PRÁCTICAS DE FARMACOLOGÍA

Transcripción

1 Apellidos: Nombre: Curso / Facultad: PRÁCTICAS DE FARMACOLOGÍA Grado en Farmacia / Medicina Universidad de Alcalá Curso Académico

2 ORGAN BATH SIMULATIONS SIMULACIÓN DE EXPERIMENTOS EN BAÑOS DE ÓRGANOS 1. Starting an Experiment To start a new experiment: a) Select the type of tissue to be placed within the organ bath from the Tissue Type list. b) Click the New Experiment button. c) Click the Record button to start the chart recorder running. d) Nerve stimulation / Select and apply drugs from the list of available Agonists and Antagonists. 2

3 Note. Four types of tissue are available: The guinea pig ileum is a section cut from the ileum region of a guinea pig s gastrointestinal tract. The smooth muscle within the ileum contracts in response to the application of a variety of agonists. It also has nerves within it which can be electrically stimulated to produce contraction. The chick biventer cervicis is a skeletal muscle from the neck of a young chicken. It is dissected out with the nerve which innervates it intact. It can be made to contract by the application of agonists or by electrical stimulation of its nerve. The rabbit arterial ring is a section cut from a rabbit artery and attached to a force transducer. It can be made to contract by the application of either KCl or the agonist noradrenaline. The artery can be made to relax again by applying a number of antagonists. The rabbit jejunum (Finkleman's preparation) is a section cut from the jejunum region of a rabbit s gastrointestinal tract. It contracts spontaneously and these contractions can be inhibited by the application of adrenergic agonists or by stimulation of the sympathetic nerve supply. 2. Adding Agonists To add an agonist drug to the organ bath: a) Select the type of agonist to be applied from the list of available agonists. b) Select the concentration of the drug solution to be applied from the Stock Soln. list. c) Enter the volume (between 0 and 1 ml) of the stock solution to be applied into the Volume box. d) Click the Add to Organ Bath button to inject the selected volume of the select stock solution agonist into the organ. e) When the tissue response on the chart recording reaches a steady state (or after 30 seconds if no response has occurred) click the Flush Reservoir to Bath button to wash out the agonist from the organ bath. Note. Agonists are drugs which, when applied to tissue, cause a response (contraction in the case of the tissues typically studied in organ baths) by binding to specific receptors on the surface of the cells within the tissue. 3

4 3. Adding Antagonists To add an antagonist drug to the organ bath or Krebs solution reservoir: a) Select the type of antagonist to be applied from the list of available antagonists. b) Select the concentration of the drug solution to be applied from the Stock Soln. list. c) Enter the volume (between 0 and 1 ml) of the stock solution to be applied into the Volume box. d) Select Organ Bath from the Add To list if the antagonist is to be applied directly to the organ bath. Select Reservoir if the drug is to be added to the Krebs solution reservoir. e) Click the Add to button to inject the volume of the selected stock solution agonist into the organ bath or reservoir. Note. Antagonists are drugs which block the actions of agonists on tissue, reducing or preventing the tissue response to the agonist. Application of an antagonist will thus have no apparent effect on the tissue in the organ bath unless an agonist is present (or the tissue is being stimulated). Antagonists are typically studied by observing the effects an antagonist has on different concentrations of a chosen agonist. To avoid the necessity of repeatedly applying the antagonist to the organ bath before each agonist, it is usually added to the Kreb s solution reservoir of Krebs solution used to flush the organ bath between agonist applications. 4. Calculating Final Bath Concentration (Organ Bath) The final bath concentration (FBC), in M (Moles/litre), is related to the stock solution concentration [stock] (in M) the volume of stock added to the bath (in ml) and the tissue bath volume (ml) by the formula: [ stock ] volume added FBC bath volume The organ volume is 10 ml. Thus, adding 0.1 ml of a 10-4 M stock solution gives a final bath concentration of 10-6 M. The bath dilution formula can be rearranged to work out the volume you need to add to achieve a required FBC: Volume added [ FBC] bath volume stock 4

