, está conformado por dos grupos recíprocamente monofiléticos. Estos son el clado I, el que incluye a las especies L. geometricus y L. rhodesiensis y el clado II compuesto por los clados CS y clado III. El clado CS, está formado por las especies de Steatoda y Crustulina, mientras que el clado III está compuesto por las demás especies de Latrodectus (clado mactans). Dentro del clado III, podemos reconocer dos clados que incluyen a L. tredecimguttatus y L. renivulvatus, y a continuación se puede observar el clado IV, politómico, que incluye a los clados V, especies de Latrodectus de Chile, Argentina y Paraguay; el clado VI, con especies de América del Norte; y el clado VII que incluye a las especies de Nueva Zelanda (Fig. 2). Gen 18 y 28 S: En el análisis de MP, de los 1761 caracteres utilizados, 939 fueron constantes y 615 parsimoniosamente informativos. El resultado del análisis mostró 4 cladogramas igualmente parsimoniosos (Longitud = 1097 pasos; IC = 0,932; IR = 0,977). El árbol de consenso muestra una politomia basal (Fig. 3). El análisis bayesiano se muestra en la Figura 4. Es destacable la presencia de los clados I-a y CS, similares a los hallados con COI. Gen de glándula de la seda Tubuliforme: De los 1309 caracteres utilizados en al análisis de MP, 692 fueron constantes y 383 parsimoniosamente informativos. El resultado del análisis mostró 2 cladogramas igualmente parsimoniosos (Longitud = 1044 pasos; IC = 0,843; IR = 0,851). El árbol de consenso está parcialmente resuelto (Fig. 5). La inferencia bayesiana (Fig. 6) muestra una topología similar a la de MP. Aun cuando para este gen solo fue posible incluir una especie del género Steatoda, esta se relacionó de manera parafilética con las especies de Latrodectus. El análisis de las tasas evolutivas muestran para el gen COI y el gen Tubul una tasa constante de mutación, mientras que para el gen 18S-28S presenta una tasa variable (Fig. 7). Discusión A partir del gen COI es posible observar que los géneros de la subfamilia Latrodectinae se agruparon de forma monofilética. Además se encontraron algunas topologías ya descritas con anterioridad por Garb et al. (2004), e.g., el clado III que es mencionado como el clado mactans, 70

4 A D B E C F Figuras: 1: A-C) Consenso estricto del análisis de Máxima Parsimonia. Los valores sobre los nodos corresponden al soporte estimado con Bootstrap. A) COI: L = 1414, IC = 0,427, IR = 0,694. B)18S y 28S: L = 1761, IC = 0,932, IR = 0,977. C) Tubul: L = 1044, IC = 0,843, IR =0,851. D-F) Filogenias por análisis Bayesiano. Los valores en cada nodo se refieren a la probabilidad posterior. D) COI. E) 18S y 28S. F) Tubul. con un fuerte soporte. Los clados internos al clado mactans, incluye a linajes marcados por su distribución, diferenciando las especies distribuidas en el cono sur de América, de las de Norteamérica, Nueva Zelanda y Australia. Igualmente cada uno de estos clados siempre mostró altos valores de apoyo. Por otro lado el clado CS reúne a especies del género Steatoda y Crustulina, las que se relacionan de manera polifilética entre sí, lo que se mejoraría incorporando mas especies del género Crustulina. 71

