Revista de la Universidad Industrial de Santander. Salud ISSN: Universidad Industrial de Santander Colombia

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1 Revista de la Universidad Industrial de Santander. Salud ISSN: Universidad Industrial de Santander Colombia Rodríguez Sanabria, Fernando Determinación de las Constantes Cinéticas de la Enzima Hipoxantina- Guanina Fosforribosiltransferasa (HGPRT) en Controles Normales y en una Familia Afectada por el Sindrome de Lesch-Nyhan Revista de la Universidad Industrial de Santander. Salud, vol. 38, núm. 2, 2006, pp Universidad Industrial de Santander Bucaramanga, Colombia Disponible en: Cómo citar el artículo Número completo Más información del artículo Página de la revista en redalyc.org Sistema de Información Científica Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto

2 Determinación de las Constantes Cinéticas de la Enzima Hipoxantina- Guanina Fosforribosiltransferasa (HGPRT) en Controles Normales y en una Familia Afectada por el Sindrome de Lesch-Nyhan Fernando Rodríguez Sanabria 1 El sindrome de Lesch-Nyhan (SLN) es producido por una deficiencia total de la enzima Hipoxantina-Guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT). Las madres de niños afectados por el SLN son heterocigotas obligadas ya que la enfermedad se hereda de forma recesiva ligada al cromosoma X. Una de las células utilizadas para determinar la enfermedad es el eritrocito; sin embargo, la determinación de la condición portadora de las madres con niños afectados no se puede hacer en estas células ya que presentan una actividad que cae dentro del rango considerado normal.esto sucede porque el eritrocito deficiente en la enzima HGPRT es destruido antes de que alcance la circulación sanguínea. Aplicando los principios cinéticos de Lineweaver-Burk y mediante espectrofotometría se determino la cinética de la (HGPRT) extraída de los eritrocitos de una familia que sufre el Sindrome de Lesch-Nyhan y se compararon con la cinética de esta enzima utilizando eritrocitos de 10 individuos sanos y normales procesados de igual forma. Los dos sustratos estudiados fueron la Guanina y el Fosforribosilpirofosfato (PRPP). La Guanina en individuos normales presentó un rango de Vmax entre 1.7 a 2.8 µmol de GMP/ min/ g Hb. mientras que el rango presentado para la Km fue de 10 a 25 µm. El PRPP en los controles normales presentó un rango para la Vmax de 2 a 2.7 µmol de GMP/min/g Hb y el rango para la Km fue de 301 a 590 µm. estos valores corresponden a lo reportado por otros autores. En la familia estudiada la cual tiene dos niños que padecen el síndrome de Lesch- Nyhan, tanto el padre como la hija presentaron cinéticas que caen dentro del rango considerado normal, mientras que la madre presentó una alteración en la Km para el PRPP ( 1176 µ M ). Cuando se comparó la regresión linear de las pendientes presentadas por los controles con la presentada por la paciente portadora de la enfermedad se encontró que estadísticamente son muy diferentes, diferencia que es ocasionada por el valor elevado de la Km de esta paciente por el sustrato PRPP.Salud UIS 2006;38: Palabras Clave: Guanina, PRPP, Síndrome de Lesch-Nyhan, Cinética Enzimática, Análisis matemático de Lineweaver-Burk, HGPRT. The syndrome of Lesch-Nyhan (SLN) is produced by total deficiency of the enzyme Hipoxanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase (HGPRT). The mothers of children affected by the SLN are obliged heterocigotes since the illness is inherited from a recessive way bound to the chromosome X. One of the utilized cells to diagnostic the illness is the erythrocyte; however, the determination of the condition carrier of the mothers with affected children cannot make in these cells since they present an activity that falls inside the normal considered range. This happens because the faulty erythrocyte in the enzyme HGPRT is destroyed before it reaches the blood stream. Applying the kinetic principles of Lineweaver-Burk and by means of espectrophotometry I to carry out the kinetic of the HGPRT enzyme extracted of the erythrocytes of a family that it suffers the SLN and they were compared with the kinetics of this enzyme in erythrocytes of ten individuals health and normal. The two studied substrates were the Guanine and the phosphorybosylpirophosphate(prpp). The Guanine in normal individuals presented a range of Vmax among 1.7 at 2.8 µmol GMP/min/gHb, while the range presented for the Km went from 10 to 25 µ M. The PRPP in the normal controls presented a range for the Vmax from 2 at 2.7µmol GMP/min/gHb and the range for the Km went from 301 to 590 µm. These ranges are similar to those reported by other authors. In the estudied family which has two children that suffer the SLN, as much the father as the daughter presented kinetic that fall inside the normal considered range, while the mother presented increased the km for the PRPP ( the value of Km for the PRPP of the mother of the children affected by the syndrome was of 1176 µ M. When we compared the pendent the normal controls with the obliged heterocigotes pendent for the PRPP substrate was statisticaly different owing to high Km value.salud UIS 2006;38: Key Words: Guanine, PRPP, Syndrome of Lesch-Nyhan, Enzymatic Kinetics, Mathematical analysis of Lineweaver-Burk, HGPRT. 1 Msc en Biología. Profesor Asociado del departamento de ciencias básicas de la sección de Bioquímica. Facultad de Salud de la universidad Industrial Santander. Correspondencia: frodrig@uis.edu.co. 122

3 HIPOXANTINA-GUANINA FOSFORRIBOSILTRANSFERASA (HGPRT) Y SINDROME DE LESCH-NYHAN INTRODUCCIÓN La deficiencia de la enzima encargada de la vía de salvamento de las purinas: Hipoxantina -Guanina Fosforribosiltransferasa (HGPRT) es causa de tres síndromes con signos clínicos muy parecidos y que dependerán de la cantidad de enzima residual en cada uno. Pacientes con al menos un 8% de la actividad de la enzima presentan alta producción de ácido úrico, hiperuricemia, nefrolitiasis y gota. Pacientes con 1.5 a 8% presentan alta producción de ácido úrico y alteraciones neurológicas extrapiramidales como coreatetosis ó alteraciones piramidales como espasticidad o hiperreflexia. Y por último pacientes que presenten menos del 1.5% de actividad enzimática presentan sobre producción de ácido úrico, retardo mental, alteraciones neurológicas graves piramidales y extrapiramidales, y anormalidades comportamentales que incluyen autoagresión, este último se conoce como el síndrome de Lesch-Nyhan (SLN) 1,2,9,11,12, 13, 18. El gen que codifica para la enzima esta en el cromosoma X, se hereda en forma recesiva, ha sido mapeado en el locus Xq26-q27 y secuenciado en su totalidad. Hasta el momento se han encontrado más de 200 mutaciones responsables del síndrome 10, 14. Mujeres heterocigotas para el SLN muestran un patrón diverso en la actividad enzimática de la HGPRT en diferentes células: en eritrocitos se ha reportado que ellas presentan una actividad normal, esto porque al parecer la célula roja deficiente en la enzima es destruida y nunca alcanza la circulación sanguínea; mientras que en fibroblastos y raíces de cabello se pueden encontrar células HGPRT - y células HGPRT + esto como consecuencia de la inactivación al azar de uno de los dos cromosomas X heredados por estas mujeres (Hipótesis de Lyon ) aunque se han reportado mujeres que presentan el fenotipo clasico del síndrome de Lesch- Nyhan 3, 15, 16,17,19,20. En el eritrocito asi como en la mayoria de las células, la enzima HGPRT se encuentra entre y 0.04% de la proteína celular como una enzima citoplasmática no glicosilada. En esta célula como lo han reportado Krenitsky, Papaioannou y McDonald, se determinaron las constantes cinéticas (Km y Vmax ) para los tres sustratos de la enzima es decir para la Guanina, Hipoxantina y el PRPP 4, 5, 6, 8. Hasta el momento varios trabajos reportados muestran que los individuos heterocigotos presentan actividad normal de la enzima HGPRT ante concentraciones saturantes de los sustratos fosforribosilpirofosfato, guanina e hipoxantina cuando es determinada en eritrocitos mientras que muy pocos han estudiado la cinética de la HGPRT en mujeres portadoras de la enfermedad 7,11,14,17. Estudiar la cinética de las mujeres que son heterocigotas es importante ya que se podrían encontrar nuevas alteraciones originadas por la relación entre la enzima y sus sustratos lo que permitiría proponer nuevos mecanismos de acción enzimática. En el presente trabajo se realizó la cinética de los integrantes de la familia afectada: la madre, la hermana y el padre de los niños afectados y los resultados se compararon con los obtenidos en 10 individuos sanos. MATERIALES Y MÉTODOS Material biológico Eritrocitos: Tanto de los 10 controles como de los integrantes de la familia afectada se tomaron de cada uno 5ml de sangre total con heparina como anticoagulante. Se separo el plasma y después se sometieron los eritrocitos a un proceso de lisis por ciclos de choque de temeratura ( 37 C - nitrógeno líquido ). Posteriormente se procedió a hacer una dilución 1: 60 del lisado en solución salina M y a la cuantificación de la hemoglobina para luego proceder a analizar la cinética de la HGPRT ante cambios en la concentración de Guanina y fosforribosilpirofosfato (PRPP), los dos sustratos de esta enzima. MÉTODO Se cuantifico la hemoglobina utilizando el método tradicional de la cianometahemoglobina. La determinación de la actividad de la HGPRT con cada una de las concentraciones del respectivo sustrato se realizó por espectrofotometría de la siguiente forma: 50 µl de la solución de hemolizado se mezclaron con cantidades ascendentes de cada uno de los sustratos en 500 µl de un buffer tris de ph 8.5 y el delta de absorbancia se monitoreó durante 15 minutos a 257 nm. Este delta de absorbancia correspondiente al GMP producido en la reacción fue proporcional a la actividad de la enzima. Reacción química del método: Guanina como sustrato variable: GUANINA + PRPP HGPRT ph 8.5 GMP + PPi 123

4 RODRÍGUEZ SANABRIA F. Salud UIS 50 µl del hemolizado conteniendo la enzima HGPRT se mezclaron con 500 µl de Buffer Tris de ph 8.5 y con concentraciones ascendentes de Guanina en tubos separados (en cada tubo se colocaron 20 µl de guanina de concentraciones entre 0.1 y 5 mm ); manteniendo constante la concentración del otro sustrato (en cada uno de los tubos se colocaron 30 µl de PRPP40 mm ) el cual se agrego previa incubación de los tubos durante 5 minutos a 35 C. El delta de absorbancia para cada tubo se monitoreo durante 15 minutos a 257 nm. El GMP producido en cada tubo es proporcional a la actividad de la HGPRT. (Figura 1). Fosforribosilpirofosfato (PRPP) como sustrato variable: Manteniendo la concentración constante de Guanina (20 µl de concentración (5mM) se procedió a utilizar concentraciones variables de PRPP ( en cada tubo se colocaron 30 µl de concentraciones entre 0.1 a 40 mm de este reactivo ) y se siguió el mismo procedimiento descrito para la guanina. (Figura 2). Cálculos: Los calculos se sacaron como un promedio de los deltas de absorbancia por minuto ( Abs/min) Actividad Específica = Abs / min x * g/l de Hemoglobina en cada prueba Figura 1: Cinética de la enzima HGPRT determinada en eritrocitos de un control normal por medio del análisis matemático de Lineweaver-Burk. Sustrato Variable (S): PRPP (expresado en mm). Actividad Específica (V) expresada en µ mol de GMP/min/g Hb. El intercepto sobre el eje Y corresponde al inverso de la velocidad máxima (1/Vmax) y el intercepto sobre el eje X corresponde al inverso de la constante de Michaelis (1/Km). Vmax = 2,05 µmol de GMP/min/gHb. Km = 312 µ M. * Corresponde al coeficiente de absorción molar del GMP Actividad total de la enzima en U/L = Abs/min X La cinética de la enzima en estudio mostró un comportamiento Micheliano con una reacción inicial de primer orden y luego una reacción de orden cero que dibujó una hipérbole de acuerdo al análisis matemático de Michaelis y Menten para los dos sustratos ( Gráficas no mostradas). Posteriormente los datos de Velocidad contra sustrato fueron convertidos y analizados según los parametros de Lineweaver - Burk que convierte la hipérbole Micheliana en un recta; esto con el fin de darle una mayor exactitud a los datos de las diferentes constantes. (Figura 1). La tabla 1 resume los resultados de Km y Vmax para los 10 controles normales los cuales presentaron para el sustrato Guanina un rango de Vmax entre 1.7 y 2.8 µmol de GMP/min/gHb y un rango de valores de Km entre 10 y 25 µm. y para el sustrato PRPP valores de Vmax entre 2 y 2.7 µ mol de GMP/min/gHb y valores de Km entre 301 y 590 µm. Nótese que no hay distinción de sexo ni de edad ya que la actividad de esta enzima no es afectada por estos dos factores. Figura 2. Cinética de la enzima HGPRT de la paciente heterocigota obligada realizada utilizando eritrocitos como fuente de la enzima. Las constantes de Vmax y Km para el PRPP como sustrato variable se obtuvieron utilizando el análisis matemático de Lineweaver- Burk. La Actividad Específica (V) de la enzima estudiada esta dada en terminos de µmol de GMP/ min/ g Hb, el sustrato (S) esta expresado en mm. El intercepto en el eje Y corresponde al inverso de la velocidad máxima y el intercepto con el eje X corresponde al inverso de la constante de Michaelis. El método esta descrito en el texto. Vmax = 2.56 µ mol de GMP/min/gHb. Km = 1176 µm. 124

5 HIPOXANTINA-GUANINA FOSFORRIBOSILTRANSFERASA (HGPRT) Y SINDROME DE LESCH-NYHAN Tabla 1: Constantes Cinéticas ( Vmax y Km )de la enzima HGPRT determinadas en 10 controles normales obtenidas por medio del análisis de Lineweaver - Burk para los sustratos Guanina y PRPP. Control normal Guanina PRPP V max µmol GMP/min/hHb Km µm V max µmol GMP/min/gHb Km µm Rango de referencia µmol GMP/min/hHb µm µmol GMP/min/hHb µm La Tabla 2 resume las constantes cinéticas de la familia en estudio. Esta familia tiene dos niños que sufren el síndrome de Lesch-Nyhan. La figura 2 muestra el análisis de Lineweaver-Burk para los datos de la cinética de la madre de los niños que padecen el síndrome de Lesch-Nyhan, para el sustrato (PRPP) y lo que puede observarse allí es que la Km para el sustrato PRPP es un poco más del doble comparada con la presentada por los controles. Por otro lado la cinética presentada por la hija de la mujer portadora ( en la tabla 2 identificada por DA) mostró valores de Km y Vmax que están dentro de los valores considerados normales tanto para la Guanina como para el PRPP. CONCLUSIONES -El rango de referencia obtenido para los controles normales en células rojas y para los sustratos Guanina y PRPP están de acuerdo con los reportados por otros autores 10,14, 17. -Trabajos previamente reportados muestran que a condiciones saturantes de los sustratos Guanina y PRPP aquellos individuos heterocigotos no se pueden distinguir de los individuos normales cuando se utilizan los eritrocitos como fuente enzimática, esto porque presentan una actividad de la HGPRT que esta dentro de los rangos establecidos para las personas normales. Tabla 2. Constantes cinéticas de la enzima HGPRT de eritrocitos de la Familia estudiada, obtenidas por medio del análisis de Lineweaver- Burk. Miembro de la Familia GUANINA PRPP Vmax µmol Vmax µmol Km µm GMP/min/gHb GMP/min/gHb Km µm Padre Madre (Heterocigota) ciente D.A. (Hermana de niños con el síndrome, y posible heterocigoto) Paciente E.A Paciente F.A

6 RODRÍGUEZ SANABRIA F. Salud UIS -Los valores de la cinética para los dos sustratos de la enzima HGPRT presentados por la hija de la paciente portadora de la enfermedad permitirían pensar que es una persona con una actividad normal de la enzima y que posiblemente no sea portadora de la enfermedad; condición que deberá ser corroborada con un estudio molecular posterior. - Por otra parte los estudios cinéticos realizados a la paciente heterocigota muestran una pendiente muy diferente a la de los controles como se puede observar en la figura 4 ocasionada por el valor alto presentado en la Km para el sustrato PRPP lo que podría estar indicando una inhibición cruzada causada por el otro sustrato, es decir, que la Guanina en esta paciente ocasiona algún tipo de alteración estructural en la proteína que disminuye la afinidad de la enzima por el PRPP cuando este sustrato se utiliza en concentraciones cercanas al valor de Km. Esta alteración no se puede observar cuando ambos sustratos se utilizan a concentraciones elevadas. Un trabajo anterior 7 ha reportado este tipo de inhibición explicado sobre un modelo de unión secuencial; de tal forma que en condiciones normales cuando se utilizan concentraciones saturantes de los dos sustratos lo que sucede es la unión de los dos sustratos en el orden en que se describen a continuación: Figura 3. Comparación de la pendiente presentada por los controles normales y la de la paciente portadora del síndrome de Lesch-Nyhan ante diferentes concentraciones del sustrato Guanina. Y lo que propongo que podría estar sucediendo en la mujer portadora de la enfermedad a quien nos referimos en esta publicación es que a concentraciones saturantes de Guanina pero utilizando concentraciones bajas de PRPP (esto se hace para obtener las costantes de Km y Vmax del PRPP, figura 2) es la Guanina la que se esta uniendo primero a la enzima lo que causa una disminución de la afinidad de la enzima por el PRPP que solo termina en la medida en que se aumenta la concentración del PRPP usado. Trabajos a nivel molecular (secuenciar la proteína ó el gen que codifica para la enzima) podrían dar luces sobre la alteración propuesta en esta publicación. PRPP E --- Figura 4. Comparación de la pendiente presentada por los controles normales y la de la paciente portadora del síndrome de Lesch Nyhan ante diferentes concentraciones del sustrato Fosforribosil pirofosfato. Regresión lineal para la paciente: 1/PRPP= (459,38 x 1/S) mientras que para los controles es 1/PRPP= (60.59 x 1/S). 126

7 HIPOXANTINA-GUANINA FOSFORRIBOSILTRANSFERASA (HGPRT) Y SINDROME DE LESCH-NYHAN REFERENCIAS 1. Lesch M, Nyhan WL: A familial disorder of uric acid metabolism and central nervous system function. Am. J. Med. 1964, 36: Seegmiller JE: Contributions of Lesch-Nyhan syndrome to the understanding of purine metabolism. J. Inherit. Metab. Dis. 1989, 12: Emmerson BT, Thompson CJ, and Wallace DC : Partial deficiency of Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase: Intermediate enzyme deficiency in Heterozygote red cells. Ann. Intern. Med. 1972, 76: McDonald JA and Kelley WN: Lesch-Nyhan Syndrome: Altered Kinetic properties of Mutant Enzyme. Science. 1971,171: Krenitsky TA, Papaioannou R and Gertrude B E : Human Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase: Purification, properties and Specificity. J. Chem. 1969, 244, 5: McDonald J A and Kelley W N: Lesch-Nyhan Syndrome: Altered Kinetic properties of mutant enzyme.science. 1971, 171: Steyn LM and Harley E H : Substrate inhibition in a human variant of Hypoxanthine-Guanine phosphoribosyltransferase. J. Biol.Chem. 1984, 259,1: Krenitsky T A and Papaioannou R.: Human Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase: Kinetics and Chemical modification.j. Biol. Chem. 1969, 244, 5: Visser JE, Baer P, Jinnah HA: Lesch-Nyhan Syndrome and the basal ganglia. Brain. Res. Rev. 2000, 32: Jinnah HA, DeGregorio L, Harris JC, Nyhan WL, O Neill JP: The spectrum of inherited mutations causing HPRT deficiency: 75 new cases and a review of 196 previously reported cases. Mutat. Res. 2000, 463: Gina H.A. Friedmann T. Lesch-Nyhan disease and its variants in the metabolic and Molecular Bases of inherited disease. Scriver Charles, Beaudet Artur, Sly William and Valle David. Eigth edition 2001; vol 2, Chapter 107, Barrera L, Rodríguez F, Gomez A, Echeverri D y Escudero E. Aspectos clínicos y bioquímicos del Síndrome de Lesch-Nyhan. Acta Médica Colombiana 1992; 17: Fardi K, Topouzelis N, and Kotsanos N : Lesch-NYHAN Síndrome: A preventive approach to self-mutilation. Int. J. of Pediatric Dentistry.2003;13: Zofre-Shani E, Bromberg Y, Hirsch J, Feinstein S, Frishberg Y and Sperling O: A novel point mutation(i137t) in the Conserved 5-phosphoribosyl- 1- pyrophosphate binding motif Of hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase (HPRT Jerusalem) in a variant of Lesch-Nyhan syndrome. Molecular Genetics and Metabolism.2003; 78: Emmerson BT, Thompson CJ, and Wallace DC : Partial Deficiency of Hypoxanthine-Guanine phosphoribosyltransferase: Intermediate enzyme deficiency in heterozygote red cells. Ann. Intern. Med. 1972, 76: Rodríguez F, Gomez A, Barrera L: Determinación de la condición heterocigota para el síndrome de Lesch- Nyhan utilizando un método radioquímica. Salud UIS 2000;32: Rodríguez F y Barrera L: Actividad de la enzima HGPRT en eritrocitos de una familia afectada por el síndrome de Lesch-Nyhan. Salud UIS. 2001, 33: Ohdoi C, Nyhan WL, and Kuhara T.:Chemical diagnosis of Lesch-Nyhan syndrome using gas chromatografhy-mass Spectrometry detection. J. of Chromatografy B. 2003;792: Ogasawara, N., Stout, JT: Molecular analysis of female Lesch-Nyhan patient. J.Clin.Invest 1989;4: De Gregorio,L., Nyhan, W.L.: An unexpected affected female patient in a classical lesch-nyhan family. Mol. Genet. Metab. 2000; 69: