RELACIÓN ENTRE LA ACTIVIDAD DE LA NADPH OXIDASA, COMPUESTOS ESFINGOIDEOS Y RESPUESTA A PATÓGENOS EN CÉLULAS VEGETALES

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1 Memorias del XIV Congreso de Bioenergética y Biomembranas. Sociedad Mexicana de Bioquímica A.C. 13 al 18 noviembre 25; Oaxaca, Oaxaca. RELACIÓN ENTRE LA ACTIVIDAD DE LA NADPH OXIDASA, COMPUESTOS ESFINGOIDEOS Y RESPUESTA A PATÓGENOS EN CÉLULAS VEGETALES Priscila Rodríguez Mejía, Javier Plascencia y Marina Gavilanes Ruíz Depto. de Bioquímica, Lab. 11, conjunto E, Facultad de Química, UNAM, Tel pris_118@yahoo.com.mx, gavilan@servidor.unam.mx RESUMEN La reacción de explosión oxidativa ha sido conocida por casi 4 años en mamíferos como respuesta ante el ataque de patógenos, sin embargo, este fenómeno no fue demostrado en plantas sino hasta hace poco. Aunque se ha reportado la existencia de homólogos para la subunidad gp 91 phox en células de Nicotiana tabacum y Lycopersicom esculentum que tienen la misma actividad que la enzima de células de mamíferos, a la fecha no se han reportado homólogos de esta enzima o sus subunidades en Zea mays. En este trabajo se estudió el efecto de la adición de compuestos esfingoideos a fracciones membranales de ésta especie en la reducción de colorantes de tetrazolio, los cuales, al ser reducidos por el radical superóxido, uno de los productos de la reducción secuencial de oxígeno molecular durante la reacción de explosión oxidativa catalizada por NADPH oxidasa, dan lugar a la formación de formazán, un producto colorido que puede ser detectado espectrofotométricamente. Los resultados obtenidos en este trabajo nos permiten sugerir que un homólogo de esta enzima puede ser el responsable de ésta reacción. INTRODUCCIÓN Entre las reacciones de defensa primaria de una planta desencadenadas por la invasión de un patógeno se encuentra la respuesta de hipersensibilidad (RH), la cual consiste en lesiones que llevan a la muerte celular en los sitios de infección. Una característica de esta reacción es la rápida e intensa producción de especies reactivas de oxígeno (ERO). Este término se usa para describir los productos de la reducción secuencial del oxígeno molecular: radical superóxido ( O - 2 ), peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) y radical hidroxilo ( OH), especies predominantes detectadas durante las interacciones plantapatógeno (Wojtaszek, 1997) y las cuales son citotóxicas, mutagénicas y pueden modificar y dañar biomoléculas críticas, incluyendo DNA, lípidos y proteínas. La cinética y funciones de defensa de la generación de ERO en plantas, principalmente O - 2 y H 2 O 2 son reminiscencias de la explosión oxidativa durante la activación de los neutrófilos de mamíferos. - Dicha reacción de explosión oxidativa involucra la reacción O 2 + NADPH O 2 + NADPH + + H +, la cual es catalizada por una oxidasa de la membrana plasmática llamada NADPH oxidasa, seguida de la dismutación de O - 2 a H 2 O 2 (Sagi y Fluhr, 21). Esta reacción ha sido conocida por casi 4 años en

