PNT07BIO0020 MEDIDAS CON EL LECTOR DE PLACAS. Aprobado

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1 PNT07BIO0020 MEDIDAS CON EL LECTOR DE PLACAS Firma Aprobado Nombre (1)Julián Martínez Fernández/ Patricia Aparicio Fernández. (2)Josep Casadesús Pursals. Cargo (1)Dirección SGI. (2)Director SGI Biología. Fecha de aprobación: 24/09/2012 Revisión: 00 PNT07BIO0020. Rev 00 Página 1 de 6

2 ÍNDICE CONTROL DE REVISIONES 2 1.-OBJETO Y ALCANCE DESARROLLO PRECAUCIONES EN EL ENCENDIDIO ACCESORIOS Y FILTROS TIPO DE MEDIDA 4 CONTROL DE REVISIONES Nº Rev/Fecha Naturaleza de la revisión 00 / Creación del procedimiento PNT07BIO0020. Rev 00 Página 2 de 6

3 1.-OBJETO Y ALCANCE El objeto del presente PNT es facilitar a los usuarios el procedimiento más adecuado para llevara acabo mediciones de absorbancia, fluorescencia y luminiscencia de diferentes muestras con el equipo Synergy HT de BIO-TEK del Servicio General de Biología de la. Su aplicación permitirá llevar a cabo un buen uso del equipo por parte de los usuarios del Servicio. 2.- DESARROLLO Este equipo es muy versátil en la gama de lectores de microplacas. Permite la medición de absorbancia, fluorescencia y luminiscencia de diferentes muestras. La lectura superior de la placa para soluciones homogéneas permite el empleo de placas negras de bajo ruido de fondo. Por otro lado y mediante la lectura de la placa por la parte inferior, nos permite realizar una lectura óptima cuando trabajamos con células, especialmente cuando se requiere esterilidad y queremos trabajar con tapa. El lector admite todo tipo de placas, desde 6 a 384 pocillos. Las características del equipo permiten la rapidez de la medición, la versatilidad de su empleo y el ahorro de reactivos en las lecturas, debido al pequeño volumen de muestra PRECAUCIONES EN EL ENCENDIDIO El equipo tiene un botón de encendido en la parte frontal y el orden de encendido con el ordenador, no importa. Si es recomendable dejarlo unos minutos antes de hacer la primera medida. El icono que ejecuta el programa es el: GEN Una vez dentro del programa aparece una ventana que nos da opción de ir directamente a lo que deseemos. PNT07BIO0020. Rev 00 Página 3 de 6

4 2.2.- ACCESORIOS Y FILTROS - Tornillo de seguridad y llave para desatornillarlo. - Carro con filtros de excitación. - Carro con filtros de emisión. - En cuanto a la configuración de filtros que tenemos colocados ahora mismo en el equipo es la siguiente: Filtros de excitación Filtros de emisión 380/40 460/40 485/20 528/20 530/25 590/35 plug hole - Otros filtros son: 595/20 (excitación) y 645/40 (emisión) TIPO DE MEDIDA a) Medida de absorbancia Para medidas de absorbancia, se utiliza una lámpara flash de xenón, que permite realizar medidas de absorbancia tanto en el UV como en el visible y un monocromador con un rango de 200 a 999 nm (con incrementos de 1 nm) permitiendo optimizar de esta forma gran variedad de ensayos. También presenta un rango de densidad óptica de 0 a 4 OD y un paso de banda de 2,4 nm. Al ejecutar el programa Gen se nos abre la ventana welcome to gen5. Entre todas las opciones que aparecen, nos vamos a Real a plate. PNT07BIO0020. Rev 00 Página 4 de 6

5 De nuevo se nos abre otra ventana, Procedure-Synergy (Com1), seleccionamos el tipo de placa en plate type, y a continuación damos a read en la opción add step. Indicamos el tipo de lectura en detection method. (absorbance) y en wavelengths seleccionamos las longitudes de onda (nm) o bien las tecleamos directamente. Por último en full plate podemos seleccionar los pocillos de la placa con muestra. Ahora damos a ok, validamos (procedure step sequence is valid, aceptar) y de nuevo a ok. Pulsamos en READ y en la ventana guardar damos a cancelar, metemos la placa y damos ok. Los datos se pueden ver en data layout y si pinchamos en flecha derecha y seleccionamos la longitud de onda, nos lo representan. Luego podemos exportarlos a Excel. Para medidas de absorbancia usar placas transparentes. b) Medida de fluorescencia Como característica diferenciadora respecto a otros lectores de microplacas, el equipo utiliza un diseño único de doble-óptica. Cuando existe la necesidad de realizar medidas de fluorescencia o luminiscencia, el equipo emplea una lámpara halógena de tungsteno con filtros interferenciales en conjunción con un detector fotomultiplicador. La lámpara de tungsteno genera una gran cantidad de luz a una intensidad constante, proporcionando una elevada sensibilidad y repetitividad. Además, la posibilidad de emplear filtros con diferentes pasos de banda permite al investigador diseñar ensayos a su medida. Los rangos de excitación ( nm) y emisión ( nm), permiten la detección de los compuestos fluorescentes más comunes. Además, tiene un rango dinámico de 5 órdenes de magnitud (0 99,999) y una gran sensibilidad de 1 pg/ml de fluoresceína sódica. En este caso, en detection method, indicamos el tipo de lectura (fluorescence) y en filter sets seleccionamos la longitud de onda de excitación y la de emisión. PNT07BIO0020. Rev 00 Página 5 de 6

6 También le decimos si la lectura la queremos hacer por arriba o por debajo y con la sensibilidad vamos probando. Para empezar la dejamos en 35. Para fluorescencias es mejor usar placas entras opacas. c) Medida de luminiscencia Una medida de luminiscencia, no es más que una medida de fluorescencia en la cual no hay excitación y en la emisión intentamos recoger sin filtro. En este último caso, marcamos luminiscence en detection method y debemos no tener ningún filtro en emisión (hole). La medida también podemos hacerla por encima o por debajo y la sensibilidad la dejamos en 135. Para luminiscencia se usan placas blancas opocas. PNT07BIO0020. Rev 00 Página 6 de 6