5 You should aim to add volumes between of ml to the tissue bath (less than 0.1 ml is difficult to measure accurately and more than 0.5 ml starts to increase the solution volume in the bath significantly). 5. Calculating Final Bath Concentration (Reservoir) When applying drugs to the Krebs solution reservoir, the resulting concentration within the reservoir [RC], in M (Moles/litre)., is related to the stock solution concentration [stock] (in M) the volume of stock added to the reservoir (in ml) and the reservoir volume (ml) by the formula: [ stock ] volume added RC reservoir volume The reservoir volume is 1000 ml. Thus, adding 0.1 ml of a 10-3 M stock solution gives a final bath concentration of 10-7 M. The dilution formula can be rearranged to work out the volume you need to add to achieve a required reservoir concentration: [ RC] reservoir Volume added [ stock ] volume You should aim to add volumes greater than 0.1 ml to the reservoir (less than 0.1 ml is difficult to measure accurately). 6. Measuring Tissue Responses To measure the peak amplitude of tissue contractions: a) Click the Stop button to stop recording. b) Using the scroll bar at the bottom of the chart recorder display, select a section of the recording containing the tissue contraction to be measured. c) Drag the measurement cursor on the chart display to the point on the recording trace to be measured (the peak of nerve stimulated responses, or the plateau of agonist responses). The contractile force at the cursor point (in units of grams) is displayed below the cursor. 7. Menu Options 5

6 Printing a chart recording To print a copy of the displayed chart recording on a printer, select Print from the File menu. Copying the chart recording to other programs To copy the data points of the displayed chart recording to the Windows clipboard for pasting into a spreadsheet or graph plotting program, select Copy Data from the Edit menu. To copy the a picture of the displayed chart recording to the Windows clipboard for pasting into a Word document or a PowerPoint presentation, select Copy Image from the Edit menu. Saving a chart recording to file To save the current chart recording for the current experiment to a data file, select Save Experiment from the File menu and enter the name of a new data file. Loading an existing chart recording from file To load a previously saved chart recording from a data file, select Load Experiment from the File menu and enter the name of the data file. 6

7 2.1. Simulación de íleon de cobaya aislado El término simulación se refiere la imitación de una cosa o un proceso real. Las técnicas de simulación se emplean en multitud de campos de la tecnología, ingeniería, formación, aprendizaje y educación. En nuestro caso, en esta sesión de prácticas vamos a emplear el programa de simulación de baño de órganos Virtual Organ Bath de la Universidad de Strathclyde, que está disponible de forma gratuita en la dirección PASOS 1. Vaya al menú de inicio y abra el programa OBSim > OBSim. 2. Una vez abierto el programa de simulación, examine los siguientes apartados: a. Tipo de tejido (Tissue type). Presione ON > New experiment. b. Verá que en los menús que aparecen dos menús de agonistas y antagonistas, en los cuales aparecen diferentes fármacos a distintas concentraciones (nota: no puede añadir más de 1 ml de disolución de fármaco, el volumen para el baño de órganos viene determinado en 10 ml y el volumen de reserva son 1000 ml). c. En el eje de las abscisas (X) se representa el tiempo en minutos. d. En el eje de las ordenadas (Y) se representa la fuerza de contracción en gramos. 7

8 3. Seleccione íleon de cobaya como tipo de tejido e histamina como agonista. Después presione Experimental setup para ver la representación del montaje experimental. 4. Vuelva a Chart y presione ahora Record para comenzar el experimento. Compruebe que la línea base está estabilizada. 8

9 5. Seleccione el volumen y la concentración stock de histamina que desea añadir al baño de órganos con el fin de obtener una concentración final en el baño de órganos de 10-9 M (e.g. 1 ml 10-8 M / 10 ml). Presione entonces Add to Organ Bath; deje la histamina durante unos 10 s, y presione a continuación Flush Reservoir to Bath, con el fin de lavar el órgano y eliminar la histamina. Compruebe que se recupera la línea base. 6. Añada dosis crecientes de histamina usando el procedimiento anterior (e.g. 0,2 ml 10-7 M, 0,5 ml 10-7 M, 0,1 ml 10-6 M, etc), dejando 10 s entre cada una de las administraciones ( dosis ) y lavando entre ellas. Continúe hasta que se alcance la respuesta máxima (100% efecto). 7. Para cada concentración de histamina en el baño (que aparece mostrada en la parte inferior del gráfico), mida la fuerza de contracción 9

