PATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA DE CAMARONES PENAEIDOS

Transcripción

1

2

3 GUÍA TÉCNICA PATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA DE CAMARONES PENAEIDOS PROGRAMA CYTED ÁREA DE AGROALIMENTACIÓN RED II-D: Red Vannamei Editores: Vielka Morales Q. Jorge Cuéllar-Anjel Autores: María José Almanza Abud Margherita Anna Barracco Jorge Cuéllar-Anjel Donald V. Lightner Emiko Shinozaki Mendes Alitiene Moura Lemos Pereira María Soledad Morales Covarrubias Carlos Pantoja Luciane María Perazzolo Rafael Diego Rosa Agnés Saborio Coze Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira

4 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos La presentación y disposición en conjunto de: GUÍA TÉCNICA - PATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA DE CAMARONES PENAEIDOS son propiedad de los editores. Ninguna parte de esta obra puede ser reproducida o transmitida, mediante ningún sistema o método, electrónico o mecánico (incluyendo fotocopiado, la grabación o cualquier sistema de recuperación y almacenamiento de información), sin consentimiento por escrito de los editores. Derechos reservados: 2008 Vielka Morales Q. y Jorge Cuéllar-Anjel (507) (507) vielkamorales2003@yahoo.com jocuan@gmail.com Panamá Primera edición en español Hecho en Panamá ISBN: Esta obra se citará de la siguiente manera: Todo el libro: Morales, V. y J. Cuéllar-Anjel (eds.) Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos. Programa CYTED Red II-D Vannamei, Panamá, Rep. de Panamá. 270 pp. Ejemplo para citar un capítulo: Pantoja, C. y D.V. Lightner Enfermedades virales pp En: Morales, V. y J. Cuéllar- Anjel (eds.) Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos. Programa CYTED Red II-D Vannamei, Panamá, Rep. de Panamá. 270 pp. Diseño e impresión: New Concept Publications, Inc. (507) Panamá Daniel Ho - Fotografías de portada, contraportada, páginas 1, 55, 117, 135, 159, 169, 225, 243 y 254 ii

5 AGRADECIMIENTOS Los editores agradecen la colaboración de Reinaldo Morales y Hugo Pérez Athanasiadis, por la traducción preliminar del portugués al español, de varios capítulos del libro, así como a Roberto Chamorro (Licencia de intérprete público autorizado del Ministerio de Gobierno y Justicia de Panamá, Resolución Nº 28, de 8 de marzo de 1984) por la revisión y perfeccionamiento de los documentos traducidos. De igual manera por la revisión y aportes de la Dra. Patricia Del Portillo (Métodos Moleculares), Dra. Margherita Barracco (Parámetros Inmunológicos), Dr. Carlos Pantoja y Kenneth W. Hasson (Parásitos en Camarones), Ing. Roberto Chamorro y Dra. María del Pilar Moyano (Métodos de Diagnósticos) y Oscar Olivares (glosario y correcciones de texto). iii

6 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos IN MEMORIAM ELPIDIO BELTRAME, el hombre incansable y luchador por la camaronicultura en la región, hoy no se encuentra con nosotros, no obstante, su recuerdo permanecerá por siempre en el corazón de todos los que tuvimos la suerte de trabajar a su lado. El Grupo Técnico Asesor (GTA) de la Red Vannamei del CYTED y los autores de esta Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos, deseamos dedicarla a nuestro amigo, hermano y compañero, ELPIDIO. El fue uno de nuestros pilares en el GTA de la Red Vannamei, con aportes de grandes ideas y colaboración desinteresada para sino también en el resto de los países iberoamericanos que conforman esta importante familia CYTED. Gracias por tu contribución a una actividad que seguirá dando respuestas en la generación de empleos y divisas a diferentes países de iberoamerica. iv

7 PRÓLOGO La camaronicultura tiene sus inicios en la década del 60 incrementándose rápidamente en la del 70, surgiendo como una de las fuentes de mayores ingresos de divisas por sus elevadas producciones. En la actualidad y según estudios de la FAO, aún especies del género Penaeus (también llamado Litopenaeus). a enfermedades que se reportaron desde la aparición del Taura en los años y el Síndrome de la Mancha blanca en los años 98-99, afectando grandemente las producciones y dando como resultado el cierre de muchas empresas, pérdidas de empleos y por ende de ingresos. La industria ha tenido que ir implementando innovaciones tecnológicas y mejoramiento en el manejo de los cultivos de camarón, observándose una lenta recuperación en sus producciones y en la productividad. Sin embargo, con la expansión territorial de esta actividad y el desarrollo de técnicas situación actual en los temas de enfermedades, haya querido compartir sus conocimientos y experiencias de muchos años, a través de esta importante Guía Técnica de Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos, diseñada para productores, técnicos, estudiantes una herramienta útil y práctica en su actividad diaria. Como regente de un sector que vela por el desarrollo de las actividades acuícolas en la República de Panamá, nos sentimos honrados de poder expresar la importancia de en Iberoamérica. GUILLERMO A. SALAZAR N. Ministro de Desarrollo Agropecuario Panamá, 2008 v

8 vi Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

9 INTRODUCCIÓN El Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) ámbito iberoamericano y carácter horizontal. En el marco del CYTED, hay una serie de acciones dentro de las cuales se encuentran las Redes Temáticas, que son asociaciones de grupos de I+D pertenecientes a entidades públicas o privadas de al menos seis países miembros del Programa y cuyas actividades En este caso en particular, la Red denominada FORO PARA LA GESTIÓN DE CONOCIMIENTOS Y TRANSFERENCIA DE TECNOLOGÍAS SOBRE EL CULTIVO DE PENAEUS VANNAMEI: RED VANNAMEI de la industria camaronera de los países iberoamericanos que se dedican a la actividad. Entre los objetivos logrados por la Red, están las siguientes: constitución de un foro regional de convergencia para los grupos de investigación, productores y sector estatal; fomento de la investigación interdisciplinaria que coadyuva al desarrollo tecnológico en temas relativos al L. vannamei; la promoción en el intercambio de información el establecimiento de un sistema de información electrónico de divulgación periódica, el cual facilitó la transferencia de conocimientos; organización de actividades de de investigación; la ayuda a la consolidación de grupos de investigación y desarrollo, lo mismo que la interacción con los diferentes grupos, a través de redes o foros nacionales y miembros del sector productivo, quienes participaron en las actividades que coordinó la red. Entre los temas de mayor énfasis durante el desarrollo de las actividades de la red, están los relacionados con la genética, buenas prácticas de manejo y, patología e la red: Como última actividad de la red, estuvo la realización de un curso teórico-práctico internacional sobre la patología e inmunología del camarón L. vannamei, donde para el cierre de la red, los facilitadotes del curso acordaron contribuir con el desarrollo de cada capítulo a ellos asignados para la publicación de esta guía, la cual servirá de herramienta básica para estudiantes, empresas y entidades estatales que se dedican a la camaronicultura. Este compromiso desinteresado de parte de cada uno de ellos, es uno de los mejores aportes que quedará plasmado en las acciones que vienen desarrollándose la coordinación de la Red Vannamei. A los autores, amigos y compañeros les extendemos un cordial agradecimiento por toda su colaboración. VIELKA MORALES Q. Coordinadora Red Vannamei vii

10 viii Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

11 Capítulo 1 Prólogo Introducción ÍNDICE DE CONTENIDO Reseñas de los editores y autores Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo (Jorge Cuéllar-Anjel) 1.1 Anamnesis Examen clínico Microscopía Directa Montajes en Fresco (María Soledad Morales-Covarrubias) Bacteriología Histología Pruebas con anticuerpos Métodos moleculares Parámetros inmunológicos Microscopía electrónica de transmisión Bioensayos Capítulo 2 Enfermedades Virales (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner) Principales enfermedades y métodos de diagnóstico Virus de la necrosis hipodérmica y hematopoiética infecciosa (Infectious hypodermic and hematopietic necrosis virus, IHHNV) Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (White spot syndrome virus, WSSV) 2.4 Virus del Síndrome de Taura (Taura syndrome virus, TSV) Virus del síndrome de la cabeza amarilla (Yellow head syndrome virus, 87 YHV) 2.6 Virus de la mionecrosis infecciosa (Infectious myonecrosis virus, IMNV) Mionecrosis infecciosa viral (IMNV) y sus implicaciones en los cultivos de camarones brasileños (Alitiene Moura Lemos Pereira, Emiko Shinozaki Mendes, Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira) Penaeus vannamei nodavirus (PvNV) Capítulo 3 Enfermedades Bacterianas (María Soledad Morales-Covarrubias) Vibriosis sistémica Erosión bacteriana del caparazón Síndrome de Zoea II 124 v vii xi 1 70 ix

12 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos 3.4 Enfermedad de luminiscencia (NHP-B) Necrosis del hepatopáncreas bacteriana Spiroplasma penaei (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner) Capítulo 4 Enfermedades por Parásitos (Jorge Cuéllar-Anjel) Gregarinas Microsporidios Haplosporidios Epicomensales Metazoarios Capítulo 5 Enfermedades causadas por hongos (Carlos R. Pantoja y Donald Lightner) Micosis Fusariosis Capítulo 6 Inmunología del Camarón (Margherita Anna Barracco, Luciane María Perazzolo y Rafael Diego Rosa) Sistema Inmune de los Crustáceos Inmunoestimulantes Parametros hemato-inmunológicos como indicadores de salud Conclusiones y Perspectivas Capítulo 7 Buenas Prácticas De Manejo En La Camaronicultura (Agnés Saborío Coze y María José Almanza) Código de Conducta para una camaronicultura responsable Objetivos de un Código de conducta Buenas Prácticas de Manejo Características de las Buenas Prácticas de Manejo Buenas Prácticas de Manejo en Laboratorios de larvas Buenas Prácticas de Manejo en granjas camaroneras Buenas Prácticas de Manejo en plantas procesadoras Glosario 243 x

13 VIELKA MORALES Q. Coordinadora Red Vannamei-CYTED RESEÑAS DE LOS EDITORES Licenciada en Biología. Experiencia de 14 años en el tema de larvicultura, maduración, técnica de la Organización del Sector Pesquero y Acuícola de Centroamérica. Consultora para FAO y PRADEPESCA-UE. Cuenta con 19 publicaciones (11 en temas de camarones). Ha participado en otras redes del CYTED relacionada a camarones y moluscos. JORGE CUÉLLAR-ANJEL Director del Departamento de Patología e Investigación Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO) Aguadulce, Coclé, República de Panamá jocuan@usa.net Médico Veterinario, Máster en Microbiología. Experiencia de 18 años en las áreas de cultivo de camarón marino Litopenaeus vannamei; diseño y montaje de laboratorios de patología de camarones (microbiología, histopatología y biología molecular); docencia universitaria en pregrados y postgrados así como investigación aplicada en Producción, Patología, Inmunología y Nutrición de camarones penaeidos; manejo sanitario de cultivos de camarón (larvicultura, engorde y maduración) mediante clínica y pruebas de campo y de laboratorio (montajes en fresco, microbiología, histopatología y biología molecular); conferencista en Congresos Internacionales; miembro del Grupo Ad hoc de la OIE en crustáceos para las Américas. Ha tenido desempeño laboral en Ecuador, Colombia y Panamá. RESEÑA DE LOS AUTORES MARÍA SOLEDAD MORALES COVARRUBIAS Centro de Investigaciones en Alimentación y Desarrollo, A.C. Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental México, marisol@ciad.mx Maestría y Doctorado en Patología de crustáceos, Licenciatura en Biología Pesquera Investigadora en el área de acuicultura y manejo ambiental del CIAD. Sus principales trabajos cursos en sanidad acuícola y colabora en un programa de transferencia tecnológica, capacitación y consultoría en histopatología de crustáceos, con diferentes países de América Latina. JORGE CUÉLLAR-ANJEL Director del Departamento de Patología e Investigación Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO) Aguadulce, Coclé, República de Panamá jocuan@usa.net La reseña de este autor ha sido citada previamente en Reseña de los Editores xi

14 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos AGNÉS SABORIO COZE Universidad Centroamericana (UCA) Centro de Investigación de Ecosistemas Acuáticos Managua, Nicaragua. cideauca@gmail.com la Global Alliance Aquaculture para plantas de proceso, granjas de acuicultura y laboratorios. en temas relacionados a la zonas costeras. Elaboración y gestión de proyectos acuícolas. Asistencia Técnica, capacitación y extensión a comunidades costeras. Docente universitaria. Consultora. Relaciones de trabajo con cooperantes de USA, JICA, UE, Universidades y Centros de Investigación como Universidad de Rhode Island, Universidad de Florida, Universidad de como ACRA, GVC, OIKOS entre otras, las Naciones Unidas (FAO) y el Banco de Desarrollo Interamericano. Coordinadora de Redes Internacionales. Directora de Acuicultura. Directora de Centro de Investigación. MARÍA JOSÉ ALMANZA ABUD Centro de Investigación de Ecosistemas Acuáticos Universidad Centroamericana (UCA) Managua, Nicaragua almanzaabud@gmail.com Máster en Ciencias Ambientales, Licenciada en Ecología y Recursos Naturales, curso de la Universidad Hawai Hilo. Responsable del área de Físico-química de agua del Laboratorio divulgación y Coordinador de Investigaciones del CIDEA. CARLOS PANTOJA Departamento de Ciencias Veterinarias y Microbiología Universidad de Arizona Tucson, Estados Unidos cpantoja@u.arizona.edu Ingeniero Bioquímico en Explotación de Recursos Acuáticos (Tec de Monterrey, Campus Guaymas, México). Maestría en Acuacultura (Tec de Monterrey, Campus Guaymas, México). Doctorado en Patobiología (The University of Arizona). Actualmente es profesor investigador asociado en el laboratorio de patología acuícola de la Universidad de Arizona. Principales áreas de trabajo son patología morfológica, caracterización de nuevas enfermedades y agentes infecciosos de camarones peneidos, desarrollo de métodos de detección de agentes infecciosos y diagnóstico de enfermedades. Provee servicios de consultoría a la industria camaronícola en el área de patología y da entrenamiento técnico en el área de diagnóstico de enfermedades a través de talleres en la Universidad de Arizona o en el extranjero. xii

15 DONALD V. LIGHTNER Departamento de Ciencias Veterinarias y Microbiología Universidad de Arizona Tucson, Estados Unidos dvl@u.arizona.edu PhD en Patología y Biología Pesquera, Maestría en Biología Pesquera y su Licenciatura en Biología Pesquera. Su experiencia está dirigida a la patología y enfermedades de los cultivos de crustáceos y peces, enfermedades de invertebrados, marinos y de agua dulce, enfermedades infecciosas, virología, histología, microscopio electrónico, desarrollo de métodos de diagnósticos, nutrición de animales acuáticos y toxicología acuática. Provee servicios de consultoría a la industria camaronicola en el área de patología y da entrenamiento técnico en el área de diagnóstico de enfermedades a través de talleres en la Universidad de Arizona o en el extranjero. MARGHERITA ANNA BARRACCO Universidad Federal de Santa Catarina (UFSC), Departamento de Biología Celular, Embriología y Genética (BEG), Laboratorio de Inmunología Aplicada à la Acuicultura (LIAA), Florianópolis, SC, Brasil barracco@mbox1.ufsc.br Doctorado en Inmunologia de Invertebrados y Licenciatura en Ciencias Biológicas. Profesora Titular de Biología Celular, con participación en los programas de Postgrado en Acuicultura y Biotecnología. Investigadora en el área de inmunología de crustáceos y moluscos de interés para la acuicultura, con implicaciones en la sanidad y en el monitoreo ambiental. Sus principales trabajos de investigación están enfocados en el estudio de la respuesta inmunológica a infecciones, el desarrollo de parámetros hemato-inmunológicos para el monitoreo de condiciones de salud y el efecto de sustancias inmunoestimulantes en invertebrados acuáticos, con énfasis en camarones y bivalvos marinos. LUCIANE MARÍA PERAZZOLO Universidad Federal de Santa Catarina (UFSC), Departamento de Biología Celular, Embriología y Genética (BEG), Laboratorio de Inmunología Aplicada à la Acuicultura (LIAA), Florianópolis, SC, Brasil luciane@ccb.ufsc.br Maestría en Inmulogía de Crustáceos y Doctorado en Vitelogénesis de Peces. Profesora Asociada de Biología Celular, con participación en el programa de Postgrado en Acuicultura. Investigadora en el área de inmunologia de crustáceos de interés para la acuicultura, con implicaciones en la sanidad. Sus principales trabajos de investigación están enfocados en el estudio de la respuesta inmunológica a las infecciones, caracterización bioquímica y molecular de proteínas inmunes efectoras y/o reguladoras, el desarrollo de parámetros hemato-inmunológicos para el monitoreo de las condiciones de salud y el efecto de sustancias inmunoestimulantes en camarones. xiii

16 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos RAFAEL DIEGO ROSA Universidad Federal de Santa Catarina (UFSC), Departamento de Biología Celular, Embriología y Genética (BEG), Laboratorio de Inmunología Aplicada a la Acuicultura (LIAA), Florianópolis, SC, Brasil rddr@gmail.com Maestría en Biotecnología aplicada a la acuicultura y Licenciatura en Ciencias Biológicas. Sus principales trabajos de investigación están enfocados en la inmunología de crustáceos y moluscos bivalvos, en especial en los péptidos antimicrobianos producidos por estos animales. ALITIENE MOURA LEMOS PEREIRA Embrapa Meio-Norte, Parnaíba, PI, Brasil, alitiene@cpamn.embrapa.br Tecnóloga en Acuicultura, con Maestría y Doctorado en Acuicultura. Investigadora de la Empresa Brasileña de Investigación Agropecuaria (Embrapa). Coordinadora del Núcleo de Investigación en Pesca y Acuicultura da Embrapa Meio-Norte. Responsable por el Laboratorio de Patología de Organismos Acuáticos (LAPOAq). Participa de La Red de Investigación en Camaronicultura del Nordeste (RECARCINE), grupo enfermedades. Responsable por proyectos en patología, diagnóstico y monitoreo sanitario de camarones cultivados. EMIKO SHINOZAKI MENDES Universidade Fed. Rural de Pernambuco, Recife, PE, Brasil esmendes@dmv.ufrpe.br Médica Veterinaria, con Maestría en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Doctorado en enfermedades tropicales. Profesor Asociado del Departamento de Medicina Veterinária, y en los programas de pós-grado en Veterinária y de los Recursos Pesqueros y Acuicultura, ambos de la Universidad Federal Rural de Pernambuco. Responsable por el Laboratorio de la Salud de los Animales Acuáticos (LASAq) y Coordinadora actual de la Red de la Investigación en Camaronicultura del Nordeste (RECARCINE), grupo enfermedades, actuando principalmente en el área de la microbiología. TEREZA CRISTINA VASCONCELOS GESTEIRA Universidade Fed. do Ceará, LABOMAR, CE, Brasil cgesteira@labomar.ufc.br Bióloga con maestría en Zoología por la Universidad Federal de Rio de Janeiro y PhD en Biología por la Universidad de New Brunswick Canadá. Trabaja en el área de histología y en histopatología de camarones peneídos. Realiza investigaciones en el área de patologías de crustáceos marinos. Es responsable por la cátedra de Patología de Organismos Marinos y Estuarinos y directora de postgrado a nivel de maestría en el Curso de Ciencias Marinas Tropicales. Es miembro activo de la World Aquaculture Society (WAS) del Consejo Regional de Biología y de la Asociación Brasileña de Patología de Organismos Acuáticos (ABRAPOA).Participa de la Red de Camarones Marinos del Nordeste RECARCINE, subred Enfermedades. xiv

17 Capítulo 1 Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo

18

19 Capítulo 1 Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo Jorge Cuéllar-Anjel Director del Departamento de Patología e Investigación Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO) Coclé, Panamá Introducción Con base en las principales técnicas utilizadas en la actualidad para determinar enfermedades en camarones, la siguiente lista presenta los pasos básicos y métodos que sirven como herramienta para realizar diagnósticos y detectar agentes etiológicos en estos crustáceos de gran importancia comercial en la economía mundial. Aunque algunos de estos procedimientos pueden ser realizados por los mismos productores en deben ser hechos por profesionales en sanidad acuícola o por Médicos Veterinarios especialistas. Se debe recordar siempre que el diagnóstico no consiste en una prueba de laboratorio como tal, sino en la interpretación que hace el especialista con base en sus conocimientos y en la información recopilada de las pruebas de campo y de laboratorio. serán mencionadas a lo largo del texto para facilitar la lectura de los diferentes temas. A Pasos para el diagnóstico: oscuro, con montajes en fresco de tejidos teñidos o sin coloraciones, barridos o montajes en fresco de tiras fecales) sedimento y otros organismos acuáticos) anticuerpos policlonales (PAbs por sus siglas en inglés) o anticuerpos monoclonales (MAbs por sus siglas en inglés) - Sondas de ADN en pruebas de hibridación dot blot directamente con muestras frescas de tejido o con ADN extraído in situ con cortes

20 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos altamente susceptibles (estadios del animal o especies) como indicadores de la presencia del patógeno 1.1 Anamnesis diagnóstico de una enfermedad en una población de camarones, debe incluir una visita Durante esta visita, el técnico debe recopilar la información histórica previa a instalaciones, presencia de animales foráneos al sistema como perros, aves, roedores o vacas, alteraciones en el régimen y tipo/calidad del alimento suministrado, cambios en los procedimientos o tipos de fertilizantes, uso de productos químicos o biológicos en el cultivo afectado, existencia de brotes similares con anterioridad en dicha empresa o en otras conocidas y, toda aquella información pasada o presente relacionada directa o indirectamente con la población en cuestión. Debe llevarse un registro de esta información obtenida en la empresa, para estudios de correlación con los hallazgos obtenidos en el examen clínico y en las pruebas de laboratorio complementarias que se harán luego de la visita de campo. 1.2 Examen clínico Cuando se trate de un brote de una enfermedad, durante la visita a las instalaciones deben evaluarse las unidades de producción (tanques o estanques) que presenten problemas. Se deben realizar capturas de camarones in situ y hacer una revisión individual de animales, para formarse una idea aproximada de la proporción del problema: qué tanta población está afectada (prevalencia en %), grado de severidad de las afecciones observadas en los organismos enfermos y qué tipo de enfermedad puede estar causando el brote. los camarones que sean revisados, los cuales no deben ser capturados al azar, sino seleccionados por presentar alguna manifestación de enfermedad. Con base en los hallazgos de esta valoración clínica, es factible en algunos casos hacer un diagnóstico de enfermedades, está afectado por la habilidad de reconocer camarones enfermos en exámenes generales, la naturaleza del problema presente y por la experiencia del profesional especialista en sanidad acuícola. Cuando se eligen camarones que presenten La captura o colección de camarones para realizar un examen que busca determinar la presencia de enfermedad, debe realizarse procurando el mínimo de estrés durante la manipulación de los animales. 2

21 Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo Si el examen clínico debe ser realizado en un lugar diferente al de la captura y los camarones deben ser transportados hacia otra parte, la movilización debe hacerse en recipientes con agua del mismo estanque, limpia (sin lodo ni trozos de vegetales), con adecuada aireación y teniendo una densidad baja (para evitar el estrés). Si los camarones van a permanecer un período de tiempo en el recipiente antes de ser examinados, deben tener buena aireación y, en lo posible, se debe bajar la temperatura a 25-27ºC mediante la adición de bolsas con hielo (selladas). animales moribundos, descoloridos, con comportamiento anormal o que presenten otras anormalidades macroscópicas con las cuales se sospeche de una enfermedad. Las principales observaciones que se deben realizar en camarones enfermos durante una valoración clínica, son las siguientes: o estanques, las siguientes son observaciones frecuentes en camarones enfermos: Cuando se realicen muestreos aleatorios intencionales para estimar la prevalencia de una enfermedad en una población, los camarones deben ser tomados al azar (no Pantoja. 3

22 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos MÉTODO DE EXAMEN CLÍNICO de cultivo mediante el uso de una atarraya, para ser sometidos a un examen clínico. P. vannamei sanos, enfermos y muertos observados en un recipiente de fondo blanco, después de su captura en un estanque de cultivo. Se observan algunos camarones muertos sin apéndices (pereiópodos o pleópodos), debido a que han sido canibalizados por otros camarones. P. vannamei que están siendo observados luego de haber sido capturados en un estanque de cultivo, durante caso de estos 5 camarones, no se observan manifestaciones clínicas de enfermedad. 4

23 Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo 1.3 Microscopía Directa (Análisis en fresco) contenido gástrico. Para una evaluación sanitaria con microscopía directa, deben examinarse las muestras lo más pronto posible después del muestreo y después de la preparación del montaje en un portaobjetos. Se deben utilizar organismos vivos siempre que sea posible, o usar muertos frescos que han sido mantenidos en frío (refrigerados o enhielados), o camarones vivos. Si se puede contar con un laboratorio de campo adecuado, debe usarse para procesar y examinar las muestras lo más cerca del sitio de muestreo. Una aplicación importante del método de microscopía, es el examen del contenido al azar en una población determinada (estanque o tanque). Se extrae cuidadosamente el estómago luego de hacer una disección del mismo utilizando tijeras y pinzas pequeñas. Se realiza una incisión por la línea media con las tijeras y se extrae el equivalente a una gota de contenido gástrico. Se ubica sobre una lámina portaobjetos y se añade una gota de solución salina. Se coloca luego una lámina cubreobjetos y se hace presión con la Se observa luego la muestra bajo el microscopio utilizando los objetivos de 4X zooplancton, sedimento y otros componentes que se observen. Se promedian los porcentajes estimados en los 10 camarones para cada una de estas observaciones y se afectando el crecimiento, así como realizar correctivos en la dieta de los animales. Los detalles relacionados con la técnica de montajes en fresco, son estudiados más 5

24 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos MÉTODO DE MICROSCOPÍA (Montajes en fresco) P. vannamei bajo observación durante un examen clínico. Nótese la presencia de una zona oscura en la parte media del cefalotórax y superior de las branquias abdominal puede deberse al tiempo que han estado fuera del agua (estrés por hipoxia). No se observan manifestaciones adicionales de enfermedad. P. vannamei en el cual se está levantando la cutícula posterior del cefalotórax, para extraer muestras del hepatopáncreas, las branquias y heces del intestino medio, a partir de las cuales se va a preparar un montaje en fresco. de un camarón P. vannamei en donde ya se han colocado bajo el cubreobjetos muestras de hepatopáncreas (izquierda) y branquias (centro). Las heces están siendo extraídas del intestino medio con la ayuda del borde de unas tijeras. 6

25 Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo MÉTODOS DE MICROSCOPÍA (Montajes en fresco) camarón subadulto P. vannamei preparada mediante un montaje en fresco. Se observa gran cantidad de vacuolas lipídicas (reservas de grasa) de colores amarillo y gris y con tamaños proceso de melanización (color marrón) de un una forma alargada siendo más ancho hacia la P. vannamei preparada mediante un montaje en fresco. Se observan 2 lamelas branquiales bifurcadas en su extremo (superior), las cuales presentan melanización de origen tóxico. Sin una muestra de heces de un camarón subadulto P. vannamei. Se observan dos trofozoitos de gregarina Nematopsis sp., uno de ellos con el células (centro), respectivamente. Se puede diferenciar la célula anterior (protomerito) y la célula posterior (deutomerito). Sin tinción. 7

26 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos MÉTODO DE MICROSCOPÍA DIRECTA partir de heces de una postlarva (pl-10) de P. vannamei, en la que se observan trofozoitos de la gregarina Paraophioidina sp. (probablemente P. scolecoides). Cada trofozoito está compuesto parásito tiene la particularidad de formar grupos en los cuales varios organismos se adhieren a 1.4 Montajes en fresco (María Soledad Morales-Covarrubias) Introducción de la enfermedad. Con el diagnóstico aumenta la probabilidad de un control efectivo cuando se determina la causa exacta y se relaciona con sus factores contribuyentes efectivos. Sin embargo, debemos aceptar que el conocimiento de la salud y la enfermedad varía en diferentes animales acuáticos, incluidos los camarones y que en las granjas camaroneras y laboratorios aparecen nuevas enfermedades. Por tanto, en una situación particular, la precisión esperada y la calidad de un diagnóstico pueden ser directamente afectadas por el conocimiento disponible respecto a enfermedades de camarones, por el entrenamiento y experiencia de la persona encargada de realizar el diagnóstico, así como por las prácticas de manejo en los sistemas de cultivo. Uno de los objetivos principales en el diagnóstico de una enfermedad de un animal etiológicos de la enfermedad se realiza (o debería realizarse) mediante la aplicación de de camarones (para buscar bacterias, hongos, protozoarios, metazoarios e inclusiones de rickettsias y virus) a través de microscopía de luz e histopatología (respuesta del etiológicos, los cuales conllevan a determinar la causa de enfermedades en camarones. Los agentes patógenos se encuentran en el ambiente en forma natural y el medio acuático no es la excepción. Muchos de ellos son oportunistas; es decir que mientras los camarones se encuentren sanos y las condiciones de los parámetros de cultivo no 8

27 Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo organismos se encuentren enfermos. La gravedad dependerá del nivel de incidencia, de la prevalencia, tipo de patógeno, de su virulencia, de su patogenicidad, de la especie cultivada, de la genética de la misma (ciclo cerrado o silvestres) y el nivel de estrés de los camarones al momento de estar expuestos al patógeno. donde no existían y que en algunos casos se diseminan a las poblaciones silvestres. Análisis en fresco los organismos y realizar diagnósticos presuntivos en laboratorio y campo. Consiste en la disección del camarón en todos sus estadios, para observar las alteraciones y patógenos que presenten sus órganos y tejidos. La capacitación para este tipo de análisis consta de un corto entrenamiento básico que profesionales (biólogos, ingenieros en acuicultura, médicos veterinarios etc.) pueden recibir en una granja o laboratorio. Para realizar el diagnóstico del estado de salud de una población se requiere de la selección y toma adecuada de la muestra, la cual es elegida de acuerdo al estado de salud de los organismos o a la sospecha de alguna enfermedad. La intensidad del muestreo información, de la historia de la granja, del origen de los organismos y de la densidad de organismos sembrados en el cultivo. Por lo tanto para una buena selección se tiene que tomar en cuenta lo siguiente: Muestreo aleatorio. Cuando solamente se quiere determinar el estado de salud o para buscar la prevalencia de patógenos, se toman los organismos y estanques al azar, lo cual que de existir una infección, ésta se incluirá en la muestra y para la prevalencia su aireación, procurando crearles el menor estrés posible y se trasladan de inmediato al laboratorio para su posterior análisis. Muestreo no aleatorio muestreo se realiza cuando se tiene la sospecha de la presencia en el estanque, de alguna enfermedad o síndrome. Se seleccionan por lo menos 10 organismos que presenten señales clínicas tales como: decoloración, melanización y necrosis en la cutícula, así como anorexia (falta de apetito), letargia (reducción de la actividad normal), coloración rojiza de los pleópodos y telson o cualquier otra alteración que se observe en ellos. Los organismos con estas características generalmente se encuentran en la compuerta de Las muestras deben procesarse inmediatamente, de acuerdo al procedimiento o procedimientos que se hayan elegido para la detección del agente causal de la enfermedad. Los organismos deben ser enviados vivos a los laboratorios de diagnóstico. 9

28 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos donde se observan las cuatro áreas diferentes para la toma de organismos en muestreo al azar. donde se observa la compuerta de salida para la toma de organismos en muestreo no aleatorio. Tabla 1. Selección del tamaño de muestra y cálculo del porcentaje de prevalencia de un patógeno la población 2% 5% 10% 20% 40% 50% , , , , , >/= 10,

29 Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo Para la realización del análisis en fresco, se requiere contar con espacio limpio en donde se tenga el siguiente material: Portaobjetos Cubreobjetos Navajas de disección Pinzas de disección Cajas de petri Pizetas Guantes Xileno Contenedores para muestras Manuales Desarrollo de la técnica: Los organismos se miden y pesan para obtener el peso y tamaño promedio. y en el sexto segmento abdominal, como cutícula delgada (o suave), epicomensales, decoloración, coloración rojiza, melanización, ampollas y necrosis de cutícula porciones se colocan individualmente en portaobjetos limpios (no mezclar porciones), se les adiciona unas gotas de agua de mar estéril y se pone el cubreobjetos; debe procurarse que en la muestra no se formen burbujas que puedan interferir (para ello hay que realizar una leve presión sobre el cubreobjetos con la pinza de disección). Las muestras que se tomarán son: Branquias: Se toma una pequeña porción y se coloca en el portaobjetos para buscar: cambios Zoothamnium Epistylis sp, Acineta, Ascophris, Bodo Leucothrix mucor y Flexibacter sp), detritus del fondo de los estanques, restos de microalgas, hongos, bacterias, melanizaciones y deformaciones. Para detectar cuerpos de inclusión viral en 11

30 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos Hepatopáncreas: se elimina todo el exoesqueleto del cefalotórax para descubrir el (aumento de tamaño) del órgano. Con unas pinzas, se retira la membrana que cubre lista para ser analizada. Zoothamnium sp. 12

31 Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo el hepatopáncreas y con un bisturí se parte por la mitad para observar la coloración se coloca en un portaobjetos para buscar: Baculovirus penaei, Monodon baculovirus, gregarinas (trofozoitos y sicigias), bacterias, deformación tubular, nódulos hemocíticos, Intestino: el abdomen, se separa del cefalotórax, del telson y de los urópodos para facilitar la extracción del intestino. Por la parte posterior se localiza el intestino (que coloca en el portaobjetos, procurando extenderlo. Luego se vierten unas gotas de agua cuerpos de oclusión de Baculovirus penaei y Monodon baculovirus. Músculo y gónadas: (especialmente, aquel tejido que muestre opacidad de tipo lechoso). Se coloca en un estos órganos y tejidos fueron parasitados se deben observar masas de esporas de tamaño y forma uniformes. Las muestras ya preparadas se analizan en el microscopio, iniciando con el objetivo primera muestra que se analiza es la del hepatopáncreas; después se estudia la muestra creas expuesto para tomar pequeña porción para su análisis. 13

32 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos adheridas al epitelio y en el lumen del intestino. observan las cápsulas de Ameson nelsoni. 14

33 Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo Tabla 2. Formato de reporte para el análisis en fresco. No Procedecia. No. de muertos. No. de examinados. Peso promedio. Actividad de los camarones Contenido del intestino Presencia de heces en forma de cadena o discontinua coloración Presencia de epibiontes, bacterias y hongos en el camarón Deformidades en el rostrum, antenas abdomen, telson, urópodos y pleópodos Apéndices rotos Melanización (color café claro) Presencia de gregarinas en todos sus estadíos Coloración anormal Características de la cutícula Presencia de masa de bacterias y cantidad de lípidos Coloración Presencia de gregarinas en todos sus estadíos. Presencia de epibiontes Masas melanizadas de hemocitos Nódulos de bacterias en las lámelas branquiales Micosis (hifas, conidios) MÚSCULO Cuerpos de inclusión de WSSV Materia orgánica Color Presencia de melanización y necrosis Microsporidios Síndrome del encalambramiento 15

34 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos Tabla 3. Guía general para dar un valor numérico cualitativo de grado de severidad a la infección, infestación y síndrome (Lightner, 1996). GRADO DE SEVERIDAD SIGNOS CLÍNICOS No presentan signos de infección por el agente patógeno, parásito o epicomensal. No presentan lesiones características de síndromes. encuentra justo arriba del límite normal. Se observan muy pocas lesiones características del síndrome. Se observa la presencia baja y moderada del patógeno, parásito o epicomensal. Se observan lesiones ligeras o moderadas, características del síndrome. Incremento en la mortalidad si no se aplica tratamiento (cuando existe tratamiento). Se observa la presencia moderada del patógeno, parásito o epicomensal. Se observan lesiones moderadas a severas, características del síndrome. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento (cuando existe tratamiento). Se observa gran cantidad del patógeno, parásito o epicomensal. Se observan severas lesiones características del síndrome. Muy letal con altas mortalidades. Tabla 4. Guía para dar un valor numérico cualitativo de grado de severidad a la deformación tubular en hepatopáncreas con análisis en fresco (Morales-Covarrubias, 2004). GRADO DE SEVERIDAD SIGNOS CLÍNICOS No presentan signos de deformación tubular (0). No presentan lesiones características de síndromes. Presencia muy baja de deformación tubular (1-5/campo/organismo). Se observan muy poco desprendimiento celular. campo/organismo). Presencia de hemocitos y formación de nódulos hemocíticos. Se observa mortalidad si no se aplica tratamiento. Se observa la presencia alta de deformación tubular (11-20/ campo/organismo). Se observan lesiones moderadas a severas, formación de nódulos hemocíticos. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento. organismo). Se observan severas lesiones como melanización, hemolíticos y presencia de granulomas. Muy letal con altas mortalidades. 16

35 Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo infestación por gregarinas utilizando análisis en fresco. GRADO DE SEVERIDAD SIGNOS CLÍNICOS No presentan signos de infección por el parásito (0). No presentan lesiones causadas por el parasitismo. Presencia muy baja del parásito (1-15/intestino/organismo). Se observan muy pocas lesiones causadas por el parasitismo como ganismo). Se observa un incremento en las lesiones causadas por los hemocítico Se observa mortalidad si no se aplica tratamiento. Se observa la presencia alta del parásito (51-100/intestino/organismo). Se observan lesiones moderadas a severas causadas por mecanizadas y formación de nódulos hemocíticos. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento. Se observa gran cantidad del parásito (mas de 100/intestino/organismo). Se observan severas lesiones causadas por el parasitismo Muy letal con altas mortalidades. Tabla 6. Guía para dar un valor numérico cualitativo de grado de severidad a la infestación por epicomensales en lamelas branquiales. GRADO DE SEVERIDAD SIGNOS CLÍNICOS No presentan signos de infección por protozoario (0). No presentan lesiones causadas por epicomensales. Presencia muy baja de protozoarios (1-5/lámela/organismo). Se observan muy pocas lesiones causadas por los epicomensales, organismo). Se observa un incremento en las lesiones causadas de n odulos hemocíticos. Se observa mortalidad si no se toman las medidas de corrección. Se observa la presencia alta de protozoarios (10-20/lámela/organismo). Se observan lesiones moderadas a severas causadas por los mecanizadas y formación de nódulos hemocíticos. Potencialmente letal si no se toman medidas de corrección Se observa gran cantidad del parásito (mas de 20). Se observan tración hemocítica, melanización multifocal y necrosis. Muy letal con altas mortalidades. 17

36 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos Objetivo. tipo de las bacterias presentes en la hemolinfa, otros tejidos o larvas y postlarvas, así como en agua para / de cultivo. Descripción. La bacteriología es un conjunto de métodos que se utiliza como apoyo en el diagnóstico de enfermedades en camarones, cuando se sospecha que la causa de la enfermedad está relacionada con presencia de bacterias patógenas en el agua de cultivo o dentro del organismo de los animales. Consiste en la siembra de muestras en diferentes medios de cultivo, para determinar si hay crecimiento o no de bacterias potencialmente patógenas. Metodología. dependerá de si la captura es aleatoria o, de si se escogen sólo animales enfermos para de muestreo). Los camarones que se van a someter a pruebas de bacteriología, deben estar siempre vivos; no debe realizarse ninguna prueba bacteriológica con camarones muertos, debido a que los resultados estarán sesgados por los cambios autolíticos (postmortem), con los cuales se alteran las poblaciones bacterianas presentes en los tejidos, así como su crecimiento. Antes de iniciar cualquier procedimiento bacteriológico, se deben tener previamente 15 libras de presión (121 C) durante quince minutos. Las asas de platino se esterilizan hipoclorito de sodio concentrado por 5 minutos. Posteriormente se lava con agua estéril hasta que desaparezca el olor producido por el hipoclorito. La toma de muestra para análisis bacteriológico tanto de agua de transporte de nauplios como de los mismos nauplios, se debe realizar, si es posible, en el momento de recibir los animales y directamente en las bolsas o cajas de transporte. La toma de muestra de agua en tanques de larvicultura, se debe realizar al menos en 2 puntos: la entrada del tanque y en el centro del mismo. colador pequeño de cocina, previamente desinfectado con yodo, formalina o etanol 70%. Las muestras deben ser luego maceradas en un recipiente esterilizado y agregando una cantidad conocida (en ml) de agua de mar estéril o solución salina estéril para la dilución del macerado. desinfectar el área de punción (seno cardíaco dorsal o seno hemolinfático ventral ) con trozos de algodón impregnado con etanol 70%. Con una aguja de insulina (1 ml) nueva y estéril que tenga aguja hipodérmica (muy delgada), se extraen al menos 100 μl 18

37 Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo de la jeringa se debe considerar antes de emitir los resultados de los conteos bacterianos (anticoagulada o no) o agua de cuerpos de agua en estudio, se deben sembrar 100 selectivo principalmente para bacterias marinas de la familia Vibrionaceae (género Vibrio), aunque también crecen especies bacterianas de los géneros Pseudomonas, Plesiomonas, Aeromonas, Flavobacterium y enterobacterias, entre otras. Para cultivos tripticasa soya) y Agar Marino. Una vez se inoculan los 100 μl de muestra sobre el agar elegido y en condiciones extiende circularmente mediante el uso de un asa de Drigalski (varilla de vidrio tipo Seguidamente se invierte la caja de Petri y se incuba de esta manera a una temperatura o se realiza un extendido de una colonia representativa sobre una lámina portaobjetos, habiéndola diluido antes en solución salina estéril hasta obtener un grado de 0.5 en la del género Vibrio se observarán como bacilos Gram negativos bipolares. cual existen métodos de observación directa (a trasluz) o utilizando un equipo especial Si las bacterias aisladas sugieren ser la causa de una enfermedad en los camarones (bacteriosis), se realizan pruebas de sensibilidad a antibióticos (antibiogramas), para establecer qué productos antibacterianos comerciales son capaces de eliminar dichas bacterias aisladas. Una vez determinado el antibiótico más efectivo, se puede realizar una prueba para medir la concentración mínima inhibitoria (MIC) de dicho antibiótico, referencia para la medicación de la población afectada de camarones. 19

38 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos MÉTODO DE BACTERIOLOGÍA utilizada durante la siembra de muestras de camarones, agua o sedimento en medios de cultivo, para evitar la contaminación con bacterias presentes tos equipos están dotados con entradas de agua, gas y sistemas de vacío, así como luz blanca y luz ultravioleta. utilizado para esterilizar elementos, materiales y reactivos que se utilizan presión producida por vapor de agua, lo que eleva la temperatura a 121ºC, a la cual se exponen los materiales por 15 minutos. 20

39 Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo MÉTODO DE BACTERIOLOGÍA anticoagulada de un camarón P. vannamei en alcohol cerca del medio de cultivo, para procurar tener un ambiente estéril alrededor de la zona una micropipeta graduada volumétricamente, será esparcido por todo el medio utilizando una el cual se observa crecimiento de bacterias Sucrosa positiva (colonias amarillas). La muestra pertenece a hemolinfa de un camarón P. vannamei y fue incubada durante 24 horas a de las bacterias predominantes. colonias en los platos Petri donde se presentan crecimientos bacterianos. Cada colonia procede de una bacteria, la cual constituye una unidad 21

40 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos 1.6 Histología Objetivo cambios a nivel celular en cortes de tejidos que han sido sometidos a procesos físicos bajo crecimiento, alteraciones de comportamiento y otros aspectos durante el cultivo reproductores. Descripción de la enfermedad de la población de camarones bajo estudio; se logra generalmente hacer el diagnóstico de todas las enfermedades virales reportadas en camarones (por nemátodos, enteritis hemocítica y necrosis muscular idiopática, entre otras enfermedades. Para esto, se requiere que las láminas histológicas sean perfectamente preparadas y examinadas bajo el microscopio por el ojo de un patólogo entrenado. La autolisis es un proceso post-mortem que se presenta en los crustáceos extremadamente rápido y que consiste en la ruptura celular, salida de enzimas y componentes celulares, pérdida de la arquitectura de los tejidos y destrucción de los y por la inmersión en el mismo, el cual debe ofrecer una rápida penetración en los la solución debe penetrar el órgano rápidamente o los cambios post-mortem conducirán a la pérdida de estructuras tisulares, eliminando zonas de tejido importantes para el diagnóstico. Si existe interés en estudiar problemas de morfología externa en camarones como es el caso de deformidades en post-larvas o presencia de epibiontes (epicomensales) adheridos a las branquias, también se obtienen buenos resultados si los animales son Metodología para los procedimientos de rutina, cuando se van a preparar muestras de camarones 22

41 Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo Para la realización de un estudio histológico en camarones, se requiere de un obtener láminas de óptima calidad, las cuales permitan nitidez óptica en la organización celular de los tejidos, cuando sean estudiados bajo el microscopio. Fijación. Corresponde a la preservación de los tejidos en las mismas condiciones estructurales y morfológicas del momento de la muerte del camarón, lo cual como ya se ser sustituido completamente por etanol 70%, el cual deberá reemplazarse a los 15 días Consiste en eliminar la mayor parte del agua 12 recipientes estando 1 hora en cada uno, los cuales contienen etanol 70% (2), etanol Bloqueo. bloque. Los moldes plásticos disponibles para bloqueo, permiten además servir como base para el montaje de los tejidos en la unidad de corte (micrótomo). Corte. de tejido con un espesor de 1 a 15 micras. Luego de ajustar el grosor deseado en este equipo, se realizan los cortes mediante giros de una manivela y cada vez que se le da Recuperación del corte. agua moderadamente caliente con temperatura controlada (40-50ºC aprox.), la cual puede contener una pequeña concentración de gelatina neutra. Las tiras se expanden al entrar en contacto con el agua caliente y así se elige la que presente una estructura más completa del tejido en cuestión. Separada de los segmentos no deseados mediante el uso de un pincel delgado, la porción seleccionada es recuperada con una lámina 23