Identificación y caracterización biológica y molecular de una nueva especie de begomovirus bipartito: Tomato mottle Taino virus

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1 Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología Departamento de Plantas Laboratorio de Virología Vegetal Tesis en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas Identificación y caracterización biológica y molecular de una nueva especie de begomovirus bipartito: Tomato mottle Taino virus Pedro Luis Ramos González Ciudad de La Habana 2004

2 Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología Departamento de Plantas Laboratorio de Virología Vegetal Tesis en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas Identificación y caracterización biológica y molecular de una nueva especie de begomovirus bipartito: Tomato mottle Taino virus Autor: Lic. Pedro Luis Ramos González Tutores: Dr. Tirso Pons Hernández Dr. Rafael Rivera Bustamante Asesora: Dra. Ana María Riverón Rojas Ciudad de La Habana 2004

3 LISTA DE CONTENIDO Lista de contenido SÍNTESIS 1 LISTA DE ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS 2 1 INTRODUCCIÓN 5 2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Los geminivirus: primeros informes Características generales de la familia Geminiviridae Los géneros de la familia Geminiviridae Caracterización molecular de los miembros de la familia Geminiviridae Organización del genoma geminiviral Los genes geminivirales y las proteínas que codifican: sus funciones Productos génicos de los begomovirus bipartitos Productos génicos de los begomovirus monopartitos y curtovirus Productos génicos de los mastrevirus Caracterización bioquímica de las proteínas Rep y REn Caracterización bioquímica de las proteínas TrAP/C Caracterización bioquímica de las proteínas MP, NSP, CP, V1 y C Replicación del genoma de los geminivirus Expresión de los genes geminivirales Los promotores geminivirales: regulación de la expresión Ciclo replicativo geminiviral Tropismo de la infección por geminivirus Interacción del ciclo replicativo geminiviral con la fisiología de la célula vegetal Mecanismos que generan la diversidad genética de los geminivirus Diversidad de los geminivirus en América Latina, el Caribe y el sur de los Estados Unidos. Breve panorama del impacto económico de las epifitias geminivirales Diversidad de los geminivirus en Cuba Detección e identificación de los geminivirus 40 3 MATERIALES Y MÉTODOS Cepas bacterianas Enzimas, cebadores para la Reacción en Cadena de la Polimerasa y otros reactivos 43

4 Lista de contenido 3.3 Medios de cultivo Soluciones Plasmidios Métodos de análisis y manipulación de ADN Técnicas básicas de genética molecular Transformación de Escherichia coli Transformación de Agrobacterium tumefaciens Aislamiento de ADN plasmídico Aislamiento del ADN total vegetal y del ADN geminiviral Estimación de la concentración de las preparaciones de ADN Secuenciación de ADN Hibridación de ADN Hibridación en colonias Recolección y conservación de las plantas infectadas Transmisión viral Inoculación viral mediada por Agrobacterium tumefaciens Inoculación viral por injertos Inoculación viral por biobalística Preparación de las mezclas de ADN-micropartículas Inoculación viral manual o mecánica Transmisión por tubérculos Gama de hospedantes Reacción en cadena de la polimerasa para la detección de begomovirus Clonación y secuenciación de los fragmentos de genomas virales amplificados por la reacción en cadena de la polimerasa Análisis del polimorfismo basados en cortes con enzimas de restricción de los fragmentos amplificados por la reacción en cadena de la polimerasa Clonación del genoma de Tomato mottle Taino virus y su secuenciación Identificación de los sitios de restricción únicos en el genoma viral Clonación de los componentes A y B de Tomato mottle Taino virus Verificación de la infección e identificación de los componentes virales clonados Secuenciación del genoma de Tomato mottle Taino virus Obtención de dímeros y hemidímeros de los ADN A y B de Tomato mottle Taino virus 50

5 Lista de contenido 3.15 Experimentos de pseudorrecombinación Impresión de tejidos vegetales en membranas de nylon Hybond Hibridación no radiactiva para la detección del ADN de Tomato mottle Taino virus en las impresiones de tejidos vegetales infectados Aislamiento y clonación del promotor de la proteína asociada a la replicación de Tomato mottle Taino virus y sus fragmentos Modificación del vector binario pbi Transformación genética de plantas de tabaco, papa y tomate Obtención de suspensiones celulares de tabaco Regeneración de plantas a partir de suspensiones celulares de tabaco Localización histoquímica de la actividad de la β-d-glucuronidasa Extracción de proteínas y cuantificación de la actividad β-d-glucuronidasa Detección de la actividad del promotor de la proteína asociada a la replicación de Tomato mottle Taino virus durante el desarrollo de la planta de tabaco Biometría y Bioinformática Secuencias virales empleadas en los análisis bioinformáticos RESULTADOS Patrón de restricción de los fragmentos de 1,1 Kb amplificados a partir de las muestras de Alquízar y Quivicán Secuenciación de los fragmentos de 1,1 Kb y su comparación con la colección de secuencias nucleotídicas anotadas en bases de datos Detección de ADN B begomoviral en las muestras colectadas en Alquízar y Quivicán Separación de la mezcla Tomato yellow leaf curl virus-tomato mottle Taino virus Clonación y organización del genoma de Tomato mottle Taino virus Comparación de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de los genes y proteínas de Tomato mottle Taino virus con otros geminivirus: su relación filogenética Evidencias de la recombinación interespecífica en la evolución de Tomato mottle Taino virus Gama de hospedantes y transmisión de Tomato mottle Taino virus Detección de infección natural por Tomato mottle Taino virus en plantaciones de papa Tropismo de Tomato mottle Taino virus 78

6 Lista de contenido 4.9 Reordenamientos entre los componentes genómicos de Tomato mottle Taino virus, Potato yellow mosaic virus y Tomato mottle virus Identificación de posibles determinantes de la especificidad de la proteína asociada a la replicación de Tomato mottle Taino virus Modelación de la estructura 3D de la región N-terminal de la proteína Rep de Tomato mottle Taino virus Caracterización del promotor de la proteína asociada a la replicación de Tomato mottle Taino virus Actividad del promotor de la proteína asociada a la replicación durante el desarrollo de la planta de tabaco Actividad del promotor de la proteína asociada a la replicación en suspensiones celulares de tabaco y en plantas regeneradas a partir de éstas Delimitación de la región mínima requerida para la actividad vascular específica del promotor de la proteína asociada a la replicación 89 5 DISCUSIÓN Tomato mottle Taino virus es una nueva especie de begomovirus en la que la recombinación interespecífica contribuyó a su evolución Tomato mottle Taino virus pseudorrecombina con Potato yellow mosaic virus y no con Tomato mottle virus La especificidad de la proteína asociada a la replicación de Tomato mottle Taino virus por su origen de replicación, está determinada por los aminoácidos de las posiciones 3, 5, 8 y El promotor del gen de la proteína asociada a la replicación de Tomato mottle Taino virus dirige una expresión vascular específica en plantas solanáceas El patrón de expresión determinado por el promotor del gen de la proteína asociada a la replicación de Tomato mottle Taino virus puede ser un determinante genético del tropismo viral CONCLUSIONES RECOMENDACIONES REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS AUTOBIBLIOGRAFÍA 137

7 Síntesis SÍNTESIS Geminiviridae es una familia de virus vegetales cuyos miembros poseen como genoma a moléculas de ADN circular de simple cadena. Sus epifitias producen reducciones considerables en los rendimientos de varios cultivos, por ejemplo: el frijol (Phaseolus vulgaris L.), el tomate (Lycopersicon esculentum P. Mill.), la yuca (Manihot esculenta Crantz) y el algodón (Gossypium hirsutum L.). En el presente trabajo se describe el aislamiento y la caracterización de una especie nueva de esta familia: Tomato mottle Taino virus (ToMoTV). El aislamiento del virus se realizó mediante la transmisión selectiva por biobalística, a partir de extractos de ADN provenientes de plantas de tomate coinfectadas con Tomato yellow leaf curl virus. La clonación y la secuenciación del intermediario replicativo de ToMoTV, demostró que es un begomovirus bipartito americano típico, relacionado filogenéticamente con otros geminivirus aislados en la cuenca del Caribe, Centroamérica y la Florida. El análisis del genoma reveló que la recombinación interespecífica estuvo presente en la evolución de este virus. Los estudios de reordenamientos genómicos demostraron que ToMoTV no forma pseudorrecombinantes con Tomato mottle virus, su especie más cercana desde el punto de vista filogenético, pero sí pseudorrecombina de forma simétrica con Potato yellow mosaic virus. Estos experimentos permitieron determinar que los residuos Arg 3, Gly 5, Ser 8 y Lys 10, en el extremo N-terminal de la proteína asociada a la replicación (Rep), son los determinantes de la especificidad en la interacción con el ADN viral durante la replicación de ToMoTV. El análisis de un fragmento de 597 nt del componente genómico A de ToMoTV, demostró que este segmento contiene la región promotora correspondiente al gen que codifica para la proteína Rep. La actividad del promotor de la proteína Rep, caracterizada a través de la expresión del gen reportero uid A, está restringida al tejido vascular de plantas transgénicas de papa (Solanum tuberosum L.), tomate y tabaco (Nicotiana tabacum L.). La expresión guiada por este promotor se activa a partir de los siete días post-imbibición, durante la germinación de la plántula de tabaco, y permanece durante el resto del desarrollo del vegetal, incluido el órgano floral. Los análisis con mutantes por omisión de regiones, en el fragmento de 597 nt, demostraron que los elementos en cis mínimos necesarios para la actividad del promotor, se localizan en los primeros 132 nt del extremo 5. Esta región también muestra una actividad específica en el tejido vascular de las plantas transgénicas de tabaco. Los estudios de gama de hospedantes y transmisión, demostraron que ToMoTV se transmite eficientemente a un conjunto de solanáceas y fabáceas por métodos artificiales como la agroinoculación, el injerto y la biobalística, pero no mecánicamente. Los análisis sobre el tropismo viral revelaron la presencia de ToMoTV en los haces vasculares de plantas de tomate y de Nicotiana megalosiphon. Además, en este trabajo se describe la detección de cepas de ToMoTV en plantaciones de papa infectadas. 1

8 Lista de abreviaturas y acrónimos LISTA DE ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS Lista de abreviaturas 3D tridimensional aa aminoácidos ADN ácido desoxirribonucleico ADNc ADN cromosomal ADNdc ADN de doble cadena ADNsc ADN de simple cadena Amp Ampicilina ARN ácido ribonucleico cc Cadena complementaria cv Cadena viral CLE Elemento tardío conservado, del inglés Conserved Late Element CP Proteína de cápside, del inglés Coat Protein dc doble cadena DE Determinantes de especificidad DPI Días post-imbibición EEC Elemento estructural conservado EMBL Laboratorio europeo de biología molecular, del inglés European Molecular Biology Laboratory FR Forma replicativa GTP Guanosin trisfosfato ICTV Comité Internacional para la Taxonomía Viral, del inglés International Committee for Taxonomy of Virus Kb Kilopares de bases Kan Kanamicina MLA Marco de lectura abierto MP Proteína de movimiento, del inglés Movement Protein NES Señal de exportación nuclear, del inglés Nuclear Export Signal NSP Proteína transportadora nuclear, del inglés Nuclear Shutter Protein nt nucleótidos pb pares de bases PCNA Antígeno nuclear de proliferación celular, del inglés Proliferating Cellular Nuclear Antigen PTGS Silenciamiento génico posttranscripcional, del inglés Posttrancriptional Gene Silencing RC Región común RDP Siglas del inglés Recombinant Detection Program RCP Reacción en cadena de la polimerasa REn Proteína potenciadora de la replicación del inglés Replication Enhancement Rep Proteína asociada a la replicación, del inglés Replication-associated protein RI Región intergénica sc simple cadena Spm Espectinomicina del inglés Spectinomycin 2

9 Lista de abreviaturas y acrónimos Str Estreptomicina del inglés Streptomycin TrAP Proteína transactivadora, del inglés Trans-activator Protein Lista de acrónimos Los nombres y acrónimos de los virus que a continuación se listan y que se emplean en el documento, se han conservado en la forma en la que están registrados por el Comité Internacional de Taxonomía Viral (ICTV, siglas en inglés), por lo que estos representan los nombres científicos de estas especies. No se hizo la transcripción al español para evitar confusiones con las traducciones y porque además, no existe de forma oficial, en el caso de los virus, una correspondencia entre los nombres comunes y los científicos (Gibbs, 2003). Siguiendo las normas del ICTV (Fauquet y col., 2003), el nombre de aquellos miembros definitivos de cada género se han escrito en itálico. AbMV Abutilon mosaic virus ACMV African cassava mosaic virus BBTV Banana bunchy top virus BCaLCV Bean Calico leaf curl virus BCTV Beet curly top virus BCTV Cal [Log] Beet curly top virus California Logan BDMV Bean dwarf mosaic virus BeYDV Bean yellow dwarf virus BGMV Bean golden mosaic virus BGYMV Bean golden yellow mosaic virus BGYMV-DR Bean golden yellow mosaic virus-aislamiento de República Dominicana BGYMV-MX Bean golden yellow mosaic virus-aislamiento de México BGYMV-PR Bean golden yellow mosaic virus-aislamiento de Puerto Rico BSCTV Beet severe curly top virus CaLCuV Cabbage leaf curl virus CaMV Cauliflower mosaic virus CdTV Chino del tomate virus CLCuMV Cotton leaf curl Multan virus CLCV Cabagge leaf curl virus CuLCV Cucurbit leaf curl virus DiYMoV Dicliptera yellow mottle virus EACMCV East African cassava mosaic Cameroon virus EACMZV East African cassava mosaic Zamzibar virus ICMV Indian cassava mosaic virus MaYMV Macroptilium yellow mosaic virus MCLCV Melon chlorotic leaf curl virus MGMV-JM Macroptillium golden mosaic virus-jamaica MSV Maize streak virus 3

10 Lista de abreviaturas y acrónimos PepGMV PHYVV PYMPV PYMTV PYMV PYMV-GP PYMV-VE SACMV SiGMCRV SiGMFV SiGMHV SiGYVV SiYVV SLCMV SLCV SSV TbLRV TGMV ToDLCV ToLCLV ToLCrV ToLCV ToMHV ToMoTV ToMoV ToRMV TPCTV TYDV TYLCCNV TYLCSV TYLCV WDV Pepper golden mosaic virus Pepper huasteco yellow vein virus Potato yellow mosaic Panama virus Potato yellow mosaic Trinidad virus Potato yellow mosaic virus Potato yellow mosaic virus-aislamiento de la Isla Guadalupe Potato yellow mosaic virus-aislamiento de Venezuela South African cassava mosaic virus Sida golden mosaic Costa Rica virus Sida golden mosaic Florida virus Sida golden mosaic Honduras virus Sida golden yellow vein virus Sida yellow vein virus Sri Lankan cassava mosaic virus Squash leaf curl virus Sugarcane streak virus Tobacco leaf rugose virus Tomato golden mosaic virus Tomato dwarf leaf curl virus Tomato leaf curl Laos virus Tomato leaf crumple virus Tomato leaf curl virus Tomato mosaic Havana virus Tomato mottle Taino virus Tomato mottle virus Tomato rugose mosaic virus Tomato pseudo curly top virus Tobacco yellow dwarf virus Tomato yellow leaf curl China virus Tomato yellow leaf curl Sardinia virus Tomato yellow leaf curl virus Wheat dwarf virus 4

11 Introducción 1 INTRODUCCIÓN Las epifitias causadas por geminivirus son un factor limitante de la productividad de los cultivos del tomate (Lycopersicon esculentum P. Mill.) y del frijol (Phaseolus vulgaris L.) en Cuba. Por lo tanto, la detección y la caracterización de los agentes causales son una necesidad para el manejo de estas enfermedades. Los geminivirus se caracterizan por presentar genomas de ADN circular, de simple cadena, con tallas entre 2,5 y 3 Kb, y por ser encapsidados en partículas con morfología gemelar. Estos virus están agrupados taxonómicamente en la familia Geminiviridae y se subdividen en cuatro géneros (Mastrevirus, Curtovirus, Topocuvirus y Begomovirus) que se distinguen atendiendo a la gama de hospedantes, la organización genómica y al tipo de insecto que emplean como vector (Matthews, 1979; van Regenmortel y col., 2000). Los miembros del género Begomovirus se transmiten por la mosca blanca (Bemisia tabaci Gennadius), infectan plantas dicotiledóneas y sus genomas están constituidos por una o dos moléculas (monopartitos o bipartitos, respectivamente). Los virus de los restantes géneros son monopartitos. Los curtovirus y topocuvirus infectan plantas dicotiledóneas y los mastrevirus infectan principalmente a monocotiledóneas. Los miembros de estos tres géneros se transmiten por varias especies de saltahojas (Nesocluta tenellus, Circulifer tenellus, etc.) Geminiviridae es una familia de virus emergentes debido a la acelerada diseminación de sus miembros y a la creciente identificación de nuevas especies. A nivel mundial, a partir de 1980, numerosos informes revelaron las pérdidas parciales o totales producidas por los geminivirus, en especial por los begomovirus, en los cultivos de la yuca (Manihot esculenta Crantz), el tomate y el algodón (Gossypium hirsutum L.) (Brown y Bird, 1992; Anderson y Morales, 1994; Polston y Anderson, 1997; Morales y Anderson, 2001). Con anterioridad se prestó poca atención a estos patógenos porque infectaban sólo a malezas y afectaban esporádicamente a los cultivos (Moffat, 1999). Sin embargo, la consolidación de la agricultura extensiva y el desarrollo del intercambio de productos agrícolas (flores, frutos y posturas de hortalizas) contribuyeron a la propagación de los geminivirus y en especial de uno de sus vectores, la mosca blanca. La mosca blanca (Homoptera: Aleyrodidae) es una especie que exhibe polimorfismo biótico y los diferentes biotipos son morfológicamente indistinguibles (Brown, 2000; Jones, 2003). Este insecto se alimenta de más de 500 especies que pertenecen a 74 familias vegetales. El biotipo B u hoja plateada de la mosca blanca, es oriundo del medio oriente y se difundió por el mundo desde 1986 a través del comercio de plantas ornamentales (Brown y col., 1995b; De Barro y col., 2000). Se caracteriza por causar fitotoxicidad y por potenciar la dispersión de los begomovirus, propiciando la aparición de las infecciones mixtas (Bedford y col., 1994; Polston y Anderson, 1997; Jones, 2003). Además, la diseminación del biotipo B de la mosca blanca trae aparejada la identificación de nuevas especies de begomovirus (Polston y Anderson, 1997). El uso reiterado y en sobredosis de pesticidas para combatir a esta plaga, indujo la aparición de poblaciones resistentes a los insecticidas (De Barro, 1995). 5

12 Introducción Los geminivirus se replican en el núcleo celular empleando dos mecanismos no excluyentes: el mecanismo de círculo rodante y la replicación dependiente de la recombinación (Jeske y col., 2001). Ambos mecanismos necesitan de un intermediario replicativo de ADN de doble cadena, que además es activo en la transcripción (Hanley-Bowdoin y col., 2000). Para completar el ciclo infectivo, el genoma geminiviral codifica entre otras proteínas, aquellas indispensables para la replicación (Rep, Proteína asociada a la replicación) y la transcripción (TrAP, siglas del inglés Transactivator protein ) de sus genomas, el movimiento viral en el vegetal (MP y NSP, siglas del inglés Movement protein y Nuclear shuttle protein ; respectivamente) y para la proteína de la cubierta del virión (CP, siglas del inglés Coat protein ). La recombinación contribuye a la diversidad de los geminivirus (Padidam y col., 1999; Monci y col., 2002). Entre las causas probables que facilitan la recombinación están el alto número de copias del intermediario replicativo de ADN doble cadena y la ocurrencia de las infecciones mixtas entre geminivirus. La recombinación y la aparición de mutaciones generan la variabilidad genética necesaria para la adaptación de los geminivirus a diferentes nichos y para la aparición de nuevas especies. Entre los begomovirus bipartitos también puede ocurrir el intercambio de sus moléculas de ADN, proceso conocido como pseudorrecombinación, y que también contribuye a su variabilidad. Durante el ciclo infectivo de algunos geminivirus y posiblemente a consecuencia de la recombinación no homóloga, se generan moléculas de ADN simple cadena, circular, con tallas entre 1,1 y 1,4 Kb (Stenger y col., 1992; Stanley y col., 1997; Liu y col., 1998b). Estas moléculas defectivas retienen el origen de replicación geminiviral y otros pequeños fragmentos del genoma viral del que se derivan. Por ejemplo, segmentos del extremo 5 del gen que codifica para la proteína Rep, o de los genes que codifican para las proteínas del movimiento y la CP. El resto de la molécula está constituido por secuencias no relacionadas con los geminivirus. En la infección por geminivirus también pueden presentarse ADN satélites, como el ADN 1 y el ADN β (Dry y col., 1997; Mansoor y col., 1999; Saunders y col., 2002a). Los ADN satélites son moléculas circulares que poseen tallas entre 0,6 y 1,3 Kb, que pueden o no replicarse autónomamente, y sus secuencias no están relacionadas con la de los geminivirus (Mansoor y col., 2003). La detección y la caracterización parcial de los geminivirus se realizan mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP), la hibridación de ADN y en menor grado por ensayos inmunoquímicos. Para la RCP se emplean cebadores específicos o degenerados, los que permiten detectar la presencia de uno o de varios geminivirus, respectivamente. En la detección de los begomovirus es común el empleo del par de cebadores degenerados pal1v1978-par1c496, que permite discernir entre los virus que poseen un genoma monopartito y los que lo poseen bipartito (Rojas y col., 1993). Estos cebadores hibridan en regiones conservadas (en términos relativos) de los genes que codifican para las proteínas Rep y CP en los genomas begomovirales. La separación entre estas regiones en los begomovirus bipartitos es diferente a la que se presenta en los monopartitos. Los fragmentos amplificados a 6

13 Introducción partir de los begomovirus monopartitos son de 1,4 Kb aproximadamente, mientras que a partir de los bipartitos se amplifica un fragmento de alrededor de 1,1 Kb. Por otra parte, en la detección de geminivirus mediante la hibridación de ADN se emplean sondas que se generan a partir de genomas geminivirales conocidos. Hasta la fecha, todos los geminivirus identificados en América son begomovirus, excepto los cuatro miembros del género Curtovirus, que se encuentran confinados en Norteamérica. Los begomovirus irrumpieron en la América tropical y el Caribe en la década posterior a 1950, y la entrada del biotipo B de la mosca blanca a finales de los 80 impulsó la diseminación y la aparición de nuevas especies (Polston y Anderson, 1997). En Cuba, los cultivos del tomate y del frijol fueron los primeros afectados por el complejo mosca blanca-geminivirus. Los trabajos iniciales para identificar a los virus presentes, atendiendo a la sintomatología de las plantas enfermas, propusieron la presencia del begomovirus monopartito Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) y del begomovirus bipartito Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV) en los cultivos del tomate y del frijol, respectivamente (Gómez y González, 1993; Blanco y Faure, 1994). La caracterización molecular del virus presente en las plantaciones habaneras de tomate confirmó la presencia de TYLCV (Ramos y col., 1996; Martínez y col., 1996). Sin embargo, las pérdidas económicas asociadas a la enfermedad estimularon a caracterizar molecularmente la población geminiviral a lo largo del país, lo que facilitaría implementar diversas medidas fitosanitarias. Entre diciembre de 1994 y febrero de 1996, se recolectaron por todo el país muestras de plantas de tomate enfermas y se determinó la presencia de geminivirus en sus extractos de ADN mediante la RCP y el empleo de los cebadores pal1v1978 y par1c496. Los resultados a partir de todas las muestras colectadas, mostraron la amplificación de un fragmento de 1,4 Kb aproximadamente, lo que sugirió la presencia de un begomovirus monopartito. Las muestras correspondientes a las localidades habaneras de Alquízar y Quivicán mostraron además, fragmentos de 1,1 Kb aproximadamente. Este resultado indicó la presencia de: a) un begomovirus bipartito, b) un mutante por reordenamiento de un begomovirus monopartito (ej. eliminación de 300 nt en la región a amplificar), o c) una partícula defectiva. La hibridación de los productos de la RCP, en condiciones restringentes y con sondas derivadas del genoma de TYLCV, mostró señal únicamente en los fragmentos de 1,4 Kb aproximadamente. Otros análisis por RCP con el empleo de cebadores específicos para TYLCV y la secuenciación de los fragmentos de talla aproximada 1,4 kb, corroboraron la presencia de TYLCV en todas las muestras colectadas (Herrera y col., 1999). A la vez, la ausencia de señales de hibridación asociadas a las bandas de 1,1 Kb descartó la opción de un mutante de TYLCV, o de una partícula defectiva generada a partir del genoma de este virus. Así, este conjunto de evidencias apuntó hacia la presencia de un begomovirus bipartito en el cultivo del tomate en Cuba. Tal vez pudiese tratarse de una cepa de BGYMV con posibilidad de infectar tomate, de una cepa de una especie viral detectada previamente en una región geográfica fuera de Cuba, o tratarse de una especie begomoviral no identificada con anterioridad. Aunque el tomate no se encuentra entre la gama de hospedantes reconocida para BGYMV, existe esta 7

14 Introducción posibilidad debido a la alta capacidad de adaptación de los geminivirus. Por lo tanto, de acuerdo con las evidencias preliminares obtenidas en los análisis de las muestras de Alquízar y Quivicán se formuló la siguiente hipótesis: Existe un begomovirus bipartito en el cultivo del tomate en Cuba, que puede representar una nueva especie en el país o en la familia Geminiviridae. En consecuencia, se plantearon los siguientes objetivos: 1. Determinar la identidad del begomovirus desconocido presente en las plantas de tomate colectadas en las localidades de Alquízar y Quivicán, y establecer su relación filogenética con los virus miembros de la familia Geminiviridae. 2. Realizar la caracterización biológica del virus desconocido, a través de la identificación de sus hospedantes, la transmisión por métodos artificiales y su tropismo. 3. Evaluar la replicación y la regulación de la expresión génica del virus identificado. Para cumplir con los objetivos trazados se propusieron las siguientes tareas: 1. Realización de un ensayo tipo RFLP del fragmento de 1,1 Kb amplificado por RCP y su comparación con los correspondientes a otros geminivirus caracterizados. 2. Secuenciación del fragmento de 1.1 Kb y realización de un ensayo tipo Southern con el empleo de sondas heterólogas obtenidas a partir de un begomovirus bipartito caracterizado, para confirmar la naturaleza bipartita del begomovirus en estudio. 3. Separación de la mezcla Tomato yellow leaf curl virus-begomovirus bipartito presente en las muestras de tomate de Alquízar y Quivicán, clonación de la forma replicativa del virus bipartito y la secuenciación de su genoma. 4. Establecimiento de la relación filogenética entre el virus desconocido y otros miembros de la familia Geminiviridae. Una vez establecida la identidad del virus en estudio y conocido que representaba una nueva especie dentro de la familia Geminiviridae, se propusieron las siguientes tareas: 5. Detección de los hospedantes experimentales del virus identificado entre especies vegetales de las familias Solanaceae y Fabaceae, empleando la agroinoculación, la biobalística, el injerto y la inoculación mecánica como medio de transmisión. 6. Caracterización de las cepas del virus identificado en posibles hospedantes naturales alternativos al tomate. 7. Identificación del tropismo del virus en estudio en dos de sus hospedantes. 8. Evaluación de la capacidad de pseudorrecombinación del virus identificado con los geminivirus Potato yellow mosaic virus y Tomato mottle virus, aislados de la región del Caribe y la Florida, respectivamente. 9. Identificación de los aminoácidos de la proteína asociada a la replicación del virus en análisis, que determinan la especificidad de su interacción con el origen de replicación. 10. Delimitación de la región mínima del promotor del gen que codifica para la proteína Rep y la caracterización de su patrón de expresión en plantas transgénicas de especies solanáceas. 8

15 Introducción La novedad científica de este trabajo radica en la identificación de una nueva especie viral (Tomato mottle Taino virus, ToMoTV), reconocida desde el año 2000 por el ICTV (siglas del inglés International Committee for Taxonomy of Viruses ) como miembro definitivo del género Begomovirus de la familia Geminiviridae (van Regenmortel y col., 2000). Además, el estudio del genoma de ToMoTV aportó datos sobre dos aspectos de interés actual en la biología molecular de los geminivirus: (1) los determinantes de especificidad (DE) en la replicación geminiviral y (2) la regulación de la expresión génica en los geminivirus. La identificación de cepas de ToMoTV en plantaciones de papa, constituye el primer reporte de la presencia de geminivirus en este cultivo en Cuba. El presente trabajo también aporta evidencias sobre el papel de la recombinación y la pseudorrecombinación en la generación de la diversidad genética geminiviral. La importancia teórica del trabajo reside en que se dispone del genoma de un aislamiento cubano de un begomovirus americano típico, cuyo análisis brinda nuevos datos sobre la evolución de los geminivirus y la epifitiología de esta familia viral en la región. Las secuencias de los ADN A y B de ToMoTV se han depositado en la base de datos EMBL con los números de acceso AF y AF012301, respectivamente. A través de los estudios de pseudorrecombinación desarrollados, se aportaron nuevos elementos que contribuyen a demostrar la veracidad de la hipótesis de los iterones (Argüello-Astorga y col., 1994a) y en paralelo se identificaron aminoácidos de la proteína Rep geminiviral que pueden constituir los DE en la interacción Rep-origen de replicación. También se logró definir, a través de la expresión de un gen reportero en plantas transgénicas, el patrón de expresión específico del tejido vascular dirigido por el promotor del gen que codifica para la proteína Rep de ToMoTV, así como el fragmento mínimo necesario para esa actividad. La importancia práctica del trabajo radica en que se detectó la presencia de un nuevo virus que infecta las plantaciones de tomate y papa en Cuba, y que potencialmente puede infectar a otros cultivos de interés económico como son el frijol y el tabaco (Nicotiana tabacum L.). Así, este trabajo aporta datos para el desarrollo de las medidas fitosanitarias requeridas para el control del patosistema agrícola en Cuba. También los trabajos recogidos en la tesis permiten contar con el genoma clonado de un begomovirus americano, a partir del cual se han generado sondas útiles para la detección e identificación de éste y otros geminivirus que afectan los cultivos del frijol y del tabaco en Cuba. Los genes u otros fragmentos del genoma de ToMoTV se pueden emplear en la generación de construcciones genéticas para implementar la resistencia derivada del patógeno en plantas transgénicas. En este sentido, el empleo de los genes derivados de este virus pudiese complementar los trabajos que se realizan en nuestro país para la obtención de plantas transgénicas de tomate resistentes a la infección por TYLCV y lograr resistencia a un espectro mayor de geminivirus. Los estudios desarrollados en la tesis acerca de la pseudorrecombinación entre dos especies de geminivirus, alertan sobre la viabilidad de genomas virales quiméricos que pudiesen constituir los agentes causales de nuevas epifitias. Por otra parte, el aislamiento del promotor del gen que codifica para la 9

16 Introducción proteína Rep permite contar con una herramienta útil en el desarrollo de nuevas estrategias de expresión de genes en plantas transgénicas, teniendo en cuenta que dicha expresión sólo estará dirigida a ciertos tipos celulares del tejido vascular vegetal. De esta manera se garantiza una disminución de la carga metabólica que impone al vegetal el uso de promotores constitutivos. La tesis está dividida en 11 secciones. Son ellas: Síntesis, Lista de abreviaturas y acrónimos, Introducción, Revisión bibliográfica, Materiales y Métodos, Resultados, Discusión, Conclusiones, Recomendaciones, Referencias bibliográficas y Autobibliografía del aspirante. El documento posee 35 figuras y 12 tablas que contribuyen a la compresión del contenido que se presenta. Los resultados obtenidos en este trabajo han sido incluidos en una comunicación corta y tres artículos, todos en revistas arbitradas. Parte de los resultados presentados en la tesis han sido seleccionados como logro institucional del CIGB (1997), resultado destacado de la delegación provincial Habana del CITMA (2001), premios del Ministerio de la Agricultura de Cuba (1998 y 2001) y premio de la Academia de Ciencias de Cuba (1998). 10

17 Revisión bibliográfica 2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1 Los geminivirus: primeros informes La primera referencia a los geminivirus, y tal vez a un virus vegetal, aparece en un poema recogido en la antología clásica japonesa Manyōshū. En dicho poema, escrito por la Emperatriz Kōken en el 752 DC, se describe la belleza de las hojas amarillas de una planta que hoy día se conoce como Eupatorium makinoi. Esa descripción coincide con los síntomas del mosaico amarillo de las nervaduras causado en esta planta por el complejo formado por el geminivirus Eupatorium yellow-vein virus y su ADN β satélite (Saunders y col., 2003). Los próximos informes en los que se tuvieron noticias sobre los geminivirus revelaron las pérdidas ocasionadas en los cultivos de la remolacha (Beta vulgaris L.) en California y del maíz (Zea mays L.) en Sudáfrica en 1899 y 1901, respectivamente. Estas epifitias fueron las primeras de importancia agronómica y sólo después de más de 70 años se reconocieron a dos geminivirus, Maize streak virus (MSV) y Beet curly top virus (BCTV), como sus agentes causales. Estos virus fueron los primeros de su tipo en ser caracterizados parcialmente a través de su purificación en 1974 (Bock y col., 1974; Mumford, 1974). Con posterioridad, varios virus con características similares se identificaron como la causa de numerosas enfermedades en plantas oriundas de las regiones tropicales y templadas. La caracterización de uno de ellos, que infectaba frijol (Phaseolus vulgaris L.), demostró la presencia de ADN de simple cadena como material genético de los virus recién descubiertos (Goodman, 1977). El término geminivirus derivado del vocablo gemĭni, que significa gemelos en latín, se acuñó por Harrison y col. en 1977 (Harrison y col., 1977) atendiendo a la morfología en par de las partículas virales y en 1978, la familia Geminiviridae se reconoció oficialmente por el ICTV (Matthews, 1979). Sin embargo, fueron los trabajos de Franki y col. en los años siguientes, con el uso de la microscopía electrónica de alta resolución, los que demostraron con precisión que la cápside de los geminivirus es un par de icosaedros incompletos (Hatta y Franki, 1979; Franki y col., 1980) (Figura 1). 2.2 Características generales de la familia Geminiviridae La familia Geminiviridae constituye una de las cuatro familias de virus vegetales con ADN como material genético. Sus miembros se caracterizan por presentar partículas con simetría casiicosaédrica incompleta (T=1) de 18 a 20 nm de diámetro, que se presentan mayormente en pares de hasta 30 nm (Zhang y col., 2001b) (Figura 1). El coeficiente de sedimentación de las partículas es de alrededor de 70 s. Estos virus poseen como genoma una o dos moléculas de simple cadena (sc) de ADN, circular y cerradas covalentemente, de talla entre 2,5 y 3 Kb (0,7 a 0,9x10 6 g/mol) (Harrison y col., 1977; Goodman, 1977; Lazarowitz, 1992). Estas moléculas se conocen como cadenas virales. Los productos génicos están codificados en la cadena viral (cv) o en la cadena complementaria (cc), la que se genera durante el proceso replicativo. Los genes geminivirales reciben su nombre de acuerdo con la cadena a partir de la cual se transcriben (V o C), un número que coincide generalmente con la disposición a partir del extremo 5 (ej. V1, V2, C1, C2, C3, etc.) y si se trata de un geminivirus bipartito se le 11

18 Revisión bibliográfica Figura 1. Fotografía de una preparación de viriones de TYLCV observada al microscopio electrónico. Cortesía del Dr. R. G. Milne. Instituto de Fitovirología Aplicada, Italia. antepone la letra A o B en dependencia del componente genómico que lo codifica (ej. AC1, BV1, etc.). Los geminivirus codifican sólo un tipo de proteína de cubierta que se agrega en pentámeros para formar un capsómero y 22 capsómeros se agrupan formando un virión (Zhang y col., 2001b). Aunque varios miembros de la familia son transmitidos de planta a planta de forma mecánica, la mayoría de los geminivirus son transmitidos exclusivamente, de manera circulativa (Rubinstein y Czosnek, 1997), por insectos del orden Homoptera. Los síntomas característicos de la infección por geminivirus pueden consistir en decoloración foliar (amarillamientos o dorados con patrones de mosaicos, moteados o rayados), enanismo, epinastias, enrollamiento o encrespamiento foliar, reducción del área foliar, abscisión floral y reducción del tamaño de los frutos, entre otros. Estos pueden presentarse aislados o combinados. Los síntomas producidos por una especie geminiviral pueden variar de una a otra planta atendiendo a la especie hospedante y a la edad fisiológica a la que ocurre la infección. Las diferencias también pueden aparecer dentro una misma combinación virus-planta sometidas a diferentes condiciones ambientales. Los geminivirus afectan un gran número de familias vegetales y muchas de ellas albergan especies que resultan de interés económico. Ejemplos de ellas son: Solanaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Poaceae, Asteraceae, Caprifolaceae, Malvaceae, etc. 2.3 Los géneros de la familia Geminiviridae Tras varios intentos de agrupar los virus de la familia atendiendo a los síntomas producidos (Costa, 1976; Muniyappa, 1980), actualmente los casi 200 miembros han sido reorganizados atendiendo a varias características biológicas y moleculares. En un principio, se reconocieron tres subgrupos (I, II y III) que posteriormente adquirieron categorías de géneros. Así, el subgrupo I pasó a ser el género Mastrevirus y el II y el III son los géneros Curtovirus y Begomovirus, respectivamente (Rybicki, 1994; Padidam y col., 1995; Fauquet y col., 2000; Fauquet y col., 2003). Un cuarto género (Topocuvirus) ha sido definido recientemente (van Regenmortel y col., 2000). Los géneros están definidos por el número de componentes genómicos y la organización de los genes dentro de ellos, el tipo de planta que infectan y el insecto vector. Los virus del género Mastrevirus, de los cuales MSV es el miembro tipo, son monopartitos, infectan principalmente plantas monocotiledóneas y son transmitidos por saltahojas (ej. Nesocluta tenellus y Cicadulina spp). Los mastrevirus poseen cuatro marcos de lectura abiertos (MLA) en su genoma (Figura 2). El género cuenta con 15 miembros definitivos, tres tentativos y varias de sus especies definitivas cuentan con numerosos aislamientos o cepas (ej. MSV con 35 cepas reconocidas hasta la fecha). Los miembros del género Begomovirus (Bean golden 12

19 Revisión bibliográfica mosaic virus, BGMV; miembro tipo) poseen genomas monopartitos o bipartitos (mayoría de los miembros), infectan plantas dicotiledóneas y se transmiten a través de la mosca blanca (Bemisia tabaci Gennadius). Desde el punto de vista filogenético, los begomovirus están subdivididos en dos grupos, los cuales coinciden con el origen geográfico de los aislamientos virales. Se reconocen así a los begomovirus del Nuevo Mundo (americanos) y a los del Viejo Mundo (Eurasia, África y Australia). En dependencia del número de componentes, estos virus poseen de seis (monopartitos) a siete (bipartitos) MLA en su genoma. Los siete MLA de los begomovirus bipartitos se distribuyen cinco en el componente A y dos en el B (Figura 2). Los virus bipartitos del viejo mundo poseen un MLA adicional en la cadena viral. Los begomovirus constituyen el género más numeroso y más ampliamente distribuido en el planeta, con más de 100 miembros definitivos y cerca de 50 miembros tentativos. El género Curtovirus (BCTV, miembro tipo) agrupa a virus con genomas monopartitos y son transmitidos, al igual que los mastrevirus, por diferentes especies, y en muchos casos de diferentes géneros de cicadélidos (ej. Circulifer tenellus). Los curtovirus infectan plantas dicotiledóneas. BCTV es el geminivirus con más amplia gama de hospedantes conocida, con más de 300 especies que pertenecen a 44 familias de plantas. Este género está representado por 4 miembros definitivos y uno tentativo. Los curtovirus poseen siete MLA, cuatro de ellos son codificados en la cadena complementaria y el resto en la viral (Figura 2). El género Topocuvirus ha sido reconocido recientemente dentro de la familia Geminiviridae y hasta el momento sólo recoge a un único miembro, Tomato pseudo-curly top virus (TPCTV), que da nombre al género (Pringle, 1999; van Regenmortel y col., 2000). Este virus es monopartito, es transmitido por el saltárboles Micrutalis malleifera Fowler, e infecta plantas dicotiledóneas. Su genoma contiene seis MLA, cuatro de ellos codificados en la cadena complementaria y dos en la viral (Figura 2) (Briddon y col., 1996). 2.4 Caracterización molecular de los miembros de la familia Geminiviridae Organización del genoma geminiviral Los MLA en el genoma geminiviral se disponen en dos grupos a ambos lados de una región intergénica (RI) de 280 a 350 nt, en la cual se encuentran dos promotores divergentes y las señales en cis necesarias para la replicación del virus (Figura 2). En la RI se encuentra una secuencia de 30 nt en los virus bipartitos (Figura 3A) y de 46 nt en los monopartitos, rica en GC, que forman el tallo de una horquilla. Sólo esta estructura y la secuencia 5 -TAATATTAC- 3, que forma el asa de dicha horquilla, son conservadas en todos los geminivirus (Lazarowitz, 1992; Hanley-Bowdoin y col., 2000). A una distancia variable de la horquilla se encuentran los motivos repetidos en tándem conocidos como iterones. Su organización y secuencia nucleotídica dependen del linaje geminiviral del que se trate (Argüello-Astorga y col., 1994a; Argüello-Astorga y Ruiz-Medrano, 2001). Las secuencias de los dos componentes genómicos de los begomovirus bipartitos son desiguales, excepto una parte de la RI denominada región común (RC) (Figura 2). La RC, de 200 nt aproximadamente, es casi idéntica entre ambos componentes. 13

20 Revisión bibliográfica Los primeros trabajos de clonación R Im V1, MP C4 RI V3, MP de genomas geminivirales se C1, Rep A MSV - [NG1] 2687 nts C1, Rep BCTV - Cal[Log] 2994 nts V2 desarrollaron con los begomovirus bipartitos African cassava mosaic V2, CP V1, CP virus (ACMV) y Tomato golden C2, Rep B R In C2, TrAP C3, REn mosaic virus (TGMV) (Stanley y Gay, 1983; Hamilton y col., 1984; C4 R I V2 R I V2 Townsend y col., 1985). Su C 1, Rep TPCTV 2861 nts C4 V1, CP C1, Rep TYLCV 2787 nts V1,CP secuenciación reveló que en la cadena complementaria del componente A, se hallan cuatro MLA C2, TrAP C3, REn C2, TrAP C3, REn (AC1, AC2, AC3 y AC4) solapados parcialmente, y que en la cadena AC4 AC1, Rep AC2, TrAP RC BGYMV-MX A 2644 nts AC3, REn AV1, CP BC1, MP BGYMV-MX B 2609 nts BV1, NSP Figura 2. Esquema que representa los genomas de los virus miembros tipo de cada género de la familia Geminiviridae y del begomovirus monopartito TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus). MSV-NG1 (Maize streak virus-nigeria, Mastrevirus), BCTV- Cal[Log] (Beet curly top virus-california Logan, Curtovirus), TPCTV (Tomato pseudo-curly top virus, Topocuvirus) y BGYMV-MX (Bean golden yellow mosaic virus-mexico, Begomovirus). Debajo de cada acrónimo se señala el número de nucleótidos de cada molécula de ADN simple cadena. Las flechas indican los marcos de lectura abiertos y en cada caso se señalan el nombre del gen (en itálico) y de la proteína codificada (igual color significa proteínas con funciones equivalentes). RI: Región intergénica, RIm: RI mayor, RIn: RI menor y RC: Región común. RC viral se encuentran los genes AV1 y AV2, este último sólo en los begomovirus del viejo mundo (Figura 2). El componente B presenta los genes BV1 y BC1 sobre la cadena viral y complementaria, respectivamente. Hasta la fecha, todos los begomovirus bipartitos tienen la misma organización genómica. Los begomovirus monopartitos, como TYLCV, presentan una organización genómica similar a la mostrada por el componente A de los begomovirus bipartitos del Viejo Mundo (Figura 2). Esta organización también se comparte por el único topocuvirus reconocido hasta el momento (Briddon y col., 1996). La secuenciación de MSV y Wheat dwarf virus (WDV), demostró que los mastrevirus poseen dos genes en cada cadena y que ambos pares están solapados (MacDowell y col., 1985; Lazarowitz, 1988) (Figura 2). Los mastrevirus, además de la RI típica de los geminivirus, poseen una RI menor formada entre los extremos 3 de los genes C2 y V1. La organización genómica de la cadena complementaria de los curtovirus asemeja a la de los begomovirus, mientras que la de la cadena viral es un poco más compleja, con tres MLA solapados. El análisis genómico de los curtovirus reveló que la recombinación contribuyó con su evolución (Stanley y col., 1986; Klute y col., 1996; Padidam y col., 1999). Los genes codificados sobre la cadena complementaria de BCTV son homólogos a los genes respectivos de los begomovirus, mientras que el gen V1 presenta mayor homología al presente en los mastrevirus (Briddon y col., 1998). 14

21 Revisión bibliográfica A pesar de las diferencias en la organización genómica entre los géneros, existen ciertas regularidades entre ellos como son: (1) la posición del gen AV1, que codifica para la proteína de la cápside (CP), siempre en la cadena viral, y (2) el gen AC1 o C1, que codifica para la proteína asociada a la replicación (Rep), siempre en la misma posición de la cadena complementaria, con la singularidad de que en los mastrevirus la proteína Rep está codificada por los genes C1:C Los genes geminivirales y las proteínas que codifican: sus funciones Tras la clonación de varios geminivirus, la generación de mutantes, la comparación del curso de la infección en líneas celulares y en plantas de los virus salvajes y mutados, y la utilización de plantas transgénicas, etc; se han podido conocer las funciones de los productos génicos codificados en el genoma geminiviral. Aunque varios de ellos conservan sus funciones principales a través de los diferentes géneros, coexisten las particularidades. Con el tiempo, los productos génicos geminivirales se han nombrado de diferentes formas y en este documento adoptaremos la forma más actualizada Productos génicos de los begomovirus bipartitos El componente A de los begomovirus bipartitos codifica toda la información necesaria para la encapsidación y la replicación (Rogers y col., 1986; Sunter y col., 1987). Por su parte, el componente B no se replica autónomamente y se requiere en la infección para garantizar el movimiento y la expresión de los síntomas (Elmer y col., 1988b; Lazarowitz, 1991). En los análisis en que se mutaron los genes AC1, AC2, BC1 y BV1 la infección fue bloqueada, lo que demostró el carácter esencial de las proteínas codificadas por ellos (Etessami y col., 1988; Elmer y col., 1988a; Etessami y col., 1991; Sung y Coutts, 1995a). El producto del gen AC3 no resulta imprescindible, aunque su ausencia propicia atenuación y retraso en la aparición de los síntomas (Etessami y col., 1991; Morris y col., 1991; Sung y Coutts, 1995a). Las proteínas REn (siglas del inglés Replication Enhancement ) y Rep (codificada por los genes AC3 y AC1, respectivamente), participan en el proceso de replicación. Las mutaciones sobre AC1, bloquean la replicación, mientras que los mutantes en el gen AC3 muestran niveles reducidos de acumulación del ADN viral. La proteína Rep puede replicar al componente B del virus del cual proviene, en plantas transgénicas AC1 + y en ausencia del componente A, lo que demuestra su suficiencia en el proceso replicativo (Hanley-Bowdoin y col., 1990). El producto del gen AV1 (que codifica para la proteína CP) es dispensable en dependencia del modo de inoculación y del hospedante donde se practique el ensayo (Stanley y Townsend, 1986; Gardiner y col., 1988; Briddon y col., 1990; Pooma y col., 1996; Hofer y col., 1997a). Si la transmisión es mediada por los insectos vectores, la presencia de la proteína CP es indispensable, pero si la inoculación se hace por biobalística, mecánicamente o mediada por Agrobacterium tumefaciens no se requiere su presencia. La proteína CP tampoco se requiere cuando la infección ocurre sobre hospedantes bien adaptados o permisivos, mientras que en los hospedantes subóptimos sí se requiere del gen AV1 funcional para la infección sistémica 15