UNIVERSIDAD DR. JOSÉ MATÍAS DELGADO RED BIBLIOTECARIA MATÍAS DERECHOS DE PUBLICACIÓN

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1 UNIVERSIDAD DR. JOSÉ MATÍAS DELGADO RED BIBLIOTECARIA MATÍAS DERECHOS DE PUBLICACIÓN DEL REGLAMENTO DE GRADUACIÓN DE LA UNIVERSIDAD DR. JOSÉ MATÍAS DELGADO Capítulo VI, Art. 46 Los documentos finales de investigación serán propiedad de la Universidad para fines de divulgación PUBLICADO BAJO LA LICENCIA CREATIVE COMMONS Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported. No se permite un uso comercial de la obra original ni la generación de obras derivadas. Para cualquier otro uso se debe solicitar el permiso a la Universidad [Escribir texto]

2 UNIVERSIDAD DR. JOSE MATIAS DELGADO FACULTAD DE AGRICULTURA E INVESTIGACION AGRICOLA JULIA HILL O ULLIVAN SEMIANARIO DE INVESTIGACION: Evaluación del proceso de fermentación tradicional y no tradicional de la semilla de cacao Theobrama cacao del Ecotipo Acriollado, por la determinación de factores físicos - químico y microbiológicos, utilizando cuatro medios de cultivos y levadura Saccharomyces cerevisiae como iniciador de fermentación en el método no tradicional. PRESENTADO POR: BR. JUAN JOSE ALAS CASTRO BR. RICARDO ANTONIO RIOS CANALES PARA OPTAR AL GRADO DE: INGENIERO EN ALIMENTOS INGENIERO AGROINDUSTRIAL ANTIGUO CUSCATLAN, AGOSTO DEL 2012

3 INDICE INTRODUCCIÓN CAPITULO OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION GENERALIDADES HISTORIA CLASIFICACIÓN BOTÁNICA CACAO ACRIOLLADO CLAVES DE IDENTIFICACION DE CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS 6 DE LA PLANTA CACAO ACRIOLLO CLAVES DE IDENTIFICACION DE CARACTERISTICAS DE LAS 7 SEMILLAS CACAO CRIOLLO CAPITULO 2. REVISION DE LITERATURA PRIMERA FASE SEGUNDA FASE TERCERA FASE MICROORGANISMOS DE LA FERMENTACIÓN DEL CACAO LACTOBACILLUS FERMENTUM GLUCONOBACTER OXYDANS CONSECUENCIAS DE LA FERMENTACIÓN MEDIOS DE CULTIVOS AGAR DEXTROSA SABOURAUD AGAR ESTANDAR CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS DE AGAR ESTANDAR AGAR MRS MEDIO DE ÁCIDO ACETICO-ETANOL RUTHERFORD (RAE) ANÁLISIS BROMATOLÓGICO ACTIVIDADES ENZIMATICAS GENERALIDADES DE LA FERMENTACION DEL CACAO 16 CAPITULO 3. METOLOGIA DE LA INVESTIGACION CORTE Y SELECCIÓN DEL FRUTO PESO DE LA MAZORCA EXTRACCIÓN DE MUESTRAS DE SEMILLAS PESO Y DIMENCIONES DE LAS SEMILLAS PREPARACIÓN DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS FISICO-QUIMICOS DE LA 22 SEMILLAS FERMENTADAS PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DEL PH PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION DE SOLIDOS SOLUBLES, 23 ÁCIDO ACETICO Y NIVEL DE ALCOHOL

4 3.7 PROCEDIMIENTO MICROBIOLOGICO DE LA FERMENTACION MATERIALES Y EQUIPO MEDIO DE CULTIVO STANDARD MEDIO DE CULTIVO MRS MEDIO DE CULTIVO RAE MEDIO DEXTROSA SABORAUD INOCULACION DE MICROORGANISMOS MATERIALES Y EQUIPO ANÁLISIS CUANTITATIVO SECADO DE GRANO DE CACAO PESO SECO Y DIMENSION DE LA SEMILLA SECA METODOS DE DETERMINACION BROMATOLOGICA 29 CAPITULO 4: ANALISIS DE RESULTADOS CUANTIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS EL COMPORTAMIENTO DE MICROORGANISMOS CON RESPECTO AL 32 TIEMPO DE INCUBACION. 4.3 CAMBIOS DE COLORACION DE LA SEMILLA DURANTE EL PROCESO DE 37 FERMENTACION 4.4 COMPROBACIÓN DEL ALCOHOL, ÁCIDO ACETICO, PH, SOLIDOS 40 TOTALES Y TEMPERATURA DURANTE EL PROCESO DE FERMENTACION 4.5 EL COMPORTAMIENTO DEL ALCOHOL, ÁCIDO ACETICO, PH, SOLIDOS 41 TOTALES Y TEMPERATURA DURANTE EL PROCESO DE FERMENTACION. 4.6 ESQUEMATIZACIÓN DE DIMENSIONES, PESO Y RENDIMIENTO DE LAS 46 SEMILLAS DE CACAO 4.7 OBSERVACIÓN DE LOS A ANÁLISIS BROMATOLÓGICOS EN MT-01 Y EL 48 MNR-02. CONCLUSIONES 49 RECOMENDACIONES 50 ANEXOS 51 GLOSARIO 64 FUENTES CONSULTADAS 66

5 ÍNDICE DE FIGURAS Fig. 1 Árbol de Cacao 5 Fig. 2 Mazorca de Cacao Criollo 5 Fig. 3 Semilla de Cacao 6 Fig. 4 Hoja del Árbol de Cacao 6 Fig. 5 Flor del Árbol de Cacao 7 Fig. 6 Esporas Ovales de Hanseniaspora guillermondiid 8 Fig. 7 Esporas de Saccharomyces cerevisiae 9 Fig. 8 Imagen al microscopio de Lactobacillus Fermentum 10 Fig. 9 Vista al microscopio de Gluconobacter oxydans 10 Fig. 10 Selección de Mazorcas de Cacao, Hacienda la Carrera 20 Fig. 11 Pesado de Mazorca de Cacao 20 Fig. 12 Extracción de Semillas 21 Fig. 13 Medición de las Dimensiones de la Semilla del Cacao Fresco 21 Fig. 14 Preparación del Proceso de Fermentación no Tradicional 21 Fig. 15 Medición Electrométrica del ph mediante Tiras de Tornasol 22 Fig. 16 Medición de Ácido Acético 23 Fig. 17 Medición de Alcohol 23 Fig. 18 Medición de Solidos Solubles Totales 23 Fig. 19 Dilución en Agua Peptonada 26 Fig. 20 Inoculación y Siembra en Medio Cultivo 26 Fig. 21 Homogenización de las Muestras 27 Fig. 22 Tinción de Gram 27 Fig. 23 Secado de Grano 28 Fig. 24 Medición con Pie de Rey 28 Fig. 25 levaduras, Hanseniaspora guilliermondii y S. cereviseae. 33 Fig. 26 bacterias, Oxydans Gluconobacter y Lactobacillus Fermentum. 34 Fig. 27 bacterias, Oxydans Gluconobacter 35 Fig. 28 bacterias Lactobacillus Fermentum. 36 Fig. 29 levaduras, Hanseniaspora guilliermondii y S. cereviseae. 37 Fig. 30 grano de cacao del MT Fig.31 grano de cacao del MNT Fig. 32 grano de cacao del MT Fig.33 grano de cacao del MNT Fig. 34 grano de cacao del MT Fig.35 grano de cacao del MNT Fig. 36 grano de cacao del MT Fig.37 grano de cacao del MNT-02 39

6 ÍNDICE DE TABLAS Y GRÁFICOS TABLA N 1: CLASIFICACIÓN CIENTÍFICA 4 TABLA N 2: BROMATOLOGÍA DEL CACAO 14 TABLA N 3: PROMEDIO DE CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS DE ACUERDO AL 31 MEDIO DE CULTIVO TABLA N 4: TABLA DE INTERACCION DE ALCOHOL, ÁCIDO ACETICO, SOLIDOS TOTALES 40 Y TEMPERATURA TABLA N 5: DIMENSIONES DE LAS SEMILLAS 46 TABLA N 6: RENDIMIENTO DE LOS GRAOS DE CACAO CON RESPECTO AL PESO DE LAS 47 SEMILLAS FRESCAS Y SECAS GRAFICO 1: INDICE DE CRECIMIENTO DE LEVADURAS EN MEDIO ESTANDAR 32 GRAFICO 2: INDICE DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS EN MEDIO ESTANDAR 33 GRAFICO 3: INDICE DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS ACETICAS EN MEDIO R.A.E. 34 GRAFICO 4: INDICE DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS LACTICAS EN MEDIO M.R.S. 35 GRAFICO 4: INDICE DE CRECIMIENTO DE LEVADURAS EN MEDIO DEXTROSA 36 GRAFICO 6: COMPARACIÓN DEL CAMBIO DE COLORACIÓN EN LA SEMILLAS DE LOS 39 MÉTODOS MT-01 Y MNT-02. GRAFICO 7: COMPORTAMIENTO DE LA TEMPERATURA EN LA FERMENTACION DEL 41 CACAO GRAFICO 8: COMPORTAMIENTO DE SOLIDOS TOTALES EN LA FERMENTACION DEL 42 CACAO GRAFICO 9: COMPORTAMIENTO DEL ALCOHOL EN LA FERMENTACION DEL CACAO 43 GRAFICO 10: GRAFICO DE COMPORTAMIENTO DEL ÁCIDO ACETICO EN LA 44 FERMENTACION DEL CACAO GRAFICO 11: GRAFICO DE COMPORTAMIENTO DEL ph EN LA FERMENTACION DEL 45 CACAO GRAFICO 12: GRAFICO COMPARATIVO DEL RENDIMIENTO, EL CAMBIO DE VOLUMEN 47 Y LA PÉRDIDA DE PESO EN MT-01 Y MNT-02. GRAFICO 13: GRAFICO COMPARATIVO DE LOS ANÁLISIS BROMATOLÓGICOS. 48

7 RESUMEN Este estudio consiste en determinar el efecto de la adición de levaduras y sacarosa para aumentar la calidad de las características organolépticas de la especie de Theobroma cacao de tipo acriollado, manteniendo constante el proceso fermentativo, esto con el objetivo de que las semillas se mantengan en un medio alcohólico junto a un desarrollo estable de las levaduras manteniendo los sólidos solubles totales a 22 Brix, colocándolos en cajas de plástico, adoptando el nombre de Método No Tradicional (MNT-02), ya que a comparación del método que utilizan en Hacienda Real La Carrera en Usulután; el método tradicional (MT-01), ellos únicamente extraen los granos de la mazorca de cacao, los colocan en cajas de madera y dejan que el proceso de fermentación se efectué de forma natural, únicamente se realiza la práctica de volteo en el cual se mezcla la masa en fermentación, fue de esta forma como se realizó el experimento comparativo colocándolo en cajas de madera. Los resultados indicaron que durante el proceso fermentativo la temperatura aumentó, alcanzando su máximo valor a las 48 horas. Durante la investigación se determinaron diversos tipos de análisis fisicoquímicos para determinar el comportamiento de los microrganismos en la fermentación y así, ver cuáles fueron los factores que influyeron en el cambio físico, químico, y organoléptico del grano de cacao. Los resultados obtenidos demostraron en el MT-01 una disminución constante de los sólidos solubles totales debido al consumo de este por las bacterias nativos de la mazorca de cacao, mientras que el alcohol presenta un aumento durante las primeras 24 horas del proceso, viéndose influida una disminución en las siguientes 12 horas, y eso es debido a la elaboración de ácido acético que mostro un incremento a las 48 horas del proceso. A comparación con MNT-02 los sólidos solubles se mantienen constante debido a la adición de sacarosa al proceso, además el alcohol presenta un incremento considerable y el ácido acético presenta un aumento a las 24 horas, presentando una disminución en la última etapa, esto demuestra la efectividad de la adición de sacarosa y de la continuidad del proceso fermentativo. Adicionalmente esta investigación determina el tipo de microrganismos que crecen en el proceso de fermentación en ambos métodos, obteniendo resultados positivos en diversas fases; al determinar el crecimiento de levaduras en la primera fase, tales como Sacchacromyces Cereviseae, Anseniaspora guilliermonddii, mientras que en la segunda fase se encontraron bacterias lácticas como lo es el microorganismo Lactobacillus fermentum y en la tercera fase se encontraron bacterias acéticas tal como la Gluconobacter oxydans. Finalmente, se realizaron análisis bromatológicos para determinar la cantidad de Cenizas, Fibra, Grasa, Humedad y Proteína presentes en ambos experimentos. Los valores son comparativamente similares, presentando pequeñas diferencias. En el grafico anterior se realiza una comparación de los análisis bromatológicos como fibra, humedad, proteína y ii

8 grasa en el MT-01 y el MNT-02. En fibra en el MT-01 tuvo 24.36% y en el MNT %, en la humedad el MT-01 obtuvo 5.85% y en el MNT %, en los análisis de proteína en el MT-01 se observa un 11.17% y el MNT-02 es de 12.07% y en la determinación de la grasa se obtuvo en el MT-01 un 20.63% y en el MNT-02 fue de 21.09%. Haciendo una comparación de los análisis bromatológicos que el MNT-02 fue obtuvo mejores resultados, que el MT-01. Siendo así se puede decir que el MNT-02 brinda mejores resultados dando mejor calidad. iii

9 INTRODUCCIÓN En los procesos de fermentación del cacao existen etapas muy importantes en la transformación del grano, ya que en éstas etapas es donde se producen los cambios bioquímicos que dan origen a los precursores sensoriales más importantes como son el aroma y el sabor. Existen diversos factores que influyen sobre el proceso fermentativo, dentro de los que destaca la zona de cultivo (edafoclimático), el tipo de cacao y el manejo post-cosecha, así como la técnica empleada en la fermentación. Así mismo, el tipo de fermentador, el volumen de la masa y el volteo durante el proceso afectan la fermentación y en consecuencia la calidad del grano fermentado. Para el desarrollo de ésta investigación primeramente se realizó una evaluación agromorfológica del cacao en la Hacienda San José Real De La Carrera ubicada en la región costera en el departamento de Usulután, cantón San José, municipio de Jiquilisco, en el Km 109, sobre la carretera del Litoral. Se inició desde la selección de arboles más productores y de las mazorcas de mayor tamaño así como de su punto de madurez óptima, luego de su traslado a los laboratorios se llevó acabo las diferentes evaluaciones para determinar la presencia de microorganismos que crecen durante el tiempo que tarda la fermentación de los ecotipos acriollados (tres días), utilizando cuatro diferente medios de cultivo (M.R.S, R.A.E, Dextrosa Saburaud y Estándar) para cuantificar y cualificar la presencia de levaduras, bacterias lácticas y acéticas; además se efectuaron análisis a las variables físico-químicas que interviene en el proceso fermentativo, mediante un método tradicional (MT-01, cajas de madera) en seco versus un método no tradicional (MNT-02, cajas plásticas) en húmedo, añadiendo sacarosa al 22% y levadura al 0.05% como iniciador de la fermentación en MNT-02; en ambos ensayos se evaluaron el ph, % de Ácido Acético, % Alcohol, % Sólidos Solubles ( Brix), los índices variación como pérdida o ganancia de peso (Pp), cambio de volumen y rendimiento de las semillas; todos éstos análisis fueron realizados en el laboratorio de microbiología de alimento de CENSALUD, en la Universidad Nacional de El salvador.

10 Al finalizar el proceso de fermentación se efectuó el secado de la semilla durante tres días en bandejas de aluminio las que servirían para realizar los respectivos análisis bromatológicos que determinen los % de ceniza, % de fibra y % de humedad mediante el método gravimétrico así como el % de grasa mediante el método de extracción de Soxlet y el % proteínas mediante el método Micro Kjeldahl, basados en técnicas descritas por la AOAC 17 TH edición, Realizados en el laboratorio control de calidad de la facultad de agricultura e investigación agrícola de la Universidad Doctor José Matías Delgado ; ubicado en Km 8 1/2 carretera a Santa Tecla, Antiguo Cuscatlán. Edificio 5 nivel 3, los análisis bromatológicos como fibra, humedad, proteína y grasa en el MT-01 y el MNT-02. En fibra en el MT-01 tuvo 24.36% y en el MNT %, en la humedad el MT-01 obtuvo 5.85% y en el MNT %, en los análisis de proteína en el MT-01 se observa un 11.17% y el MNT-02 es de 12.07% y en la determinación de la grasa se obtuvo en el MT-01 un 20.63% y en el MNT-02 fue de 21.09%. Haciendo una comparación de los análisis bromatológicos que el MNT-02 se obtuvo mejores resultados, que el MT-01. Siendo así se puede decir que el MNT-02 brinda mejores resultados dando mejor calidad.

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12 CAPÍTULO OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN Objetivos Generales Evaluar el proceso de fermentación tradicional y no tradicional de la semilla de cacao Theobrama cacao del Ecotipo Acriollado, por la determinación de factores físicos - químico y microbiológicos, utilizando cuatro medios de cultivos y levadura Saccharomyces cerevisiae como iniciador de fermentación en el método no tradicional Objetivos Específicos 1. Identificar descriptores agromorfológico del ecotipo acriollado. 2. Evaluar los factores físicos y químico que influyen en el proceso de fermentación dichos factores son la temperatura, ph, alcohol, ácidos acéticos y sólidos solubles ( Brix). 3. Identificar en cuatro medios de cultivo la presencia de Levaduras, Bacterias Lácticas y Acéticas en la fermentación por proceso tradicional y no tradicional. 4. Evaluaciones bromatológicas de las semillas secas de teobroma cacao obtenidas de los procesos de fermentación tradicional y no tradicional.

13 1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La investigación estuvo orientada al estudio de los cambios que ocurren durante la fermentación de la semilla del cacao a través de microorganismo auténticos de la fermentación natural y fermentaciones inducidas este será evaluado a través de un proceso no tradicional que consistió en dos ensayos; uno de forma tradicional en cajas de madera y otro inoculando la semilla con Saccharomyces cerevisiae en plástico. Se realizó específicamente con variedades de cacao Acriollado que se encuentran en la Hacienda San José del Real de la Carrera, Usulután. El objetivo de la investigación fue Identificar descriptores agromorfológico en los ecotipos acriollados, Evaluar los factores que influyen en el proceso de fermentación Utilizando cuatro medios de cultivo para cuantificar y cualificar la presencia de Levaduras, Bacterias Lácticas y Acéticas en la fermentación tanto en proceso tradicional y no tradicional y establecer una metodología apropiada que mejore las características sensoriales del grano de cacao con parado con el método tradicional. Por lo que se plantió la siguiente incógnita Será posible utilizar inóculos iniciadores de levaduras en el proceso de fermentación por el método húmedo que pueda sustituir el método tradicional y mejorar las propiedades bromatológicas del grano de cacao acriollado?

14 1.3 JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACIÓN Esta investigación tiene como objetivo general contribuir a hacer más eficiente la producción y aumentar la calidad de la semilla de cacao acriollado mediante el desarrollo de nuevas técnicas que ayude a estandarizar el protocolo de beneficiado, controlando los factores que intervienen en la fermentación; identificando la alta productividad mediante la selección de árboles élites que en la actualidad no se ha realizado ningún estudio sobre éstos aspectos y que a partir de ésto se puede mejorar la productividad en la Hacienda San José del Real de la Carrera, Usulután. Ya que actualmente por falta de conocimientos científicos, los procesos de fermentación son únicamente bajo el método tradicional de forma deficiente, por lo que dicha investigación se enfocó en analizar los factores que intervienen en la fermentación y de ésta manera contribuir a que el proceso se mejore y se optimice el beneficiado que en la actualidad se está realizando. Por otra parte El Salvador está sujeto a las importaciones, considerando la demanda nacional es importante que se realicen estudio que mejoren las tecnologías de beneficiado para que exista el desarrollo de los productores cacaoteros del país, y así mantener y desarrollar rentabilidad agroindustrial.

15 1.4 GENERALIDADES 1.5 HISTORIA Según Jorge Redmond Schlageter, los primeros árboles del cacao crecían de forma natural a la sombra de las selvas tropicales de las cuencas del Amazonas y del Orinoco, hace unos 4000 años. Los primeros cultivadores en Centroamérica fueron los habitantes del sitio de Puerto Escondido, en Honduras, alrededor de 1100 a. C. Entre 600 y 400 años. se extendió a Belice también. A la temporada de la civilización Olmeca, cerca de 900 años. es probable que la siembra de cacao fue extensivo en Mesoamérica. El cacao son semillas del árbol Teobroma cacao, que vienen en una mazorca. Ésta tiene entre 30 y 40 granos envueltos en una sustancia mucilaginosa de aspecto gelatinoso. El cacao crudo tiene un sabor astringente desagradable, de manera que debe ser tratado mediante un proceso en el que los microrganismos, a través de una fermentación, modifiquen sus componentes. Posteriormente los granos son secados y tostados, para que se desarrollen las características sensoriales del chocolate. 1.6 CLASIFICACIÓN BOTÁNICA Tabla N 1: Clasificación científica Reino: Subreino: División: Clase: Subclase: Orden: Familia: Subfamilia: Tribu: Género: Especie: Plantae Tracheobionta Magnoliophyta Magnoliopsida Dilleniidae Malvales Malvaceae Byttnerioideae Theobromeae Theobroma T. cacao Fuente: Juddet al, (1999) citado por Jiménez (2006)

16 1.7 CACAO ACRIOLLADO. El cacao de tipo criollo presenta las mismas características que los antiguos iollos ve ezola os o a aos hi os e Cuba, y en particular todos aquéllos que te ga otiledo es la os, ultivados e A é i a Ce t al su de Mé ico. Debido a la gran variabilidad de los cacaos cultivados, con relación al color, dimensiones y formas de las pa tes ue o stitu e la flo, f uto se illa, o e iste e la a tualidad u ite io con verdadero rigor científico que explique las características distintivas de los diferentes grupos cultivados del género Theobroma. Por éllo se recomienda no dar la denominación de va iedad, si o del tipo o fo a e i luso g upo genético. Esa variabilidad de los cacaos cultivados en la actualidad deriva de los numerosos cruces, mutaciones y selecciones (naturales y dirigidas) que se han sucedido a lo largo de tantos años. El árbol en general es más pequeño que el del tipo forastero, de copa redonda, follaje menos denso y hojas más pequeñas, ovaladas, gruesas, de color verde claro, las flores tienen pedicelos cortos, los estaminodios y líneas guías de los pétalos de color rosado pálido, las espátulas de los pétalos son de forma y color muy variables. El árbol es más susceptible a los ataques de enemigos naturales (patógenos y plagas) en comparación a los forasteros. Fig. 1 Árbol de Cacao Las mazorcas son grandes, con diez surcos bien definidos, de los cuales cinco de éllos (en forma alterna) son más profundos que los otros, cáscara (pericarpio) rugosa, delgada o gruesa, con una ligera capa lignificada en el centro del pericarpio, con o sin depresión en el cuello, puntas agudas en cinco ángulos, rectas o recurvadas. Fig. 2 Mazorca de Cacao Criollo

17 El color de la mazorca puede variar del verde al rojo cuando está inmadura, de amarillo dorado a rojo oscuro cuando maduras, el tamaño oscila entre unos 35 cm de longitud y 35 a 40 granos/mazorca a 12 cm con granos/mazorca. Las semillas tienen los cotiledones blancos o ligeramente pigmentados cuando frescos y de color canela claro al estar beneficiadas; cilíndricos u ovales, son grandes, rollizos y muy aromáticos, pueden pesar hasta 6 g frescos y con mucílago (2,4 g seco), el sabor del grano es ligeramente astringente, fermenta en horas (1 ½ a 2 días), de alta calidad. Fig. 3 Semilla de Cacao CLAVES DE IDENTIFICACIÓN DE CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LA PLANTA CACAO ACRIOLLO A continuación se describen las diferentes características morfológicas que se observan en el Cacao Criollo: Árboles bajos, poco vigorosos excepto en ambientes favorables (con riego y fertilización). Algunos genotipos no emiten verticilo (horqueta). Hojas pequeñas, ovaladas, color verde claro y gruesas. Flores con pedicelos cortos, estaminoides y líneas guía de los pétalos de color rosado claro. Por lo general son auto-compatibles. Usualmente toman cinco años para producir las primeras mazorcas. Fig. 4 Hoja del Árbol de Cacao Produce bajos rendimientos respecto a los forasteros y trinitarios.

18 Mazorcas cilíndricas, con 10 surcos profundos, simples o en cinco pares. Cáscara verrugosa, delgada o gruesa con una ligera capa lignificada en el centro del pericarpio. Con o sin depresión en el cuello (angoleta/cundeamor). Punta aguda en cinco ángulos, recta o curvada. Fig. 5 Flor del Árbol de Cacao Color de la mazorca inmadura varía del verde al amarillo. Semillas blancas o ligeramente pigmentadas, cilíndricas u ovales. Algunos genotipos presentan semillas con embriones necróticos o vacíos. Son altamente susceptibles a monilia, escoba de bruja, mazorca negra y buba Floral (Astorga, 2009) CLAVES DE IDENTIFICACION DE CARACTERÍSTICAS DE LAS SEMILLAS CACAO CRIOLLO Período de fermentación de 2 á 3 días. Son considerados de alta calidad del chocolate Confieren un sabor fuerte parecido a la pimienta, sus principales características son: Sabor medio a cacao Sabor medio a frutas Poco sabor floral Alto sabor a nueces Fuente: Castañeda, Vianney; Bonilla, Guillermo; Pérez, Juan Manuel

19 CAPÍTULO 2. REVISIÓN DE LITERATURA Según Wacher M. (2007) en su artículo Microrganismos y Chocolate, el proceso de fermentación del cacao es natural o espontáneo, ya que no se añaden intencionalmente los microrganismos a los granos, que de hecho se encuentran estériles dentro de las vainas. Se contaminan con microrganismos provenientes de todas las superficies con las que entran en contacto: los utensilios y las manos de las personas que manipulan el cacao. Durante la fermentación, que puede dividirse en fases, ocurre una sucesión de poblaciones de microrganismos: 2.1 PRIMERA FASE La pulpa es rica en carbohidratos y tiene un ph bajo. En ésas condiciones se favorece el desarrollo de levaduras. En la primera fase aparecen entre 5 y 6 especies diferentes de levaduras, que luego desaparecen dejando su lugar a Hanseniáspora guilliermondii, que es la levadura predominante durante las primeras 24 horas. La Hanseniáspora sólo se le encuentra ocasionalmente en las fases posteriores. La levadura Cándida zemplinina es una nueva especie que sólo se pudo detectar hasta que aparecieron las técnicas modernas de la biología Fig. 6 Esporas Ovales de Hanseniáspora guillermondiid molecular que detectan la presencia de microrganismos por sus genes, más no cultivándolos. Cándida silvae, Cándida zemplinina y Cándida diversa son levaduras que se encuentran comúnmente en las fermentaciones en charolas, posiblemente por la mayor concentración de oxígeno en ese tipo de fermentación. Se reporta que a las horas dominan Saccharomyces cerevisiae y Pichia membranaefaciens, que se encuentra al final de la fermentación; Cándida krusei y Hanseniaspora guilliermondiid, en las fermentaciones en charolas, y predomina también Saccharomyces cerevisiae (Nielsen et

20 al., 2007). En las fermentaciones por pilas, Pichia kudriavzevii, Saccharomyces cerevisiae y Hanseniaspora opuntiae En la fermentación del cacao participan un gran número de especies de microorganismos, algunos de los cuales no se han reportado en otros ambientes o fueron aislados inicialmente del cacao. Éste es el caso de nuevas levaduras como Cándida halmiae, Geotrichum ghanense, Cándida awuaii (Nielsen et al., 2010). Fig. 7 Esporas de Saccharomyces cerevisiae 2.2 SEGUNDA FASE En la segunda fase del proceso de fermentación del cacao, se favorece el desarrollo de bacterias lácticas, que fermentan los carbohidratos residuales y continúan el consumo del ácido cítrico. En las fermentaciones de pilas se han aislado sobre todo bacterias del tipo Lactobacilos (Lb.collonides, Lb. fermentum, Lb. mali y Lb. plantarum), aunque también se han identificado bacterias como Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc pseudoficulneum, y Pediococcus acidilactici. Por otro lado, Lb fermentum y Lb plantarum son indígenas de ésta fermentación. Las levaduras contienen enzimas del tipo pe ti olíti o, lo ue les permite hidrolizar las pectinas, ocasionando una disminución de la viscosidad de la pulpa de mucílago y favoreciendo la entrada de aire. Con éste ambiente aerobio y menos ácido - debido al consumo de ácido cítrico- se favorece el desarrollo de bacterias acéticas. 2.3 TERCERA FASE En la tercera fase del proceso de fermentación ocurre un cambio importante en términos de los productos de la fermentación, ya que intervienen bacterias acéticas que llevan a cabo la transformación del etanol que produjeron las levaduras en ácido acético, tal como ocurre en la industria productora de vinagre. Dado que la transformación de etanol en ácido acético es una reacción exotérmica, se produce calor. El etanol y el ácido

21 acético se difunden hacia el interior de los granos y, junto con la temperatura alta, matan al embrión. Las más importantes bacterias acéticas que se han aislado de la fermentación del cacao, son: Gluconobacter oxydans. 2.4 MICROORGANISMOS DE LA FERMENTACIÓN DEL CACAO LACTOBACILLUS FERMENTUM Es una especie de bacterias gram-positivas del género lactobacilos. Es miembro generalizada del género Lactobacillus, comúnmente se encuentran en muchos alimentos fermentados, así como materia de la planta anaeróbica. Toleran bien concentraciones relativamente altas de ácidos y valores de ph más bajos que el resto de las bacterias por lo que pueden desplazarlas de los hábitats que colonizan. Bacterias muy importantes en la producción de alimentos fermentados y en el deterioro por fermentación de Fig. 8 Imagen al microscopio de Lactobacillus Fermentum alimentos GLUCONOBÁCTER OXYDANS Oxydans Gluconobácter, anteriormente conocido como suboxydans acetobacter, son Gram-negativas varilla o bacterias en forma de óvalo que van desde aproximadamente 0,5 a 0,8 mm x 4,2 mm a. El nombre de oxi oxydans Gluconobacter en latín significa "fuerte" y "ácida", y se dans "dar". Gluconobácter oxydans es una bacteria gram-negativa Fig. 9 Vista al microscopio de Gluconobácter oxydans que pertenece a la familia Acetobacteraceae. G. oxydans es un aerobio obligado, que tiene un tipo de metabolismo respiratorio utilizando oxígeno como aceptor terminal de electrones.

22 Las cepas de Gluconobácter florecen en nichos de dulces, por ejemplo, uvas maduras, las manzanas, las fechas, la tierra del jardín, la tierra del pan, las abejas, las frutas, sidra, cerveza, vino. 2.5 CONSECUENCIAS DE LA FERMENTACIÓN Se sabe que en el sabor a chocolate participan por lo menos 500 compuestos diferentes y que éste sabor depende de muchos factores, como el tipo de grano de cacao, la época en la cual se cosechó, la fermentación (la acción de microorganismos), la acción de enzimas endógenas (enzimas del cacao), el rostizado y el secado. Es por lo mismo muy difícil definir de cuál de todas estas etapas depende la producción de aromas. Las enzimas endógenas, por ejemplo, pueden actuar sobre los carbohidratos, proteínas y polifenoles del grano de cacao, generando aromas. Lo que es un hecho es que el sabor característico del chocolate no se desarrolla si no hay fermentación. Durante la fermentación los microorganismos juegan papeles muy importantes: las levaduras eliminan la pulpa que rodea a los granos de cacao frescos, des-polimerizando o rompiendo la pectina y en las condiciones anaeróbicas (sin oxígeno) que imperan en el ambiente, llevando a cabo la fermentación de los azúcares para producir etanol. Las bacterias lácticas fermentan los azúcares y producen ácido láctico, ácido acético y manitol. Según Ba ale, L. 2007, E su o a Mate ias Primas: chocolate: fe e ta ió, el proceso del volteo tiene el efecto inmediato de aumentar la aireación y por consiguiente la actividad bacteriana, lo que se refleja en la rápida elevación de temperatura, que puede superar al efecto del enfriamiento provocado por el volteo. Uno de los objetivos del volteo es asegurar el grado de fermentación uniforme, pero se ha encontrado considerable variación entre diferentes zonas aún cuando se practica el volteo. El Criollo necesita menos fermentación y suele bastar con dos días. Sorprendentemente, aunque el cacao tipo Criollo no parecen quedar excesivamente fermentadas. Las alteraciones químicas en el interior del haba de cacao, dependen de la muerte de las células del cotiledón. Sus membranas celulares se degradan y permiten que se pongan en contacto los diferentes constituyentes que estaban separados en el tejido

23 vivo. La muerte, que tiene lugar durante el segundo día es producida principalmente por el ácido acético. Las antocianinas y otras sustancias polifenólicas de las células pigmentadas, pueden difundirse entonces hacia las células adyacentes de almacenamiento, donde se encuentran con diversas enzimas que provocan reacciones hidrolíticas en las condiciones anaerobias del haba. Los cambios internos en los granos durante la fermentación. Los granos de cacao están compuestos por células blancas (grasa/manteca, proteínas) y células moradas (polifenoles).alta temperatura y efecto del ácido interrumpen la estructura molecular interna, A causa de ésta interrupción, los compuestos del grano se mezclan y reaccionan entre éllos. Reacciones entre proteínas, enzimas y polifenoles son cruciales para la formación de los precursores del sabor a chocolate. 2.6 MEDIOS DE CULTIVOS AGAR DEXTROSA SABOURAUD El Agar Dextrosa Sabouraud es un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras. El Agar de Dextrosa Sabouraud es una modificación a la fórmula original del Agar de Dextrosa desarrollado por Raymand Sabouraud. Éste medio es utilizado para el cultivo de hongos patógenos, particularmente de aquellos asociados con infecciones de piel. La alta concentración de dextrosa y la acidez del ph hacen a éste un medio selectivo para hongos. Con la adición de cicloheximida, estreptomicina y penicilina, se obtiene un excelente medio para el aislamiento primario de dermatofitos. Éste medio es también utilizado para la determinación microbiológica en cosméticos y para evaluar la presencia de hongos en alimentos. En éste medio las peptonas proveen la fuente de carbono y nitrógeno para el crecimiento de los microorganismos, la dextrosa actúa como fuente de energía y el agar es agregado como agente solidificante.

24 2.6.2 AGAR ESTANDAR El Agar Estándar es un medio utilizado para el recuento de bacterias aeróbicas a partir de agua, aguas residuales, alimentos y productos lácteos. Éste medio también es conocido como Agar Cuenta Estándar. El Agar Métodos Estándar fue desarrollado por Buchbinder Baris and Goldstein en 1953 como un requerimiento de la American Public Health Association. Éste medio se formula con los ingredientes originales. El extracto de levadura y la peptona de caseína han sido utilizados en medios diseñados para estudiar la presencia de microorganismos termofílicos en productos lácteos desde La peptona de gelatina y el extracto de levadura proporcionan la fuente de carbono y nitrógeno. La dextrosa es el carbohidrato fermentable y el agar es adicionado como agente solidificante CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS DE AGAR ESTANDAR Las colonias son generalmente pequeñas, blanco-grisáceas, lisas o rugosas. Se observa el crecimiento de microorganismos de Lactobacillus fermentum ATCC 9338 y Lactobacillus gasseri ATCC Las levaduras llevan a cabo el proceso de fermentación, transformando los azúcares sencillos del mucílago o pulpa en etanol, degradando la pectina, lo que modifica la textura del grano y elimina el ácido cítrico, lo que trae como consecuencia una disminución de la acidez. Por otro lado, el consorcio de levaduras consume el oxígeno, creando un ambiente anaerobio que favorece el desarrollo de bacterias lácticas AGAR MRS A menudo abreviado como MRS, éste tipo de medio de crecimiento bacteriano se llama así por sus inventores: Man, Rogosa y Sharpe. Desarrollado en 1960, éste medio fue diseñado para favorecer el crecimiento exuberante de lactobacilos para el estudio de laboratorio. Contiene acetato de sodio, que suprime el crecimiento de muchas bacterias competidoras (aunque algunos Lactobacillus, otros, como Leuconostoc y Pediococcus, pueden crecer). Éste medio tiene un color marrón claro. La levadura y extractos de carne y peptona proporcionan fuentes de carbono, nitrógeno y vitaminas para el crecimiento

25 bacteriano en general. El extracto de levadura contiene también vitaminas y aminoácidos específicamente requeridos por lactobacilos. polisorbato 80 es un tensioactivo que contribuye a la absorción de nutrientes por lactobacilos. El sulfato de magnesio y sulfato de manganeso proporcionan cationes utilizados en el metabolismo MEDIO DE ÁCIDO ACÉTICO-ETANOL RUTHERFORD (RAE) Éste medio de cultivo, contiene los componentes necesarios para observar el crecimiento de bacterias acéticas. Junto con los elementos de Peptona, Glucosa, Fosfato Sódico, Agar y Ácido Cítrico evitan el crecimiento de otros microorganismos, lo que lo convierte en un medio selectivo muy particular. 2.7 ANÁLISIS BROMATOLÓGICO A continuación se muestra un cuadro donde se exponen los índices de Humedad, Grasa, ph y el sabor del grano de cacao previo a su tostado. PORCENTAJE DE HUMEDAD 6 á 6.5 PORCENTAJE DE GRASA 52 á 55 ph 5.0 á 5.5 SABOR 2.8 ACTIVIDADES ENZIMATICAS TABLA N 2: BROMATOLOGÍA DEL CACAO Amargo Fuente: fedecacao.com.co Según Selamat Jinap Misnawi. La fermentación es un aspecto muy importante de la transformación del grano de cacao. Un estudio ha demostrado que los granos no fermentados no desarrollan ningún sabor a chocolate cuando se tuestan y son excesivamente astringentes y amargos. Por lo tanto, los granos no son los preferidos por los fabricantes de cacao. Para aumentar la calidad de la aceptación y el sabor, los granos fermentados en general, se mezclan con los granos bien fermentados. En virtud de fermentación se refiere a los granos que se secan (en el secado al sol) sin fermentar o

26 fermentado durante 1-2 días, los granos se produjeron por lo general por los pequeños agricultores. La evaluación de los demás enzimas clave en la seca en los granos de cacao fermentados muestra que el proceso de secado de la proteasa significativamente inactivada y la invertasa en los granos de cacao. El efecto de la inactivación de la fermentación (2 días) fue menor que el efecto de secado. Las actividades restantes aspártico endoproteasa en granos secos de cacao sin fermentar y fermentadas en parte, fue de 34 y el 31% de la actividad en los granos frescos, respectivamente, mientras que los de la actividad carboxipéptidasa fueron del 20 y el 16%. Inactivación efecto de secado y la fermentación fue mayor en la invertasa que cualquiera de la endoproteasa asparlic o carboxipéptidasa. Se encontró que las actividades de invertasa restantes en los granos de cacao fermentados y se secó-fermentado parcialmente eran 19 y 7% de la actividad en los granos frescos, respectivamente. Las anteriores actividades el resto de la enzima clave fueron lo suficientemente alta como para formar los precursores del aroma de incubación de la activación. De acuerdo con estudios previos realizados en la reacción enzimática en cotiledón podría continuar durante la fermentación, aunque en un grado limitado. Las enzimas restantes parcialmente pierden su actividad inmediatamente después de la reacción empieza. Ésto puede ser debido al hecho de que los polifenoles se unen a la proteína in situ de las enzimas durante la incubación. Secos sin fermentar y parcialmente fermentados, los granos de cacao son ricos en polifenoles, que comprende 12-18% de su peso seco de los productos de la oxidación de los polifenoles inactivan las enzimas hidrolíticas durante el proceso de fermentación del cacao en la transformación del grano, por lo tanto, si la oxidación se produce inmediatamente después de la muerte de los granos, el cacao producido sería deficiente en sabor a chocolate. El grupo hidróxilo fenólico es un donador de hidrógeno de excelente unión, y forma enlaces de hidrógeno fuertes con el carbonilo de la amida del esqueleto peptídico. La interacción entre los polifenoles y las proteínas en un sistema modelo. También encontró que la oxidación enzimática de polifenoles produce quinonas, que son agentes muy reactivos y pueden

27 reaccionar adicionalmente con los aminoácidos y proteínas, o polimerizar uno con el otro para formar productos de alto peso molecular, los llamados " taninos condensados ", mientras que en peso molecular superior a 3000, forman complejos con proteínas a través de enlaces de hidrógeno. Endoproteasa aspártico, carboxipéptidasa y la invertasa son inactivados de manera significativa durante la fermentación y el secado de los granos de cacao. El efecto de inactivación de las enzimas en la fermentación es significativamente menor que el proceso de secado. La actividad de las enzimas que quedan en los granos de cacao se secan sin fermentar y fermentadas en parte, son suficientes para llevar a cabo reacciones enzimáticas durante la incubación. Patrones peptídicos de desgrasada, sin fermentar y parcialmente fermentado de soja en polvo después de la incubación son muy similares a los patrones fermentados. Las concentraciones de aminoácidos en los granos fermentados se incrementaron significativamente durante las primeras 4 h de incubación y luego se mantuvo constante, mientras que en los granos fermentados en parte, la formación continuada y la concentración de hidrófobos y el total de aminoácidos libres alcanzado el valor de los granos bien fermentados después de 24 h de incubación. La reducción de las concentraciones de azúcar de granos bien fermentados podría ser alcanzado por la incubación de ambos sin fermentar y fermentadas en parte, los granos de cacao. Éstos resultados indican claramente que la calidad del sabor de las semillas sin fermentar los granos de cacao puede ser mejorado mediante la activación de las enzimas clave pendientes. 2.9 GENERALIDADES DE LA FERMENTACIÓN DEL CACAO Según Ligia Ortiz de Bertolelli. La fermentación es una fase indispensable en el beneficio del cacao, Theobroma cacao L., ya que en ella se desarrollan los precursores del aroma y sabor a chocolate. Ésta etapa es afectada por el tipo de cacao tiempo de almacenamiento del fruto o mazorca antes de la apertura y el desgrane, así como por el método de fermentación empleado, dependiendo del tipo de fermentador usado el tiempo del proceso y frecuencia de remoción de la masa fermentante (semillas y pulpa),

28 entre otros, consecuentemente todos éstos factores influyen sobre la calidad del producto final. El tiempo de fermentación está relacionado con el tipo de cacao. El criollo fermenta más rápidamente que el forastero, tardando el primer tipo de cacao dc 2 a 3 días y el segundo de 5 a 7 días. No obstante, las condiciones climáticas, el volumen de la masa y el método aplicado ejercen un papel importante sobre la duración del proceso y pueden causar grandes variaciones, por lo que es conveniente establecer en campo el tiempo adecuado. Igualmente se ha detectado que a medida que aumenta el tiempo entre la cosecha y el desgrane del fruto se incrementa la posibilidad de una sobre-fermentación por lo que se recomienda reducir el tiempo de fermentación cuando la proporción de mazorcas desgranadas tardíamente es alta. En cuánto a la remoción de la masa durante la fermentación del cacao, se ha encontrado que ejerce un efecto significativo sobre los precursores del sabor. Al remover la masa fermentante se incrementa la aireación, lo que conlleva a una regulación de la acidez del producto y de la velocidad del proceso fermentativo, ya que el desarrollo de la temperatura y de la acidez depende de la aireación de la masa en fermentación. Además, la remoción impide la aglomeración de los granos y el consecuente desarrollo de hongos en la superficie y en las esquinas de los fermentadores. Ahora bien, la frecuencia de remoción de la masa puede alterar la apropiada secuencia microbiana durante la fermentación y provocar la aparición de metabolitos que, al difundirse por el interior de los cotiledones, pueden afectar la calidad del producto final, por lo que es importante el control de dicho factor. Se ha observado que el almacenamiento de los frutos de cacao por varios días después de la cosecha realza el sabor. Ésta demora en el desgrane favorece la hidrólisis de la pulpa y reduce la acidez del cacao, así mismo promueve bajos niveles de ácido láctico, ácidos volátiles y ácidos totales libres y un incremento de los taninos en el cotiledón. Al retardar el desgrane, la fermentación es acelerada debido a que la temperatura se incrementa más rápidamente, dependiendo dicho incremento del tiempo de

29 almacenamiento de la mazorca, de manera que los valores de la temperatura serán más altos a medida que aumenta el tiempo entre la cosecha y el desgrane del cacao. Sin embargo, se ha notado que un ascenso lento de la temperatura es importante para obtener un mejor potencial del sabor, ya que se forma menos cantidad de ácido acético, el cual en concentraciones moderadas puede difundir lentamente dentro de los granos sin causar una sobre acidificación, por lo tanto no es conveniente almacenar la mazorca por mucho tiempo. La fermentación del cacao es una etapa muy importante en el procesamiento del grano, ya que se producen los cambios bioquímicos que dan origen a los precursores del aroma y del sabor. Diversos factores que influyen sobre el proceso fermentativo, dentro de los que destaca el tipo de cacao, las condiciones ambientales y el almacenamiento de la mazorca, así como el sistema empleado en la fermentación. Así mismo, el tipo de fermentador, el volúmen de la masa y el volteo durante el proceso afectan la fermentación y en consecuencia la calidad del grano fermentado. El proceso fermentativo se realiza de distintas maneras y los métodos tradicionalmente más utilizados son la fermentación en canastas, cajas o en montones. En la zona de Cumboto, Venezuela, la mayoría de los productores fermentan en sacos de yute, cajas de plástico y en montones. Sin embargo, en la actualidad varios productores están efectuando éste proceso en las cajas de madera disponibles en El Central de Beneficio de Ocumare de La Costa, el cuál ha sido recuperado. En Cumboto la aplicación de un determinado método de fermentación depende, básicamente, de la experiencia del productor y el manejo post cosecha, por lo general, es realizado con una gran variabilidad, que ha impedido garantizar a los compradores un producto con una determinada calidad, lo cual ha incidido negativamente en el precio y en el prestigio del cacao. El objetivo del estudio consistió en evaluar los tipos de fermentadores utilizados por los productores de cacao de la localidad de Cumboto, a fin de seleccionar el más adecuado para el proceso fermentativo en la zona.

30 La variación del ph y de la acidez durante La fermentación del cacao se debe a la degradación microbiana de los ácidos y a la pérdida por difusión de éstos compuestos hacia el cotiledón. Durante la fermentación, los azúcares totales de La pulpa + testa y del cotiledón disminuyeron en los tres fermentadores, con diferencias significativas (P<0,05) entre sí. Ei descenso de éstos compuestos en la pulpa + testa es ocasionado por la conversión de los azúcares en alcohol por acción de Las levaduras y por su eliminación a través del exudado, en cambio en el cotiledón la sacarosa es hidrolizada a fructosa y glucosa por acción de la invertasa. Entre los fermentadores, los valores de los azúcares totales de la pulpa testa fueron significativamente (P<0,05) mayores en la caja de madera que en La caja plástica, mientras que en el cotiledón no difirieron entre sí.

31 CAPÍTULO 3. METOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN Para la realización de ésta investigación se identificaron aquellos eco tipos de cacao que presenten las características potenciales de buena producción tomando en cuenta que estén libres de enfermedades, daños físicos, mecánicos que puedan afectar los resultados en los análisis, a continuación se describe las etapas realizados en esta investigación. 3.1 CORTE Y SELECCIÓN DEL FRUTO Ésta operación requiere de mucho cuidado ya que los frutos o mazorcas que fueron evaluados deben estar en su óptimo desarrollo de madurez lo cual se estima a partir de aquellos frutos que tengan cinco a seis meses de desarrollo. Luego de la identificación se procedió a su corte mediante tijeras de podar, se realizó el corte cerca del fruto en el pedúnculo para no dañar el cojinete floral. Los frutos se trasladaron al laboratorio para efectuar el siguiente proceso. 3.2 PESO DE LA MAZORCA. El peso de las mazorcas se determinó para estimar el rendimiento de las masas de semillas que serían colocada en las cajas de maderas y plástico. Se Pesaron 75 mazorcas en una balanza COBOS PRECISION CB- JUNIOR MAX/d 600/0.01g. Haciendo un peso total en Fig. 10 Selección de Mazorcas de Cacao, Hacienda la Carrera mazorca de 72.99lb, cuyo promedio en mazorca fué de 0.86lb. Fig. 11 Pesado de Mazorca de Cacao

32 3.3 EXTRACCIÓN DE MUESTRAS DE SEMILLAS El proceso consiste en quebrar la mazorca de cacao utilizando un cuchillo de acero inoxidable de aproximadamente 20cm de largo de la hoja, teniendo cuidado de romper solamente el epicarpio para no dañar la semilla que serian extraídas de la placenta. Fig. 12 Extracción de Semillas 3.4 PESO Y DIMENCIONES DE LAS SEMILLAS El peso total de las semillas fresca extraída con mucílago fue 21.22lb, y su promedio fue de 0.25lb por mazorca. Luego se realizaron mediciones a 10 semillas de la masa obtenida (21.22lb); cuyo promedio en semillas fue: largo 25.5mm, ancho 15.6mm y grueso 10.6mm, datos determinantes para obtener rendimientos de fermentación. Fig. 13 Medición de las Dimensiones de la Semilla del Cacao Fresco 3.5 PREPARACIÓN DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN De la masa obtenida de las semillas frescas se dividieron en tres repeticiones, colocándola en depósitos plásticos con un diámetro de 32cm, y de alto 14cm, con peso de 4.56lb para MNT-02 en las cuales se inocularon con levaduras S. cereviceae al 0.05% y a su vez se mezclaron con agua purificada en una relación de uno de semilla y uno de agua cuya solución sirvió para preparar un jarabe a una concentración 22 Brix. Fig. 14 Preparación del Proceso de Fermentación no Tradicional

33 En la muestra MT-01 las semillas se colocaron en cajas de madera cortés blanco cuyas dimensiones fueron: largo de 30ml, ancho de 20ml, alto 15ml. En éste tratamiento se le colocó hojas de huerta y para cubrir las semillas tal como se realiza en la Hacienda San José del Real la Carrera, se efectuaron las mediciones de temperatura con un termómetro de mercurio con una escalas de C de 260mm largo LUDWIG SCHNEIDER LS-0003, éste proceso se efectuó cada 24 horas durante 72 horas que duró la fermentación. 3.6 TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICOS DE LA SEMILLAS FERMENTADAS En ésta etapa se efectuaron medición cada 24 horas en los tratamientos durante el tiempo que se tardó la fermentación (aeróbica y anaeróbica), teniendo cuidado de ventilar la masa que fue fermentada cada 24 horas. En éstos períodos de fermentación se tomo en cuenta el ph, % de azucares, % de alcohol, % de ácido acético y la temperatura PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DEL ph Para la medición del ph se utilizó un potenciómetro digital modelo PHS-3CW. Se calibra el potenciómetro utilizando agua destilada y se seca con una toalla absorbente de material suave, luego se procede a su calibración utilizando soluciones búffer de 4 y 7; ya que el rango de acidez del mucílago oscila entre éstos parámetros. Posteriormente se obtiene una muestra de aproximadamente 20ml de mucílago en la cual se introduce los electrodos en diferentes zonas es decir en la porción superior, media y baja con el objetivo de tener un parámetro de tres puntos para luego determinar la media de sus valores. Ésto se realizo para el MT-01 y MNT-02. Fig. 15 Medidor Electrométrica del ph PHS-3CW

34 3.6.2 PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE SÓLIDOS SOLUBLES, ÁCIDO ACÉTICO Y NIVEL DE ALCOHOL Para la determinación de Ácido Acético, Alcohol y la cantidad de Sólidos Solubles totales ( Brix) presentes, en las muestras se utilizó el método por refractómetria. El dato se muestra en la pantalla y éste básicamente facilita el procedimiento de medición. A) DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ACÉTICO En la determinación de Ácido Acético se utilizó un refractómetro marca ATAGO (PAL-305) digital manual de un rango 0-20g/100g; se calibra a 0% colocando 0.3ml agua destilada cubriendo el prisma, se presiona cero; ya calibrado se coloca 0.3ml de mucílago, se presiona start y se efectúa la lectura en el visualizador de cristal líquido, los datos se reportan en porcentaje. Nota: Si éste sobrepasa el 20% se realizó una dilución de 0.1ml Fig. 16 Medición de Ácido Acético en 1ml de agua destilada. B) DETERMINACIÓN DE ALCOHOL En la determinación de Alcohol se utilizó en un refractómetro marca ATAGO (PAL-34S) digital manual de un rango 0-45g/100g; se calibra a 0% colocando 0.3ml de agua destilada en el prisma se presiona cero; ya calibrado se coloca 0.3ml de mucílago, se presiona start y se observa en el visualizador de cristal líquido, los datos se reportan en porcentaje. Fig. 17 Medición de Alcohol C) DETERMINACIÓN DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES ( BRIX) En la determinación de los Brix, se utilizó en un refractómetro marca ATAGO (PAL-1) digital manual de un rango 0 53%; se calibra a 0% colocando 0.3ml agua destilada en el prisma se presiona cero; ya calibrado se coloca 0.3ml de mucílago, se presiona start y se observa en el visualizador de cristal líquido, los datos se reportan en porcentaje. Fig. 18 Medición de Sólidos Solubles Totales