2 células animales, sin embargo, este fenómeno no fue demostrado en plantas sino hasta hace poco y se ha indicado que las ERO producidas durante la explosión oxidativa pueden servir no solamente como protección contra patógenos invasores, sino como activadores de señales para posteriores reacciones de defensa de la planta, incluyendo la RH de las células infectadas. Adicionalmente, cuando se induce un incremento en la producción de H 2 O 2 se produce en la pared celular un entrecruzamiento de sus proteínas estructurales a través de la actividad de una peroxidasa, reforzándose así las barreras físicas que coadyuvan a evitar la diseminación del patógeno. Después de una gran producción de ERO hay una importante producción de etileno, desintegración de la membrana y fuga de electrolitos. Posteriormente a estos eventos se producen la muerte celular y necrosis del tejido. Aunque la fuente de ERO en plantas ha sido objeto de controversias, varias evidencias experimentales sugieren que la responsable es una enzima similar a la NADPH oxidasa de neutrófilos: 1) la explosión oxidativa en plantas atacadas es muy similar a la presentada por mamíferos, esto es: es rápida, intensa, transitoria e inducida por un patógeno. 2) La explosión oxidativa en plantas es inhibida irreversiblemente por un inhibidor de la NADPH oxidasa de mamíferos: el cloruro de difenilen iodonio (DPI) (Simon-Plas et al, 22). Además, se han identificado genes que codifican para homólogos de la subunidad gp 91 phox en Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Lycopersicom esculentum, Nicotiana tabacum y Solanum tuberosum. De la misma manera, se han reportado bandas de formazán - producidas por O 2 dependientes de NADPH en ensayos de actividad en gel basados en el fraccionamiento en geles nativos o desnaturalizantes de poliacrilamida para muestras de proteínas de membrana plasmática de N. tabacum y L. esculentum (Sagi y Fluhr, 21). La fumonisina B 1 (FB 1 ), es una micotoxina producida principalmente por especies de Fusarium verticillioides, comúnmente asociadas con enfermedades del maíz y otros cereales. Existen evidencias de que el mecanismo por el cual actúa esta toxina se basa en su similitud estructural con las bases esfingoideas libres. En células animales y vegetales, un blanco de la fumonisina es la esfinganina N-acil transferasa, cuya inhibición causa una marcada acumulación de bases esfingoideas endógenas (Abbas et al, 1994). De esta manera, se tiene la hipótesis de que el mecanismo por el cual actúan las fumonisinas para causar toxicidad en plantas involucra la interrupción de la biosíntesis de esfingolípidos, vía la inhibición de la síntesis de ceramidas, misma que es precursora de esfingolípidos complejos membranales. Se ha observado que embriones de maíz que han sido embebidos en FB 1 durante 24 horas tienen una mayor liberación de solutos en agua desionizada que los embriones que han sido embebidos sin la toxina, lo cual sugiere que la toxina altera la permeabilidad de las membranas celulares de estos embriones (Gutiérrez-Nájera et al, no publicado) y su fluidez (Gutiérrez- Nájera et al, 25) y que esto es consistente con el surgimiento de una explosión oxidativa, una de las reacciones iniciales de resistencia.

3 El objetivo de este trabajo es determinar si la adición de compuestos esfingoideos: FB 1, esfinganina (SN) y fitoesingosina (PS) a tejidos vegetales estimula la actividad de la NADPH oxidasa. MATERIALES Y MÉTODOS Material biológico. Se utilizaron embriones de maíz (Zea mays, raza criolla Chalqueño), los cuales fueron embebidos en presencia de 1 ó 2 µm de FB 1, 1 ó 2 µm de SN ó 2 µm de PS durante 24 h a 29 C en la oscuridad (imbibición continua). Otro lote de embriones se embebió durante 22 h a 29 C en la oscuridad en medio control y posteriormente se incubaron 3, 6 ó 12 h más a 29 C en la oscuridad en presencia o ausencia de 2 µm de FB 1, 2 µm de SN o 2 µm de PS (imbibición discontinua). Obtención de las fracciones microsomal y de membrana plasmática. De los embriones embebidos se obtuvieron microsomas y membranas plasmáticas por la técnica de reparto de fases en dos polímeros acuosos (Briskin et al, 1987; Larsson et al, 1987; Larsson et al, 1994). Medición de la actividad de NADPH oxidasa en disolución. Se realizaron determinaciones espectrofotométricas a diferentes tiempos a λ 51nm cuando el colorante empleado fue y a λ 47nm cuando el colorante fue XTT, de acuerdo con las técnicas reportadas en Able et al, (1998) y Sutherland y Learmonth (1997). Uso de inhibidores. Previamente a la determinación de actividad, las fracciones membranales fueron incubadas con 5 µm de DPI, el cual es un inhibidor de la NADPH oxidasa de células de mamíferos. Separación electroforética de proteínas. Las muestras conteniendo 1 µg de proteína fueron sometidas a una separación electroforética en un sistema de geles desnaturalizantes en geles separadores con 9.84% (p/v) de poliacrilamida (Schägger y von Jagow, 1987). Renaturalización de la NADPH oxidasa en gel y determinación de actividad. Posterior a la separación de proteínas, los geles desnaturalizados fueron sometidos al ensayo de actividad descrito por Sagi y Fluhr (1997) hasta que las bandas de actividad fueron visibles. Determinación de proteína. Se utilizó la técnica de Lowry modificada por Peterson (1997). RESULTADOS Efecto de la concentración de compuestos esfingoideos. Se llevaron a cabo ensayos de reducción de o XTT en presencia o ausencia del inhibidor DPI por fracciones de membrana plasmática de embriones de Z. mays embebidos 24 h en 1 ó 2 µm de FB 1 y 1 ó 2 µm de SN. En la figura 1 se presentan los resultados obtenidos 2 min después de iniciada la reacción. Se observó un aumento de hasta 5 y 34 % en la reducción de y XTT respectivamente en las muestras que

4 fueron embebidas en presencia de 2 µm FB 1 con respecto a las muestras que fueron embebidas en ausencia de este compuesto. A B DE DPI FB 1 (µm) 1 2 DPI SN (µm) Figura 1. Reducción de colorantes de tetrazolio por fracciones de membrana plasmática de embriones de Z. mays embebidos 24 h en diferentes concentraciones de FB 1 y SN en presencia y ausencia del inhibidor DPI. Se considera como 1% de reducción del colorante la llevada a cabo en muestras control. (A) Reducción de, el 1% de reducción corresponde a.19 unidades de absorbancia. (B) Reducción de XTT. El 1% de reducción corresponde a.351 unidades de absorbancia. Se muestran las medias y desviaciones estándar de seis experimentos realizados con dos diferentes preparaciones membranales. DE XTT DPI FB 1 (µm) 1 2 DPI SN (µm) Las muestras embebidas en 2 µm SN presentaron un aumento en la reducción de estos colorantes de aproximadamente 83 y 64 % respectivamente con respecto al control. En el caso de los embriones embebidos en 1 µm FB 1 se encontró que el porcentaje de reducción de los colorantes de tetrazolio decreció hasta aproximadamente 66 % del presentado por las muestras control. A B Figura 2. Reducción de colorantes de tetrazolio por fracciones de membrana plasmática de embriones de Z. mays embebidos 24 h en diferentes condiciones en presencia y ausencia del inhibidor DPI. Se considera como 1% de reducción del colorante la llevada a cabo en muestras control. (A) Reducción de, el 1% de reducción corresponde a.19 unidades de absorbancia. (B) Reducción de XTT. El 1% de reducción corresponde a.351 unidades de absorbancia. Se muestran las medias y desviaciones estándar de seis experimentos realizados con dos diferentes preparaciones membranales.

5 No se observó diferencia significativa en el caso de los embriones embebidos en 1 µm SN. Embriones que fueron embebidos en 2 µm de FB 1 ó 2 µm SN y que fueron incubados en presencia de 5 µm del inhibidor DPI mostraron una inhibición de entre 78 y 84 % en la reducción de colorantes de tetrazolio. Ensayo en disolución. Imbibición continua. La figura 2 muestra los resultados del porcentaje de reducción de y XTT por fracciones de membrana plasmática de Z. mays embebidas en 2 µm de FB 1, SN o PS en presencia y ausencia del inhibidor DPI (5 µm), 2 min después de iniciada la reacción. Se observó un aumento en la reducción de colorantes de tetrazolio en las muestras que fueron embebidas en presencia de 2 µm FB 1 y 2 µm SN con respecto al control. No se encontró diferencia apreciable en la reducción de o XTT debida a muestras de embriones embebidos en 2 µm PS respecto al control. A B C D E F XTT XTT + DPI XTT XTT + DPI XTT XTT + DPI Figura 3. Reducción de colorantes de tetrazolio por fracciones microsomales de embriones de Zea mays sometidos a imbibición discontinua con diferentes compuestos y midiendo la actividad en presencia y ausencia del inhibidor DPI. Se considera como 1% de reducción del colorante la llevada a cabo en muestras control. Las figuras (A), (B) y (C) muestran la reducción de para embriones embebidos 22 h en medio control y transferidos a medios con el compuesto por 3, 6, ó 12 h más respectivamente. El 1% de reducción corresponde, en ese orden, a.75,.67 y.13 unidades de absorbancia. Las figuras (D), (E) y (F) muestran la reducción de XTT para las mismas condiciones. El 1% de reducción corresponde a.316,.33 y.247 unidades de absorbancia respectivamente. Se muestran las medias y desviaciones estándar de tres experimentos realizados con una preparación membranal. Imbibición discontinua. Se repitió el ensayo anterior utilizando fracciones microsomales de embriones de Z. mays embebidos 22 h en medio control y 3, 6, ó 12 h más en medios con diferentes

