PROCEDIMIENTO ENUMERACION POR METODO SERIE DE TUBOS MULTIPLES (NMP) DE BACILLUS CEREUS EN ALIMENTOS. PRT Página 1 de 15

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1 PRT Página 1 de OBJETIVO Detectar el número de células viables de Bacillus cereus en el alimentos con baja contaminación. 2. CAMPO DE APLICACION Y ALCANCE Aplicar este procedimiento en alimentos en los que se espera detectar < 10 células / g o ml. Este método es recomendable en muestras deshidratadas, alimentos con alto contenido de almidón en donde el recuento no es recomendado. 3. FUNDAMENTO Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, aerobio-anaerobio facultativo. Es formador de esporas, las que se encuentran en la tierra, polvo y por esta razón es un frecuente contaminante de alimentos. La intoxicación alimentaria provocada por B. cereus puede ocurrir cuando los alimentos son preparados con mucha anticipación sin la refrigeración adecuada. Alimentos con una enumeración >10 6 ufc/g pueden provocar intoxicación alimentaria. El fundamento del método se basa en proporcionar una etapa de enriquecimiento selectivo por la adición de Polimixina B y por la capacidad del microorganismo para precipitar la lecitina de la yema de huevo que contiene el medio y su característica de no fermentar el manitol, estas 2 propiedades son utilizadas para diferenciar las colonias de B. cereus en el medio de cultivo MYP. La adición de la polimixina es actuar como un inhibidor del desarrollo de otros bacilos facultativos ambientales. 4. REFERENCIAS 4.1. Food and Drug Administration "Bacteriological Analytical Manual" online, enero 2001, carpeta TERMINOLOGIA No Aplica. 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1. Materiales Pipetas estériles de 1, 5 y 10 ml graduadas en 0,1 ml Propipetas Placas Petri estériles 15 x 100 mm Asas desechables de nicrom o platino de aro 2 mm y 3 mm de diámetro Tubos estériles de 13 x 100 mm y tubos de 16 x 125 mm Jarra anaerobiosis, Anaerogen o Gas Pack con generador de H 2 + CO 2 y catalizador Rastrillos estériles Lápiz marcador

2 PRT Página 2 de Mecheros Tubos estériles 13 x 100 mm Tubos 16 x 125 mm Gradilla para tinción 6.2 Medios de Cultivo y Reactivos Caldo soya tripticasa con polimixina Solución de polimixina B al 0,15 % Agar Manitol-Yema de huevo y Polimixina (MYP) Agar Tirosina Agar nutritivo para Bacillus cereus Caldo Glucosa-Rojo fenol Caldo Nitrato Caldo Voges Proskauer (VP modificado) Caldo lisozima Solución de Polimixina B 0.1% para agar MYP Solución de α naftol 0,5% en ácido acético 5N Solución de ácido sulfanílico 0,8% en ácido acético 5N Solución de α naftol 5% en etanol Solución de KOH al 40% Emulsión de Yema de Huevo al 50% Reactivos para tinción de Gram Zinc en polvo Agua de dilución debutterfield en tubos con 9 ml ± 0,2 ml y frascos de 450 ml ± 5mL Cristales creatina Solución de tinción Fucsina básica Metanol Medio movilidad B cereus Agar soya tripticasa sangre de cordero 6.3 Equipos Estufas de incubación reguladas a 30º ± 2 C y 35º ± 2º C Refrigerador Vortex Contador de colonias Microscopio

3 PRT Página 3 de 15 7 DESARROLLO DEL PROCESO 7.1 Recepción de la muestra en el laboratorio Recibir la dilución 10-1 de la muestra procesada en el laboratorio de Recepción de muestras según PRT Preparar a partir de dilución 10-1 diluciones seriadas hasta 10-3, transfiriendo 1 ml a 9 ml de diluyente Si es necesario realizar diluciones adicionales si se sospecha de una población de B. cereus que excede 10 3 / g Anotar en la hoja de registro la inscripción de muestras del laboratorio, N, fecha de recepción, naturaleza de la muestra, fecha de análisis, analista y todos lo datos solicitados por el registro En el caso de muestras de brotes de ETA, anotar la información adicional que se disponga, si la hay El período transcurrido entre la preparación del homogeneizado de la muestra y la siembra no debe superar los 20 minutos. 7.2 Siembra recuento de células viables de Bacillus cereus Inocular 3 tubos de caldo soya tripticasa con polimixina al 0,15 % con 1 ml de la dil 10-1 cada uno Inocular 3 tubos de caldo soya tripticasa con polimixina al 0,15 % con 1 ml de la dil 10-2 cada uno Inocular 3 tubos de caldo soya tripticasa con polimixina al 0,15 % con 1 ml de la dil 10-3 cada uno Incubar los tubos por 48 ± 2 h a 30 C. y observe un denso desarrollo, el cual es típico para B. cereus. 7.3 Lectura Enumeración presuntiva células viables B. cereus Registre la combinación de tubos positivos en la hoja de Registro de análisis del laboratorio RG De cada tubo positivo sembrar por separado en estría en placas agar MYP Incube las placas h a 30 C.

4 PRT Página 4 de Traspaso Seleccionar las placas de agar MYP que presenten desarrollo de colonias rosadas (manitol negativas y una zona de precipitación alrededor de la colonia (lecitinasa positiva) Traspasar al menos 1 o más colonias que presenten las características del punto a agar nutritivo tendido para realizar la confirmación de B. cereus En caso de no tener colonias aisladas, proceder como sigue: Tomar una porción de cultivo con asa Sembrar por aislamiento en una placa de agar MYP previamente seca Incubar las placas invertidas a 30º C ± 2 C por 24 a 48 horas Registrar las características de este cultivo en la hoja de Registro de análisis del laboratorio RG Traspasar al menos 1 o más colonias que presenten las características del punto a agar nutritivo tendido para realizar la confirmación de B. cereus Realizar pruebas bioquímicas a las colonias seleccionadas 7.5 Pruebas Confirmativas Del agar nutritivo tendido realizar Gram y observar microscópicamente. B. cereus aparece como bacilo largo Gram positivo, en cadenas cortas a largas; de esporas elipsoidales de disposición central o subterminal y el esporangio no engrosado A partir del cultivo de agar nutritivo tendido transferir con asa de 3 mm a tubos de 13 x 100 mm que contienen 0,5 ml de agua de dilución buffer fosfato, suspenda el cultivo y mezcle en vortex. Use esta suspensión para inocular los siguientes medios confirmatorios: Prueba de Fermentación de glucosa: Inocular con asa de 2 mm la suspensión de cultivo en 3 ml de caldo glucosa rojo fenol e incubar en anaerobiosis por 24 horas a 35 C ± 2 C Prueba VP modificado: Inocular en 5mL de medio VP con la suspensión de cultivo utilizando asa de 3mm de diámetro. Incubar por 48±2 h a 35 C Prueba lisozima: Inocular en 2,5 ml de caldo nutritivo que contenga 0,001% de lisozima con la suspensión de cultivo utilizando asa de 2 mm. También inocular en 2,5 ml de caldo nutritivo como control positivo. Incubar por 24 horas a 35 C ± 2 C.

5 PRT Página 5 de Prueba tirosina: Inocular en toda la superficie del agar tirosina tendido la suspensión de cultivo con asa de 3 mm, Incubar por 48 horas a 35 C ± 2 C. Incubar los tubos que no presenten crecimiento hasta por 7 días antes de considerar el resultado como negativo Prueba de reducción de nitratos a nitritos: Inocular en 5 ml de caldo nitrato con la suspensión del cultivo, utilizando asa de 3 mm. Incubar por 24 horas a 35 C ± 2 C Agar MYP: puede ser omitido si los resultados son determinantes en las placas de agar MYP original o inicial en las cuales además no se observan interferentes de otros microorganismos presentes. Si no es así dividir la placa en 6-8 secciones iguales y rotular cada sección e inocular tocando suavemente con asa de 2 mm la suspensión del cultivo en la superficie del agar en un área de 4 cm 2 de agar. (Por esta forma pueden ser ensayados seis o más cultivos por placa).incubar a 35 C ± 2 C por 24 horas. 7.6 Pruebas adicionales para diferenciar otros miembros del B. cereus: B. mycoides, B, thuringiensis y B. anthracis Prueba de la motilidad: Inocular en medio BC motilidad en picadura en el centro del tubo con asa de 3 mm con cultivo de una suspensión de 24 horas. Incubar 18 a 24 horas a 30 C y examinar crecimiento a lo largo de la línea de inoculación. Alternativamente, añada 0,2 ml de agua destilada estéril a la superficie de agar nutritivo tendido e inocule con asa de 3 mm del cultivo de una suspensión. Incubar 6 a 8 horas a 30 C ± 2 C y suspenda con asa de 3 mm el líquido a acumulado en la base del agar tendido en una gota de agua estéril sobre un portaobjeto, ponga un cubreobjeto y observe al microscopio Desarrollo rizoidal: en agar nutritivo (18 a 20 ml) en placa, dejar secar completamente a temperatura ambiente por 1 a 2 días. Inocular suspensión del cultivo con asa de 2 mm suavemente sólo tocando la superficie de la parte central del agar en la placa. Permitir que el inóculo sea absorbido. Incubar a 30 C ± 2 C por 48 a 72 horas Actividad hemolítica: en una placa de agar soya tripticase con sangre de cordero dividir la placa en 6-8 secciones iguales y rotular cada sección e inocular tocando suavemente con asa de 2 mm la suspensión del cultivo de 24 h en la superficie del agar en un área de 4 cm 2 de, se pueden hacer cuñas de agar.incubar a 35 C ± 2 C por 24 horas Prueba de cristales de proteína tóxicos: inocular en agar nutritivo tendido con asa de 3 mm una suspensión de un cultivo de 24 h.incubar a 30 C ± 2 C por 24 h y luego dejar a temperatura ambiente por 2 a 3 días. Preparar extendido o frotis con agua destilada estéril en un porta objeto. Secar al aire y fijar suavemente con la llama de un mechero Bunsen. En un soporte de tinción inundar con metanol, dejar tendido por 30 segundos, elimine el metanol y secar al aire. Ubicar nuevamente el porta objeto en el soporte de tinción e inundar completamente con fucsina básica al 0,5 % o con colorante TB carbolfucsina tinción de ZN. Calentar deslizando desde abajo con un pequeño mechero Bunsen hasta que se desprenda vapor. Esperar 1 a 2 min y repita este paso,

6 PRT Página 6 de 15 dejar tendido 30 segundos, elimine el colorante y enjuagar profundamente con agua corriente. Dejar secar y examinar al microscopio en inmersión. 7.7 Lectura de las pruebas bioquímicas En caldo Fermentación de glucosa, agitar vigorosamente el tubo y observar desarrollo por incremento de la turbiedad y viraje del indicador de rojo a amarillo, lo que indica que el ácido ha sido producido anaeróbicamente desde la glucosa, un cambio parcial de color rojo a naranjado/ amarillo puede ocurrir incluso en los tubos de control sin inóculo debido a la reducción de ph por la exposición del medio a CO 2 formado en la jarra de anaerobiosis. Asegúrese de usar apropiados controles positivos y negativos para distinguir reacciones falso-positivo La prueba en VP para la producción de acetilmetil-carbinol es positiva al pipetear 1 ml y transferirlo a tubos de 16 x 125 mm, luego añadir 0,6 ml de solución de alfa-naftol al 5% en etanol y 0,2 ml de NaOH al 40%.Agitar y se puede añadir unos pocos cristales de creatina. Después de una hora a temperatura ambiente se puede observar la aparición de color rosado intenso o violeta lo que indica que la reacción es positiva En caldo lisozima observar desarrollo por la presencia de turbidez como resultado positivo. Observar desarrollo en caldo lisozima como en caldo nutritivo de control. Si la lectura fuese negativa incubar por 24 horas adicionales antes de descartar En el agar tirosina observar una zona clara en el medio cerca o alrededor de desarrollo de B. cereus, lo que indica que la tirosina ha sido descompuesta. Los tubos que presenten desarrollo pero sin evidencia de hidrólisis de la tirosina incubar por un total de 7 días antes de considerar la prueba como negativa En caldo nitrato observar la parición color rojo anaranjado al agregar 0,25 ml de ácido sulfanílico al 0,8 % en ácido acético 5 N y 0,25 ml de α naftol al 0,5% en ácido acético 5N, un cambio de color a anaranjado indica que la prueba es positiva, si no aparece color naranjo dentro de 10 minutos, indica que la prueba es negativa y se debe agregar polvo de Zn, no debe observarse cambios para interpretar la prueba como positiva, de lo contrario si al agregar Zinc en polvo se presenta coloración anaranjada, se debe interpretar la prueba como negativa En agar MYP observar la producción de lecitinasa indicada por una zona de precipitación alrededor de las colonias. El manitol no es fermentado por lo tanto las colonias son rosadas Interpretación de los resultados: B. cereus es un bacilo Gram positivo con esporas, produce lecitinasa y no fermenta manitol en agar MYP, crece y produce ácido en condiciones anaeróbicas a partir de la glucosa, reduce nitratos a nitritos, produce acetilmetil-carbinol, descompone la tirosina, y crece en presencia de lisozima la 0,001%.

7 PRT Página 7 de Estas características básicas son compartidas con otros miembros del grupo Bacillus cereus, incluyendo las cepas rizoidales de B. mycoides, los cristales de B. thuringiensis patógenos para insectos, y B. anthracis patógeno de mamíferos Pruebas adicionales: Prueba de la motilidad, los microorganismos móviles producen desarrollo difuso en el medio de cultivo. Los inmóviles crecen sólo en la línea de inoculación. Si realiza la prueba en agar tendido en la observación al microscopio se distinguen microorganismos móviles. La mayoría de las cepas de B. cereus y B. thuringiensis son móviles, unas pocas cepas de B. cereus son inmóviles El desarrollo rizoidal se manifiesta por el crecimiento en arborización o desarrollo similar a raíces que se extienden por varios centímetros del centro de la inoculación y es característico de B. mycoides Actividad hemolítica en B. cereus es fuerte y marcada produciendo 2 a 4 mm de zona de β.- hemólisis (hemólisis completa) alrededor de las colonias. (Seis o más colonias pueden ser testeadas en cada placa) En la prueba de cristales tóxicos de proteína se observan esporas libres y los cristales se observan como formas tetragonales y se tiñen en forma muy oscura. Los cristales son usualmente más pequeños que las esporas Interpretación resultados pruebas adicionales: B. cereus es móvil, presenta una marcada β- hemólisis, no presenta desarrollo rizoidal y no produce cristales tóxicos de proteína. 7.8 Cálculo y expresión de resultados Anotar lo resultados de las pruebas bioquímicas y morfológicas en RG Confirmar como B. cereus las colonias que cumplen con los puntos y Realizar el cálculo de NMP de B. cereus / g o ml de muestra basado sobre el número de tubos cada dilución que obtuvo confirmación de al menos una colonia de B. cereus. 7.9 Informe de resultados El resultado se expresa en NMP de Bacillus cereus por g o ml de producto analizado según corresponda.

8 PRT Página 8 de 15 8 REGISTROS 8.1 Registro resultados de análisis enumeración de Bacillus cereus en alimentos 8.2 Registro control esterilidad medios de cultivo laboratorio ensayos de esporulados 8.3 Registro cepa control positivo y control negativo análisis Bacillus cereus 9 ANEXOS Anexo N 1 Tabla diferencial de grupo Bacillus cereus. Anexo N 2 Preparación Medios de cultivo. Anexo N 3 Preparación Reactivos. Anexo N 4 Registro resultados de análisis enumeración de Bacillus cereus en alimentos RG Anexo N 5 Registro cepa control positivo y control negativo análisis Bacillus cereus RG Anexo N 6 Registro control esterilidad medios de cultivo laboratorio ensayos esporulados RG

9 PRT Página 9 de 15 ANEXO N 1-PRT TABLA DIFRENCIAL GRUPO BACILLUS CEREUS Table 1. Differential characteristics of large-celled Group I Bacillus species Feature B. cereus B. thuringiensis B. mycoides B. anthracis B. megaterium Gram reaction + (a) Catalase Motility +/- (b) +/- - (c) - +/- Reduction of nitrate + +/ (d) Tyrosine decomposed + + +/- - (d) +/- Lysozyme-resistant Egg yolk reaction Anaerobic utilization of glucose VP reaction Acid produced from mannitol Hemolysis (Sheep RBC) (d) - Known pathogenicity (e) /characteristic a +, % of strains are positive. b +/-, 50-50% of strains are positive. c -, % of strains are negative. d -, Most strains are negative. e See Section H, Limitations of method for B. cereus. produces enterotoxins endotoxin crystals pathogenic to insects rhizoidal growth pathogenic to animals and humans

10 PRT Página 10 de 15 ANEXO N 2-PRT PREPARACION MEDIOS DE CULTIVO Agar soya tripticase con sangre de cordero Fórmula: Peptona tripticasa Peptona phytone Na Cl Agar Agua destilada 15 g 5 g 5 g 15 g 1 L Calentar hasta disolver. Autoclavar 15 min a 121 C, ph final 7,3 ± 0,2 C. Enfriar a 50 C y añadir 5 ml de sangre de cordero desfibrinada a 100 ml de agar base. Mezclar y dispensar 20 ml en placas Petri de 15 x 100 mm. Medio motilidad para Bacillus cereus Fórmula: Tripticasa Extracto de levadura Dextrosa Na 2 HPO 4 Agar Agua destilada 10 g 2,5 g 5 g 2,5 g 3 g 1 L Calentar con agitación hasta disolver. Dispensar 100 ml en frascos Schott de 250 ml. Autoclavar por 15 min a a121 C. El ph final 7,4 ± 0.2. Enfriar a 50 C. Dispensar asépticamente 2 ml en tubos estériles de 13 x 100 mm. Almacenar a temperatura ambiente 2 días antes de su uso.

11 PRT Página 11 de 15 Caldo soya tripticasa con Polimixina B. Fórmula: Peptona tripticasa Petona fitona Na Cl K 2 HPO 4 Glucosa Agua destilada 17 g 3 g 5 g 2,5 g 2,5 g 1 L Calentar con constante agitación hasta disolver. Dispensar porciones de 15 ml en tubos de 20 x 150 mm. Autoclavar por 15 minutos a 121 C. Solución de Polimixina B al 0,15 % Disolver unidades de sulfato de polimixina B en 33.3 ml de agua destilada. Esterilizar por filtración. Almacenar en la oscuridad a 4 C hasta su uso. Antes de usar, añadir 0,1 ml de la solución de polimixina B al 0,15% a 15 ml del caldo de soya tripticasa. Mezclar.

12 PRT Página 12 de 15 ANEXO N 3-PRT PREPARACIÓN REACTIVOS Solución Lisozima Disolver 0.1 g de lisozima en 65 ml de HCl 0,01 N estéril. Calentar hasta ebullición por 20 min. Diluir a 100 ml con HCl 0,01 N. Alternativamente, disolver 0,1 g de lisozima en 100 ml de agua destilada. Esterilizar por filtración a través de membrana filtrante de 0,45 µm. Confirmar esterilidad antes de usar. Añadir 1 ml de solución lisozima a 99 ml de caldo nutritivo. Mezclar y dispensar 2,5 ml a tubos estériles de 13 x 100 mm. Suspensión Tirosina Suspender 0,5 g de L- tirosina en 10 ml de agua destilada en tubos de 20 x 150 mm. Mezclar con Vortex. Autoclavar 15 min a 121 C. A 100 ml de agar base agregar los 190 ml de la suspensión de tirosina. Mezclar bien invirtiendo el tubo 2 ó 3 veces. En forma aséptica dispensar 3,5 ml en tubos de 13 x 100 mm y mezclar. Tender los tubos y enfriar rápidamente para prevenir la separación de la tirosina. Solución de Fucsina Básica Disolver 0,5 g de fucsina básica en 20 ml de etanol al 95%. Diluir a 100 ml con agua destilada. Filtrar si es necesario con papel filtro Whatman N 3 para remover colorante sin disolver. También se puede usar TB carbolfucsina ZN.

13 PRT Página 13 de 15 Anexo N 4 Registro resultados de análisis enumeración de Bacillus cereus en alimentos. Fecha de recepción:... N :...Analista:...Incubadora... Tipo demuestra:...hora análisis...observaciones:... Diluciones Partida Diluyente Recuento en placa Agar MYP Enumeración (NMP) CST con polimixina al 0,15% Pruebas bioquímicas Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3 Colonia 4 Colonia 5 Observaciones Agar MYP: Lecitinasa Fermetación Manitol Gram Ferm. Glucosa en anaerobiosis Reducción nitratos a nitritos Desarrollo en lisozima Lisis Tirosina Voges Proskauer Hemólisis Motilidad Desarrollo rizoidal Cristales tóxicos proteico Recuento Confirmado:...Fecha Informe:...

14 PRT Página 14 de 15 Anexo N 5 Registro cepa control positivo y control negativo análisis Bacillus cereus. Responsable: Fecha Informe: Fecha Pruebas Partida Control positivo Cepa Control negativo Cepa Control esterilidad Agar MYP Glucosa en Anaerobiosis Reducción de Nitratos Desarrollo en Lizosima Lisis Tirosina Voges Proskahuer Pruebas adicionales Desarrollo Rizoidal Hemólisis Movilidad Cristales tóxicos proteico Manitol Lecitinasa Lectura Manitol Lecitinasa Lectura

15 PRT Página 15 de 15 Anexo N 6 Registro control esterilidad medios de cultivo laboratorio ensayos esporulados Fecha/Lote Caldo soya Tripticase con polimixina Agar MYP Agar TSC Buffer fosfato Butterfield Agua Peptonada 0,1% Agar Nutritivo Agar Sangre Caldo soya Tripticase Caldo Cerebro Corazón Caldo Cerebro Corazó n almidón Caldo Cooked Meat Caldo Tioglicolato Medio Medio fermentació Duncan Spray Strong Fecha Lectura