Fisiología y respuestas de comportamiento de escarabajos acuáticos salinos frente al estrés térmico y salino

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1 TESINA DE LICENCIATURA Fisiología y respuestas de comportamiento de escarabajos acuáticos salinos frente al estrés térmico y salino Susana Pallarés Párraga Dpto. de Ecología e Hidrología Facultad de Biología Directores: Josefa Velasco y Andrés Millán

2 Índice Resumen... ii 1. Introducción Justificación e interés del estudio Objetivos Hipótesis y predicciones de partida Material y métodos Especies estudiadas Diseño experimental Resultados Correlación entre la mortalidad y las respuestas de comportamiento Efecto de la temperatura y la conductividad en las variables respuesta Tolerancia al estrés: mortalidad Respuestas de comportamiento de huida para evitar la exposición al estrés Emersión Vuelo Discusión Conclusiones Referencias Agradecimientos i

3 Resumen El presente trabajo compara la tolerancia fisiológica y las respuestas de comportamiento frente al estrés térmico y salino de tres pares de especies congenéricas de coleópteros acuáticos salinos (Enochrus falcarius y E. bicolor, Nebrioporus baeticus y N. ceresyi, Ochthebius glaber y O. notabilis) con el objetivo de explicar sus diferentes patrones de ocupación de hábitat y rango geográfico y su sensibilidad a cambios en las condiciones de sus hábitats. Para ello se realizaron experimentos de laboratorio sometiendo a individuos de cada especie a diferentes tratamientos combinados de conductividad y temperatura del agua. Durante 30 minutos de exposición se midió la tolerancia fisiológica (mortalidad) así como respuestas de comportamiento (emersión y vuelo) para evitar las condiciones estresantes. Los resultados mostraron que el shock térmico agudo tiene un efecto más importante e inmediato sobre la fisiología y el comportamiento de huida de los individuos que el estrés salino o la interacción de ambos factores. La emersión y el vuelo fueron dependientes de la tolerancia al estrés de las especies. Temperaturas entre 35-40ºC fueron críticas para las respuestas de comportamiento analizadas, siendo estos valores los umbrales de máxima respuesta de vuelo o emersión en la mayoría de las especies estudiadas. Temperaturas de 45ºC produjeron un daño fisiológico importante sobre los individuos, resultando letales para las especies de Enochrus y Nebrioporus. Sin embargo, las especies de Ochthebius resultaron más resistentes a dicha temperatura. En dos de los tres pares de especies estudiados (Nebrioporus y Ochthebius) las especies que ocupan cuerpos de agua lóticos (N. baeticus y O.glaber) fueron menos tolerantes al estrés térmico y en niveles críticos de estrés sus respuestas de emersión y vuelo fueron de mayor magnitud que sus especies hermanas de medios leníticos (N. ceresyi y O. notalibis), mostrando una mayor sensibilidad frente al aumento de temperatura. Dichos resultados concuerdan con lo esperado, ya que los medios lóticos, en general y en un contexto evolutivo, sufren menores fluctuaciones ambientales que los medios de aguas estancadas, más inestables. Sin embargo, las dos especies de Enochrus presentaron similar tolerancia al estrés y respuesta de emersión, siendo E. bicolor, la especie lenítica, la que mostró una respuesta de vuelo mayor a temperaturas críticas subletales. En este caso, diferencias en la capacidad de dispersión, claramente menor en E. falcarius, parecen determinar el distinto patrón biogeográfico de estas especies. Nuestro estudio, por tanto, demuestra que, en general, las especies lóticas, especialmente las que tienen una capacidad de vuelo reducida, son más sensibles que las leníticas frente al previsible aumento de temperaturas como consecuencia del cambio climático. Palabras clave: tolerancia fisiológica, respuestas de comportamiento, estrés térmico, estrés salino, umbrales críticos de estrés, coleópteros acuáticos salinos, estabilidad del hábitat, cambio climático. ii

4 1. Introducción 1.1 Justificación e interés del estudio El estudio de la fisiología de las especies constituye una herramienta muy útil para algunas disciplinas generales como la ecología, biogeografía y biología evolutiva (Spicer y Gaston 1999). Para entender los procesos pasados y presentes que actúan sobre las especies es fundamental conocer cómo responden los organismos a la variabilidad de su entorno (Chown 2001). Los rasgos fisiológicos definen el nicho de las especies, delimitan sus rangos geográficos (e.g. Hoffmann y Blows 1994, Gaston 2003, 2009) y, además, juegan un papel esencial en aspectos básicos de su ecología, como por ejemplo la ocupación de hábitat (Tomanek y Somero 1999, Stillman 2003). Así mismo, en las últimas décadas ha surgido una urgente necesidad de predecir los efectos potenciales de la alteración de los hábitats derivados del cambio climático y de las diversas presiones humanas sobre las especies y poblaciones, dando un nuevo ímpetus a la fisiología ecológica (e.g. Deutsch et al. 2008, Tewksbury et al. 2008, Gaston et al. 2009, Helmuth 2009). En este contexto han surgido numerosos estudios que examinan los efectos de factores estresantes sobre la fisiología de los organismos con fines conservacionistas (e.g. Davis y Olla 2001, Homan et al. 2003, Swanson et al. 2000, Sardella et al. 2008b, Sánchez-Fernández et al. 2010). Junto a los rasgos fisiológicos, la capacidad de las especies para adaptarse a los cambios ambientales depende de ajustes del comportamiento que pueden modificar sustancialmente las condiciones ambientales experimentadas por los individuos (Huey 1991, Marais y Chown 2008, Angilletta 2009). Por ejemplo, las especies pueden adaptarse a cambios en las condiciones climáticas desplazándose hacia otras áreas (Thuiller et al. 2005, Massot et al. 2008) o moviéndose dentro de sus actuales hábitats en busca de condiciones microclimáticas favorables para mantener un ambiente térmico constante (Feder 2010). En el contexto de la actual crisis de la biodiversidad y en particular del cambio global, resulta especialmente necesario disponer de un mejor conocimiento de este tipo de respuestas (Bozinovic et al. 2011), ya que determinan en gran medida la supervivencia y persistencia de las poblaciones locales. Sin embargo, 1

5 hasta ahora pocos estudios han integrado medidas de tolerancia fisiológica y de estrategias de comportamiento de organismos ectotermos en relación con el estrés ambiental (e.g. Hazell et al. 2010). Entre las múltiples dimensiones del nicho de las especies, la temperatura es reconocida como uno de los factores más importantes ya que determina la actividad metabólica y las historias de vida de las especies (Willott y Hassall 1998). Los efectos del estrés térmico en insectos y las respuestas fisiológicas, morfológicas y de comportamiento que los individuos emplean para contrarrestar estos efectos han sido aspectos centrales en fisiología y ecología (e.g Bale 2002, Hoffmann et al. 2003, Sinclair et al. 2003, Chown y Nicolson 2004, Korsloot et al. 2004). Sin embargo, la mayoría de los estudios se han centrado en determinar los límites térmicos letales y subletales de las especies o su tolerancia a temperaturas extremas (e.g Kay y Whitford 1978, Pandolfo et al. 2010, Hughes et al. 2010, Chidawanyika y Terblanche 2011), dedicando menos atención a otras respuestas subletales de comportamiento críticas para hacer frente a los cambios ambientales. Por otro lado, los organismos no experimentan variación en un solo factor abiótico independientemente, sino que en la naturaleza es frecuente que múltiples factores cambien simultáneamente (Terblanche et al. 2011). De este modo, es especialmente interesante el desarrollo de aproximaciones multifactoriales que combinen la temperatura con otros factores ambientales de estrés para evaluar el efecto de su interacción sobre las respuestas de los organismos. Los medios salinos continentales mediterráneos son un interesante modelo para el estudio de respuestas fisiológicas y de comportamiento frente a múltiples factores de estrés. En estos ambientes, la combinación de altos niveles de salinidad y temperatura es frecuente, actuando de forma aditiva, sinérgica o incluso antagónica sobre los individuos que los ocupan. Estas condiciones tan extremas constituyen una barrera infranqueable para la mayoría de especies acuáticas; solo las especies más especializadas son capaces de colonizar estos medios (Millán et al. 2011). Estudios recientes de tolerancia térmica en escarabajos acuáticos salinos han mostrado que la salinidad influye en su fisiología térmica (e.g. Sánchez Fernández et al. 2010), al igual que ocurre en otros taxones marinos (e.g. Kir y Kumlu 2008, Rajagopal et al. 2005, Sardella et al. 2008a, b). Por lo tanto, es probable que las respuestas fisiológicas y de 2

6 comportamiento de las especies para compensar el estrés térmico y salino en estos medios sean especialmente complejas y singulares, aunque hasta ahora han sido poco estudiadas. Entre los macroinvertebrados, los coleópteros, junto a los dípteros y hemípteros, son los órdenes más comunes y ricos en especies en las aguas salinas continentales. En especies taxonómicamente relacionadas de escarabajos salinos ibéricos se ha encontrado una correlación entre el tamaño del rango geográfico y el tipo de hábitat ocupado. Así, las especies que ocupan los medios leníticos (aguas estancas), sistemas más inestables desde un punto de vista ecológico y geológico, presentan rangos geográficos más amplios que especies congenéricas que viven en medios lóticos (aguas corrientes) (e.g Ribera y Vogler 2000, Hof et al. 2006, Abellán et al. 2009, Damm et al. 2010, Arribas et al. en prensa). La tolerancia fisiológica, como un componente de la capacidad de colonización de las especies, ha sido identificada como uno de los rasgos fundamentales que determina este patrón. Debido a que los cuerpos de agua someros leníticos están sujetos a mayores fluctuaciones térmicas diarias y estacionales que los ríos o arroyos (Álvarez-Cobelas et al. 2005, Florencio et al. 2009), la selección para resistir estas fluctuaciones locales ha podido resultar en una amplia tolerancia térmica de las especies leníticas, permitiéndoles establecerse en un rango mayor de localidades en comparación con las especies lóticas. Así, la fauna de los medios acuáticos salinos constituye un grupo ideal para comparar respuestas frente al estrés entre especies relacionadas que ocupan hábitats con diferente estabilidad ambiental. 1.2 Objetivos El objetivo general del presente estudio es comparar las respuestas de comportamiento frente al estrés térmico y salino en tres pares de especies congenéricas de escarabajos acuáticos salinos, con diferente tamaño de sus rangos geográficos y contrastada ocupación de hábitat, en relación con su tolerancia fisiológica. Con los términos respuestas de comportamiento se hace referencia al conjunto de estrategias, condicionadas por la tolerancia fisiológica, que los organismos emplean frente a condiciones desfavorables o cambiantes en sus medios para evitar la exposición al estrés ambiental, con el fin de mantener un estatus térmico y osmótico 3

7 óptimo. En concreto este estudio se centra en dos respuestas: vuelo y emersión del agua (comportamiento de huida). La mayoría de especies de coleópteros en fase adulta muestran capacidad para volar, lo cual les permite escapar de sus hábitats cuando las condiciones se vuelven fisiológicamente subóptimas, en busca de hábitats más favorables, siendo el aumento de la temperatura un factor clave del inicio de la dispersión (Zalom et al. 1980, Velasco y Millán 1998). Por otro lado, los individuos adultos acuáticos pueden emerger del agua cuando las condiciones del medio varían, reduciendo el estrés al que están expuestos. Además la emersión en coleópteros voladores es un paso previo necesario para el vuelo, ya que para desplegar las alas los élitros deben estar secos. El presente estudio pretende dar respuesta a las siguientes cuestiones: 1) Afecta la combinación de estrés térmico y salino a la tolerancia y el comportamiento de huida escarabajos acuáticos salinos? 2) Dependen las respuestas de comportamiento de huida de la tolerancia fisiológica de las especies? 3) Son las especies lóticas más sensibles al estrés que las especies leníticas? 4) Qué especies dentro de cada género estudiado podría ser más susceptible a cambios en las condiciones de sus hábitats en base a su fisiología y comportamiento frente al estrés ambiental? 1.3 Hipótesis y predicciones de partida En relación a la cuestión 1, predecimos que la combinación de elevadas temperaturas y salinidades disminuirá la capacidad de los individuos estudiados de desarrollar respuestas de escape por el daño fisiológico acumulado, reduciendo la supervivencia. En cuanto a las cuestiones 2 y 3, la predicción general es que las respuestas de comportamiento de escape o huida están condicionadas por la tolerancia fisiológica de las especies, y en base a ello se espera que dentro de cada par de especies estudiadas, la especie menos tolerante al estrés muestre respuestas de comportamiento críticas para su supervivencia (emersión y vuelo) en niveles de estrés más bajos que las especies más tolerantes. Debido a que en general los arroyos salinos son ecológicamente más estables que los humedales salinos, es esperable un patrón de respuesta diferente entre especies lóticas y leníticas. Así, se prevé que las especies lóticas sean más sensibles al estrés ambiental que las leníticas, ya que están adaptadas 4

8 a un menor rango de variación de las condiciones ambientales, y por ello sus respuestas de escape se producirán en niveles de estrés térmico y salino más bajos que las leníticas y/o serán de mayor magnitud. Por último, en relación a la cuestión 4, de acuerdo con el planteamiento anterior, las especies lóticas podrían ser más vulnerables frente a cambios ambientales que las leníticas. 2. Material y métodos 2.1. Especies estudiadas Entre los coleópteros acuáticos salinos, las familias más representativas son Hydraenidae, Hydrophilidae y Dytiscidae, pertenecientes a dos sub-órdenes (Polyphaga las dos primeras y Adephaga la última). El presente estudio se centra en tres pares de especies congenéricas de coleópteros típicos de medios acuáticos mesosalinos e hipersalinos continentales, con contrastada ocupación de hábitat y tamaño del rango geográfico. Estas especies pertenecen a tres géneros: Nebrioporus (N. ceresyi (Aubé 1836) y N. baeticus (Schaum 1864), familia Dytiscidae), Enochrus (E. bicolor (Fabricius 1792) y E. falcarius Hebauer 1991, familia Hydrophilidae) y Ochthebius (O. notabilis Rosenhauer 1856 y O. glaber Montes & Soler 1988, familia Hydraenidae). Nebrioporus es un género de escarabajos acuáticos relativamente rico en especies, la mayoría de ellas distribuidas por la región Paleártica, aunque el género también está presente en zonas de África sub-sahariana (Toledo 2009). Algunas especies ocupan arroyos y lagunas salinos (grupo N. ceresyi). N. ceresyi es una especie de distribución circum-mediterránea que habita aguas estancas como humedales y pozas, particularmente localizados en cotas bajas cerca de la costa (Fery et al. 1996). Excepcionalmente ocupa zonas salinas de interior de origen marino. N. baeticus es endémica del sureste de España y ocupa arroyos hipersalinos, en general alejados de la costa (Fig. 1). Enochrus es un amplio género de escarabajos acuáticos, con 189 especies distribuidas en todas las regiones biogeográficas. Las especies mediterráneas de ambientes salinos pertenecen al complejo Enochus bicolor (Schödl 1998). E. bicolor, la especie que da 5

9 nombre al complejo, ocupa cuerpos de agua salinos leníticos (humedales y pozas) en Europa, Norte de África, este de Asia y Mongolia (Hansen 2004). Su especie congenérica, E. falcarius, presenta una distribución más restringida, ocupando arroyos salinos en el sur de la Península Ibérica, Túnez, Sicilia (Hansen 2004) y Marruecos (Fig. 1). Un estudio reciente ha revelado que esta especie tal y como se entiende actualmente, realmente incluye un complejo de diferentes linajes, cada uno con distribuciones disyuntas y restringidas a lo largo del área mediterránea (Arribas et al. en prensa). En nuestro caso trabajamos con el linaje ibérico ( E. falcarius IP según Arribas et al., en adelante E. falcarius para simplificar). Por último, Ochthebius es uno de los géneros más diversos de la familia Hydraenidae (Jäch et al. 2005), con 66 especies citadas en la Península Ibérica. O. notabilis se encuentra en la Península Ibérica, Islas Canarias y Norte de África (Fig. 1), habitando lagunas salinas y cubetas salineras, mientras que O. glaber es endémico del sur de la Península Ibérica, ocupando principalmente los arroyos hipersalinos (Abellán et al. 2009). 6

10 Figura 1. Distribución geográfica aproximada de los tres pares de especies estudiadas. 7

11 2.2. Diseño experimental Para evaluar las respuestas de comportamiento (emersión y vuelo) y la tolerancia al estrés térmico y salino en los tres pares de especies seleccionados se desarrolló un diseño experimental en laboratorio con tres factores fijos (temperatura, conductividad y especie). En primer lugar se recolectaron aproximadamente 400 individuos de cada especie en diferentes localidades (una localidad por especie) en el sureste ibérico (Tabla 1). Los individuos se mantuvieron durante una semana en laboratorio, dentro de acuarios que contenían agua filtrada procedente de los sitios de recolección con aireación artificial, alimentándoles periódicamente (larvas de quironómidos para las especies depredadoras - Nebrioporus-, Ruppia marítima para las especies herbívoras -Enochrusy biofilm para las especies de Ochthebius). Tras la semana de mantenimiento, los individuos fueron aclimatados durante 24 h en una cámara climática (SANYO MLR-351) en condiciones constantes de temperatura (20ºC), fotoperiodo (12h luz: 12h oscuridad) e intensidad de luz de 15 μmol.m -2.s -1, sin proporcionarles alimento durante este periodo. Para llevar a cabo los experimentos, grupos de 10 individuos de cada especie seleccionados aleatoriamente fueron sometidos a 12 tratamientos combinados de conductividad y temperatura en el caso de las especies de Enochrus y Nebrioporus y 20 tratamientos para las especies de Ochthebius (Fig. 2). Los niveles de conductividad testados se establecieron de acuerdo con el rango natural de salinidad en el que se encuentran las especies en los hábitats que ocupan (Velasco et al. 2006): 20, 50, 80 ms.cm -1 para las especies de Enochrus y Nebrioporus y 20, 50, 80, 180, 240 ms.cm -1 para las especies de Ochthebius. Las disoluciones correspondientes a cada tratamiento se prepararon disolviendo sal marina (Ocean Fish, Prodac ) en agua destilada. Los niveles de temperatura testados son valores representativos de un gradiente que abarca desde temperaturas habituales en los hábitats de las especies (20 y 35ºC) hasta temperaturas extremas (40 y 45ºC) próximas a los límites térmicos subletales y letales registrados para estas especies en estudios previos (Sánchez-Fernández et al. 2010, 8

12 Arribas et al. en prensa). Cada tratamiento combinado de temperatura y salinidad fue replicado 3 veces. Los acuarios experimentales se introdujeron en un baño húmedo con temperatura controlada (Fig. 3) para mantener unas condiciones térmicas constantes durante el experimento (±1ºC). Cada acuario contenía 100 ml de la correspondiente disolución y una piedra artificial de cemento parcialmente emergida del agua (Fig. 3) cuya función era facilitar a los individuos la salida del medio (emersión) y el vuelo para evitar las condiciones de estrés. Cada conjunto de 10 individuos se extrajo de los acuarios de aclimatación e inmediatamente se expuso al tratamiento asignado durante 30 min, es decir, se trata de experimentos de choque térmico y salino de exposición corta. En este periodo se registraron las respuestas de comportamiento de huida (emersión y vuelo) y la mortalidad. Los individuos que volaron durante el experimento se contaron y retiraron para que no interfirieran en el tratamiento; el vuelo se expresó como número total de vuelos registrados en el tratamiento. Cada 2 min se registró el número de individuos que se encontraba sobre la piedra, expresando la emersión como el número medio de individuos que emergieron del agua durante el tiempo experimental. La mortalidad, como medida de la tolerancia al estrés, se expresó como el número de individuos muertos contados tras los 30 minutos de exposición. 9

13 Tabla 1. Rango de conductividad natural de los hábitats de las especies estudiadas y localidades de recolección (posición geográfica y conductividad media). Rango de Conductividad Especies conductividad Localidad de muestreo Latitud Longitud media (ms.cm -1 ) (ms.cm -1 ) N. ceresyi Laguna Cotorrillo, Salinas de San Pedro, Murcia N. baeticus Río Chícamo, Murcia E. bicolor 4-90 Laguna del Mojón Blanco, Albacete E. falcarius Rambla Salada de Fortuna, Murcia O. notabilis Estrecho de la Salineta, Alicante O. glaber Rambla salada de Librilla, Murcia ºC 35ºC 20ºC 35ºC 40ºC 45ºC 40ºC 45ºC Figura 2. Tratamientos combinados de temperatura y conductividad a los que fueron sometidos los individuos. 10

14 Figura 3. Acuarios de mantenimiento (arriba izq.), baño húmedo con temperatura controlada (abajo izq.) y acuarios experimentales (dcha.). Las flechas señalan individuos emergidos sobre la piedra durante el experimento Análisis de datos Dado que a priori las respuestas analizadas en los experimentos no son independientes unas de otras (una de las predicciones de partida es que las respuestas de comportamiento están en gran medida condicionadas por la tolerancia fisiológica), se testó la relación entre las tres variables dependientes estimadas (emersión, vuelo y mortalidad) mediante el cálculo de los coeficientes de correlación de Pearson para cada par de especies. Tras comprobar la relación entre las variables, se realizó para cada par de especies un MANOVA Multifactorial con la temperatura, conductividad y especie como factores fijos. Se empleó el test multivariado de la lambda de Wilks para estimar el efecto global de los factores y las interacciones entre factores en las variables respuesta. Para determinar los efectos de cada factor e interacciones sobre cada variable dependiente por separado se realizaron test univariados (ANOVA). 11

15 Se testó la homocedasticidad y normalidad de los datos y la homogeneidad de las covarianzas. Sin embargo, debido a que algunos tratamientos no cumplieron estos requisitos se analizó también el cumplimiento de los mismos con los residuos no tipificados (Underwood 1997, Rutherford 2001). Para detectar diferencias significativas en las variables respuesta entre los distintos tratamientos se realizaron análisis posthoc, aplicando el test de Bonferroni, más conservativo, para compensar el incumplimiento de algunos de los requisitos del análisis. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS para Windows, Rel Chicago: SPSS Inc. 3. Resultados 3.1. Correlación entre la mortalidad y las respuestas de comportamiento La emersión y la mortalidad estuvieron significativamente correlacionadas en los tres pares de especies estudiadas. Esta relación fue negativa en las especies de Enochrus (r= , p = 0.001) y Nebrioporus (r = , p = 0.009) y positiva en las especies de Ochthebius (r = 0.253, p = 0.005). El vuelo y la mortalidad también mostraron una correlación negativa en las especies de Enochrus (r = , p = 0.040) y Nebrioporus (r = , p = 0.011), aunque no en las especies de Ochthebius. Finalmente, ambas respuestas de comportamiento (emersión y vuelo) tuvieron una relación positiva en los tres pares de especies (r = 0.289, p = en Enochrus; r = 0.440, p < en Nebrioporus y r = 0.328, p < en Ochthebius) Efecto de la temperatura y la conductividad en las variables respuesta Los test multivariantes de la lambda de Wilks mostraron que la temperatura tuvo un efecto global significativo sobre las variables dependientes en los tres pares de especies estudiadas (Tabla 2). Los test univariantes revelaron resultados similares (ver Tabla 3 para mortalidad, Tabla 4 para emersión y Tabla 5 para vuelo). En cambio, el efecto global de la conductividad y de la interacción conductividad x temperatura solo fue significativo para las especies de Ochthebius (Tabla 2) en todas 12

16 las variables respuesta (Tablas 3, 4 y 5), aunque los test univariados (ANOVA) mostraron que el efecto de estos factores fue diferente en O. glaber y O. notabilis. Tabla 2. Resultados del MANOVA. Test de la lambda de Wilks del efecto global de la temperatura y la conductividad sobre las variables dependientes en los tres pares de especies estudiadas. Fuente Lambda de Wilks F Σ 2 parcial p Enochrus Temperatura *** Conductividad n.s Especie *** Temperatura x Conductividad n.s Temperatura x Especie *** Conductividad x Especie n.s Temperatura x Conductividad x Especie n.s Nebrioporus Temperatura *** Conductividad n.s Especie *** Temperatura x Conductividad n.s Temperatura x Especie *** Conductividad x Especie n.s Temperatura x Conductividad x Especie n.s Ochthebius Temperatura *** Conductividad *** Especie *** Temperatura x Conductividad *** Temperatura x Especie *** Conductividad x Especie *** Temperatura x Conductividad x Especie *** * p 0.05, ** p 0.01, *** p 0.001, n.s no significativo 13

17 3.3. Tolerancia al estrés: mortalidad Las dos especies de Enochrus mostraron una tolerancia similar al estrés térmico agudo (Tabla 3). La supervivencia de E. bicolor y E. falcarius fue alta en todos los niveles de temperatura testados excepto en el nivel más extremo, 45ºC, que resultó letal para prácticamente todos los individuos expuestos (Fig. 4a). Las especies de Nebrioporus fueron menos resistentes al estrés térmico; el incremento de temperatura redujo la supervivencia de ambas especies y a 45ºC murieron la mayoría de individuos (Fig. 4b). La mortalidad de N. baeticus fue significativamente mayor que la de N. ceresyi (Tabla 3), siendo esta diferencia especialmente notable en los tratamientos de 40ºC (post-hoc Temperatura x Especie 40ºC: p < 0.001; Fig. 4b). Las especies de Ochthebius presentaron diferente tolerancia a ambos factores estresantes, siendo O. glaber en general menos tolerante que O. notabilis (Tabla 3, Fig. 4c,d). La mortalidad de O. glaber aumentó progresivamente con la temperatura, siendo moderadamente alta a 40ºC y alcanzando el valor máximo a 45ºC. Dentro de los tratamientos de temperaturas más elevadas (40 y 45ºC), la mortalidad de esta especie fue significativamente mayor en el nivel de conductividad más extremo (240 ms.cm -1 ) (Fig. 4c). En cambio, la mortalidad de O. notabilis fue muy baja o nula en las temperaturas de 20, 35 y 40ºC; sólo el nivel de estrés térmico más extremo (45ºC) redujo significativamente la supervivencia de esta especie (Fig. 4d). Para esta especie no se observaron diferencias significativas en la mortalidad entre los diferentes niveles de conductividad (p = 0.238). 14

18 Tabla 3. Resultados del ANOVA. Efecto de la temperatura y la conductividad en la mortalidad en los tres pares de especies estudiadas. Variable dependiente: Mortalidad Fuente SS g.l. F p Enochrus Modelo corregido *** Intersección *** Temperatura *** Conductividad n.s Especie n.s Temperatura x Conductividad n.s Temperatura x Especie n.s Conductividad x Especie n.s Temperatura x Conductividad x Especie Error Nebrioporus n.s Modelo corregido *** Intersección *** Temperatura *** Conductividad n.s Especie *** Temperatura x Conductividad n.s Temperatura x Especie *** Conductividad x Especie n.s Temperatura x Conductividad x n.s Especie Error Ochthebius Modelo corregido *** Intersección *** Temperatura *** Conductividad *** Especie *** Temperatura x Conductividad *** Temperatura x Especie *** Conductividad x Especie *** Temperatura x Conductividad x *** Especie Error SS, suma de cuadrados; g.l, grados de libertad. * p 0.05, ** p 0.01, *** p 0.001, n.s no significativo 15

19 Figura 4. Mortalidad media ± ES de cada especie. Las diferencias significativas determinadas por los análisis post-hoc con la corrección de Bonferroni se indican como sigue: con letras mayúsculas junto a la leyenda para los niveles de conductividad, con letras minúsculas sobre las barras para los niveles de temperatura, con números sobre las barras para los niveles de conductividad dentro de un mismo nivel de temperatura y con asteriscos para diferencias entre especies congenéricas dentro de un mismo tratamiento. 16

20 3.4. Respuestas de comportamiento de huida para evitar la exposición al estrés Emersión Las especies de Enochrus mostraron un patrón de respuesta de emersión similar frente al estrés térmico, aunque se registraron más emersiones de E. bicolor que de E. falcarius (Tabla 4). En ambas especies, la emersión fue más frecuente cuanto mayor era la temperatura, siendo 40ºC el umbral crítico de máxima emersión y decreciendo bruscamente a 45ºC (Fig. 5a) debido a la alta mortalidad registrada en esta temperatura (Fig. 4a). En las especies de Nebrioporus el estrés térmico produjo un resultado similar en la respuesta de emersión, siendo 40ºC el umbral crítico de máxima actividad para las dos especies (Fig. 5b). En esta temperatura, N. baeticus emergió menos que N. ceresyi (post-hoc Temperatura x Epecie 40ºC: p < 0.001; Fig. 5b) debido a su mayor mortalidad (Fig. 4b). Entre O. glaber y O. notabilis no se encontraron diferencias significativas en el número medio de emersiones (Tabla 4), mostrando ambas especies un patrón de respuesta similar frente al estrés térmico. En las temperaturas más bajas se registraron pocas emersiones y los umbrales críticos de máxima respuesta fueron 40 y 45ºC (Fig. 5c,d). La emersión se vio significativamente afectada por la conductividad en O. glaber (p < 0.001), decreciendo conforme aumentaba el nivel de estrés salino. En las dos especies la combinación de altas temperaturas (40 y 45ºC) y conductividad extrema (240 ms.cm -1 ) redujo significativamente la respuesta de emersión (Tabla 4), especialmente en O. glaber, coincidiendo con la alta mortalidad de esta especie registrada en dichos tratamientos. 17

21 Tabla 4. Resultados del ANOVA. Efecto de la temperatura y conductividad en la emersión en los tres pares de especies estudiadas. Variable dependiente: Emersión Fuente SS g.l. F p Enochrus Modelo corregido *** Intersección *** Temperatura *** Conductividad n.s Especie * Temperatura x Conductividad n.s Temperatura x Especie * Conductividad x Especie n.s Temperatura x Conductividad x Especie Error Nebrioporus n.s Modelo corregido *** Intersección *** Temperatura *** Conductividad n.s Especie *** Temperatura x Conductividad n.s Temperatura x Especie *** Conductividad x Especie n.s Temperatura x Conductividad x n.s Especie Error Ochthebius Modelo corregido *** Intersección *** Temperatura *** Conductividad *** Especie n.s Temperatura x Conductividad *** Temperatura x Especie n.s Conductividad x Especie n.s Temperatura x Conductividad x ** Especie Error SS, suma de cuadrados; g.l, grados de libertad. * p 0.05, ** p 0.01, *** p 0.001, n.s no significativo 18

22 Figura 5. Emersión media ± ES de cada especie. Las diferencias significativas determinadas por los análisis post-hoc con la corrección de Bonferroni se indican como sigue: con letras mayúsculas junto a la leyenda para los niveles de conductividad, con letras minúsculas sobre las barras para los niveles de temperatura, con números sobre las barras para los niveles de conductividad dentro de un mismo nivel de temperatura y con asteriscos para diferencias entre especies congenéricas dentro de un mismo tratamiento. 19

23 Vuelo El patrón de actividad de vuelo frente al estrés térmico fue significativamente diferente entre las especies de Enochrus (Tabla 5). E. bicolor voló más que E. falcarius en todos los niveles de temperatura, siendo esta diferencia significativamente mayor en 35 y 40ºC (post-hoc Temperatura x Especie 35ºC y 40ºC: p < 0.001; Fig. 6a), donde se registró el máximo número de vuelos de ambas especies. En ambas especies de Nebrioporus se registró un número significativamente alto de vuelos en 35 y 40ºC, aunque en estas temperaturas N. baeticus voló más que N. ceresyi (post-hoc Temperatura x Especie 35ºC: p < 0.001; 40ºC: p = 0.001; Tabla 5, Fig. 6b). Las especies de Ochthebius iniciaron la respuesta de vuelo en niveles de estrés térmico más altos que los otros pares de especies, siendo el umbral crítico de máximo vuelo 40ºC y mostrando una respuesta similar en 35 y 45ºC (Fig. 6c,d). La magnitud de la respuesta de vuelo fue ligeramente superior en O. notabilis, aunque el nivel de significación de esta comparación es próximo a 0,05 (Tabla 5). El efecto de la conductividad sobre el vuelo solo fue significativo para O. notabilis (p < 0.001) aunque la respuesta no mostró un patrón claro a lo largo del gradiente de estrés salino. Para las dos especies la interacción de temperatura x conductividad tuvo un efecto significativo sobre el vuelo, aunque de forma diferente (Tabla 5). Así, en las temperaturas más extremas (40-45ºC) O. glaber voló más que O. notabilis en el nivel mas bajo de conductividad (20 ms.cm -1 ) mientras que O. notabilis voló más que O. glaber en las conductividades más altas (180 y 240 ms.cm -1 ) (Fig. 6c,d), lo cual concuerda con la menor tolerancia que presentó O. glaber en estas condiciones más extremas. 20

24 Tabla 5. Resultados del ANOVA. Efecto de la temperatura y conductividad en el vuelo en los tres pares de especies estudiadas. Variable dependiente: Vuelo Fuente SS g.l. F p Enochrus Modelo corregido ** Intersección *** Temperatura ** Conductividad n.s Especie *** Temperatura x Conductividad n.s Temperatura x Especie ** Conductividad x Especie n.s Temperatura x Conductividad x n.s Especie Error Nebrioporus Modelo corregido *** Intersección *** Temperatura *** Conductividad n.s Especie *** Temperatura x Conductividad n.s Temperatura x Especie * Conductividad x Especie n.s Temperatura x Conductividad x n.s Especie Error Ochthebius Modelo corregido *** Intersección *** Temperatura *** Conductividad *** Especie * Temperatura x Conductividad *** Temperatura x Especie n.s Conductividad x Especie *** Temperatura x Conductividad x *** Especie Error SS, suma de cuadrados; g.l, grados de libertad. * p 0.05, ** p 0.01, *** p 0.001, n.s no significativo 21

25 Figura 6. Nº de vuelos medio ± ES de cada especie. Las diferencias significativas determinadas por los análisis post-hoc con la corrección de Bonferroni se indican como sigue: con letras mayúsculas junto a la leyenda para los niveles de conductividad, con letras minúsculas sobre las barras para los niveles de temperatura, con números sobre las barras para los niveles de conductividad dentro de un mismo nivel de temperatura y con asteriscos para diferencias entre especies congenéricas dentro de un mismo tratamiento. 22

26 4. Discusión Afecta la combinación de estrés térmico y salino a la tolerancia y el comportamiento de huida de escarabajos acuáticos salinos? La salinidad y la temperatura son dos de los factores abióticos que más influyen en el crecimiento y la supervivencia de organismos acuáticos (Kir y Kumlu 2008). En los ecosistemas marinos, varios estudios han demostrado que la salinidad influye en la fisiología térmica de un amplio rango de animales, por ejemplo, corales (Coles y Jokiel 1978), crustáceos (Kir y Kumlu 2008), bivalvos (Rajagopal et al. 2005) y peces (Sardella et al. 2008a, b). Recientemente se ha demostrado el efecto de la salinidad sobre los límites térmicos en algunas de las especies estudiadas en el presente trabajo (Sánchez Fernández et al. 2010, Arribas et al. en prensa). Estos estudios han encontrado un efecto sinérgico de la exposición crónica a altas salinidades y temperaturas sobre los límites térmicos letales en N. baeticus, N. ceresyi y E. falcarius, siendo dichos límites mayores en individuos aclimatados a salinidades y temperaturas relativamente altas. Sin embargo, en contra de lo esperado, en nuestros experimentos de exposición aguda al estrés, ni la salinidad ni la interacción entre salinidad y temperatura tuvieron, en general, un efecto significativo sobre la supervivencia ni las respuestas de comportamiento de las especies estudiadas, excepto en las especies de Ochthebius, especialmente O.glaber. Nuestros resultados indican que la influencia de la salinidad sobre la tolerancia térmica de las especies depende en gran medida del tiempo de exposición, siendo menos importante en exposiciones cortas en las que los organismos son sometidos a cambios bruscos en las condiciones térmicas y salinas que en exposiciones largas y graduales a condiciones de estrés, donde la temperatura va progresivamente incrementándose hasta alcanzar niveles extremos (experimentos de ramping ). En exposiciones agudas, el shock térmico parece causar un efecto más severo e inmediato sobre la fisiología y la capacidad de desarrollar respuestas de huida de los organismos en comparación con el estrés salino. 23

27 A diferencia del resto de especies, en O. glaber la combinación de altas conductividades ( 180 ms.cm -1 ) con temperaturas extremas (40-45ºC) produjo un daño fisiológico que impidió cualquier movimiento y por tanto desarrollar respuestas de huida para evitar las condiciones de estrés, reduciendo su supervivencia. En este caso, las interacciones entre ambos factores parecen ser más importantes cerca de los límites de tolerancia, como han señalado otros autores (Coles y Jokiel 1978). En individuos expuestos a temperaturas extremas los mecanismos osmoreguladores resultan dañados ya que aumenta la tasa de pérdida de agua y la acumulación de solutos en los organismos (Rezende et al. 2011). Es probable que en medios hipersalinos el aumento de la temperatura acentúe los efectos del estrés sobre los individuos, no obstante es necesario un conocimiento más profundo de las consecuencias que la exposición a temperaturas próximas a los límites letales tiene sobre la capacidad osmoreguladora de las especies. Dependen las respuestas de comportamiento de huida de la tolerancia fisiológica de las especies? Los efectos de la variación de los factores abióticos del medio sobre un organismo no solo dependen de su tolerancia fisiológica a dichos factores, sino también de su capacidad de regular los niveles de estrés que experimenta a través de ajustes del comportamiento (p.ej mediante la búsqueda de microhábitats). De este modo, ambos rasgos deben ser interpretados conjuntamente determinando qué niveles de estrés ambiental son críticos para la supervivencia de una especie bien por causar un daño fisiológico irreversible o bien por inducir respuestas de comportamiento para evitar la exposición a dicho estrés. De acuerdo con nuestra predicción inicial, las respuestas de comportamiento analizadas estuvieron condicionadas por la tolerancia al estrés de las especies. Esta relación fue clara en las especies de Enochrus y Nebrioporus, cuya mortalidad y respuestas de comportamiento mostraron una correlación negativa. En general, la emersión y el vuelo aumentaron conforme lo hacía el nivel de estrés térmico en temperaturas entre 20 y 40ºC, en las que no se produjo un daño fisiológico importante y por tanto la mortalidad fue baja, siendo 35ºC el umbral de máximo vuelo y 40ºC el 24

28 umbral de máxima emersión. En cambio, en los tratamientos de 45ºC las respuestas de comportamiento se vieron bloqueadas ya que el estrés térmico causó un daño severo e irreversible sobre la fisiología de los individuos y en última instancia la muerte de prácticamente todos los individuos expuestos. En las especies de Ochthebius se observó un patrón diferente, siendo la relación entre tolerancia y las respuestas de escape (emersión y vuelo) positiva. El nivel de estrés en el rango de temperatura y salinidad testado no causó un daño fisiológico sobre O. glaber y O. notabilis tan importante como en el caso anterior. La temperatura más extrema (45ºC) redujo la supervivencia de ambas especies, sin embargo no fue letal para todos los individuos. Por tanto, los individuos que sobrevivieron en el nivel de estrés térmico más extremo fueron capaces de escapar de las condiciones adversas mediante emersión y vuelo. Los umbrales térmicos críticos fueron 40ºC para el vuelo y 40-45ºC para la emersión. En este sentido, la mayor tolerancia de las dos especies de Ochthebius en comparación con los otros pares de especies está en concordancia con los hábitats más extremos que estas especies ocupan (Velasco et al. 2006, Abellán et al. 2009; Millán et al. 2011). Son las especies lóticas más sensibles al estrés que las especies leníticas? De acuerdo con nuestras predicciones iniciales, en dos de los tres pares de especies estudiadas (géneros Nebrioporus y Ochchtebius), las especies lóticas fueron más sensibles al estrés térmico que las especies leníticas y por lo tanto en niveles críticos de estrés sus respuestas de emersión y vuelo para escapar de las condiciones desfavorables fueron de mayor magnitud. Entre los Nebrioporus, la especie lótica N. baeticus fue menos tolerante al estrés térmico que su especie hermana N. ceresyi. Este resultado concuerda con los obtenidos por Sánchez-Fernández et al. (2010) en experimentos de aumento progresivo de temperatura ( ramping ) para determinar los límites térmicos de este par de especies, en los que N. ceresyi presentó un mayor rango térmico que N. baeticus, aunque en este caso debido a su amplia tolerancia a temperaturas bajas. En cuanto a las respuestas de comportamiento, en ambas especies se registraron los máximos valores de vuelo y emersión en los mismos niveles de temperatura (35ºC 25

29 para el vuelo y 40ºC para la emersión), aunque N. baeticus, la especie menos tolerante, mostró una mayor actividad de vuelo que N. ceresyi en estos umbrales críticos de estrés térmico. Entre las dos especies de Ochthebius se encontraron diferencias paralelas en la tolerancia al estrés. O. glaber, la especie que ocupa cuerpos de agua lóticos, fue menos resistente al estrés que su especie congenérica O. notabilis, que ocupa medios leníticos con mayor variabilidad térmica y salina (Abellán et al. 2007, 2009). En los niveles de estrés térmico más extremos (40-45ºC) y menor conductividad (20-50 ms.cm -1 ), O. glaber emergió y voló más que O. notabilis, mientras que en las conductividades más extremas ( ms.cm -1 ) O. notabilis mostró una mayor actividad de emersión y vuelo, de acuerdo con su mayor tolerancia al estrés. Contrariamente a los resultados observados en las especies de Nebrioporus y Ochthebius, E. bicolor y E. falcarius presentaron similares tolerancias al estrés térmico y similar respuesta de emersión, aunque sí mostraron diferencias significativas en la magnitud de la respuesta de vuelo. La especie lótica E. bicolor desarrolló una mayor actividad de vuelo que E. falcarius en temperaturas subletales (35-40ºC), lo cual puede estar relacionado con su mayor capacidad de dispersión. Análisis de la morfometría de las alas de este par de especies han revelado que E. bicolor tiene mayor capacidad de vuelo que su especie congenérica E. falcarius, por lo que se ha señalado la capacidad de dispersión en vez de la tolerancia térmica como el principal factor determinante de la contrastada distribución geográfica que muestran estas especies (Arribas et al. en prensa). Por lo tanto, al someter a individuos de estas dos especies a condiciones de estrés, dada su similar tolerancia fisiológica, la especie con mayor capacidad de dispersión ha mostrado una mayor tendencia a escapar del medio para buscar ambientes con condiciones más favorables. La diferente estabilidad espacial y temporal de los medios lóticos y leníticos ha podido dar lugar a la evolución de diferentes estrategias entre las especies. Así, las especies que ocupan los medios leníticos, más inestables, se han visto forzadas a desarrollar una mayor capacidad de colonización (tolerancia fisiológica y/o capacidad de dispersión) que sus respectivas especies lóticas (Ribera 2008). Nuestros resultados 26

30 sugieren una relación positiva entre tolerancia al estrés, ocupación de hábitat y rango geográfico en el par de especies estudiadas de Nebrioporus y Ochthebius, siendo las especies lóticas con una distribución más restringida más sensibles a los extremos de temperatura que sus correspondientes especies congenéricas leníticas de distribución más amplia. Esta correlación entre tolerancia térmica y tamaño del rango de distribución se ha encontrado en otras especies de escarabajos acuáticos (e.g. Calosi et al. 2008, Calosi et al. 2010) y otros invertebrados (Ribera y Vogler 2000, Hof et al. 2006, Damm et al. 2010). Por otro lado, en el caso de E. bicolor y E. falcarius, como se ha dicho anteriormente, la capacidad de dispersión y no la tolerancia térmica parece determinar sus diferentes patrones biogeográficos (Arribas et al. en prensa). Qué especies dentro de cada género estudiado podría ser más susceptible a cambios en las condiciones de su hábitat en base a su fisiología y comportamiento frente al estrés ambiental? La integración de medidas de tolerancia fisiológica y respuestas de comportamiento de especies relacionadas de escarabajos acuáticos no solo permite describir su ecofisiología, sino que además proporciona una valiosa información sobre las diferentes estrategias que las especies pueden adoptar en respuesta a cambios ambientales tanto presentes como futuros. Por un lado, la mortalidad ofrece una medida general de la tolerancia o resistencia de las especies a los factores estresantes analizados; por otro, las respuestas de comportamiento (emersión y vuelo) dan una idea de la habilidad de las especies para escapar de condiciones desfavorables o variables. Las predicciones de cambio climático prevén un incremento de las temperaturas y una reducción de las precipitaciones en el área mediterránea (IPCC 2007), resultando en unas condiciones más extremas (mayor temperatura y salinidad) para los organismos que viven en los medios salinos continentales. A pesar de la amplia tolerancia de las especies salinas a los cambios ambientales (Millán et al. 2011), en base a la fisiología y las respuestas estudiadas en el presente trabajo, las especies lóticas N. baeticus y O. glaber pueden ser más susceptibles que sus correspondientes especies leníticas N. ceresyi y O. notabilis frente a cambios bruscos de temperatura. Especialmente en el 27

31 caso de O. glaber, la combinación de temperaturas y salinidades elevadas puede comprometer su capacidad para adaptarse a cambios en las condiciones del medio mediante dispersión y búsqueda de hábitats más favorables. Además, la filogeografía de esta especie (Abellán et al. 2007, 2009), altamente amenazada en la Península Ibérica (Sánchez-Fernández et al. 2008), ha revelado altos niveles de divergencia genética entre poblaciones aisladas, con un bajo flujo génico y distancias de dispersión muy cortas. Esto unido a la alta fragmentación de sus hábitats (los arroyos hipersalinos) y la mayor sensibilidad que muestra la especie al estrés aumenta la vulnerabilidad de O. glaber frente al cambio climático. Los resultados obtenidos con las dos especies de Enochrus estudiadas sugieren que ambas podrían mostrar una similar sensibilidad frente a un incremento de temperatura de sus hábitats. Sin embargo, para E. falcarius, la especie del género más amenazada en la Península Ibérica (Arribas et al. datos no publicados), su menor capacidad de dispersión (Arribas et al. en prensa) puede suponer una desventaja que podría dificultar la adaptación de la especie al cambio climático. De acuerdo con los resultados obtenidos en este trabajo (Tabla 6), la fauna acuática especializada de los medios salinos lóticos representa un componente vulnerable frente al cambio global dentro de la biodiversidad de los ambientes áridos, por lo que es recomendable centrar esfuerzos de conservación en estos hábitats tan singulares y por otro lado amenazados e infravalorados. Sin embargo, futuros estudios de los rasgos analizados en este trabajo y otros como la capacidad de dispersión, tasa reproductiva o tolerancia a la composición iónica del agua serían muy útiles para predecir con mayor rigor la vulnerabilidad de estas especies frente a cambios ambientales presentes y futuros y para comprender mejor los divergentes patrones biogeográficos que muestran. 28