10 (gms) desplazando la línea verde vertical con el botón izquierdo del ratón hasta los puntos deseados. Anote el valor en cada caso. 8. Rellene la siguiente tabla y construya finalmente la curva dosisrespuesta representando la fuerza de la contracción, expresada como % del efecto máximo, frente al log[histamina] en el baño. concentración (M) Respuesta (g) % E máx (H sola) Respuesta (g) % E máx (H + antag.) 10

11 9. En un nuevo experimento, utilice ahora la CE 50 de histamina obtenida de la gráfica anterior y, sin lavar, añada al baño mepiramina (Mepyramine) para obtener una concentración de 1 nm de este antagonista. Observe el efecto y razone el resultado. 10. Pruebe a añadir concentraciones mayores y menores de agonista y antagonista en este mismo orden. Razone los resultados cualitativos obtenidos. 11. En un nuevo experimento, examine el efecto de invertir el orden de adición de agonista y antagonista. Observe los efectos y razone los resultados cualitativos obtenidos. 12. En una nueva serie de experimentos, añada al reservorio una cantidad de mepiramina tal que dé lugar a una concentración de 10-9 M, presione Flush Reservoir to Bath y repita los puntos Anote los datos en la misma Tabla del punto 8 y represente en la misma gráfica la nueva curva dosis-efecto para la histamina. Compare los resultados y determine la CE 50 en presencia del antagonista. 14. Repita la serie anterior utilizando Acetylcholine, Carbachol o Pilocarpine como agonista y Atropine como antagonista. Razone los resultados. 11

12 Apellidos / Nombre: Curso / Facultad: Grupo Prácticas: PROBLEMA 1: receptores opioides intestinales A. (i) Seleccione Guinea pig ileum como tejido sometido a estudio. Haga clic en Record para comenzar el registro y presione ON en Stimulation Nerve. La estimulación eléctrica manda trenes de ondas cuadradas al plexo mientérico y se produce la contracción de la musculatura lisa intestinal por la acetilcolina liberada por la neurona posganglionar de forma altamente reproducible. Seleccione ahora Morphine de la lista de Agonists, fije la concentración de la solución madre (Stock soln.) en 10-6 M y, al cabo de unas 5 contracciones, añada al baño de órganos 0,1 ml de la solución de Morfina. Lave el órgano (Flush Reservoir to Bath) y, una vez recuperada la contracción máxima, añada 0,2 ml de la misma solución. Anote, en cada caso, el cambio en la fuerza de la contracción correspondiente a cada concentración de morfina en el baño (es decir, la diferencia entre los valores en ausencia y en presencia de morfina). Vuelva a lavar y repita las administraciones, incrementando progresivamente la concentración y/o el volumen hasta que obtenga el efecto máximo posible (100% efecto). Compare con los registros mostrados en la figura de la página 14. (ii) Lave el órgano (Flush Reservoir to Bath) y observe la recuperación de los valores basales. (iii) Repita el experimento con la concentración de Morfina que da lugar al 50% del efecto máximo (CE 50) y observe el efecto de añadir al baño de órganos 0,15 ml de una concentración de Naloxona (en la lista de Antagonists), por ej M, sin lavar previamente. Pruebe también con otras concentraciones para comprobar la dependencia de los efectos observados con la dosis. Invierta el orden de adición de estos dos fármacos y razone el resultado obtenido. B. (i) En un nuevo experimento, añada al reservorio 1 ml de una solución que contenga 10-2 M de Naloxona. Presione Flush Reservoir to Bath para que la preparación esté en todo momento en presencia de este anatagonista y repita el experimento anterior, en el que se aumentan progresivamente las concentraciones de Morfina, empezando por una concentración en el baño de 10-7 M. (ii) Compare las gráficas obtenidas para Morfina, en presencia y ausencia de Naloxona, representando en ordenadas el efecto (como % del efecto máximo posible) y en abscisas el logaritmo de la concentración molar de Morfina en el baño (comenzando por 10-8 M). Utilice el siguiente papel semilogarítmico y/o una hoja de Excel en su ordenador. (iii) Qué ocurriría si repite la secuencia de adiciones de Morfina realizada en el experimento anterior pero en presencia de una concentración de Naloxona en el baño de M? Para ello debe calcular primero la dosis que necesita añadir al reservorio mediante un volumen medido con la jeringa. (iv) Cómo procedería para calcular el pa 2 (grado de antagonismo) de la Naloxona? 12

13 Recordatorio de las clases teóricas: 13

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15 Papel semilogarítmico 15