6 condiciones en presencia o ausencia del inhibidor DPI. En la figura 3 se muestran los resultados de estos experimentos 2 min después de iniciada la reacción. Se observó un incremento en la reducción de respecto al control de 14 % en el caso de embriones embebidos a 2 µm FB 1, 16 % en presencia de 2 µm SN y 74 % para el caso de embriones embebidos en 2 µm PS durante 3h. En el caso de los experimentos en que el colorante empleado fue XTT, el aumento en la reducción del mismo fue de 28, 15 y 19 % para embriones embebidos en presencia de FB 1, SN y PS respectivamente. La inhibición por DPI fue, en todos los casos de entre el 7 y 5 %. Los embriones expuestos a compuestos esfingoideos durante 6 y 12 h no mostraron diferencias considerables en la reducción de colorantes de tetrazolio respecto al control. Ensayo en gel. Imbibición continua. Se realizó la determinación de reducción de en un gel desnaturalizante. La figura 4 muestra la separación electroforética y posterior renaturalización de las proteínas de membrana plasmática de embriones de Z. mays embebidos 24 h en diferentes condiciones. En el ensayo de actividad de NADPH oxidasa en gel se detectaron dos bandas de actividad dependientes de NADPH de aproximadamente 6 kda y 1-18 kda respectivamente (figura 4B), no hubo diferencia apreciable en la intensidad de las bandas de proteína de las muestras embebidas en compuestos esfingoideos con respecto al control (figura 4A). A B 1kDa 6kDa Figura 4. Determinación de actividad de NADPH oxidasa en gel de proteínas de membrana plasmática de embriones de Z. mays embebidos 24 h en diferentes condiciones. (A) Gel teñido con Azul de Coomasie. Los carriles 1, 2, 3 y 4 corresponden a embriones embebidos en PS 2 µm, SN 2 µm, FB 1 2 µm y Control respectivamente. Se cargaron 25 µg de proteína en cada carril. (B) Ensayo de actividad en gel. El orden de las muestras cargadas es el mismo que para el control de cargado. Se cargaron 1 µg de proteína en cada carril. Se señalan las principales bandas de actividad. Ensayo en gel. Imbibición discontinua. La figura 5 muestra la separación electroforética y posterior renaturalización de las proteínas de microsomas de embriones de Z. mays embebidos 22 h en medio control y transferidos durante 3, 6 ó 12 h más a medios con diferentes condiciones. Se

7 observaron principalmente dos bandas de actividad de 6 y kda (figura 5B), la intensidad de las bandas no muestra diferencias significativas en las diferentes condiciones. A B 22h + 3h 22h + 6h 22h + 12h 22h + 3h 22h + 6h 22h + 12h 12-18kDa 6 kda Figura 5. Determinación de actividad de NADPH oxidasa en gel de proteínas de membrana plasmática de embriones de Z. mays embebidos en diferentes condiciones. (A) Gel teñido con Azul de Coomasie. Los carriles 1, 2, 3, y 4 corresponden a embriones embebidos 22 h en medio control que posteriormente fueron transferidos por 3 h a otro medio con los compuestos de estudio correspondientes: control, 2 µm FB 1, 2 µm SN y 2 µm PS. En los carriles 5, 6, 7 y 8 la segunda incubación duró 6 h, el orden de las muestras es similar al anterior. Los carriles 9, 1, 11 y 12 fueron incubados 22 h en medio control y transferidos 12 h a medio con o sin compuestos esfingoideos, el orden de las muestras es el mismo que para las anteriores secciones. Se cargaron 25 µg de proteína en cada carril. (B) Ensayo de actividad en gel. El orden de las muestras en los carriles del gel es igual al del control de cargado. Se cargaron 1 µg de proteína en cada carril. Se indican los pesos moleculares aproximados de las principales bandas de actividad observadas. DISCUSIÓN Los resultados obtenidos indican que se llevó a cabo una reacción de reducción de o XTT dependiente de NADPH por fracciones de membrana plasmática de embriones de Z. mays. Esta reacción pudo ser inhibida en diferentes porcentajes utilizando un inhibidor específico para la reacción de la NADPH oxidasa de células de mamíferos (DPI). Ésta reducción pudo deberse a proteínas con pesos moleculares similares a las masas de las proteínas reportadas en la literatura para N. tabacum y L. esculentum (Sagi y Fluhr, 21), las cuáles tienen actividad homóloga a la subunidad gp 91 PHOX de células de mamífero. A la fecha no se han reportado homólogos parta esta enzima o sus subunidades en Z. mays, sin embargo los resultados obtenidos en este trabajo nos permiten sugerir que un homólogo de esta enzima puede ser el responsable de la reducción de colorantes de tetrazolio por fracciones membranales de esta especie. Asimismo, se encontró que la adición in vivo de compuestos esfingoideos, principalmente FB 1 y SN, a embriones de Z. mays afectó ésta reacción dependiendo de la concentración: concentraciones bajas de FB 1 (1 µm) disminuyeron el nivel de reducción de los compuestos de tetrazolio, mientras que concentraciones mayores (2 µm) la incrementaron, en experimentos preliminares realizados en nuestro laboratorio no se ha detectado FB 1 presente en la membrana plasmática después de incubar los embriones por 24 h en 1 µm de FB 1 ; cuando los embriones se incubaron 24 h en 2 µm de este

8 compuesto, la cantidad de FB 1 detectada es aproximadamente de.34 pmolas (Gutiérrez, no publicado). Éstos datos sugerirían que la FB 1 remanente en la membrana podría estar causando la activación de la NADPH oxidasa, sin embargo, no se puede descartar que el gran exceso de SN producido por la adición de FB 1 sea el responsable de éste efecto, ya que la adición de 2 µm de SN exógena induce el mismo efecto de activación. Se ha encontrado que la inoculación con Pseudomonas syringae pv. glycinea a células de Phaseolus vulgaris causa una rápida pero débil y transitoria acumulación de ERO (fase I), aproximadamente durante la primera hora post-inoculación y una segunda explosión oxidativa (fase II) más intensa y prolongada entre 3 y 6 h después de la inoculación (Lamb y Dixon, 1997). En este trabajo se encontró que embriones que fueron sometidos a imbibición discontinua mostraron un incremento en la producción de radical superóxido cuando fueron embebidos 3 h en compuestos esfingoideos, esto podría sugerir la detección de una fase II de la explosión oxidativa en nuestro sistema de estudio, ya que los tiempos de incubación en dichos compuestos de los embriones de Z. mays, fueron aparentemente demasiado largos, quedaría pendiente estudiar el sistema utilizando tiempos de incubación menores. AGRADECIMIENTOS Este proyecto se realizó con apoyo del Subprograma 127, de la Coordinación de Superación Académica de la Facultad de Química de la UNAM, con el proyecto de CONACYT (4311-Q) y con el proyecto de UC-MEXUS (CN-3-118), Universidad de California y CONACYT. Se agradece a la QFB Consuelo Enríquez Arredondo la supervisión técnica otorgada a este trabajo. REFERENCIAS Abbas HK, Tanaka T, Duke SO, Porter JK, Wray EM, Hodges L, Sessions AE, Wang E, Merrill HA, Riley RT (1994) Fumonisin and AAL-toxin- induced disruption of sphingolipid metabolism with accumulation of free sphingoid bases. Plant Physiol. 16: Able AJ, Guest DI, Sutherland MW (1998) Use of a new tetrazolium-based assay to study the production of superoxide radicals by tobacco cell cultures challenged with avirulent zoospores of Phytophthora parasitica var nicotianae. Plant Physiol. 117: Briskin DP, Leonard RT, Hodges TK (1987) Isolation of the plasma membrane markers and general principles. Methods Enzymol. 148: Lamb C, Dixon RA (1997) The oxidative burst in plant disease resistance. Annu. Rev. Plant Mol. Biol. 48:

9 Gutiérrez-Nájera N, Muñoz-Clares RA, Palacios-Baena S, Ramírez J, Sánchez-Nieto S, Plascencia J, Gavilanes-Ruíz M (25) Fumonisin B 1, a sphingoid toxin, is a potent inhibitor of the plasma membrane H + -ATPase. Planta. 221: Larsson C, Widell S, Kjellbom P (1987) Preparation of high-purity plasma membranes. Methods Enzymol. 148: Larsson C, Sommarin M, Widell S (1994) Isolation of highly purified plant plasma membranes and separation of inside-out right-side-out vesicles. Methods Enzymol. 228: Peterson GL (1977) A Simplification of the protein assay method of Lowry et al, wich is more generally applicable. Anal Biochem. 83: Sagi M y Fluhr R (21) Superoxide production by plant homologues of the gp 91 phox NADPH oxidades. Modulation of activity by calcium and by tobacco mosaic virus infection. Plant Physiol. 126: Schägger H y Von Jagow G (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 1 kda. Anal. Biochem. 166: Sutherland MW y Learmonth (1997) The tetrazolium dyes MTS and XTT provide new quantitative assays for superoxide and superoxide dismutase. Free Rad. Res. 27: Wojtaszek P (1997) Oxidative burst: an early plant response to pathogen infection. Biochem. J. 322: