ISOFLAVONAS DE SOJA: UN NUEVO NUTRACÉUTICO

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1 ISFLAVNAS DE SJA: UN NUEV NUTRACÉUTIC Comba, Nadia Zoé. Estudiante de Ingeniería Química, Universidad Tecnológica Nacional, Facultad Regional Villa María. TUTRA: Dra. Montenegro, Mariana Angélica RESUMEN Esta investigación surge tras el creciente interés por parte de la población del uso de alimentos en la prevención de enfermedades y mejora de la salud general. Los alimentos tienen compuestos nutritivos y otros que no tienen una función nutricional clásicamente definida, pero que pueden tener un impacto significativo en el curso de alguna enfermedad, y son llamados compuestos nutracéuticos, dentro de los cuales se encuentran las isoflavonas. Las isoflavonas pertenecen al grupo de los flavonoides; este tipo de compuesto forma parte de los polifenoles, que son compuestos fitoquímicos, o quimiopreventores. Las isoflavonas poseen una estrecha similitud en la estructura química con los estrógenos humanos, por lo que son consideradas un estrógeno vegetal, contenido principalmente en la soja, y no sintetizado por el organismo humano. Este trabajo tiene la finalidad de hacer una revisión de las influencias de las isoflavonas en la salud humana, mencionando como ejemplos efectos antiinflamatorios, antivirales, antialérgicos, alivio de síntomas menopáusicos, protectoras de enfermedades cardiovasculares, cáncer, etc. También se estudió la obtención de isoflavonas de harina de soja mediante extracción por solvente, y los factores tales como procesamiento y calentamiento que puedan afectar este proceso. La exploración en este tema tiene como propósito sentar las bases del conocimiento en esta área de la alimentación para realizar en el futuro el proyecto final de grado de la autora. INTRDUCCIÓN El concepto tradicional de que la dieta debe proveer cantidades adecuadas de nutrientes esenciales, para el mantenimiento de una salud óptima, ha cambiado en los últimos años; los alimentos contienen también sustancias fisiológicamente activas denominadas nutracéuticos que cumplen, al igual que los nutrientes esenciales, una función de beneficio y contribuyen a reducir la incidencia de ciertas enfermedades crónicas, y por lo tanto son necesarias para una vida saludable [1,2]. El término nutracéutico incluye nutrientes aislados, suplementos dietarios, alimentos naturales o procesados y sustancias no nutrientes. Los nutracéuticos en la soja y sus derivados pueden ser: oligosacáridos, fibras, proteínas, isoflavonas (IF), fosfolípidos, ácidos grasos insaturados ω3, fitoesteroles y fitoestanoles. Las IF y sus derivados glicosídicos son abundantes en la naturaleza, habiendo sido identificados 70 moléculas y más de 40 de sus derivados. Se encuentran en leguminosas, principalmente en las semillas de soja, pero también las contienen plantas de las familias de las solanáceas, gramíneas y rosáceas. Las IF no se encuentran en la lecitina de soja, sino que es necesario extraerlas de la semilla con solventes adecuados para respetar la integridad de sus propiedades. Estructura Química y Espectroscopía de las Isoflavonas Las IF pertenecen a un gran grupo de compuestos denominados flavonoides [3]. Estas sustancias son polifenoles heterocíclicos que presentan una gran semejanza estructural con el 17 β- estradiol (Figura 1), el principal estrógeno endógeno del cuerpo humano, por lo que también son denominadas fitoestrógenos. Los derivados glucosídicos presentan una molécula de glucosa o un grupo metilo unido a uno de los grupos funcionales hidroxilo de la molécula principal [4]. Los fitoestrógenos son compuestos orgánicos producidos por una gran variedad de plantas y que pueden localizarse semillas, tallos, raíces o flores. Podemos clasificar los fitoestrógenos en dos grandes grupos según su estructura química: lignanos, sintetizados endógenamente en el intestino por acción de la microflora sobre precursores de origen vegetal; e isoflavonoides sintetizados exclusivamente por las plantas y poseen actividad estrogénica intrínseca. Existen dos tipos de isoflavonoides: las IF y los

2 cumestanos [4]. Estructuralmente las IF consisten en dos anillos aromáticos, A y B, unidos a través de una cadena de tres átomos de carbono que puede formar un tercer anillo, C. Figura 1. Similitud estructural entre isoflavonas y estrógenos. Ingerimos las IF como glucósidos de IF (inactivas), las cuales se rompen por la acción de bacterias en el intestino delgado para formar las agliconas, sin azúcar (biológicamente activas) (Figura 2). Los antibióticos pueden reducir la habilidad de las bacterias intestinales para convertir las IF en los compuestos antes mencionados y disminuir su acción, por lo tanto, no se recomienda el uso de antibióticos durante un tratamiento con IF. Existen 230 tipos de IF, las de mayor importancia clínica son: daidzeína (4 7-dihidroxisoflavona), genisteína (4 5,7-trihidroxiflavona) y gliciteína [5,6]. A partir de estos se construyen las formas maloniles, acetiles y glucósidos (Figura 2). C H Malonil CH 2 C H H CH H H H H H Acetil Glucósido H R 3 R 2 A C R 1 Aglicona B R 4 Isoflavona R 1 R 2 R 3 R 4 Daidzeína H H H H Daidzina H H Glu H Genisteína H H H H Genistina H H Glu H Gliciteína H CH 3 H H Glicitina H CH 3 H H Figura 2. Estructura de isoflavonas y sus glucósidos. Si bien las IF pueden ser analizadas por diferentes técnicas espectroscópicas y cromatográficas, la espectroscopia UV-Vis es una de las principales herramientas utilizadas para el análisis de IF. El espectro de absorción de la mayoría de las IF consiste en dos máximos, uno en el rango de nm (Banda II) y el otro en el rango de nm (Banda I) (Figura 3) [7]. La Banda II puede considerarse originada a partir del anillo A o sistema benzoílo y la Banda I se asocia al anillo B o sistema cinamoílo. Figura 3. Espectro de absorción de la isoflavona daidzeína [8].

3 Beneficios de Isoflavonas en la salud humana Cuando hablamos de IF y sus numerosas funciones biológicas, nos referimos al rol que cumple en algunas enfermedades crónicas como distintos tipos de cáncer, menopausia (como paliativo de sus síntomas), enfermedad cardiovascular, renal, problemas óseos, hipercolesterolemia, diabetes, función antioxidante, composición corporal y hasta en la función cognitiva e inmunitaria. A continuación se detallan las funciones de IF en algunas de estas enfermedades. Acción Estrogénica: Algunos isoflavonoides demostraron tener un efecto estrogénico débil (relativamente selectivo) actuando como agonistas estrogénicos; cuando las concentraciones son lo suficientemente altas, pueden observarse niveles de bioactividad semejantes entre las IF y el estradiol. Por este motivo, el empleo de fitoestrógenos puede ser útil en el tratamiento de la sintomatología asociada al climaterio. Los más importantes son la genisteína y la daidzeína, ambas procedentes de la semilla de soja. El estradiol se une a ciertas partes de las células llamadas receptores estrogénicos α (REα) y receptores estrogénicos β (REβ) para realizar sus funciones. Los REα se encuentran en útero, hígado, mama y riñón; los REβ en huesos, cerebro, hipófisis, tracto urinario, aparato cardiovascular y próstata, además en tejidos reproductivos como ovarios y testículos. Las IF se unen a estos receptores, mayoritariamente a los REβ, produciendo un efecto menor que el del estradiol [9]. Anticancerígenos: Las IF actúan contra las células de cáncer de manera similar a muchas drogas comunes de tratamiento contra el mismo. Los estudios basados en poblaciones muestran una fuerte relación entre el consumo de IF y la reducción del riesgo de cáncer de mama y endometrial. Las mujeres que ingirieron la mayoría de los productos de la soja y otros alimentos ricos en IF redujeron el riesgo de cáncer endometrial en un 54% [10]. Numerosos estudios epidemiológicos en humanos, en animales e in vitro han demostrado la acción inhibitoria de las IF durante las fases de inicio y de desarrollo del cáncer. Esto de debe a que las IF ayudan además a prevenir el proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos, propios de la formación de un tumor. De esta manera se deja al tumor sin fuente de alimentación impidiendo que crezca y se facilita que el organismo pueda eliminarlo. La genisteína ha demostrado tener un efecto en la célula del cáncer de próstata, y en ratones implantados con células de cáncer de próstata humana disminuye el crecimiento tumoral [11]. Acción Antioxidante: Un reciente estudio ha demostrado que las IF tienen potentes propiedades antioxidantes, comparables al de las vitaminas E y C [12,13]. La capacidad antioxidante de las IF puede reducir el riesgo a largo plazo de cáncer, previniendo el daño por radicales libres de ADN. Entre las IF, la genisteína tiene la actividad antioxidante más alta. Existen evidencias de que esta IF estimula la producción de Superoxido Dismutasa (SD) la cual desactiva al radical anión superóxido. Enfermedades seas: Las IF contribuyen a mantener una buena salud ósea, ayudando en la prevención de la osteoporosis [14]. A diferencia del estrógeno, que ayuda a la prevención de la destrucción del hueso, la evidencia sugiere que las IF también puedan ayudar en la formación del nuevo hueso. El equol puede aumentar la densidad mineral de los huesos, haciéndolos más resistentes y fuertes. Sin embargo, el 50% de las personas no pueden transformar la daidzeína a equol ( no productores de equol ) y por esta razón no experimentan los mismos efectos farmacológicos que los productores de equol Enfermedades Cardiovasculares: Las IF también parecen reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares por medio de distintos mecanismos, uno de ellos es inhibiendo el crecimiento de las células que forman la placa que obstruye las arterias. Estas arterias normalmente forman coágulos de sangre que pueden llevar a un ataque cardíaco. Existe evidencia de que las IF son los ingredientes activos en la soja, responsables de mejorar el nivel de colesterol [15]. Acción antiinflamatoria: Se han propuesto diferentes mecanismos que explican la actividad antiinflamatoria, demostrándose in vitro el efecto de los flavonoides sobre diferentes mediadores y enzimas proinflamatorias [16]. Como derivados fenólicos que son, actúan como agentes quelantes de

4 metales y captadores de radicales libres, pueden regular la actividad de las células implicadas en la inflamación como mastocitos, macrófagos, linfocitos y neutrófilos. Por ejemplo, algunos flavonoides inhiben la liberación de histamina de mastocitos y otros inhiben la proliferación de los linfocitos T. Isoflavonas de soja La mejor fuente dietética de este no-nutriente bioactivo es la soja [8,17] y sus productos alimenticios [18]. La genisteína, daidzeína y gliciteína son las IF específicas que se encuentran en la soja en un 60 %, 35 % y 5 % respectivamente del total de la IF. Se observa que el contenido de IF en la soja varía dependiendo de la variedad, condiciones de cultivo y crecimiento, año de cosecha como así también del proceso que hayan sufrido [19,20]. Ha sido establecido que la biodisponibilidad de IF puede ser influenciada por su estructura química en alimentos y la susceptibilidad a la degradación durante el calentamiento [20]. Barnes y sus colaboradores [21] demostraron que genisteína podría ser formado a partir de genistina durante la fermentación y que malonylgenistina podría ser convertida a acetylgenistina o genistina durante la calefacción. Por esta razón, es necesario investigar la conversión entre varias IF durante el procesamiento de productos de soja. MATERIALES Y MÉTDS Reactivos y Equipamiento Se emplearon Metanol grado HPLC, Sintorgan Argentina, Éter de Petróleo y Éter etílico grado ACS, Cicarelli Argentina. Agua tri destilada. En las determinaciones se usaron los siguientes equipos: Evaporador Rotatorio Buchi modelo 480, Espectrofotómetro UV-Vis MetroLab 1700, Balanza Analítica Adventurer HAUS. Estufa de secado. Caracterización Química de Harina de soja Se analizaron muestras de harina de soja provenientes de la zona de Villa María provincia de Córdoba. Las muestras fueron obtenidas por extrusión de granos de soja. Determinación de Humedad por Secado Directo Se pesaron 5 g de muestra y se desecaron durante 1,5 h a 130 C. Se dejó enfriar en un desecador y se determino por pesada la pérdida de agua por desecación. Determinación de Lípidos por el Método de Soxhlet Se pesaron 3 g de muestra seca en un cartucho de papel de filtro el cual se colocó posteriormente en el tubo extractor. Se tomó el peso del balón del aparato y se conecto al mismo. Por la parte superior del tubo extractor se agregó el solvente de extracción éter etílico- éter de petróleo (1:1). Se calentó el aparato para que se produzcan al menos 7 ciclos de llenado y sifonado del tubo extractor (durante 2 horas aproximadamente). Se retiró el balón y se evaporo el solvente en Evaporador Rotatorio a 50 C hasta sequedad. Se calculó el contenido de grasa por diferencia de pesada y el porcentaje en función de la masa de muestra pesada. Determinación de Isoflavonas Totales por Extracción con Solvente Se pesaron 2 g de muestra (sin tratamiento térmico y con calentamiento a 130 C) y se colocaron en frascos con tapa rosca de 150 ml, como solvente de extracción se empleo una mezcla metanol-agua (8:2). Se procedió a la extracción por agitación constante a temperatura ambiente durante 2 horas. Posteriormente la muestra fue filtrada al vacío, el extracto fue transferido a matraz aforado de 25 ml. La cuantificación de IF se realizó por espectroscopia de absorción UV-Visible, para lo cual se realizó una dilución (1:50) a partir del extracto concentrado, se registro la absorbancia a 258 nm contra blanco de metanol-agua. Los resultados de IF totales se expresaron como malonildadzina con ε 258nm = 26830, por ser la IF mayoritaria en harina de soja [19].

5 También se registraron los espectros de absorción de los extractos sin y con tratamiento térmico con el objeto de determinar variaciones en la forma de los mismos las cuales podrían indicar conversión entre formas de IF. Para tal fin se realizó un barrido espectral manual cada 5 nm. RESULTADS Y DISCUSIN Caracterización Química de Harina de soja En la Tabla 1 se muestran los resultados de las determinaciones de humedad y lípidos para las muestras de harina de soja. Los mismos obtenidos son concordantes con los valores esperados para muestras de harina de soja [22] Tabla 1. Composición química de harina de soja Determinación Valor en % Humedad 7,40 Lípidos 17,2 Determinación de Isoflavonas Totales por Extracción con Solvente Para la muestra sin tratamiento térmico se expresa el contenido de IF totales como malonildadzina (mayoritaria) ε 258nm = (Tabla 2). Mientras que para la muestra tratada térmicamente el contenido de IF totales se expresa como malonildaidzina, acetildaidzina (ε 256nm = 29007) y daidzeina (ε 249nm = 31563), suponiendo la posible degradación de la forma malonil por el calentamiento (Tabla 2). Esto fue fundamentado en el análisis de los espectros de absorción de ambas muestras (Figura 4), donde se observa un leve incremento en la Banda I, lo cual podría deberse a la mencionada degradación, como puede observarse en la Figura 5 la cual muestra los espectros de absorción de las IF derivadas de daidzeína [8]. Tabla 2. Isoflavonas totales de harina de soja (μmol/g muestra) sin tratamiento térmico calentada a 130ºC 11,02 11,39 (como malonildaidzina) 10,34 (como acetildaidzina) 8,81 (como daizeina) El contenido de IF totales obtenido se encuentra en el orden de magnitud de los valores informados para harinas de bajo contenido isoflavónico [20]. En las muestras tratadas térmicamente se observa una disminución del contenido de IF, cuando se expresa el mismo como acetildaidzina o daizeina, lo cual podría deberse a la degradación térmica de las mismas. Sin tratamiento térmico Calentamiento a 130 C Absorbancia 0,50 0,25 0, λ (nm) Figura 4. Espectros de absorción de extracto de isoflavonas de harina de soja en MeH

6 malonildaidzina daidzina daidzeína Figura 5. Espectros de absorción de isoflavonas derivadas de daidzeina [8]. CNCLUSINES Con respecto a los beneficios para la salud de las IF, existen evidencias científicas suficientes de los mismos, con lo que se podría afirmar que las IF y en particular las de soja son excelentes nutracéuticos. En cuanto al método de extracción de IF a partir de harina de soja, el empleo de la mezcla MEH-H 2 (8:2) como solvente de extracción, da una rendimiento en el orden de lo esperado. Sin embrago se planea continuar con el estudio de métodos de extracción (variando tipo de solvente, tiempo de extracción, ph, etc.) de manera de obtener una excelente relación entre rendimiento y costo. REFERENCIAS [1] N. S. Chasquivol, L.C. Lengua, I. Delmás, D. C. Rivera, D. Bazán, R. M. Aguirre, M. A. Bravo. Rev. Per. Quim. Ing. Quim. 5(2): 9-20, (2003). [2] F. Shahidi. Nutraceuticals and functional foods: Whole versus processed foods. Trends in Food Science & Technology Article in press. [3] M. Solari García. Curso de Posgrado en Internet: Enfermedad Renal y Nutrición. Buenos Aires, Marzo [4] D.A. Luis, J.L. Pérez Castrillón, R. Aller, J. Culebras. An. Med. Interna. 24(8): , [5] K.D.R Setchell. Phytoestrogens: biochemistry, physiology, and implication for health of soy isoflavones. Am. J. Clin. Nutr. 68: , [6] K.D.R. Setchell, H. Adlercreutz. Mammalian lignans and phyto-oestrogens. Recent studies on their formation,metabolism and biological role in helts and disease. In: Role of the gut flora in toxicity and cancer. Academi Press ,1988 [7] J. B. Harborne, T. J Mabry, H. Mabry. The Flavonoids. Parte 1.Capítulo 2. Academic Press [8] G. A. Micke, N. M. Fujiya, F. G. Tonin, A. C. de liveira Costa, M. F. Maggi Tavares. Method development and validation for isoflavones in soy germ pharmaceutical capsules using micellar electrokineti chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41: , [9] J. An, C. Tzagarakis-Foster, T.C. Scharschmidt, N. Lomri, D.C. Leitman. Estrogen receptor β-selective transcriptional activity and recruitment of coregulators by phytoestrogens. J Biol Chem. 276: , [10] [11] A. Gescher, U. Pastorino, S.M. Plummer, M. M. Manson. Supression of tumor development by substances derived from the diet- mechanisms and clinical implications. Br J Pharmacol, 45: [12] D.C. Liebler. Antioxidant reactions of green tea catechins and soy isoflavones. Adv Exp Med Biol. 500:191-7, 2001 [13] Patel RP et al. Antioxidant mechanisms of isoflavones in lipid systems: paradoxical effects of peroxyl radical scavenging. Free Radic Biol Med 2001;31: [14] M. Messina, V. Messina. Soyfood, soybean isoflavones, and bone health: a brief overview. Journal of Renal Nutrition, 10:2, 2000 [15] J.D. Wagner, W.T. Cefalu, M.S Anthony. Dietary soy protein and estrogen replacement therapy improve cardiovascular risk factors and decrease aortic cholesteryl ester content in ovariectomized cynomolgus monkeys. Metabolism,46: , 1997 [16] K. A. Head. Isoflavones And ther Soy Constituents In Human Health And Disease. Alternative Medicine Review. 3(1): , 1998 [17] Murphy, P.A. Phytoestrogens content of processed soybean products. FoodTechnol. 44 : [18] Kenneth D.R., Setchell, Cassidy Aedin. Dietary Isoflavones: Biological Effetc and Relevance to Human Health. J.Nutr 129 : 758S. 767S, 1999 [19] P.A. Murphy, K. Barua, C. C. Hauck. Solvent extraction selection in the determination of isoflavones in soy foods. Journal of Chromatography B, 777 (2002) [20] S. Shao, A. M. Duncanb, R. Yang, M. F. Marcone, I. Rajcan, R. Tsao. Tracking isoflavones: From soybean to soy flour, soy protein isolates to functional soy bread. Journal of functional foods 1, , 2009 [21] Barnes, S., Coward, L., Kirk, M., & Sfakianos, J. HPLC-mass spectrometry analysis of isoflavones. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 217, , 1998 [22] M. L. Genta, N. Alvarez, El complejo soja. Cet ISSN Extensión 28: 2006