NOVA Gel TM SS-A/SS-B S Para Diagnóstico In Vitro

Transcripción

1 NOVA Gel TM SS-A/SS-B S Para Diagnóstico In Vitro Aplicación NOVA Gel TM SS-A/SS-B es un sistema de prueba de difusión doble para el tamizaje y la determinación semicuantitativa de autoanticuerpos contra SS-A/SS-B, un antígeno nuclear extraíble (ENA), en suero humano. La presencia de anticuerpos contra SS-A/SS-B se puede utilizar junto con otras pruebas serológicas y hallazgos clínicos para ayudar en el diagnóstico de Lupus Eritematoso Sistémico (LES) y otras enfermedades del tejido conectivo como el Síndrome de Sjogren. Sumario y Explicación de la prueba El término anticuerpos antinucleares (ANA) hace referencia a varios autoanticuerpos que reaccionan con los constituyentes de los núcleos de las células, incluidos ADN, ARN y diversas proteínas y ribonucleoproteínas. 1 Estos autoanticuerpos se presentan con mucha frecuencia en pacientes con enfermedades del tejido conectivo o reumáticas, especialmente en pacientes con LES. En teoría, todos los pacientes con LES dan positivo en ANA. La sensibilidad del diagnóstico condujo a la inclusión de las pruebas de ANA en la Revisión de 1982 de los criterios para la clasificación del lupus eritematoso sistémico, realizada por un subcomité de la ARA Arthritis and Rheumatism Association (Asociación para la Artritis y el Reumatismo). 2 Aunque la prueba de ANA supone una excelente prueba de tamizaje para el LES (un resultado negativo descarta casi por completo la presencia de LES activo 3 ), de ningún modo se considera una prueba específica. La tendencia actual para el diagnóstico y manejo de enfermedades del tejido conectivo consiste en combinar una prueba de tamizaje sensible para ANA con otras pruebas de seguimiento específicas, por ejemplo dsadn o ENA. Las pruebas de ENA cobran especial importancia, en tanto ofrecen información de diagnóstico y también de pronóstico. Los autoanticuerpos contra SS-A se detectan en el 40-50% de los pacientes con síndrome de Sjögren y en el 25% de los pacientes con ANA positivos en LES. 4,5 Los anticuerpos contra SS-B se detectan en el 23% de los pacientes con síndrome de Sjögren y en el 5-10% de los pacientes con LES. 4,5 Se observaron anticuerpos contra SS-A y SS-B en algunos pacientes con características clínicas de LES, como características cutáneas prominentes, pero que, por lo general, no dan positivo en ANA, sobre todo cuando se usan secciones de roedor como sustrato. 6,7 Los anticuerpos contra SS-A y SS-B están muy asociados al LES neonatal y el bloqueo cardíaco congénito. 5,8 Diversos estudios señalan la utilización de anticuerpos contra SS-B como marcadores serológicos para el complejo SS-sicca, ya que se detectan anticuerpos contra SS-B en alrededor del 60 % de dichos pacientes. 9,10 Procedimiento de trabajo La prueba de doble difusión, descrita por Ouchterlony, 11 permite que una solución de antígeno se difunda de forma pasiva a través de una matriz de soporte de gel hacia la muestra del paciente o el control con los anticuerpos. Los pocillos perforados en la matriz de gel, con su diseño particular, sirven como reservorios desde donde las soluciones de antígeno y anticuerpo se difunden una hacia la otra. En el punto de equivalencia de antígeno-anticuerpo se forma una línea de precipitina visible en el gel. De esta manera, se puede determinar el estado inmunológico de un paciente mediante la observación de las líneas de precipitina adyacentes formadas en el gel, con una muestra de control de especificidad conocida y un suero desconocido del paciente. La técnica de doble difusión se puede usar con una preparación purificada de SS-A/SS-B, una muestra de control de autoanticuerpos contra SS-B o SS-A y un suero del paciente que supuestamente alberga autoanticuerpos contra SS-B o SS-A, a fin de demostrar la presencia o ausencia de identidad inmunológica. 1

2 La actividad de autoanticuerpos contra SS-B o SS-A en el suero del paciente se confirma si la línea de precipitina se une de una manera característica con la línea formada por la muestra de control conocida. El procedimiento adecuado de la prueba de doble difusión requiere el ensayo de diversas proporciones de concentración de antígeno y anticuerpo para prevenir el exceso de unos u otros. Si este es el caso, se pueden formar líneas de precipitina erróneas o engañosas. Con objeto de impedirlo, se deben ensayar diluciones del suero del paciente con la misma preparación de antígeno. Las placas NOVA Gel S se diseñaron para cumplir este requisito con facilidad. Los pocillos hexagonales grandes tienen el tamaño justo para contener la concentración 1:1 o pura del suero del paciente o los controles. Los pocillos rectangulares pequeños, gracias a su diseño, permiten realizar automáticamente una dilución 1:4 aproximada de la muestra pura del paciente. Reactivos 1. Placas de gel para tamizaje de NOVA Gel S, con siete pocillos cada una, que contienen estabilizantes y azida de sodio al 0.09% ml de antígeno SS-A/SS-B (del timo de ternero), liofilizado en solución tampón que contiene estabilizantes y azida de sodio al 0.09% ml de control de SS-B, suero humano con autoanticuerpos contra SS-B en una solución tampón que contiene azida de sodio al 0.09% ml de control de SS-A, suero humano con autoanticuerpos contra SS-A en una solución tampón que contiene azida de sodio al 0.09% Advertencias 1. Todo material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto se ha examinado resultando negativo para anticuerpos contra HIV, HBsAg, y HCV por métodos aprobados por la FDA. Ningún método puede sin embargo ofrecer garantía completa que HIV, HBV, HCV o otros agentes contagiosos estén ausentes. Por lo tanto, los controles SS-B y SS-A deben manejarse como si fueran material potencialmente contagioso Dado que se utiliza azida sódica como conservante, este producto puede ser tóxico por ingestión o absorción a través de piel o mucosas. La azida sódica puede reaccionar con el plomo o cobre de las tuberías para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Si se utilizan desagües para la eliminación de reactivos se recomienda lavarlos con abundante agua para prevenir la formación de dichas azidas metálicas. 3. Se recomienda utilizar el equipo protector apropiado al trabajar con este kit. 4. Los reactivos derramados deben limpiarse inmediatamente. Siga las normas aplicables en su laboratorio acerca de la eliminación de residuos. Precauciones 1. Este producto es para ser usado en el Diagnóstico In Vitro. 2. La sustitución de componentes diferentes de los incluidos en el sistema puede generar resultados inconsistentes. 3. Se recomienda el uso de agua destilada estéril o desionizada para rehidratar el antígeno. 4. En el rendimiento del ensayo influyen varios factores, estos incluyen la temperatura de inicio de los reactivos, la prevención para que los reactivos o las muestras del paciente no desborden los pocillos y la calidad del agua empleada para rehidratar el antígeno. Se debe prestar mucha atención a la regularidad para obtener resultados precisos y reproducibles. 5. Se recomienda el estricto cumplimiento del protocolo. Condiciones de Almacenaje Almacene todos los reactivos del conjunto a 2-8 C. No los congele. Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad si se almacenan y manejan de acuerdo con las indicaciones. Una vez rehidratado, el antígeno es estable durante dos semanas a 2-8 C. Si se desea, se pueden preparar alícuotas de 100 μl de antígeno y almacenarlas a < -70 C. El antígeno almacenado de esta forma es estable durante por lo menos un año. 2

3 Recolección de Muestras Este kit requiere suero como muestra. La adición de azida u otros conservantes a las muestras puede afectar adversamente los resultados. No deben utilizarse muestras contaminadas, tratadas por calor o que contengan partículas visibles. Deben asimismo evitarse las muestras lipémicas o hemolizadas. Tras la recolección de las muestras de sangre, el suero debe ser separado del coágulo. El documento NCCLS H18-A2 recomienda las siguientes condiciones de almacenaje para muestras: 1) Guardar las muestras a temperatura ambiente no más de 8 horas. 2) Si el ensayo no se va completar en 8 horas, refrigerar la muestra a 2-8 C. 3) Si el ensayo no se va completar entre 48 horas, o para enviar las muestras, congelar a -20 C o a temperatura inferior. Una vez descongeladas las muestras deben agitarse bien antes de utilizarse. Procedimiento Materiales Suministrados 8 placas para tamizaje NOVA Gel S previamente perforadas ml de antígeno SS-A/SS-B liofilizado ml de control de SS-B ml de control de SS-A Material necesario no incluido Micropipetas para un volumen de μl Puntas desechables para micropipetas Solución salina al 0.85% Agua destilada o desionizada (de preferencia estéril) Fuente luminosa o negatoscopio para el gel Metodología 1. Rehidratación del antígeno SS-A/SS-B Abra con cuidado un vial de antígeno y agregue 0.4 ml de agua destilada o desionizada al antígeno liofilizado. Es muy recomendable usar agua destilada o desionizada estéril para conseguir un óptimo rendimiento del producto. Deje reposar el antígeno rehidratado durante cinco minutos; luego, agite para que se mezcle bien antes de utilizarlo. 2. Llenado de la placa de gel Llene la placa de gel con el antígeno y los controles (aproximadamente 80 μl por pocillo grande) según se ilustra a continuación. Se debe colocar cada muestra del paciente en un pocillo hexagonal grande (aproximadamente 80 μl) y en un pocillo rectangular pequeño (aproximadamente 20 μl), tal como se indica. Los valores exactos de llenado no son fundamentales, pero NO SOBRECARGUE LOS POCILLOS. Los pocillos de control se pueden llenar directamente con las botellas de plástico flexibles o las micropipetas. Si emplea botellas flexibles, coloque la punta dosificadora dentro del pocillo y apriete suavemente hasta que el nivel del líquido llegue casi al borde del pocillo. Cubra la placa de inmediato una vez que la haya llenado. Nota: el menor volumen del pocillo rectangular reduce la concentración local del anticuerpo del paciente SIN QUE SE REQUIERA LA DILUCIÓN DE LA MUESTRA. La dilución efectiva del pocillo pequeño es aproximadamente 1:4. Esto disminuye la posibilidad de falsos negativos debido al exceso de anticuerpos. 3

4 3. Incubación Deje incubar la(s) placa(s) cubierta(s) a temperatura ambiente sobre una superficie plana estable durante 24 horas. Examine la(s) placa(s) y observe las líneas de precipitina que se formaron entre la muestra del paciente y el antígeno. Examine la relación de esta línea con cualquiera de las líneas de precipitina del control. Vuelva a examinar las placas tras 48 horas para verificar la aparición de nuevas líneas antes de interpretar los resultados. Control de Calidad Se deben realizar las pruebas para los controles de SS-B y SS-A en cada placa a fin de asegurar la correcta ejecución de todos los reactivos y los procedimientos. Se pueden preparar otros sueros de control adecuados a partir de alícuotas de especímenes de un conjunto de muestras de suero humano y almacenarlos a < -70 o C. Para que los resultados de la prueba se consideren válidos, se debe formar una línea de precipitina visible entre los pocillos de los controles de SS-B y SS-A y los de antígenos de SS-A/SS-B. Interpretación de los Resultados Para la óptima observación de las líneas de precipitación, se recomienda seguir el procedimiento que se describe a continuación: 1. Retire la tapa de la placa. 2. Sostenga la placa en una posición tal que se minimice el reflejo de la superficie del gel. 3. Ilumine la placa del gel desde un lateral (es decir, en forma paralela a la superficie del gel). Nota: asegúrese de que la fuente luminosa esté resguardada de la visión directa. 4. Las líneas de precipitina se observan mejor si se contrastan con un fondo oscuro y se miran desde un ángulo. 5. Sírvase de una lupa para observar las líneas débiles o distinguir las muestras que no presentan identidad. Reacción negativa. Una muestra se considera negativa si no se forma una línea de precipitina visible entre los pocillos del paciente y del antígeno, una vez transcurridas 48 horas. Interpretación de la especificidad. En la doble difusión, la especificidad se determina a partir de la observación de la relación de las líneas de precipitina de la muestra y las líneas del control conocidas. Con la prueba NOVA Gel TM SS-A/SS-B se dan las siguientes posibilidades: Fig. 1: ausencia de identidad Fig. 2: identidad con SS-B Fig. 3: identidad con SS-B y SS-A La línea de precipitina del paciente 1 atraviesa o muestra ausencia de identidad, tanto con los controles de SS-B como con los de SS-A. Esto indica que el paciente reacciona con un antígeno ENA distinto del SM o SS-A. La línea de precipitina del paciente 1 se une o muestra identidad con la línea de control de SS-B. En este caso, el paciente tiene autoanticuerpos contra SS-B. Consulte el número 5 del apartado "Limitaciones del procedimiento". El paciente 1 tiene dos líneas de precipitina. Una de las líneas muestra identidad con el control de SS-B y la otra, con el control de SS-A. Este paciente posee autoanticuerpos tanto contra SM como contra SS-A. 4

5 Limitaciones del Procedimiento 1. Si existen varias líneas de precipitina, resulta más difícil interpretar los resultados. En estos casos, es recomendable volver a someter la muestra a la prueba en una dilución en solución salina 1:2 o 1:4, colocando cada dilución en un pocillo hexagonal y en un pocillo rectangular pequeño. Así se consigue una dilución 1:8 o 1:16, respectivamente, en el pocillo rectangular pequeño. Al diluir la muestra, se eliminan líneas débiles o se separan las líneas y así se facilita la interpretación. 2. Pese a que es poco probable que ocurra en esta prueba debido a la geometría exclusiva de los pocillos, existe la posibilidad de que se presente un fenómeno de prozona. Esto sucede cuando se presenta una cantidad abrumadora de autoanticuerpos del paciente en relación con el antígeno (exceso de anticuerpos), lo que conduce a la formación de una línea de precipitina en la cara del pocillo del antígeno. En estos casos, es recomendable volver a someter a la prueba las posibles muestras positivas en una dilución 1:2 o 1:4 en solución salina para evitar que la prueba se interprete como un falso negativo. 3. Si se emplea agua no estéril o contaminada para rehidratar el antígeno, este puede degradarse inmediata o progresivamente. Si es el caso, se puede obtener como resultado una línea de precipitina muy débil o ninguna línea. 4. El control de SS-B no es monoespecífico y puede contener algo de SS-A. 5. Los resultados de este ensayo deben utilizarse conjuntamente con hallazgos clínicos y otras pruebas serológicas. 6. La funcionalidad del ensayo no ha sido establecida para matrices diferentes del suero. Valores Esperados La prueba de doble difusión NOVA Gel TM SS-A/SS-B se empleó para evaluar a varios pacientes con enfermedades del tejido conectivo, así como a 200 donantes de sangre al azar. Los resultados se indican a continuación: Grupo de pacientes Número Número de positivos de la prueba NOVA Gel ENA Positivo para SS-B Positivo para SS-A LES Lupus inducido por drogas Artritis reumatoide Escleroderma Dermatomiositis Síndrome de Sjögren Normales

6 Referencias 1. Tan E. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan E, et. al. The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Casalo SP, Friou GJ, Myers LL. Significance of antibody to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Alexander, EL et al. Ro(SS-A) and La(SS-B) antibodies in the clinical spectrum of Sjogren's Syndrome, J Rheumatol 9: , Kephart DC et al. Neonatal Lupus Erythematosus: New Serologic Findings, J Invest Derm 77: , Provost TT et al. Antibodies to cytoplasmic antigens in lupus erythematosus-serologic disease. Arth and Rheum 20: , Maddison PJ, Provost TT, Reichlin M. Serological findings in patients with "ANA negative" systemic lupus erythematosus. Medicine 60:87-93, Franco HL et al. Autoantibodies directed against sicca syndrome antigens in the neonatal lupus syndrome. J. Am Acad Dermatol 4:67-72, Alspaugh MA, Tan EM. Serum antibody in rheumatoid arthritis reactive with a cell associated antigen, Arth and Rheum 19: , Scopelitis E, Biundo JJ and Alspaugh MA. Anti-SS-A antibody and other anti-nuclear antibodies in systemic lupus erythematosus, Arth and Rheum 23: , Ouchterlony O: Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. Prog Allergy 5:1, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Fabricante: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service ESP November 2009 Revision 12 6