Análisis in silico: Modelado de Proteínas.

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1 Tlamati Sabiduría Volumen 8 Número Especial 2, Octubre 2017 Introducción 4 r. Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero 4, 5 y 6 de octubre 2017 Memorias Análisis in silico: Modelado de Proteínas. Jesús Omar Velázquez Moreno (Becario) jesus_velazquezm@hotmail.com Unidad Académica Preparatoria No. 9, Universidad Autónoma de Guerrero Dra. Olga Lilia Garibay Cerdenares (Asesora) olgaribay@hotmail.com Profesor Investigador por Cátedras CONACyT Jefe del Laboratorio de Biomedicina Molecular Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero En la actualidad, es la tecnología de mucha importancia para realizar varias tareas a la vez; facilita la vida del hombre y hace que algunas actividades sean mucho más sencillas, tales como la comunicación, el entretenimiento y el estar informados. No solamente ha influido en las actividades cotidianas que realizamos, sino que también ha tenido gran peso sobre la Ciencia, en especial en las áreas de Medicina Moderna y la Biología Molecular. Como sabemos, la informática es el procesamiento, recopilación y presentación de la información por medio de los ordenadores; la estadística es considerada como una rama de las matemáticas que se encarga de la recopilación e interpretación de datos. La combinación de estas dos áreas del saber, ha dado como resultado la llamada bioinformática. La bioinformática ha sido de mucha utilidad principalmente para el área de las Ciencias de la Salud. Actualmente, muchos proyectos denominados in silico se han llevado a cabo gracias a esta rama de la ciencia y es utilizada principalmente para hacer predicciones por medio de tres principales herramientas: el modelado, la simulación y la visualización. El modelado fue la herramienta de la Biología molecular que se llevó a cabo en un análisis in silico durante la estancia realizada en la Facultad de Ciencias Químico Biológicas para la representación tridimensional de la estructura de las proteínas para su estudio y relación que guarda con otras.

2 Tlamati Sabiduría Volumen 8 Número Especial 2, 2017 Plegamiento de Proteínas Las proteínas son el resultado de dos procesos fundamentales que se llevan a cabo a nivel celular, éstos son la transcripción y la traducción. Están formadas por una secuencia de aminoácidos, los cuales tienen una estructura química descrita a continuación: poseen un carbono quiral que tiene ocupados sus cuatro enlaces disponibles por un grupo carboxilo (COOH), un grupo amino (NH 3 ), un átomo de Hidrogeno (H) y un grupo de cadena lateral que será el responsable de la naturaleza que vaya a tener el aminoácido (refiriéndose a la carga que tenga, si será hidrofóbico o hidrofílico, etc.). Éstos están unidos por enlaces peptídicos muy resistentes entre el grupo carboxilo y el grupo amino, dando como residuo al momento de su formación, una molécula de agua (H 2 O). Dependiendo del número de aminoácidos que formen una cadena, se pueden dar diferentes nombres: cuando la cadena tiene pocos aminoácidos (a.a.) se denominan péptidos, puede haber oligopéptidos conformados por menos de 10 a.a. y polipéptidos conformados por más de 10 unidades de a.a. Se debe señalar que una cadena de aminoácidos es considerada una proteína cuando la cadena supera los 50 a.a. Las proteínas comienzan siendo una simple cadena de a.a. y pueden tener distintas formas en su plegamiento, dando origen a estructuras primarias, secundarias, terciarias y cuaternarias. Estructura Primaria. La estructura primaria de las proteínas se refiere a la cadena sencilla de aminoácidos decodificada por un RNA mensajero en los ribosomas. Estos aminoácidos están unidos entre sí por enlaces peptídicos. Estructura Secundaria. La estructura secundaria posee enlaces por puentes de hidrógeno entre átomos de Hidrogeno y Oxigeno que permiten el plegamiento en forma de escalera de caracol, denominada α-hélice y también una forma de hoja doblada, llamada β-lámina.

3 Memorias del 4 Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero 4, 5 y 6 de octubre 2017 Estructura Terciaria. La estructura terciaria posee enlaces disulfuro que permiten la estabilidad de las proteínas con esta estructura. Resulta de la combinación de las dos estructuras secundarias (α-hélice y β- lámina). Estructura Cuaternaria. La estructura cuaternaria posee los tres tipos de enlace mencionados anteriormente (peptídico, puente de hidrógeno y disulfuro). Surge de la unión de varias cadenas polipeptídicas denominadas protómeros y así dan lugar a dímeros, trímeros, tetrámeros, etc. Principales funciones de las proteínas Las proteínas se encuentran localizadas en distintas partes del organismo en cantidades determinadas. Cada una de ellas cumple una función específica a nivel molecular que propician diversas actividades celulares de suma importancia para la vida. El ejemplo más claro de esta situación, es que en procesos como la replicación del DNA se requiere la intervención de proteínas que lleven a cabo funciones importantes: la Girasa es la responsable de relajar las hebras del DNA para que posteriormente sean separadas por la Helicasa, la Polimerasa construye una nueva cadena de nucleótidos y la Ligasa sella los espacios que queden entre ellos. Estos procesos complejos se llevan a cabo cada vez que la célula entra en proceso de división. Además, muchas funciones celulares que realizarán un tipo de proteínas, serán activadas gracias a otras proteínas, dando lugar así a las llamadas: Cascadas de señalizaciones. La estructura, soporte y elasticidad de algunos tejidos del cuerpo también están vinculadas a la intervención y funcionamiento de las proteínas, estas propiedades son fundamentales para la correcta operatividad del cuerpo humano.

4 Tlamati Sabiduría Volumen 8 Número Especial 2, 2017 Bases de Datos de Proteínas Una base de datos es el lugar donde se reúne todo la información que se tiene acerca de un objeto de estudio; se accede a ellas por medio de un ordenador con la ayuda de buscadores universales, tales como: Google, Yahoo!, etc. Gracias a la gran cantidad de descubrimientos que se han hecho en el área de la biología, surge la necesidad de recopilar toda la información en bases de datos biológicas y que comprenden diversas áreas: el estudio de la secuenciación del genoma, estructura de las proteínas, taxonomía, etc. UniProt UniProt es una base de datos que es de gran ayuda para la comunidad científica ya que en ella están registradas las secuenciaciones de proteínas que se han estudiado en diversos organismos vivos; además es de fácil acceso y cuenta con apartados para cada proteína que hacen más fácil encontrar la información requerida. UniProt, nace por la unión de tres bases de datos previas: Swiss-prot, TrEMBL y PIR-PSD. Swiss-Prot y TrEML continúan siendo dos secciones en UniProt. Protein Data Bank Es una base datos que cuenta con un gran número de estructuras tridimensionales de proteínas y ácidos nucleicos; también contiene información acerca de la secuencia de cada estructura que son de gran ayuda para investigadores y alumnos. Ayuda a la comprensión de la Biología, Medicina, Biología Molecular, Biología Celular, entre otras ramas de las Ciencia de la salud. Análisis in silico El análisis in silico difiere de los procesos in vivo, que son realizados en organismos vivos; e in vitro, los cuales se llevan a cabo fuera de seres vivos en instrumentos como tubos de ensayo u otro ambiente artificial. In silico se refiere a los distintos procesos que se realizan a través de ordenadores computacionales gracias a programas y bases de datos. Este tipo de análisis tiene base en la bioinformática, cuenta con diversas aplicaciones, de las cuales, tres son muy importantes: el modelado, la simulación y la visualización.

5 Modelado Computacional de Proteínas Memorias del 4 Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero 4, 5 y 6 de octubre 2017 La secuencia de aminoácidos en una proteína nos permite saber su función dentro de los organismos; con el apoyo de la bioinformática se pueden realizar estructuras tridimensionales por medio de diferentes técnicas. Estos modelos tridimensionales son de gran importancia para la Medicina y las empresas farmacéuticas, ya que son utilizados para predecir la interacción de alguna proteína con otras proteínas, o bien para desarrollar (o probar) algún tipo de fármaco. Las interacciones proteína-proteína (PPI) generadas de manera in silico permiten comprender los efectos que tienen sobre nuestro cuerpo las modificaciones que ocurren en las proteínas o la forma en la que los fármacos actúan sobre ellas, entre otras muchas situaciones. Algunas veces, las interacciones resultantes llegan a ser perjudiciales porque favorecen al desarrollo de algunas enfermedades o desórdenes al afectar el correcto funcionamiento de procesos biológicos a nivel celular. Modelado por Homología El modelado por homología también recibe el nombre de modelado por comparación y esto se debe a que esta técnica consiste en crear una estructura tridimensional a partir de una secuencia de aminoácidos mayormente parecida a otra de la cual ya se tenga la estructura 3D. A lo largo de las dos secuencias, habrá largas regiones en las que los aminoácidos constituyentes serán los mismos y, por ende, su estructura será igual; a estas regiones se les denomina estructuras molde. Por otra parte, la secuencia problema se refiere a las partes en las que las secuencias no son idénticas y que se tendrán de completar por medio de algún software especializado. I-TASSER es un servidor de modelado por homología que genera estructuras tridimensionales con la búsqueda de una secuencia lo suficientemente parecida a la ingresada, para conocer su estructura. La información acerca de toda la composición en la estructura tridimensional de una proteína, se presenta a través de formatos denominados PDB (Protein Data Bank). El formato cuenta con diversas columnas que muestran la composición química y fisicoquímica de la proteína: el número de cada átomo, las iniciales de los nombres químicos, a qué aminoácido corresponden ese total de átomos, el número del aminoácido y algunas propiedades físicas.

6 Tlamati Sabiduría Volumen 8 Número Especial 2, 2017 Método basado en el plegamiento A diferencia del método expuesto anteriormente, éste tiene como finalidad la formación de una estructura tridimensional a partir de las similitudes entre estructura sin importar la secuencia de los aminoácidos que éstas tengan. Se utiliza este método cuando las homologías entre secuencias no son suficientes como para hallar alguna proteína con composición semejante. Los programas computacionales que son utilizados para llevar a cabo estas acciones son de tipo Threading y están disponibles por el servidor: Fisher`s Fold Recognition que es capaz de comparar resultados por medio de bases de datos de estructuras proteicas. Métodos de ab initio También son llamados métodos de novo. Consiste en formar la estructura secundaria de una proteína en forma tridimensional basándose sólo con las propiedades físicas y fisicoquímicas de cada átomo de un elemento, para así determinar qué aminoácido es más susceptible de unirse con otro. Se llevan a cabo por medio de estrategias como Chou-Fasman method y GOR method. Éstos pertenecen a la primer generación de métodos de predicción que surgieron alrededor de la década de los 70 s, durante esta época no había mucha información disponible acerca de estructuras de proteínas, por lo que eran de baja confiabilidad y se basaban en proteínas conocidas mediante cristalografía. Modelo HP Este modelo consiste en construir la estructura de la proteína mediante el conocimiento de la secuencia de aminoácidos (cadena lineal) y de propiedades físicas, otorgando así la letra H para los aminoácidos Hidrofóbicos y la letra P para los aminoácidos Polares o Hidofílicos. Docking de proteínas El término Docking hace referencia a las simulaciones in silico que se llevan a cabo para observar las interacciones entre las moléculas blanco y otros agentes, por ejemplo, algunos fármacos para

7 Memorias del 4 Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero 4, 5 y 6 de octubre 2017 su estudio. Muchas veces, las proteínas se utilizan como moléculas blanco y forman complejos mediante la interacción con moléculas u otras proteínas. Lo que interesa saber a cerca de esas interacciones es saber cuáles son las partes de las proteínas que interaccionan entre si y cuál es la función que desempeñan juntas. La relación suele ser la forma en que mejor se completan tomando en cuenta su estructura y forma geométrica. La metodología del Docking de proteínas suele dividirse en tres procesos importantes: Primera etapa: consiste en tener claro cuál va a ser la proteína que se va a manejar y establecer el lugar de unión entre esta molécula blanco y otra proteína. Segunda etapa: Aquí se requiere tener listas las moléculas con las que se desea tener la asociación y conocer su estructura tridimensional. Se pueden obtener desde una base de datos, los cuales son capaces de reconocer a la molécula blanco y adherirse a ella. Tercera etapa: Se forma el complejo y se observa la función que la unión de estas dos proteínas llevan a cabo. Interacciones Proteína-Proteína (PPI) Las interacciones dan lugar a los llamados complejos proteicos y éstos tienen una función específica a nivel celular. Se encargan de procesos fundamentales como la replicación, transcripción y traducción; a su vez, son capaces de formar redes de transducción de señales en las cuales se lleva a cabo una reacción en cadena que activan o desactivan ciertas proteínas implicadas en la realización de alguna acción específica. Tan sólo dentro de la célula, se tienen que llevar a cabo señalizaciones por medio de proteínas entre los diversos organelos, también son capaces de regular la entrada y salida de substancias por la membrana plasmática, tiene que ver también con los procesos metabólicos para la obtención de energía, el transporte de macromoléculas, entre muchas otras funciones. Objetivos. 1: Generar mediante un análisis in silico la estructura tridimensional de la proteína RCN2. 2: Evaluar mediante Docking in silico la interacción de E6 y RCN2.

8 Tlamati Sabiduría Volumen 8 Número Especial 2, 2017 Metodología Como primera fase para llevar a cabo la realización del Docking entre las dos proteínas, se tuvo que obtener la secuencia de aminoácidos de la proteína RCN2 desde la base de datos UniProt, posteriormente se introdujo toda la secuencia al servidor I-TASSER para que generara la estructura 3D por medio de la técnica por homología. El servidor solicita tu correo electrónico para enviar ahí los resultados. Pasados unos días, los resultados se te hacen llegar y te muestran 5 estructuras tridimensionales, cada una acompañada de un formato PDB, de las cuales tendrás que escoger la mejor opción de acuerdo a los criterios que tomes en cuenta. El siguiente paso es visualizar la estructura de la proteína por medio del programa VMD donde puedes modificar el color del fondo y de la proteína, su representación y el ángulo en el que desea observar, las sombras, entre otros elementos. Una vez conseguida la estructura 3D de RCN2, se necesita también la estructura de la oncoproteína E6. Ésta se me proporcionó por el Laboratorio de Biomedicina Molecular, en la Facultad de Ciencias Químico Biológicas. Brevemente, esta proteína fue diseñada mediante un análisis in sílico utilizando como estructura molde la proteína E6 VPH16 mutada presente en el modelo tridimensional PDB: 4XR8 (Martinez-Zapien et al., 2016).

9 Memorias del 4 Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero 4, 5 y 6 de octubre 2017 Finalmente, para llevar a cabo el Docking, se necesita la introducción de los dos formatos PDB a un servidor llamado ClusPro, que hace una predicción de los lugares en que interaccionarían las dos proteínas. Nuevamente, por medio del programa VMD, se visualiza dicha interacción y se modifica la representación de acuerdo a un criterio propio. Resultados A) B) N C C) N D) N C Figura 1. Estructuras tridimensionales que se utilizaron para realizar el Docking entre RCN2 y E6. A) Estructura 3D de la proteína de unión al calcio RCN2 en la que se pueden observar las α-hélice y las β-láminas que la conforman. En color amarillo se puede observar el grupo amino representado con la letra N y de color azul el grupo carboxilo terminal representado con la letra C. B) Estructura 3D de la oncoproteína E6 en la que se pueden observar las α-hélices y β-láminas que la conforman.

10 Tlamati Sabiduría Volumen 8 Número Especial 2, 2017 C) Estructura 3D de la proteína RCN2 en su representación de superficie; se incluyen las letras N y C para tratar de representar la altura a las que se encuentran el grupo amino y carboxilo terminal. D) Rotación de la estructura 3D de la proteína RCN2; se conservan las letras N y C a la altura en que estarían los grupos amino y carboxilo terminal respectivamente. E) Figura 2. Docking realizado entre las proteínas RCN2 y E6 en la que se muestra la forma de interacción. E6 interactúa con RCN2 y favorece la inmortalización de células infectadas con el VPH. Conclusiones. 1. El Docking entre las proteínas RCN2 y E6 puede servir para el desarrollo de algún fármaco al observar la manera en que éste pueda interactuar con el complejo impidiendo su unión o cambiando sus funciones y así impedir que las células infectadas con VPH16 se vuelvan

11 Memorias del 4 Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero 4, 5 y 6 de octubre 2017 inmortales y, por ende, se pueda prevenir el desarrollo de cáncer. Todo lo anterior mediante una simulación por análisis in silico. 2. El análisis in silico permite a la comunidad científica tener una idea más acertada acerca de la forma en que algún fármaco pueda actuar dentro del organismo de alguna persona. Después de analizar la forma de interacción, es necesario continuar las pruebas en análisis in vivo. 3. Con el apoyo de los tres tipos de análisis in vivo, in vitro e in silico, se pueden llevar a cabo diferentes técnicas que tienen un mismo objetivo: la detección y prevención de enfermedades que aquejan al ser humano. Bibliografía Martinez-Zapien, D., Ruiz, F.X., Poirson, J., Mitschler, A., Ramirez, J., Forster, A., Cousido- Siah, A., Masson, M., Pol, S.V., Podjarny, A., Travé, G., Zanier, K., Structure of the E6/E6AP/p53 complex required for HPV-mediated degradation of p53. Nature 529, doi: /nature The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Boutet E, Lieberherr D, Tognolli M, Schneider M, Bansal P, Bridge AJ, Poux S, Bougueleret L, Xenarios I. UniProtKB/Swiss-Prot, the Manually Annotated Section of the UniProt KnowledgeBase: How to Use the Entry View. Methods Mol. Biol. 1374:23-54 (2016). ( The I-TASSER server. I-TASSER: Protein Structure & Function Predictions. Yang, R Yan, un Roy, D Xu, J Poisson, Y Zhang. La serie I-TASSER: Estructura de la proteína y predicción de la función. Nature Methods, 12: 7-8 (2015). Un Roy, un Kucukural, Y Zhang. I-TASSER: una plataforma unificada para la estructura automatizada de proteínas y la predicción de funciones. Nature Protocols, 5: (2010).

12 Tlamati Sabiduría Volumen 8 Número Especial 2, 2017 Y Zhang. Servidor I-TASSER para la predicción de la estructura de la proteína 3D. BMC Bioinformatics, vol. 9, 40 (2008). ( The ClusPro server. ClusPro: Protein-Protein Docking. Kozakov D, Hall DR, Xia B, Porter KA, Padhorny D, Yueh C, Beglov D, Vajda S. The ClusPro web server for protein-protein docking. Nature Protocols Feb; 12(2): Kozakov D, Beglov D, Bohnuud T, Mottarella S, Xia B, Hall DR, Vajda, S. How good is automated protein docking? Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 2013 Aug. Kozakov D, Brenke R, Comeau SR, Vajda S. PIPER: An FFT-based protein docking program with pairwise potentials. Proteins Aug 24. Comeau SR, Gatchell DW, Vajda S, Camacho CJ. ClusPro: an automated docking and discrimination method for the prediction of protein complexes. Bioinformatics Jan 1. Comeau SR, Gatchell DW, Vajda S, Camacho CJ. ClusPro: a fully automated algorithm for protein-protein docking Nucleica Acids Research Jul 1. ( The VMD program. VMD: Visual Molecular Dynamics. Humphrey, W., Dalke, A. y Schulten, K., "VMD - Visual Molecular Dynamics", J. Molec. Graphics, 1996, vol. 14, págs (