5 El clado CS, formada por Crustulina y Steatoda es el grupo hermano del clado mactans (clado III), mientras que el clado geometricus se dispone como grupo hermano de los anteriores (clado CS y clado III), lo que relacionaría al género Latrodectus de manera parafilética con el clado CS. Arnedo et al. (2004), evidencia someramente esta situación, relacionando a las especies de la subfamilia de forma polifilética, pero solo utiliza tres especies de esta subfamilia, con lo que se hace imposible establecer de manera robusta las relaciones entre ellas. Por otra parte, los genes 18 S y 28 S, recuperan el clado CS, parcialmente el clado mactans, y al igual que el el gen COI L. geometricus queda como grupo hermano de el clado CS y de las demás especies de Latrodectus, agrupando así a los linajes de Latrodectus de forma parafilética. Se debe agregar que el gen de la glándula de la seda tubuliforme (Tubul), se utilizó para establecer las relaciones filogenéticas de S. grossa. Dicha especie se agrupa con las especies de Latrodectus, relacionando a esta especie de manera parafilética. En todos los análisis se recupera la monofilia de la subfamilia, pero las relaciones internas de esta se debe reevaluar considerando una mayor cantidad de especies de los géneros Steatoda y Crustulina. L. geometricus tiende a comportarse como grupo basal del Latrodectinae. Además es necesario realizar una profunda revisión de los caracteres morfológicos que sustentan, sobre todo a las especies conflictivas. En tal caso, si esta revisión amerita efectuar cambios en el estatus taxonómico de las especies en cuestión, deberá ser realizado una vez se hallan examinados los especímenes y corroborado su correcta identificación, lo que por el momento, aun no se ha tenido la oportunidad de materializar. A B C Figura 2: Distancia pareada de bases nucleotídicas calculadas independientemente para cada gen. A) COI. B) 18S y 28S. C) Tubul. Agradecimientos Proyecto DIUC N

6 Literatura Citada Agnarsson, I Morphological phylogeny of cobweb spiders and their relatives (Araneae, Araneoidea, Theridiidae). Zoological Journal of the Linnean Socciety 141: Arnedo, M. A., J. A. Coddington, I. Agnarsson y R. G. Gillespie From a comb to a tree: Phylogenetic relationships of the comb-footed spiders (Araneae, Theridiidae) inferred from nuclear and mitochondrial genes. Molecular Phylogenetics and Evolution 31: Farris, J.S The logical basis for phylogenetic analysis. In: Platnick, I., Funk, V.A. (Eds.), Advances in Cladistics. Procedings of the second meeting. Willi Henning Society Columbia University Press, New York Vol. 2: Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R. y Vrijenhoek, R., DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology 3(5): Garb, J. E., A. González y R.G. Gillespie The black widow spider genus Latrodectus (Araneae: Theridiidae): phylogeny, biogeography and invasion history. Molecular Phylogenetics and Evolution 31(3): Goloboff P. A., Farris J. S., Källersjö M., Oxelman B., Ramírez M., Szumik C. A Improvements to resampling measures of group support. Cladistics 19: Goloboff, P.A., Farris, J.S Methods for quick consensus estimation. Cladistics 17: Goloboff, P.A., J.S. Farris y K.C. Nixon TNT, a free program for phylogenetic analysis. Cladistics. 24: Huelsenbek, J.P, B. Larget, R.E. Miller y F. Ronquist Potential applications and pitfalls of Bsyesian inference of phylogeny. Systematic Biology. 51: Huelsenbek, J.P. y F. Ronquist Mr. Bayes: Bayesian inference of phylogeny. Bioinformatics. 17: Milne I, Wright F, Rowe G, Marshal DF, Husmeier D and McGuire G TOPALi: Software for Automatic Identification of Recombinant Sequences within DNA Multiple Alignments, Bioinformatics 20 (11), Nylander, J.A.A., F. Ronquist, J.P. Huelsenbeck y J.L. Nieves-Aldrey Bayesian phylogenetics analysis of combined data. Systematic Biology. 53: Platnick, N.I The World Spider Catalog. Version American Museum of Natural History. URL: Accesado: Julio, Ronquist, F. y J.P. Huelsenbeck MrBAYES 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics. 19: Tamura, K., J. Dudley, M. Nei y S. Kumar MEGA 4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24(8): Thompson, J.D., T.J. Gibson, F. Plewniak, F. Jeanmougin y D.G. Higgins The CLUSTAL X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 25(24): Xia, X., and Xie. Z DAMBE: Data analysis in molecular biology and evolution. Journal of Heredity 92: