COMPARACIÓN MOLECULAR DE GÉNEROS Y ESPECIES DE TRICHOGRAMMATIDAE DE MÉXICO, BASADOS EN SUS ESPACIADORES INTERGÉNICOS Y GENES RIBOSOMALES

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1 COMPARACIÓN MOLECULAR DE GÉNEROS Y ESPECIES DE TRICHOGRAMMATIDAE DE MÉXICO, BASADOS EN SUS ESPACIADORES INTERGÉNICOS Y GENES RIBOSOMALES Molecular comparison of genera and species of trichogrammatidae of mexico, based on their intergenic spacers and ribosomal genes Verónica Ávila-Rodríguez 1 y Omar G. Alvarado-Gómez 2. 1 Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León, Av. Universidad y Pedro de Alba s/n Ciudad Universitaria. San Nicolás de los Garza, N. L. México. 2 Facultad de Agronomía de la Universidad Autónoma de Nuevo León, Carr. Laredo Km. 3. General Escobedo, N. L. México. vavilar@gmail.com Palabras Clave: Tricogramátidos, Géneros, Identificación Molecular. Introducción Las avispitas de esta familia son parasitoides de huevecillos de insectos (Pinto y Stouthamer 1994), los cuales son de un valor considerable en el combate biológico y tienen una amplia variación de huéspedes, ya que se les ha encontrado atacando a más de 150 especies de Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, Homoptera, Hemiptera, Hymenoptera y Neuroptera. La familia Trichogrammatidae es la más pobremente conocida del orden Hymenoptera (Pinto 2006). La taxonomía de estos grupos es poco conocida debido principalmente a su tamaño diminuto, menos de 1 mm, que existe heterogeneidad morfológica en algunos géneros, que presentan alta plasticidad morfológica en algunas especies y a que la determinación morfológica requiere de preparación de laminillas para su identificación, lo cuál es difícil y consume tiempo. La técnica molecular PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es una herramienta con la cual podemos contribuir al conocimiento de estas avispitas mediante marcadores genéticos como RNAr 18S y los espaciadores intergénicos ITS. La molécula 18s en los insectos es altamente conservada (presenta tasa de cambio muy limitada), esta molécula es usada como reloj evolutivo. Gillespide et al. (2005) compilò una base de datos molecular para establecer la filogenia de la familia Trichogrammatidae basado en la amplificación de la región ARNr 18s, en la cuál incluye 54 géneros conocidos y dos géneros no descritos, usando como grupo externo al género Erectocerus Haldeman (Hymenoptera: Aphelinidae). El espaciador trascripto interno ITS del ADNr es una de las regiones hipervariables más frecuentemente utilizadas para análisis filogenéticos, reconstruye la relación filogenética entre especies y géneros utilizando las secuencias de nucleótidos. Evolutivamente la subporción ITS2, es necesaria para el procesamiento de la transcripción multimolecular del ARN transcripto. La región ITS2 conserva el material genético para distinguir eventos evolutivos raros, esta región es relativamente corta y fácil de secuenciar (Coleman 2003). Esta región ha sido ampliamente explorada para determinar especies de la familia Trichogrammatidae, en particular en la determinación de especies del género Trichogramma Westwood (Ciciola Jr. et al. 2001, Sappal et al. 1995, Stouthamer et al y España et al. 2006). Los fragmentos de la región ITS2 han podido ser amplificados en la especie del género Uscana, S. semifumipennis Girault (Schilthuizen y Stouthamer 1997). Por lo anterior el objetivo del presente trabajo es comparar molecularmente los géneros y algunas 982

2 especies de tricogramátidos más comunes encontrados en México, basándose en sus espaciadores intergénicos y genes ribosomales. Materiales y Método Insectos utilizados. La colecta de especímenes se realizó en áreas cultivadas y naturales de diferentes estados del país. El análisis y proceso de muestras se realizó en el laboratorio de la Colección de Insectos Benéficos Entomófagos (CIBE) y en el laboratorio de Ecología Molecular, de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Autónoma de Nuevo León, México. Las avispitas analizadas en el presente trabajo corresponden a los géneros y especies Oligosita Walker, Pseudoligosita marilandia (Girault), Tichogramma pretiosum, Paracentrobia Howard, Ittys Girault, Burksiella spirita (Girault), Ufens Girault y Zagella flavipes Girault, los cuales fueron colectados en diferentes regiones de México. La obtención de los insectos fue mediante red entomológica y los especímenes obtenidos fueron conservados en alcohol al 80%. Para la determinación morfológica se utilizaron las claves de Doutt y Viggiani (1968), Triapitsyn (2003) y Pinto (2006). Amplificación por PCR de las regiones ITS2 y 18S, y secuenciación. Se seleccionaron tres especimenes de cada género y especie para su análisis molecular. El ADN fue extraído en forma individual a partir de una avispita, usando el Kit QIAamp DNA MicroHandbook (Qiagen ), los productos de extracción fueron directamente utilizados para PCR. Los primers para las amplificaciones por PCR utilizados en este estudio coinciden con la región 18s del RNAr y fueron diseñados a partir de una secuencia consenso del género Ufens (sentido, 18s-for: 5 - TAACGATACGGGACTCATCC-3, antisenido, 18S-rev: 5 -GTGTTGAGTCAAATTAAGCC- 3 ). También se amplificó la región intergénica ITS2 con los primers, ITS2F: sentido 5 - TGTGAACTGCAGGACACATG-3 antisentido, ITS2R: 5 -GTCTTGCCTGCTCTGAG-3. Tanto los primers como el programa térmico utilizados en la amplificación de ADN fueron los descritos por Almeida y Stouthamer (2003). Para amplificar la región l8s la temperatura de anillamiento fue modificada a 50ºC. Los productos amplificados de los genes ITS2 del ADNr y 18s del ARNr en los diferentes géneros fueron separados por electroforesis en geles de agarosa 1.5%. Los geles fueron visualizados y fotografiados en un fotodocumentador Ovitec. Los productos fueron enviados a secuenciar a Macrogen Corp. (Maryland, U.S.A.). La secuenciación fue conducida en Big Dye TM terminator cycle sequencing kit (Applied Bio systems). Análisis. La alineación y análisis de relación filogenética de las secuencias se llevaron acabo usando el programa MEGA 4. (Tamura et al. 2007). Para el análisis de se utilizó el método de máxima parsimonia, para la construcción de la filogenia se selecciono el algoritmo parsimonioso branch-and-bound. Bootstrapping fue realizado con la búsqueda heurística de opción para 1000 replicas. Usando a Aphytis melinus DeBach (Hymenoptera: Aphelinidae) como grupo externo, basado sobre trabajos previos filogenéticos (Cheng Z. Y and F. Quetin en prensa). Resultados y Discusión Determinación molecular mediante PCR. El tamaño de los fragmentos amplificados por PCR de la región altamente conservada 18s del ARNr observados en geles de agarosa al 1.5% fue alrededor de 790pb nucleotídicas en los diferentes géneros de tricogrammátidos Oligosita, Pseudoligosita, Tichogramma, Paracentrobia, Ittys, Burksiella, Ufens y Zagella (Fig. 1). Por el contrario, la región hipervariable intergénica ITS2 mostró diferencia en tamaño de los fragmentos amplificados en los diferentes géneros Oligosita (460pb), Pseudoligosita 983

3 marilandia (450pb), Paracentrobia (590pb), Ittys (680pb), Ufens (690pb), Burksiella spirita (550pb), Zagella flavipes (700pb) y Trichogramma pretiosum (520pb) (Fig. 2). Esta región fue de gran utilidad para determinar los principales géneros de Trichogrammatidae presentes en México, ya que la variación mostrada en el tamaño de los fragmentos amplificados entre los géneros es suficiente para ser distinguidos mediante la región ITS2. bb a A A B B A B C 6 Fig. 1. Fig. 2. Karnyothri 27 Karnyoth Fig. 3. UBICACIÓK N Fig. GENERAL 4. K b 4 Fig Ka Fig. 1. Productos obtenidos de la amplificación de la región altamente conservada del gen ribosomal 18s, de los géneros de familia Trichogrammatidae. 1) marcador de peso molecular, 2) Oligosita, 3) Paracentrobia, 4) Ufens, 5) Trichogramma, 6) Pseudoligosita, 7) Burksiella, 8) Zagella y 9) Ittys. 400pb- 200pb- 100pb- 800 pb pb- 700 pb pb pb- 2000pb- 600pb- 500pb- 2400pb Fig. 2. Productos obtenidos de la amplificación de la región hipervariable intergénica ITS2 del ADNr, 1) marcador de peso molecular, 2) Oligosita 3) P. marilandia 4), Paracentrobia, 5) Ittys, 6) Ufens, 7) B. spirita, 8) Z. flavipes y 9) T. pretiosum. 984

4 Análisis de secuencias. Las secuencias obtenidas de la región 18s fueron comparadas con las secuencias encontradas en el Gen bank para esta región. Las secuencias fueron similares en un 98 y 99% para Oligosita, P. marilandia, T. pretiosum, Paracentrobia, Ittys y Ufens. La especie B. spirita fue similar en 96% con la especie Zagella spirita, actualmente esta especie esta clasificada como Burksiella spirita; mientras que el género Zagella mostró un 98% con el género Zagella sp. La inferencia evolutiva fue con el método de máxima parsimonia, el cuál fue reconstruida para ocho taxas y con el grupo externo A. melinus. La búsqueda del árbol más parsimonioso fue realizada con el algoritmo de branch-and-bound. El árbol más parsimonioso mostró una longitud de 1111, el índice de consistencia (IC) fue de , el índice de retención (IR) (estimación de niveles de homoplasia) fue de y el índice compuesto fue de para todos los sitios y el valor de los sitios informativos parsimoniosos fue de De un total de 353 caracteres, 289 mostraron información parsimoniosa. El porcentaje de replicas de árboles en el que los taxas asociados se unieron en la prueba de bootstrap fue de 1000 replicas. La relación evolutiva de estos clados mostró que los géneros Oligosita y Pseudoligosita, Paracentrobia e Ittys, así como Zagella y Burksiella son taxas hermanas. Los clados formados por Oligosita, Pseudoligosita, Paracentrobia, Ittys, Burksiella, Trichogramma, Zagella y Ufens son estrechamente cercanos en relación con el clado de Aphelinoidea. El cladograma muestra que el género Aphelinoidea es evolutivamente más antiguo y que las ramas compuestas por Oligosita, Pseudoligosita, Paracentrobia, Ittys, Zagella y Ufens son clados más recientemente formados (Fig. 3). El potencial de las secuencias de la región ITS2 para la determinación de géneros y especies de Trichogramátidos depende del conocimiento de estudios morfológicos, ya que las descripción de los géneros esta basada en su morfología, sin embargo se requieren más muestras para pruebas de consistencia, así como secuencias reportadas por otros autores, para ser utilizadas en análisis filogenéticos y poder soportar formalmente estos resultados encontrados. Los resultados del presente estudio muestran que la identificación molecular de géneros y especies de Trichogrammatidae optimiza y complementan los métodos actuales basados en características morfológicas Oligosita1-ITS-2 Pseudoligosita1-ITS-2 Paracetrobia1-ITS-2 Ittys1-ITS-2 Trichogramma-4-ITS-2 Burk siella-s3-its-2 Zagella-f1-ITS-2 Ufens1-ITS-2 Aphelinoidea-ITS-2 Aphytis melinus Fig. 3. Árbol consenso Máxima Parsimonia para los géneros de Trichogrammatidae. Los valores bootstrap para 1000 replicas son mostrados en las ramas

5 Agradecimientos Al Programa de Apoyo a la Investigación Científica y Tecnológica (PAICYT) con clave CN de la Universidad Autónoma de Nuevo León. Literatura Citada Almeida, R. P. and R. Stouthamer Molecular identification of Cacoeciae Marchal (Hymenoptera: Trichogrammatidae): A new record for Peru. Neotropic Entomology 32: Cheng Z. Y. and F. Quetin Q. The phylogenetic relationships of introduced Aphelinus (Hymenoptera: Aphelinidae). Biological Control Agents of the Russian Wheat Aphid (Homoptera: Aphididae). (En prensa). Coleman, A.W ITS2 is a double-edged tool for eukaryote evolutionary comparisons. Trends in Genetics 19: Doutt, R. L and G. Viggiani The classification of the Trichogrammatidae (Hymenoptera: Chalcidoidea). Proceedings of the California Academy of Sciences, Fourth series. 35: España-Luna M. P., O. G. Alvarado-Gómez, A. González-Hernández, S. Favela-Lara, J. Lozano- Gutiérrez y F. García- González Diferenciación genética de especies crípticas de Trichogramma Westwood (Hymenoptera: Trichogrammatidae). Folia Entomológica. Mexicana. 45: Gillespie, J. J., J. B. Munro, J. M. Heraty, M. J. Poder, A. K. Owen and A. E. Carmichael A secondary structural model of the 28S rrna expansion segments D2 and D3 for Chalcidoid wasps (Hymenoptera:Chalcidoidea). Mol. Biol. Evol. 22: Pinto, J. D. and R. Stouthamer Systematics of the Trichogrammatidae with emphasis on Trichogramma. Pp In: Wajnberg, E. & S. A. Hassan (eds.). Biological control with egg parasitoids. CAB Internacional, Wallingford. Pinto, J. D A review of the new world genera of Trichogrammatidae (Hymenoptera). Journal of Hymenoptera Research 15: Sappal, N. P., R. S. Jeng, M. Hubbes, and F. Liu Restriction fragment length polymorphisms in polymerase chain reaction amplified ribosomal DNAs of three Tricohogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) species. Genome 38: Schilthuizen, M. and R. J. Stouthamer Horizontal transmission of parthenogenesisinducing microbes in Trichogramma wasps. J. Proc. R. Soc. Lond. (B) 264: Stouthamer, R. J. Hu, F. Van Kan, G. R. Platner and J. D. Pinto The utility of internally transcriber spacer 2 DNA secuences of nuclear ribosomal gene for distinguishing sibling species of Trichogramma. BioControl 43: Tamura, K, Dudley J, Nei M and S. Kumar MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: Triapitsyn, S. V Taxonomic notes on the genera and species of: (Trichogrammatidae: Hymenoptera)- egg Proconiine sharpshooters (Hemiptera: Clypeorrhyncha: Cicadellidae: Proconiini) in southeastern U.S.A. Transactions of the American Entomological Society 129: