CÁTEDRA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA I INSTITUTO DE BIOQUÍMICA APLICADA FACULTAD DE BIOQUÍMICA, QUÍMICA Y FARMACIA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN

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1 2017 Prof. Titular Dra. Blanca Alicia Issé de Gómez Prof. Asociada Dra. Sandra Stella Lazarte Prof. Adjunta Dra. Gladis Susana Alvarez Prof. Adjunta Dra. Ana Cecilia Haro JTP Bioq. Esp. Emilse Ledesma Achem JTP Dra. María Hortensia Zelaya Aux. 1 a Categoría Bioq. Magdalena Terán CÁTEDRA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA I INSTITUTO DE BIOQUÍMICA APLICADA FACULTAD DE BIOQUÍMICA, QUÍMICA Y FARMACIA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN Balcarce 747. San Miguel de Tucumán. CP Teléfono

2 1 Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia Universidad Nacional de Tucumán GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Nº 1 Etapas preanalítica, analítica y post- analítica- Obtención de sangre Anticoagulantes - Hemograma- Recuento de leucocitos - Extendidos y coloraciones - Microscopía

3 2 BIOSEGURIDAD INTRODUCCION La palabra Bioseguridad deriva de seguro que, en su primera acepción, significa libre y exento de todo peligro, daño o riesgo; al anteponer el prefijo bio y construir bioseguridad evocamos inmediatamente el concepto de protección de la vida. Con fines prácticos se define Bioseguridad como la disciplina que se encarga de prevenir accidentes en aquellos procesos en que está involucrado material biológico. Incluye, por lo tanto todas las medidas y controles destinados a disminuir el riesgo de exposición a diversos agentes infecciosos patógenos, en un lugar donde se realiza atención o cuidado de pacientes o en un laboratorio. Se entiende por material biológico al conjunto de materia orgánica (sangre, exudados, tejidos, líquidos corporales, etc.) o materiales inorgánicos (gasas, jeringas, etc.) que potencialmente pueden estar contaminados con agentes biológicos patógenos. La regla de oro en bioseguridad es la siguiente: TODO MATERIAL DE ORIGEN HUMANO DEBE SER CONSIDERADO CAPAZ DE TRANSMITIR INFECCION. Por lo tanto las normas de bioseguridad deben implementarse en forma permanente y universal. MODOS DE INFECCION MÁS FRECUENTE 1. Auto-inoculación accidental debida a pinchazos o cortes con agujas, pipetas, bisturíes u otros elementos punzantes. 2. Exposición de la piel o mucosas a sangre, hemoderivados u otros fluidos biológicos contaminados especialmente cuando la permeabilidad de las mismas se encuentra alterada por heridas, escoriaciones, eczemas, etc. 3. Inhalación de aerosoles producidos al agitar muestras, al destapar tubos, al expulsar la última gota de una pipeta, durante la centrifugación, especialmente cuando se emplean tubos abiertos o con mayor volumen del aconsejado por el fabricante o cuando ésta es frenada abruptamente para ganar tiempo. 4. Salpicaduras en los ojos o aspiración bucal. RECOMENDACIONES GENERALES 1. La extracción de sangre debe hacerse siempre con guantes de látex, las agujas deben descartarse en un recipiente resistente a punciones y las jeringas se deben depositar en solución descontaminante. Bajo ningún concepto las agujas serán retapadas, rotas o dobladas. 2. No se permitirá comer, beber, fumar y/o almacenar comidas así como el uso de cualquier otro ítem personal (cosméticos, lentes de contacto) dentro del área de trabajo. 3. Usar uniforme dentro del laboratorio, el cual deberá quitarse inmediatamente antes de abandonar el área de trabajo.

4 3 4. Usar guantes de látex para todo manejo de material biológico. Cambiar los mismos cuando hayan sido contaminados, lavarse las manos y ponerse guantes limpios. 5. Bajo ninguna circunstancia se pipeteará sustancia alguna con la boca, para ello usar propipetas. 6. Las superficies del área de trabajo deberán ser descontaminadas cuando se termine la tarea diaria. 7. Todos los materiales usados en el laboratorio deberán ser adecuadamente descontaminados. Dichos elementos serán posteriormente desechados o lavados, secados y/o esterilizados según los requisitos que deba reunir su reutilización. 8. El desecho de los fluidos orgánicos puede efectuarse por las cañerías habituales una vez que estos hayan sido convenientemente descontaminados. 9. Lavar las manos con jabón (líquido o sólido suspendido) y agua inmediatamente después que el trabajo haya sido terminado. 10.Informe inmediatamente a su superior de cualquier accidente ocasionado con elementos del laboratorio. NOTA: La solución descontaminante recomendada por excelencia es el hipoclorito de sodio. Se usa la misma en una dilución al 1% para la descontaminación de superficies, mesadas, pisos, etc. Para todo material de vidrio y descartable que contenga material biológico se usa hipoclorito de sodio al 10%. RIESGO OCUPACIONAL DE EXPOSICIÓN A SANGRE O FLUIDOS CORPORALES Actualmente, las enfermedades infecciosas más importantes y a las que durante su práctica diaria se ven expuestos los trabajadores sanitarios con mayor frecuencia son las de etiología vírica. Entre ellas se destaca el virus de la hepatitis (HBV), hepatitis C (HCV) y el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). El riesgo de transmisión después de exposición a sangre infectada con virus de hepatitis es Hepatitis B : 30% Hepatitis C : 4% Existen vacunas para prevenir la infección por HBV, no así por HCV. El riesgo de transmisión de HIV después de exposición a sangre infectada con HIV es de aproximadamente 0,3%. No existen vacunas para prevenir dicha infección. CONCLUSIONES Las prácticas seguras de trabajo son la única protección con que se cuenta por el momento contra el riesgo de infección por HIV. Poner en práctica estas normas significa tomar conciencia que además de nuestra propia salud consideraremos la de los demás. Auto-cuidado es el compromiso de cada individuo o grupo de trabajo de mantener el uso y cumplimiento de las normas de bioseguridad en su labor diaria.

5 4 Se debe recordar que a pesar de la implantación de las precauciones generales los trabajadores de la salud se enfrentan a múltiples maniobras que pueden provocar accidentes, es decir que éstos siempre ocurrirán. Toda exposición ocupacional debe ser considerada una urgencia médica, concerniendo la administración a tiempo de la adecuada profilaxis postexposición a la institución de salud, la cual debe contar con un protocolo a seguir luego de la misma. ETAPAS PRE-ANALÍTICA Y POST-ANALÍTICA DEL ESTUDIO HEMATOLÓGICO La etapa pre-analítica comprende: El pedido del análisis La identificación del paciente (historia clínica, fecha de nacimiento o número de afiliado) El interrogatorio del paciente que permita una mejor interpretación de los resultados (diagnóstico presuntivo, medicación que toma, alimentación, estudios anteriores) La variabilidad intraindividual: las variaciones biológicas no pueden eliminarse porque el paciente es un ser vivo, pero pueden controlarse las causas endógenas (ritmo circadiano de algunos parámetros) y exógenas (ejercicio físico, ingestión de grasas y alcohol, hábito de fumar) de variabilidad estableciendo pautas de horarios, hábitos y dieta, a fin de que los resultados sean comparables La preparación del material para la extracción y recolección de sangre (elección adecuada del anticoagulante, uso de material plástico para estudio de coagulación, material libre de iones para estudio del metabolismo del hierro) La recolección, conservación y/o el transporte de la muestra al laboratorio La etapa post-analítica involucra: Valoración global que permite determinar si ocurrió algún error en el ensayo por problemas técnicos o de calibración que desvía todos los resultados en uno u otro sentido Valoración individual que aprecia la coherencia de los resultados de cada paciente Confección del informe que debe contener lo siguiente: datos del paciente, fecha de la toma de muestra, nombre de la práctica, metodología, valores de referencia con las unidades correspondientes La entrega efectiva del resultado del análisis al médico. Para ello, lo ideal es el uso de un sistema de computadoras, que permita el acceso y la impresión del resultado en el área clínica.

6 5 TOMA DE MUESTRA La muestra de sangre para el estudio hematológico puede ser tomada por medio de punción venosa o capilar. 1. SANGRE VENOSA: Existen precauciones estándares para la recolección de sangre. Ante todo se debe recordar que la sangre es una fuente potencial de infección, particularmente de hepatitis, sífilis y HIV. El lavado de manos es el procedimiento más importante para prevenir la diseminación de las enfermedades infecciosas, el cual debe llevarse a cabo con un jabón no abrasivo y agua corriente cuando se produzca contacto con fluidos biológicos. Si no se dispone de agua pueden utilizarse limpiadores antisépticos. Los guantes son parte fundamental del equipo protector y deben utilizarse cuando se realizan venopunciones. No es necesario que los mismos sean estériles, si el paciente no está inmunocomprometido. El material que se usa en la extracción debe ser estéril y descartable. Antes de iniciar la extracción se debe preparar la orden de ingreso e identificar al paciente, mediante la confirmación de su nombre y número de identificación. Si corresponde, verificar alguna restricción de la dieta. El paciente deberá: a) Tener como mínimo 4 horas de ayuno. b) Estar sentado o acostado; se localiza la vena adecuada para la punción, la cual debe ser palpable. Las venas superficiales de la cara anterior del antebrazo son las más comunes (se usa la mediana cubital, basílica o cefálica). Se aplica la ligadura 7 a 10 cm por encima del sitio de punción, se pide al paciente que cierre la mano, se desinfecta con alcohol y se espera que seque al aire. Se canaliza la vena con la aguja en la misma dirección de ella y el bisel hacia arriba, y se extrae la cantidad necesaria de sangre. Antes de retirar la aguja se indica al paciente que abra la mano y se retira el torniquete. Se coloca un algodón seco (el alcohol produce dolor y puede dañar la pared de la vena). La aguja se debe desechar en un recipiente de paredes rígidas. Luego se procede a cargar y rotular los tubos correspondientes. Los frotis se realizan colocando una gota de sangre en portaobjetos antes de separar la aguja de la jeringa y el extendido se efectúa de inmediato. Si el guante no se ha manchado con sangre se puede reutilizar previo lavado con agua y jabón. 2. SANGRE CAPILAR: es una mezcla de sangre venosa, sangre arterial y líquido tisular. Dado que esta muestra puede generar resultados ligeramente diferentes, debe especificarse la obtención por punción cutánea. Se realiza en el pulpejo del dedo en los adultos o la planta del pie en un lactante (en las regiones laterales). No debe usarse salvo que no se pueda obtener sangre venosa, ya que los resultados pueden ser discrepantes. Por ejemplo no se puede realizar recuento de leucocitos si la piel está fría, ya que puede dar más alto; ni el de plaquetas (da más bajo). Además, el hematocrito puede estar falsamente disminuido por una presión manual exagerada por lo que la sangre debe fluir libremente. Al hacer la punción se debe asegurar que la piel esté tibia y con buena perfusión. Se limpia con alcohol, se deja secar y se punza con lanceta estéril; la sangre se recoge con tubos capilares para el microhematocrito, si se hace fórmula leucocitaria, se deben hacer extendidos en forma inmediata. Recordar que la primera gota debe ser desechada. Para

7 6 estudios cuantitativos como el dosaje de hemoglobina, la sangre debe ser tomada directamente con pipeta. 3. VENOPUNCIÓN EN NIÑOS Y LACTANTES: la flebotomía pediátrica requiere experiencia, destrezas especiales y sensibilidad al tacto. Se necesita capacidad para las relaciones interpersonales, para tratar con los padres angustiados y con niños que lloran, gritan o están asustados. El secreto para una venopunción exitosa es: Sujetar bien al niño! Algunas complicaciones que pueden presentarse luego de la recolección de sangre son las siguientes: equimosis, desmayos, hematomas, petequias, convulsiones, vómitos y alergias. EMPLEO DE ANTICOAGULANTES Los anticoagulantes son sustancias que impiden la formación de coágulos sanguíneos. La sangre se mezcla con el anticoagulante para evitar que los elementos formes queden atrapados en la red de fibrina. En el uso de anticoagulantes debe respetarse estrictamente la proporción entre éstos y la sangre. Un exceso conduce a modificaciones en los elementos sanguíneos, mientras que un defecto llevaría a la formación de microcoágulos haciendo la muestra inadecuada para su estudio. El anticoagulante idóneo debe cumplir los siguientes requisitos: No alterar el volumen de los eritrocitos No producir hemólisis Evitar la agregación de las plaquetas No alterar la morfología leucocitaria Los anticoagulantes de uso más frecuente son: EDTA (sal di o tripotásica del ácido etilendiaminotetraacético): actúa fijando el calcio por formación de un quelato, impidiendo su disponibilidad para iniciar la coagulación sanguínea. El International Council of Standardization in Haematology (ICSH, 1993) recomienda usar la sal dipotásica en una concentración indicada de 1,5 ± 0.25 mg/ml (3,7-5,4µmol) de sangre. En esa misma concentración la sal tripotásica disminuye un 2-3 % el hematocrito y aumenta gradualmente el volumen corpuscular medio con el almacenamiento. Citrato sódico: es un quelante débil de calcio. Es usado en forma líquida, y el indicado para estudios hemostáticos; se recomienda el uso de soluciones de 32 g/l (0,109 M) en una relación 9/1 entre volumen de sangre y anticoagulante. Para la determinación de la eritrosedimentación pueden prepararse soluciones de 38 g/l (0,124 M de C 6 H Na 3.2 H 2 0) y se usa en una proporción de 1/4 (un volumen de citrato y 4 de sangre). Heparina: es un anticoagulante fisiológico, ideal para evitar la coagulación sanguínea in vivo. Actúa como cofactor de la antitrombina III, que es el inhibidor natural de la trombina. Tiene la ventaja de no alterar el volumen eritrocitario. Puede usarse en forma seca o líquida, siendo aconsejable la proporción de UI (0,1-0,2 mg) de heparina por mililitro de sangre. No deben realizarse frotis con esta muestra, ya que produce una coloración azul de fondo. Es el anticoagulante de elección para la realización de la prueba de resistencia osmótica eritrocitaria (ROE). No es recomendado para recuento de leucocitos, ya que produce el agrupamiento de los mismos.

8 7 La sangre anticoagulada se deteriora fácilmente, por lo que entre la extracción y el análisis no deben transcurrir más de 6 horas si es conservada a temperatura ambiente o más de 24 horas a 4ºC. Actualmente, en el mercado se encuentran tubos descartables para la recolección de sangre con sistema de vacío o no, los cuales contienen el anticoagulante en la proporción adecuada para las pruebas que se deseen realizar. Los mismos también están disponibles en presentaciones pediátricas. Casi todas las muestras que se reciben para las pruebas de rutina en la sección de hematología se recolectan en tubos con tapón color lavanda, los que contienen K 2 EDTA como anticoagulante. HEMOGRAMA Hemograma es una nomenclatura creada por Schilling para referirse al recuento diferencial porcentual de los leucocitos. Hoy en día constituye uno de los exámenes de laboratorio más solicitados, y comprende otras determinaciones. Los parámetros que constituyen el hemograma son: Recuento celular (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) Fórmula leucocitaria relativa y absoluta Concentración de hemoglobina Hematocrito Amplitud de distribución eritrocitaria Índices eritrocitarios Indices plaquetarios Observaciones cualitativas MÉTODOS DE RECUENTO CELULAR SANGUÍNEO El recuento celular es la determinación del número de células sanguíneas, eritrocitos, leucocitos, plaquetas y reticulocitos por unidad de volumen sanguíneo. El recuento de plaquetas, eritrocitos y leucocitos puede ser realizado mediante métodos ópticos con cámara cuentaglóbulos y microscopio óptico, o mediante métodos electrónicos. Debe señalarse que el recuento celular sanguíneo en cámara cuentaglóbulos constituye aún el método de referencia internacional de recuento de leucocitos y plaquetas, siempre que se sigan las recomendaciones del ICSH. Para el recuento de eritrocitos el ICSH recomienda como método de referencia el recuento electrónico normalizado. A)- MÉTODOS ÓPTICOS Han constituido, hasta hoy, el método tradicional de recuento celular. Material: 1-Sangre capilar o venosa 2-Líquido de dilución 3-Pipetas automáticas 4-Cámara cuentaglóbulos 5-Microscopio

9 8 El recuento de leucocitos mediante cámara cuentaglóbulos ha quedado limitado hoy en día a situaciones tales como intensas leucopenias o leucocitosis frente a las que el método electrónico pierde fiabilidad. También se utiliza en el recuento de líquidos biológicos (cefalorraquídeo, ascítico, pleural y otros). -Para el recuento de leucocitos, el líquido de dilución empleado es el líquido de Türk: Ácido acético glacial 1 a 3 ml Violeta de genciana o Azul de metileno (sol. acuosa al 1%) 1 ml Agua destilada c.s.p. 100 ml Esta solución tiene por objeto eliminar los hematíes por hemólisis y resaltar ligeramente el núcleo de los leucocitos. La dilución de que habitualmente se realiza es de 1/20, empleándose normalmente 20 μl de sangre en 0,38 ml de líquido de Türk. -El método óptico para recuento de eritrocitos puede considerarse histórico, dado el elevado error que se comete al usar la cámara cuentaglóbulos (aproximadamente un 20%). Hasta la introducción de los métodos electrónicos de recuento celular, la cifra de hematíes carecía de verdadero interés. -Para el recuento de plaquetas, el líquido de dilución empleado es el oxalato de amonio. Cámara cuentaglóbulos-cámara de Neubauer Consisten en un portaobjetos de vidrio grueso (unos 3 mm), que lleva grabado en su superficie tres prismas paralelos de los cuales el central está dividido en dos hemiprismas idénticos y separados por un surco central. Sobre estos últimos, hay trazados sendos retículos para el recuento celular. Los prismas laterales se hallan sobreelevados respecto al central en una altura de 0,1 mm, con lo que, colocando un cubreobjetos especial, queda constituido el espacio en que se colocará la muestra diluida. Cámara de Neubauer El más utilizado es el retículo de Neubauer, que presenta 9 cuadrados grandes de 1 mm 2 de superficie cada uno. Los 4 de las esquinas, destinados al recuento de leucocitos, están divididos en 16 cuadrados medianos cada uno por líneas simples. El retículo central (cuadrado central) que presenta mayor número de líneas de referencia, está destinado al recuento de plaquetas. A nivel del mismo, la intersección de las líneas de referencia delimitan 400 cuadraditos pequeños con una superficie de 1/400 mm 2 cada uno.

10 9 Existen dos tipos de retículo central, el original de Neubauer y el modificado. El retículo original de Neubauer presenta en el cuadrado central 16 cuadrados medianos delimitados por triples líneas, conteniendo cada uno de ellos 16 cuadrados pequeños, lo que hace un total de 256 (16 x 16). Los restantes cuadrados pequeños, ( = 144) se encuentran en las triples líneas delimitantes. El retículo descripto es también llamado retículo de Thoma (Figura N 1). Las cámaras en venta actualmente presentan el retículo de Neubauer modificado, en el retículo central hay 25 cuadrados medianos de 16 cuadrados pequeños cada uno, en total 400 cuadrados pequeños, separados por líneas triples cercanas, que aparecen como líneas gruesas en la Figura 2. El volumen es igual al retículo original, aplicándose el mismo criterio para los cálculos. FIGURA N 1: Retículo de Neubauer original

11 10 FIGURA N 2: Retículo de Nuebauer modificado Sistemática del recuento leucocitario Una vez efectuada la dilución correspondiente, se carga la cámara utilizando una pipeta automática, dejando que el líquido se distribuya por capilaridad. Luego de unos minutos, necesarios para la sedimentación de los leucocitos, se procede al recuento de los que están depositados en los cuatro cuadrantes laterales (superior derecho, superior izquierdo, inferior derecho e inferior izquierdo), usando un objetivo seco (10 ó 40X). Deben contarse las células ubicadas dentro de los 16 cuadrados medianos y las que están sobre las líneas superior y derecha de cada uno de ellos, siguiendo el recorrido que se muestra en el esquema; de esta forma se evita contar dos veces el mismo elemento.

12 11 Cálculo de los resultados El área total de los cuadrados contados es 4 x 1 mm 2 = 4 mm 2 mientras que la altura de la cámara es 0,1 mm. De acuerdo a lo anterior, el volumen en que fueron contados los leucocitos es 4 x 0,1 = 0,4 mm 3. Si en 0,4 mm 3 se contaron A leucocitos, en 1 mm 3 serán A / 0,4 = Nº de leucocitos en 1 mm 3 Este cociente debe ser referido ahora a 1 mm 3 de sangre total, sin dilución, por lo que se multiplicará por el factor de dilución. Finalmente: Nº de leucocitos en 1 mm 3 de sangre = A x 20 = A x 50 0,4 Donde A es el número total de leucocitos contados en cámara. 0,4 mm 3 el volumen en que fueron contados. 20 es el factor de dilución. Nota: 1 mm 3 = 1 µl (microlitro) = 1 x10-6 L El error del recuento de leucocitos por método óptico es aproximadamente del 20%, por la distribución al azar de estos en la cámara, que es inevitable; cuanto mayor sea el número de leucocitos, menor será el error. En casos de recuentos de leucocitos elevados se realizará una dilución mayor y en casos de recuentos bajos, una dilución menor para disminuir el error. La presencia de eritroblastos interfiere en el recuento manual y automatizado de leucocitos, debido a que los mismos no son lisados por los líquidos de dilución. Si en la observación del frotis saguíneo, se encuentran eritroblastos, se procede a contar su número con respecto a 100 leucocitos. Luego se corrige el recuento de leucocitos con la siguiente fórmula: Leucocitos reales = Leucocitos contados x 100 (Eritroblastos + 100) Ejemplo: Recuento GB: 10 x 10 9 /L Eritroblastos: 15 cada 100 leucocitos Leucocitos reales = 10x10 9 /L x 100 = 8,7x10 9 /L ( ) Causas de error al realizar el recuento celular mediante cámara 1- Pipetas mal calibradas, sucias o húmedas. 2- Llenado incompleto o deficiente de la pipeta (presencia de burbujas). 3- Insuficiente homogeneización de la sangre diluida o escaso tiempo de espera antes de cargar la cámara. 4- No desechar las primeras gotas antes de cargar la cámara. 5- Cámara mal ajustada, sucia o mojada. 6- Llenado incompleto o deficiente de la cámara. 7- Células mal distribuidas en el fondo de la cámara. La diferencia en el recuento entre los cuadrantes no debe ser superior a 5 elementos.

13 12 8- Recuento de un número insuficiente de células. 9- Errores al realizar el recuento. 10-Errores al efectuar los cálculos. 11-Uso de cubreobjetos deformable, no rígido. B)- RECUENTO CELULAR AUTOMATIZADO El sistema de recuento celular sanguíneo electrónico se basa en la medida del tamaño u otras propiedades físicas de las células suspendidas en medio líquido. El empleo de autoanalizadores ha permitido mayor rapidez, precisión y exactitud en la determinación de los parámetros sanguíneos, introduciendo también el cálculo sistemático de los llamados índices eritrocitarios, de gran interés en el diagnóstico de las anemias. Se basan en uno de los dos principios básicos: 1. La impedancia electrónica o resistencia eléctrica 2. La dispersión óptica 1. Impedancia electrónica o resistencia a la corriente continua Se aspira la muestra de sangre en forma automática o manual y es diluida por un diluyente isotónico. Por una serie de presiones y vacíos llega a determinadas cámaras. Las células sanguíneas son poco conductoras de electricidad a causa de la membrana celular, mientras que sí lo son algunos diluyentes. Así la sangre se disuelve en una solución electrolítica y fluye a través de una abertura en la cual se mantiene una corriente eléctrica continua prefijada entre dos electrodos localizados a ambos lados del orificio, creando una zona detectora. Cada vez que una célula atraviesa ese orificio se interrumpe el flujo de corriente al desplazar al líquido conductor. Esto provoca un aumento de la resistencia eléctrica, dando un pulso electrónico cuya amplitud (ancho de la onda) y magnitud (altura) dependen del tamaño (volumen) de la célula y del orificio de la zona detectora.

14 13 En un determinado período de tiempo el equipo cuenta cuantas células pasaron, cual era la altura del pico (volumen de la célula), y va catalogando cada partícula. El número de pulsos es proporcional al número de células contadas. Los pulsos se reúnen y ordenan según su amplitud mediante analizadores de la altura de los picos. Los datos se trazan en un gráfico de distribución de frecuencia, o Histograma de distribución del tamaño, con el número relativo en el eje y y el tamaño en el eje x. El histograma producido representa la distribución del volumen de las células contadas. Histograma de plaquetas Histograma de glóbulos rojos Histograma de glóbulos blancos

15 La muestra de sangre entera anticoagulada es aspirada y se divide en 2 porciones, cada una se diluye con solución isotónica. La primera dilución va a la cámara de apertura de eritrocitos y la segunda a la cámara de apertura de glóbulos blancos. En la 1ª cámara se cuentan eritrocitos y plaquetas, y se diferencian por la impedancia eléctrica a medida que pasan a través de las 3 aperturas con sensores. Las partículas entre 2-20 femtolitros (fl) se cuentan como plaquetas, mayores a 36 fl, como eritrocitos. En la cámara de leucocitos, se agrega un lisante de glóbulos rojos (GR) para liberar la hemoglobina (Hb), antes de contar los leucocitos por impedancia en cada uno de las tres aperturas sensoras. Las partículas entre 35 y 90 fl se consideran linfocitos, entre 90 y 160 fl células intermedias (monocitos, blastos, granulocitos inmaduros, linfocitos atípicos y eosinófilos), y entre 160 y 450 fl granulocitos; de esta forma es posible realizar el cálculo de cifras relativas y absolutas de estas tres poblaciones. Después que se completan los ciclos de recuento, la dilución de leucocitos pasa al hemoglobinómetro para determinar la concentración de Hb (lectura de T a 525 nm). Los pulsos eléctricos generados en los ciclos de conteo, son enviados al analizador. Se generan histogramas de distribución de tamaño de leucocitos, eritrocitos y plaquetas. El uso de reactivos líticos de marca registrada para controlar la contracción y la lisis de tipos celulares específicos, permite separar y cuantificar los leucocitos en sangre en tres poblaciones: linfocitos, células mononucleares y granulocitos. Ejemplo: contador hematológico marca Coulter. La radiofrecuencia o resistencia a la corriente electromagnética de alto voltaje a veces se utiliza junto con la impedancia electrónica de la corriente continua. Permite graficar en forma comparativa dos propiedades celulares diferentes, como la impedancia y la conductividad, para la formación de un Histograma de distribución bidimensional o un trazado de dispersión. Estos gráficos muestran las poblaciones celulares como cúmulos, con el número de puntos en cada uno que representa la concentración de ese tipo de células. El uso de esta tecnología permite la separación diferencial de los leucocitos en 5 componentes: neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos. Ejemplo: contador hematológico marca SYSMEX. Informe de un hemograma mediante autoanalizador marca ABBOTT CELL-DYN 14

16 15 FIGURA 4 FIGURA 3 FIGURA 3: histograma de distribución de tamaño de glóbulos rojos. FIGURA 4: histograma de distribución bidimensional, donde se grafica el tamaño celular versus complejidad y granularidad versus lobularidad de los leucocitos. 2. Dispersión óptica (DO) La DO puede usarse como metodología primaria o en combinación con otros métodos. Este sistema consiste en analizar la dispersión de luz producida por las células desde dos dimensiones gracias a sensores situados en ángulos diferentes. Para el análisis, las células se hacen pasar individualmente a lo largo de una cámara de lectura sobre la que incide perpendicularmente un haz de luz, que puede ser halógena o láser. A medida que las células atraviesan la zona sensora e interrumpen el haz, la luz se dispersa en todas las direcciones. La luz dispersa es el resultado de la interacción entre los procesos de absorción, difracción, refracción y reflexión. La detección y la conversión de los rayos dispersados en señales eléctricas se logran mediante fotodetectores en ángulos específicos; los pulsos electrónicos se convierten en señales digitales para el análisis computarizado. La DO se correlaciona con el volumen celular o el tamaño y con el grado de complejidad de la célula. Ejemplo: contador hematológico marca ABBOTT CELL-DYN y BAYER ADVIA. Ya sea que el equipo utilice el método de impedancia electrónica o el de dispersión óptica (primaria o en combinación con otros métodos), tienen algunos componentes básicos comunes, como el sistema hidráulico (aspiradores, dispensadores, diluyentes, cámaras de recuento, hemoglobinómetro, entre otros), el sistema neumático (cámaras de vacío y presiones necesarias para el transporte de las muestras), y el sistema eléctrico que controla las secuencias operacionales del sistema total (analizadores electrónicos y circuitos computarizados que procesan los datos obtenidos). Los instrumentos automatizados presentan las siguientes ventajas: Alta precisión y exactitud Aconsejable para número elevado de muestras

17 16 Nuevos parámetros: RDW, PDW (amplitud de distribución plaquetaria según el volumen), VPM, PCT (plaquetocrito) Alarmas Pero en el uso de los mismos es importante una técnica cuidadosa, es decir: Buena recolección de sangre (punción y extracción) Material de recolección descartable (asegurar limpieza y anticoagulante sin partículas) Diluyente de muestra libre de partículas Adecuado mantenimiento del equipo Buen control de calidad EL FROTIS SANGUINEO La práctica de un frotis sanguíneo es de gran importancia en hematología, ya que el diagnóstico de muchas enfermedades hematológicas puede realizarse con sólo observar las características morfológicas de las células sanguíneas. Debido a ello, la técnica de realización del frotis debe ser impecable, procurando que éste no sea excesivamente fino ni excesivamente grueso. Con esto se conseguirá una distribución adecuada de las células en las diferentes áreas del frotis. Deben tenerse en cuenta las siguientes consideraciones: 1.- Los portaobjetos deben estar escrupulosamente limpios y desengrasados. 2.- Si se parte de punción digital, no se empleará nunca la primera gota. 3.- Si se parte de punción venosa, el frotis se hará con la mayor rapidez posible y con sangre no tratada con anticoagulante. Este produce hinchamiento nuclear en los leucocitos con falso aumento del número de neutrófilos no segmentados, vacuolización citoplasmática y aparición de diversos artefactos. Técnica manual con dos portaobjetos en ángulo Se pone una gota de sangre en la línea media del portaobjetos a un centímetro de uno de sus extremos. Se coloca otro portaobjeto junto a la gota y formando un ángulo de unos 45 C, se establece contacto con la gota de sangre, la cual se extiende mediante un rápido movimiento de deslizamiento. La extensión debe medir 3 a 4 cm de longitud. El extensor debe limpiarse una vez usado. La extensión no debe ser demasiado fina y la cola de la misma ha de ser lisa. Por lo general se observa una irregularidad cualitativa en la distribución: los polimorfonucleares neutrófilos y los monocitos predominan en los márgenes y en la cola; los linfocitos, en el cuerpo de la extensión. Esto depende quizás de las diferencias en el grosor, tamaño y gravedad específica entre las distintas clases de células (Figura N 6). FIGURA N 6: Distribución de los leucocitos en el frotis sanguíneo

18 17 No se debe olvidar identificar el extendido con un lápiz de mina. Un buen frotis debe ser homogéneo en toda su extensión, más angosto y más corto que el portaobjetos, sin escotaduras ni agujeros, sin flecos ni estrías. Se han propuesto diversos sistemas para realizar el recuento diferencial de leucocitos, pero ninguno puede compensar las irregularidades macroscópicas de la distribución en una extensión mal hecha. Tinción del frotis sanguíneo Los colorantes de Romanowsky son utilizados universalmente para la tinción de rutina de las extensiones de sangre. Estas, después de secadas al aire y en posición horizontal, deben ser fijadas y coloreadas Los colorantes de Romanowsky tienen la propiedad de proporcionar sutil distinción de matices de tinción, debido a una mezcla de eosina, azul de metileno y derivados por oxidación de este último, los azures. El mecanismo por el cual determinados componentes de las estructuras celulares se tiñen por ciertos colorantes y otros no, depende de complejas diferencias en la afinidad de los mismos, en la estructura química y en la interacción con las moléculas del colorante. Tanto la eosina como el azul de metileno son muy sensibles a las variaciones de ph de las diferentes estructuras celulares, de manera que las que tienen carácter básico fijan preferentemente la eosina (colorante ácido), mientras que las de propiedades ácidas fijan principalmente el azul de metileno (colorante básico). Los grupos ácidos de los ácidos nucleicos, las proteínas del núcleo celular y las granulaciones primarias de los neutrófilos, las finas granulaciones de los monocitos y las de algunos linfocitos (probable origen T), determinan su apetencia por los azures, tiñéndose de color púrpura al igual que ciertas inclusiones eritrocitarias como el punteado basófilo. Los granulocitos neutrófilos en los que la granulación específica posee componentes ácidos y básicos, fijan ambos colorantes simultáneamente, lo que les da un carácter neutro. De esta propiedad deriva su nombre. El citoplasma es ligeramente acidófilo, rosa pálido. De la presencia de grupos básicos en las moléculas de hemoglobina de los eritrocitos, arginina y lisina en la granulación específica del eosinófilo, resulta la afinidad por colorantes ácidos y su tinción por la eosina. Lo que se tiñe con eosina toma color pardo anaranjado. Los granulocitos basófilos poseen sustancias de fuerte carácter ácido, principalmente heparina, por lo que fijan colorantes básicos como el azul de metileno, tiñéndose de azul intenso; a veces se puede observar una degranulación parcial por efecto del lavado en el proceso de la tinción por ser

19 18 hidrosolubles. Cuando se tiñen con azul de toluidina los gránulos adquieren un color rojizo; este comportamiento se conoce como metacromasia. Dentro del grupo de colorantes tipo Romanowsky, los más utilizados son Giemsa, May Grünwald-Giemsa y variantes, y Leishman. Tinción de Giemsa. Se basa en el empleo de una solución de azul de metileno, su derivado oxidado en medio alcalino, el azur II, y eosina disueltos en alcohol metílico y glicerina. Esta solución puede obtenerse comercialmente. Método: 1.-Fijación con alcohol metílico 1 a 3 minutos. 2.-Lavar con agua. 3.-Colocar sobre la extensión solución de Giemsa al 10% en agua corriente o ligeramente alcalina. Dejar actuar 10 a 15 minutos, controlando el tiempo óptimo de coloración al microscopio. 4.-Lavar y dejar secar. Observar al microscopio. Tinción de May Grünwald-Giemsa Es una combinación a partir de la anterior, que recibe el nombre de coloración panóptica. Requiere del reactivo de May Grünwald, que es una solución metílica de eosinato de azul de metileno. Puede obtenerse comercialmente. Método: 1.-Fijar el frotis con solución de May Grünwald durante 3 minutos. 2.-Agregar igual número de gotas de agua destilada sobre la solución anterior, dejando actuar 1minuto. 3.-Volcar el líquido y, sin lavar, cubrir la preparación con solución de Giemsa diluida 1/10 en agua corriente. Dejar actuar 10 a 15 minutos, controlando el óptimo al microscopio. Tinción de May Grünwald-Giemsa modificada A partir de soluciones comerciales, se prepara el siguiente reactivo: Para 100 ml Solución de May Grünwald 40 ml Solución de Giemsa 20 ml Alcohol metílico de buena calidad 40 ml Método: 1.-Fijar el extendido con el reactivo descripto durante 2 minutos. 2.-Agregar igual número de gotas de agua corriente sobre la solución. Dejar actuar 10 a 15 minutos, controlando el tiempo óptimo de coloración al microscopio cuando se prepara el colorante. Tinción de Leishman. El reactivo de Leishman puede adquirirse en el comercio. Se prepara: Polvo de Leishman 0,2 g Alcohol metílico puro 100 ml Método: 1.-Fijar el extendido con el reactivo descripto durante 30 segundos. 2.-Agregar igual cantidad de gotas de agua destilada sobre la solución anterior. Homogeneizar bien. 3.-Dejar actuar 10 a 15 minutos controlando el óptimo al microscopio.

20 19 Tinción automatizada Existen equipos de tinción automática que permiten manejar grandes lotes de portaobjetos. Pueden ser máquinas de tinción aisladas o formar parte de un equipo más grande para el recuento sanguíneo automatizado. En muchos casos, el equipo extiende, fija y tiñe las extensiones. Algunos equipos automatizados que incorporan la tinción solo se pueden programar para preparar y teñir una sola extensión por muestra. Otros pueden preparar y teñir múltiples extensiones a partir de una única muestra sanguínea. Algunos sistemas aplican las soluciones de tinción a los portaobjetos dispuestos horizontalmente (tinción en lecho horizontal), mientras que otros sumergen el o los portaobjetos en un baño de la solución colorante (técnica de sumergir y remojar ) o pulverizan el colorante sobre los portaobjetos en una cito centrifuga. Los inconvenientes incluyen un aumento de la coloración del fondo, la tinción inadecuada de los gránulos de los neutrófilos, la degranulación de los basófilos y la coloración azul o verde en vez de rosada de los hematíes. MORFOLOGIA DE LOS LEUCOCITOS TIPO CELULAR TAMAÑO CITOPLASMA COLOR Relación VN/VC GRÁNULOS* NÚCLEO NEUTRÓFILOS 10-15µm Rosa pálido Baja Numerosos muy finos, púrpuras o violetas Violeta oscuro, usualmente 2-5 segmentos EOSINÓFILOS 12-17µm Celeste pálido Baja Muchos, grandes, redondos, pardo anaranjados Violeta, usualmente 2 segmentos BASÓFILOS 8-10µm Rosa Baja Varios, grandes irregulares, azul o violeta intenso, cubren el núcleo Irregular, usualmente 2 segmentos MONOCITOS 12-20µm Celeste grisáceo, a veces vacuolado Moderadamente alta Número variable, finos y púrpuras Varias formas (redondo, reniforme, forma de C ó de U), cromatina laxa LINFOCITOS 7-12µm (pequeños) 12-16µm (grandes) Azul pálido Alta o muy alta **Escasos, púrpuras y gruesos Violeta, redondo, cromatina homogénea y condensada Relación VN/VC: Volumen Nuclear/ Volumen Citoplasmático. * Gránulos: descripción de gránulos específicos. ** Un bajo porcentaje de linfocitos presentan gránulos. Cromatina condensada (heterocromatina): se refiere a la densidad elevada, que es la que presentan generalmente los linfocitos. Cromatina laxa (eucromatina): es la que predomina en los monocitos.

21 20 VALORES DE REFERENCIA LEUCOCITOS EDAD ( x 10 9 / L ) RANGO MEDIA 1-3 días 9,0-30,0 18,1 1 semana 5,0-21,0 12,2 1-2 años 6,0-17,0 11,5 3-7 años 5,0-14,5 8, años 4,5-13,0 7,9 Adultos 4,5-10,0 7,2 EXPRESIÓN DE RESULTADOS EN HEMATOLOGIA Actualmente diferentes organismos internacionales recomiendan expresar los resultados de los parámetros biológicos de acuerdo al llamado Sistema Internacional de Unidades (sistema SI). El empleo del sistema SI en los laboratorios clínicos favorece la estandarización de los métodos y unifica la forma de expresar los resultados, facilitando con ello la comparación de estudios realizados en laboratorios diferentes. En hematología, la incorporación del Sistema Internacional de Unidades ha instituido un cambio significativamente importante en la expresión de los resultados. El Comité Internacional de Estandarización en Hematología (ICSH), la Federación Internacional de Bioquímica Clínica (IFCC), y la Asociación Mundial de Sociedades de Patología (WAPS), han elaborado una declaración conjunta sobre el uso del sistema SI, que consta de los siguientes apartados fundamentales: 1.-Se reconoce la aceptación del sistema internacional de unidades SI. 2.-La unidad de volumen (o de capacidad) es el litro, que se expresa con el símbolo "L". 3.-Para representar los múltiplos y submúltiplos de unidades, se emplearía solamente el prefijo correspondiente. 4.-La concentración de sustancias se expresará siempre en relación al litro. 5.-En el caso de sustancias cuya composición química es conocida se recomienda emplear el mol para indicar la cantidad de las mismas. Prefijos recomendados para múltiplos y submúltiplos de unidades básicas Factor Prefijo Símbolo Tera- T 10 9 Giga- G 10 6 Mega- M 10 3 Kilo- K 10 2 Hecto- H 10 1 Deca- D 10-1 Deci- d

22 Centi- c 10-3 Mili- m 10-6 Micro- µ 10-9 Nano- n Pico- p Femto- f Atto- a BIBLIOGRAFIA Manual de técnicas de laboratorio en hematología. Vives-Aguilar. 3ª edición El laboratorio en el diagnóstico clínico. John Bernard Henry. 20ª edición Dacie y Lewis Hematología Práctica. S. M. Lewis, B. Bain, I. Bates. 10 a edición. Churchill y Livingstone