PRÁCTICA 5. ANÁLISIS FILOGENÉTICO.

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1 PRÁCTICA 5. ANÁLISIS FILOGENÉTICO. La reconstrucción de la historia evolutiva de los organismos es uno de los objetivos principales de la biología evolutiva. La sistemática es el campo de la biología que se enfoca en entender las relaciones evolutivas entre organismos (hipótesis filogenéticas) y, con ello, permite inferir los procesos o eventos que han dado origen a la distribución y extraordinaria diversidad de organismos del planeta (Lipscomb 1998). A nivel biogeográfico, los estudios filogenéticos no solo son importantes a nivel evolutivo sino que son de gran relevancia en la determinación del supuesto de monofilia de los grupos de estudio. Por lo tanto, en esta práctica introducimos los conceptos básicos del análisis filogenético, mediante ejercicios sencillos, y mostramos la utilidad de dichos análisis en los estudios biogeográficos. Ejercicio 1 En este primer ejercicio compararemos el uso de análisis basados en similitud (análisis de agregración o cluster) o fenéticos con aquellos basados en caracteres que provean información genealógica, o análisis cladísticos. Mientras los primeros agrupan taxa con base en la similitud global, los segundos permiten reconstruir las relaciones ancestrodescendiente con base en caracteres derivados compartidos, o sinapomorfias. Para esta práctica utilizaremos el programa PAST (PAleontological STatistics, de Hammer y col. 2001), el cual se puede obtener de manera libre en la siguiente dirección: La Tabla 1 nos proporciona información hipotética (tomada de Lipscomb 1988) de caracteres (columnas) y su presencia/ausencia en cinco taxa (filas). La presencia de caracteres se indica con el signo más (+), mientras que su ausencia con el menos (-). El grupo externo se ha colocado como O. Es importante señalar que en PAST el grupo externo debe colocarse en la primera fila, donde es automáticamente reconocido como tal. Para transformar esta matriz en una matriz con datos binarios (0,1) vamos a utilizar la información proveniente del grupo externo, el cual nos permite polarizar los caracteres (si está presente en el grupo externo se considera la condición ancestral, por lo que se identifca con 0). Tabla 1. Matriz de datos para la reconstrucción filogenética (tomada de Lipscomb 1998). Caracteres Taxa A B C D E O Una vez transformada la matriz en 0s y 1s, seleccione toda la matriz, presione la pestaña Multivar y vaya a Cluster Analysis. Inmediatamente se observa el resultado, asociado a una serie de opciones de algoritmo y medidas de similitud. Nosotros usaremos el algoritmo UPGMA (que funciona generando una agrupación simple y jerárquica de especies basado en una matriz de distancia) y la distancia Euclidea como medida de similitud en este ejemplo. En la esquina inferior derecha encontrará tres botones. Con el botón del medio se puede copiar el gráfico y colocarlo en un documento Word para su posterior comparación. Puede rehacer este ejercicio pero sin considerar el grupo externo (anfibios). Nota alguna diferencia?. Para la reconstrucción filogenética, utilizaremos el método de máxima parsimonia (única opción en PAST). Seleccione toda la matriz y presione la pestaña Cladistics. Inmediatamente aparece una ventana con una serie de opciones. Aparecen cinco opciones de algoritmos de búsqueda los cuales permiten desde una búsqueda exhaustiva (explorando todos los árboles posibles) hasta búsquedas más rápidas pero menos óptimas (heurísticas, NNI). En la sección de optimización, aparecen tres criterios para optimizar los caracteres, los cuales permiten 1

2 determinar el número de pasos entre un estado del carácter y otro: Wagner (estados reversibles y aditivos u ordenados), Fitch (reversibles pero no aditivos u ordenados) y, finalmente, Dollo (cambios irreversibles del estado del carácter, por lo que las homoplasias son tratadas como reversiones o pérdidas secundarias). La ventana también permite manipular el número de reordenamientos en búsquedas heurísticas y el número de réplicas de muestreo con reemplazo (bootstrap). Igualmente, se pueden observar las estadísticas de número de árboles, longitud y el número de árboles más parsimoniosos. Para este ejercicio no vamos a modificar ninguno de los valores indicados por el programa. Apriete la casilla GO y podrá ver los resultados. En la ventana que aparece Ud. puede analizar la evolución de los caracteres mapeando éstos sobre la filogenia, presionando las flechitas hacia arriba o abajo en la esquina inferior derecha. Igualmente, se pueden observar las estadísticas de longitud e índices de consistencia y retención, los cuales evalúan la cantidad de homoplasia presente en el cladograma. Compare el cladograma obtenido con el fenograma anterior. Son iguales? Observe la matriz e indique qué caracteres agrupan a los taxas B y C o D y E en el análisis de similitud Hay diferencias en relación al análisis filogenético? Qué puede concluir con respecto al uso de análisis de similitud para reconstruir las relaciones filogenéticas de organismos? Considera que ambos análisis proveen con la misma información? Ejercicio 2 En este ejercicio utilizaremos una matriz de diez caracteres morfológicos para reconstruir las relaciones filogenéticas de los Amniota (Tabla 2). Esta matriz es tomada de Brooks y col. (1988) y nos permitirá reforzar algunos conceptos de la reconstrucción filogenética. Introduzca la matriz en PAST y realice los análisis filogenéticos como se indicó en el ejercicio anterior. Responda las siguientes preguntas: Son los reptiles un grupo monofilético? Identifique algunos caracteres simplesiomórficos, sinapormórficos y autapomórficos. Qué caracteres representan una sinapomorfia de los Amniota? Hay evidencia de evolución convergente de caracteres en la hipótesis filogenética de los Amniota? Compare el uso de los diferentes algoritmos de búsqueda del árbol más parsimonioso. Observa alguna diferencia? Compare, igualmente, el uso de diversos métodos de optimización, en especial Wagner o Fitch con Dollo. Observe como se distribuyen los estados de los caracteres a lo largo del cladograma. Hay diferencias en la longitud de los árboles? Para observar la distribución de longitudes de árboles, haga una búsqueda exhaustiva con estos tres criterios de optimización. Observa alguna diferencia? Si en alguna de las búsquedas Ud. obtuvo más de un árbol parsimonioso, realice la búsqueda del árbol concenso. Presione la pestaña Consensus en la esquina inferior derecha. Este puede ser estricto o basado en el criterio de la regla de la mayoría (mayor o igual al 50%). Qué observa? Finalmente, utilizaremos bootstrapping como prueba estadística que provee con un índice de soporte de clados presentes en la reconstrucción filogenética. Esta es una prueba de muestreo con reemplazo que genera una serie de matrices de caracteres (pseudoréplicas) con las que se generan cladogramas adicionales. Los resultados se pueden visualizar como árbol de consenso estricto o regla de la mayoría. 2

3 Tabla 2. Matriz de caracteres morfológicos a ser utilizados en el análisis filogenético de los Amniota (tomado de Brooks y col. 1994). Caracteres Taxa A B C D E F G H I J Anfibios 2 5 no si Urea ecto no no si 0 Mamíferos 2 5 no si Urea endo si no si 1 Aves 1 4 si no Úrico endo si no si 2 Lagartos 1 5 no si Úrico ecto si si no 2 Culebras 1 0 no si Úrico ecto si si no 2 Tortugas 1 5 no si Úrico ecto si no si 0 Cocodrilos 1 4 si no Úrico ecto si no si 2 A: Articulación del cráneo (número de cóndilos occipitales). B: Número de dígitos del miembro trasero. C: Sistema digestivo (presencia o ausencia de una molleja muscular). D: Sistema urogenital (presencia o ausencia de vejiga urinaria). E: Tipo de desecho nitrogenado (amoníaco vs. úrea o ácido úrico). F: Tipo de metabolismo (endotermia o ectotermia). G: Sistema reproductivo (presencia de huevo amniota). H: Genitalia masculina (presencia o ausencia de hemipenis). I: Fusión del hueso cuadrado con el yugal y cuadradoyugal. J: Número de orificios temporales del cráneo. Ejercicio 3. En este ejercicio vamos a utilizar otro tipo de caracteres, de uso común en la actualidad, como lo son los caracteres moleculares. Para ello vamos a utilizar una matriz de datos de un grupo de aves de la familia Furnariidae para evaluar la hipótesis de monofilia del grupo Margarornis (el cual incluye cuatro géneros: Margarornis, Premnoplex, Premnornis y Roraimia; Fig. 1). La monofilia es un supuesto que tiene que ser evaluado antes de proponer hipótesis biogeográficas. En este grupo, la presencia de especies en la región del Pantepui, como en la Cordillera de la Costa y los Andes, es atractiva para la propuesta de hipótesis de colonización o vicarianza como resultado de la dinámica geológica y/o climática de la Región Neotropical. Para evaluar la hipótesis de monofilia del grupo Margarornis vamos a utilizar el programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetic Analyses, Tamura y col. 2007). Este es un software libre que puede obtenerse en Nosotros vamos a utilizar una matriz con el formato Mega (*.meg). Sin embargo, este programa permite convertir diferentes tipos de archivos (incluyendo formatos FASTA y NEXUS, formatos característicos de GenBank o PAUP). La nueva versión del programa (MEGA 5) puede obtener las secuencias de manera directa del GenBank. Abra el programa MEGA y presione la pestaña File y luego Open Data. Se abrirá una ventana que le permitirá localizar el archivo Margarornis.meg (colocándole la terminación.meg el programa lo reconoce automáticamente como MEGA; si no se le añade esta terminación, entonces hay que colocar all en la pestaña de tipo de formato). Esta matriz incluye información de 1041 caracteres (posiciones o pares de bases) correspondientes a secuencias de la subunidad 2 del gen Nicotinamida Deshidrogenasa, una proteína mitocondrial que interviene en la cadena respiratoria. Se abrirá una nueva ventana con el objeto de seleccionar el tipo de datos y otras convenciones de uso de los datos en la matriz. Presione OK para la opción Nucleotide Sequences. Inmediatamente aparece un recuadro preguntando si los datos son de un gen que codifica para alguna proteína. Responda SI, ya que como dijimos antes, este gen codifica para una proteína. Aparece otra ventana donde debe seleccionar el código genético a utilizar. En este caso es Vertebrado Mitocondrial. Coloque OK. 3

4 Figura 1. Taxa incluídos en el grupo Margarornis y su distribución en la Región Neotropical. Se abrirá el Explorador de Datos donde podrá visualizar, mediante el uso de los botones en la barra de herramientas, la variación genética presente en estas secuencias (caracteres filogenéticamente informativos, sitios conservados, sitios variables, entre otros). Una vez explorado los datos, puede cerrar la ventana y seleccionar Phylogeny en la ventana del programa. Presione Construct Phylogeny y luego Maximum Parsimony. Aparece una ventana para seleccionar opciones del análisis. Presione dos veces las casillas verdes al final de las filas de Phylogeny Tests and options y Search options y seleccione las opciones de su preferencia (en Phylogeny Tests seleccione Bootstrap). Presione Compute y describa los resultados (puede tardar unos minutos obtenerlos). Opcionalmente puede realizar análisis de Máxima Verosimilitud y comparar los resultados obtenidos con ambos métodos de reconstrucción filogenética. Fíjese que no encontramos opciones para asignar el grupo externo, el cual en nuestro caso es Geositta cunicularia. Para enraizar el cladograma obtenido, explore los botones presentes en el panel izquierdo de la ventana. El primer botón (un arbolito con una flecha verde) permite seleccionar el taxón que servirá para enraizar el árbol. Presione el botón y con el apuntador seleccione la rama que lleva a G. cunicularia. Inmediatamente este taxón se ubicará como grupo externo. Es el grupo Margarornis un grupo monofilético como se había indicado previamente en la literatura (y verificado con análisis filogenéticos de caracteres musculares de los miembros posteriores, Fig. 2)? Cómo interpreta estos resultados? Figura 2. Hipótesis filogenética del grupo Margarornis con base en caracteres de la musculatura de los miembros posteriores. Cada uno de los números identifica a tres sinapormorfias presentes en el grupo (tomado de Rudge & Raikow 1992). 4

5 BIBLIOGRAFÍA Brooks, D. R., D. A. McLennan, J. P. Carney, M. D. Dennison y C. A. Goldman Phylogenetic systematics: developing an hypothesis of amniote relationships. Pp: , En Tested studies for laboratory teaching, Volume 15 (C. A. Goldman, Editor). Proceedings of the 15th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), 390 pages. Hammer, Ø., D. A. T. Harper y P. D. Ryan PAST: Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis. Palaeontologia Electronica 4(1): 9pp. Lipscomb, D Basics of Cladistic Analysis. George Washington University, Washington, D.C. Rudge, D. W. y R. J. Raikow The phylogenetic relationships of the Margarornis assemblage (Furnariidae). Condor 94: Tamura K., J. Dudley, M. Nei y S. Kumar MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: