Cultivos de referencia
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- José María Figueroa Sevilla
- hace 6 años
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1 Cultivos de referencia Capítulo siguiente: 2 - Cepas de colección de referencia, (Ref. Norma ISO 17025) Es el conjunto constituido por cepas de referencia, cepas de reserva y cepas de trabajo. Un laboratorio de microbiología cuenta con cultivos de referencia, a fin de acreditar o conservar la acreditación de un ensayo. Así, el número, la elección del género y su especie son dependientes de los ensayos que se elaboran y de las necesidades que asumen estos. La necesidad de los cultivos de referencia: La necesidad de los cultivos de referencia parte de demostrar una "trazabilidad". Para que ello se lleve a cabo, se diseña y se sigue un protocolo documental a fin de que se mantenga un buen uso y manejo de dichos cultivos. Los procedimientos que han de observarse de forma estricta son: La evaluación de la calidad de los medios de cultivo. La práctica de controles de calidad interno durante la ejecución de los ensayos. La realización de controles de calidad de reactivos. Pruebas confirmatorias, tales como la "prueba de CAMP" La validación de métodos. Requisitos de los cultivos de referencia Para que se cumpla un cultivo de referencia debe darse una serie de requisitos. Estos son: Células microbianas capaces de crecer; dándose una viabilidad. Cepas de referencia. Las colecciones aprovisionarán las cepas con instrucciones para su recuperación. Debe tratarse de un cultivo puro. Ha de observarse la pureza de la misma. La estabilidad genética. Es requisito fundamenta el que se de la estabilidad y el mantenimiento de características genotípicas y fenotípicas. En todos los casos la manipulación y modo de conservación de las cepas debe tener especial prevención sobre: El deterioro de las cepas. La contaminación cruzada. Mutaciones, deterioro o alteración de las características típicas de las cepas. Asimismo, su crecimiento característico debe ser documentado en lo que respecta a cada medio sobre el que se manipula como cepa control. El material de referencia Se denomina material de referencia al material o sustancia que ostenta valores de una o más propiedades suficientemente homogéneas y bien conocidas que permite su uso en la calibración de aparatos, la evaluación de un método de medición o la atribución de valores a estos materiales.
2 Las cepas de referencia A fin de demostrar la trazabilidad, las cepas de referencia deben obtenerse directamente de una colección con la reseña nacional o internacional de cultivo de referencia reconocido. Según la "ISO :2000", son: microorganismos definidos, por lo menos a nivel de género y especie catalogados muy caracterizados de origen conocido Dichas cepas son distribuidas y presentadas comercialmente liofilizadas; asimismo, los orga nismos de acreditación son los encargados de considerar válida la fuente de procedencia de la cepa a fin de que se cumpla con el requisito de prevenir mutaciones, deterioro o alteración de las características típicas de las cepas. de referencia adquiridas en una colección reconocida. Generalmente el 3er o 4º repique. En dicha adquisición se debe mantener sus recipientes originales; siendo de obligado requerimiento en la recepción o compra de insumo, el certificado de origen, donde conste el número de repique y el origen entre otros. Proveedores de cepas de referencia 1ª. Opción: ATCC (American Type Culture Collection). SVM (Foundation for the Advancement of Public and Environmental Protection) CECT (Colección española de cultivos tipos). CNCM. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) Institut Pasteur Etc. El número de repiques a partir de la cepa de referencia a de ser limitado, aceptándose hasta cinco repiques como máximo a partir de dicha cepa de referencia. 2ª. Opción: Los proveedores acreditados por ISO 9001 que llevan a cabo repiques a partir cepas adquiridas en la colección reconocida. Asimismo, toda cepa adquirida por una vía que no sea la propia colección, no podrá mencionarse utilizando el número que tienen en esa colección, sino únicamente como derivada de la cepa de colección. Adquisición de las cepas de referencia La adquisición de las cepas de referencia pueden provenir de: Obtención directa a partir de una colección nacional e internacional reconocida. Proveedores comerciales certificados por ISO que Comercializan repiques de cepas Material de referencia certificado. Material o sustancia acompañado de un certificado, que posee valores de una o más propiedades, certificados por un procedimiento que establece su trazabibilidad a una realización exacta de la unidad en la cual se expresan los valores de dichas propiedades, para el cual cada valor certificado está acompañado por su incertidumbre, con un nivel de confianza establecido. Cepas de referencia certificadas: La cepas de referencia certificadas es un material de referencia certificado biológico.
3 La colección certifica que se suministra una determinada cepa, que es un cultivo puro, y que se han observado las convenientes pruebas morfológicas, bioquímicas y moleculares acomodadas. Asimismo, al tratarse de un material biológico puede darse dificultades de certificación. Control de calidad de pureza y viabilidad: Este control se realiza a diferentes niveles del proceso; asimismo, se desempeña cada vez que se realiza un replique. El objetivo de dicho control es el de asegurarse que las cepas conservan su viabilidad y sus caracteres bioquímicos. Reconstitución de las cepas de referencia Las Cepas de referencia adquiridas por el laboratorio de microbiología son registradas en planilla como marca el procedimiento. Las Cepas de referencia son almacenadas entre 0-5 º C hasta su uso. En la reconstitución y siembra de la Cepas de referencia, se utiliza el medio de cultivo, las condiciones de incubación y el procedimiento indicado en las disposiciones para cada tipo de microorganismo del organismo proveedor de las cepas. Frecuencia de realización de este control: Es el laboratorio el que establece en cada caso la frecuencia de realización del control de calidad de pureza y viabilidad para las cepas de reserva almacenadas. En caso de no ostentar las características establecidas se ejecuta la "acciones correctivas" que se establecen en el procedimiento. Registro de Control de calidad de pureza y viabilidad de las cepas: Fecha del control. Las Cepas de referencia serán sometidas a un control de calidad de pureza y viabilidad, así se le dará registro. Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo. TIPO y Nº de colección. Registro de cepas de referencia Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo TIPO y Nº de colección. Nº de lote. Fecha de recepción. Control de calidad de la cepa de referencia Conforme (SI/NO). Fecha de caducidad de la cepa. Personal responsable. Tipo de cepa (Cepa de referencia, reserva o trabajo). Pruebas a realizar (depende del microorganismo): 1. Coloración de Gram 2. Características de las colonias en medios selectivos 3. Pruebas bioquímicas y serológicas.
4 3. Cepas de reserva y de trabajo Capítulo anterior: 2 - Cepas de colección de referencia Capítulo siguiente: 4 - Utilización general de cepas de referencia y simopsis de los cultivos de referencia Las cepas de reserva Se considera cepas de reserva, aquellas cepas idénticas logradas mediante un único subcultivo de una cepa de referencia, o lo que es lo mismo, una serie de alícuotas de cultivos idénticos elaboradas en el laboratorio por subcultivo de la cepa de referencia. Las cepas de reserva son preparadas y conservadas en el laboratorio, dentro del cual se destina un lugar para su almacenaje, señalando claramente de que se trata de cepas potencialmente peligrosas y cuya manipulación queda exclusivamente restringida al personal autorizado. Los Agentes Crioprotectores: Leche descremada de calidad microbiológica, con proceso de esterilización por vapor fluente, al 10% o 20% P/V. Asimismo, puede añadirse aditivos tales como el inositol. Dicho producto puede conservarse en refrigeración o a temperatura ambiente por años. Congelación a baja temperaturas Agentes Crioprotectores: 1. Leche descremada de calidad microbiológica (esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% P/V. 2. Aditivos, del tipo del Inositol. 3. Glicerol al 10%. 4. Caldo BHI con glicerol 20%. Métodos para la preservación y mantenimiento de las cepas de reserva Los métodos para la preservación y mantenimiento de cepas de reserva obtenidas a partir de cepas de referencia son la LIOFILIZACIÓN y la CONGELACIÓN A BAJAS TEMPERATURAS. Proceso de congelación: a. Equipamiento o insumos para lograr la congelación Congelador o cámara o uso de Nitrógeno líquido. Se da el uso de agentes Crioprotectores b. Proceso de congelación La Liofilización Esta se define como el proceso de desecación desde el estado congelado. Temperaturas de congelación: La temperatura de congelación ideal es de -70 o -80 C, e incluso menor temperatura. En el caso de temperaturas superiores, como los -20 C, se considera como no ideal aunque podría ser
5 la única forma posible; no obstante es preferible -40 C. Factores determinantes de la viabilidad de la cepa Envases: Los envases utilizados son el criovial o tubo estéril. Conservación del producto: Su conservación puede darse a temperatura congelación por años. Posibles inconveniente: Los inconvenientes que se puede encontrar en el proceso de congelación son entre otros: 1. problemas y pérdida de las cepas, 2. la falta de suministro de energía, 3. falta de insumos, 4. avería del equipamiento. La preservación y mantenimiento de cepas de reserva En la conservación y modo de mantener los microorganismos vivos, puros y la cepa microbiana auténtica, es primordial tener en cuenta los conocimientos fundamentales microbiológicos, suministrar condiciones ajustadas para cada tipo de microorganismo, así mismo, tener en cuenta que con cada subcultivo, existe un riesgo de mutación de la cepa y para ello debe evitarse el crecimiento. Los factores que determinan la viabilidad de las cepas, la cuales están sometidas al proceso de congelación para su reserva, son: El tipo de cepa, así por ejemplo que la resistencia de las bacterias Gram positivas es mayor que en el caso de las Gram negativas, y Las óptimas condiciones del cultivo antes de someterse a bajas temperaturas. Condiciones previas a la exposición de bajas temperaturas Las condiciones previas que ha de tenerse en cuenta a la exposición de bajas temperaturas de las cepas son: La edad del cultivo - La capacidad del microorganismo de sobrevivir puede verse afectada por la edad del cultivo. - Los cultivos muy jóvenes o muy viejos muestran menor resistencia al shock térmico. - La edad idónea corresponde con el fin de la etapa logarítmica, siendo el principio de la fase estacionaria la de mayor probabilidad de recuperación, siendo el de los microorganismos en general de 24 horas de incubación a 37º C. Las condiciones de desarrollo Estas son consideradas primordiales. Así observamos, por ejemplo, como las levaduras
6 que crecen aireadas y agitadas gozan de una mayor resistencia a la temperatura que aquellas que desarrolladas en un medio sólido. Igualmente, se deben respetar y observar las instrucciones dadas por los fabricantes de los sistemas de preservación de cepas disponibles comercialmente. Identificación de la cepa Tipo y Nº de colección Nº de repique Fecha de realización del C. res. (cepa de reserva) Fecha de vencimiento del criovial Nº de tubo o criovial Como ejemplo, observamos la supervivencia de los microorganismos almacenados a -20º C en Mast Cryobank (Ref.: Mast Cryobank TM, ETICOR) * Microorganismo... Supervivencia Enterobacter aerogenes meses Pseudomona aeruginosa meses Salmonella typhimurium... 48meses Staphylococcus aureus...48meses Listeria monocytogenes...48 meses Listeria ivanovii meses Rhodococcus equi...48 meses Bacillus cereus...24meses 2. El desarrollo microbiano logrado, se inocula asépticamente en el medio líquido sobrenadante que contienen los crioviales. 3. Congelar o liofilizar la cepas de reserva. 4. Manipulación de la cepa de reserva a fin de obtener cepas de trabajo. En el caso de las cepas congeladas de crioviales, se debe realizar este paso para prevenir el descongelamiento y la contaminación del criovial a través del traslado en su propia caja termostatizada y que repique en campana de flujo laminar. Asimismo, ha de observarse que En el caso de descongelamiento de las cepas de reserva, no se deben volver a congelarse. El criovial vencido es eliminado del cepario y se registra. Clostridium perfringes...48 meses Procedimientos a seguir en las cepas de reserva 1. Previo a la inoculación, se rotulan los tubos o crioviales donde se almacenan las cepas reserva. En cada criovial queda la siguiente información: Cuando se fracciona alícuotas en leche u otros agentes crioprotectores, se utilizan, se descongelan y no se volverá a congelar ni a usar. Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no se deben utilizar.
7 Registro de cepas de reserva Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo. TIPO y Nº de colección. Nº de Lote Cepa referencia. Nº de criovial o vial. Fecha de reconstitución de la Cepa referencia. Nº de repique. Frasco en uso. Fecha de baja criovial. Ubicación de almacenamiento. Observaciones Las cepas de trabajo Las cepas de trabajo son los Subcultivos de microorganismos obtenidos a partir de las cepas de reserva a fin de ser empleados en los ensayos que hagan falta. Obtención de cepas de trabajo: Los cultivos de trabajo se consiguen a partir de la Cepas de reserva sobre un medio sólido o líquido no selectivo adecuado manejando un ansa estéril e incubando en condiciones adecuadas. Las cepas de trabajo no convienen ser subcultivadas. Utilización general de cepas de referencia y simopsis de los cultivos de referencia SINOPSIS DE LOS CULTIVOS DE REFERENCIA El laboratorio de microbiología contará con cultivos de referencia. Los cultivos de referencia se manipulan en el laboratorio para: 1. Evaluar la calidad de los medios de cultivo, 2. asegurar la calidad de los resultados de ensayo 3. validar métodos microbiológicos. Se procederá: a. al manejo de cultivos de referencia, b. al aseguramiento de la trazabilidad y del origen de la cepa, c. al conocimiento de las características de las cepas usadas en los ensayos a fin de mantener su viabilidad y sus caracteres bioquímicos. 5. Criterios de validación y de mantenimiento del laboratorio microbiológico Capítulo anterior: 4 - Utilización general de cepas de referencia y simopsis de los cultivos de referencia Capítulo siguiente: 6 - Criterios para la validación y verificación de los equipos (SEGUN LA ENAC) Directrices para la calibración y lo controles de calibración La frecuencia con la que se realizan la calibración y los controles de calibración estriba del uso, tipo y resultados precedentes de cada uno de los equipos. Así se sugiere el siguiente cuadro: Principio del formulario 6. Criterios para la validación y verificación de los equipos Capítulo anterior: 5 - Criterios de validación y de mantenimiento del laboratorio microbiológico Capítulo siguiente: 7 - Criterios para el mantenimiento de los equipos
8 (SEGUN LA ENAC) Como en el esquema anterior, la frecuencia con la que se realizan los criterios para la validación y verificación de los equipos vienen dados por el uso, tipo y resultados precedentes de cada uno de los equipos. Así se sugiere el siguiente cuadro: 7. Criterios para el mantenimiento de los equipos Capítulo anterior: 6 - Criterios para la validación y verificación de los equipos Capítulo siguiente: 8 - Glosario de términos según la Entidad Nacional de Acreditación (SEGUN LA ENAC) La frecuencia con la que se realiza el mantenimiento de los equipos estribará de la necesidad, el tipo y las características precedentes de cada aparato. 8. Glosario de términos según la Entidad Nacional de Acreditación Capítulo anterior: 7 - Criterios para el mantenimiento de los equipos A continuación se recogen tal cual los terminos definidos por la Entidad Nacional de Acreditación, a fin de respetar la exactitud en lo que se refiere a terminología y definiciones, así como su referencia ISO. Calibración Conjunto de operaciones que permiten establecer, en condiciones específicas, la relación existente entre los valores indicados por un instrumento de medida o un sistema de medida, o los valores representados por una medida material o un material de referencia, y los valores correspondientes obtenidos mediante un patrón de referencia. NOTAS 1 El resultado de una calibración permite asignar valores de mesurandos a las marcas de escalas arbitrarias o estimar los errores de indicación de los instrumentos de medida. 2 Una calibración permite también determinar otras propiedades metrológicas, como el efecto de las magnitudes de influencia. 3 El resultado de una calibración puede registrarse en un documento, en ocasiones denominado certificado de calibración o informe de calibración. [VIM: 1993 ISO Vocabulario internacional de términos básicos y generales en metrología] Material de referencia certificado Material de referencia, acompañado de un certificado, en el cual uno o más valores de sus propiedades han sido certificados mediante un procedimiento que establece su trazabilidad a una realización exacta de la unidad en la que se expresan los valores de dichas propiedades. Cada valor certificado se acompaña de una incertidumbre y el nivel de confianza correspondiente. [Guía ISO 30:1992] Límite de detección Aplicado a análisis microbiológicos cualitativos - Número mínimo de microorganismos que pueden ser detectados, pero en cantidades que no pueden estimarse con precisión. Desviación negativa Ocurre cuando el método alternativo da un resultado negativo sin confirmación y el método de referencia da un resultado positivo. Esta desviación se convierte en un resultado negativo falso cuando puede demostrarse que el resultado verdadero es positivo. Desviación positiva Ocurre cuando el método alternativo da un resultado positivo sin confirmación y el método de referencia da un resultado negativo. Esta
9 desviación se convierte en un resultado positivo falso cuando puede demostrarse que el resultado verdadero es negativo. Cultivos de referencia Término colectivo que se refiere a cepas de referencia, cepas de reserva y cultivos de trabajo. Cepas de referencia Microorganismos definidos por lo menos al nivel de género y especie, catalogados y descritos según sus características y preferiblemente de origen conocido. [ISO :2000] Normalmente obtenidos de una colección nacional o internacional reconocida. Material de referencia Material o substancia uno o más de cuyas propiedades tienen valores suficientemente homogéneos y claramente establecidos como para poder ser utilizados en la calibración de un aparato, la evaluación de un método de medida o la asignación de valores a materiales. [Guía ISO 30:1992] Método de referencia Método investigado a fondo, que describe con claridad y exactitud las condiciones y los procedimientos necesarios para medir los valores de una o más propiedades y que ha demostrado tener una exactitud y una precisión apropiadas para el uso que pretende hacerse del mismo, de manera que puede utilizarse para evaluar la exactitud de otros métodos empleados para realizar la misma medición y, en particular, para caracterizar un material de referencia. En general se trata de un método normalizado nacional o internacional. Cepas de reserva Cepas idénticas obtenidas mediante un único subcultivo de una cepa de referencia. [ISO :2000] Exactitud relativa Grado de concordancia entre los resultados del método evaluado y los obtenidos utilizando un método de referencia reconocido. Repetibilidad Grado de concordancia entre los resultados de sucesivas mediciones del mismo mesurando realizadas en las mismas condiciones de medición. [VIM: 1993 ISO Vocabulario internacional de términos básicos y generales de metrología] Reproducibilidad Grado de concordancia entre los resultados de mediciones del mismo mesurando realizadas en diferentes condiciones de medición. [VIM: 1993 ISO Vocabulario internacional de términos básicos y generales de metrología] Sensibilidad Fracción del número total de cultivos o colonias positivos que son asignados correctamente con el método utilizado. [ISO 13843:2000] Especificidad Fracción del número total de cultivos o colonias negativos que son asignados correctamente con el método utilizado. [ISO 13843:2000] Cultivo de trabajo Subcultivo primario obtenido de una cepa de reserva. [ISO :2000] Validación Confirmación, mediante la aportación de pruebas objetivas, de que se han cumplidos los requisitos para el uso pretendido o una aplicación específica. [ISO 9000: 2000] Verificación Confirmación, mediante la aportación de pruebas objetivas, de que se han cumplido los requisitos establecidos. [ISO 9000:2000] REFERENCIA: "Anexo I al G-ENAC-04 Rev.3 Noviembre de 2002 Glosario de Términos" Final del formulario
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